Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Suivi de la dissémination tumorale dans un modèle murin de tunorigénèse intestinale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant une souffrance légère à modérée. Une partie reçoit des cellules tumorales sous la peau, avec des tumeurs laissées croître jusqu'à 1 000 mm³ pendant environ deux mois, d'autres une injection de cellules dans la rate par une chirurgie que le porteur reconnaît pouvoir entraîner la mort sous anesthésie. Toutes finissent mises à mort, une partie par ponction cardiaque. Le porteur étudie la précocité de la dissémination du cancer du côlon et affirme qu'aucun modèle de substitution ne peut aborder la question, tout en développant des organoïdes pour réduire le nombre d'animaux.
Objectifs
Alors que les métastases sont la cause de la majorité des morts attribués au cancer, nos connaissances demeurent limitées concernant les mécanismes mis en jeu lors de l'invasion des cellules tumorales dans d'autres organes. Alors que ces mécanismes étaient décrits pour intervenir tardivement des études récentes suggèrent dans le mélanome et le cancer du sein fortement que cela arrive très précocément. Le but de cette étude est de démontrer chez la souris que cette précocité d'invasion existe également dans le cas du cancer du côlon.
Bénéfices attendus
La réalisation du projet permettra dans un premier temps d'augmenter nos connaissances concernant la dissémination tumorale qui mène à la formation des métastases repsponsables de la très grande majorité des morts attribuées au cancer. Par ailleurs, à plus long terme les données acquises pourront bénéficier aux patients afin de prévenir l'apparition de métastases.
Procédures
190 animaux recevront un agent chimique qui permet l'induction (tamoxifène) quotidiennement pendant 5 jours, pour cette procédure, les animaux seront tous gardés en vie sauf si un des points limite définis au préalable est atteint. À la fin de cette procédure, des ponctions cardiaques seront faites au moment de l'euthanasie, sous anesthésie et par un expérimentateur qualifié, sur l'ensemble des animaux (190). La procédure 3 qui consiste à injecter de cellules tumorales en sous cutané sera réalisée dans 60 souris et la taille des tumeurs sera ensuite mesurée deux fois par semaine, les animaux seront conservés pour une durée d'environ deux mois. Après cette durée, les souris seront euthanasiées. La procédure 4 qui consiste à injecter de cellules tumorales dans la rate sera réalisée sur 180 souris (divisé en 5 groupes) et les animaux seront euthanasiés à deux temps différents (15 jours et à 30 jours) après l'injection.
Impact sur les animaux
Les injections des cellules tumorales en sous cutané est un geste maitrisé dans l'équipe et ne présentent pas de risques pour les animaux. Les tumeurs pourraient nécroser. L'injection des cellules tumorales dans la rate nécessite un geste chirurgical incluant une anesthésie et cela engendre des risques de non réveil des animaux. Les animaux sont traité avec des anti-douleurs pré et post-chirurgie et 1 jour apres la chirurgie. Enfin les ponctions cardiaques seront pratiqués par des personnes très bien formées et habituées à pratiquer ces gestes et seront realisés sous anesthesie.
Devenir
A l'issue du traitement des souris avec l'agent chimique qui permet l'induction (tamoxifène), les animaux seront tous gardés en vie sauf si un des points limites définis au préalable est atteint. A la fin de cette procédure, des ponctions cardiaques seront faites au moment de l'euthanasie, sous anesthesie et par un experimentateur qualifié, sur l'ensemble des animaux (190). Pour la procédure des injections tumorales en sous cutanée les aniamux seront conservés jusqu'à ce que leur tumeur atteigne la taille de 1000 mm3 (environ deux mois). Pour les injections de cellules tumorales dans la rate, les animaux (5 groupes) seront mis à mort à deux différents temps 15 jours et à 30 jours après l'injection.
Remplacement
Les questions posées dans le cadre de ce projet (suivi de la dissémination tumorale depuis le colon vers des organes distants dès un stade précoce du cancer ) impliquent l’utilisation de modèles murins reflétant au mieux la physiologie d’un point de vue intégrée. La réponse aux questions soulevées dans ce projet ne peut en aucun cas être globalement abordée par un autre modèle de substitution.
Réduction
Un nombre minimum de souris est planifié dans les expériences. Compte tenu de nos expériences précédentes, comme les souris ne présentent pas toutes des tumeurs intestinales (1/3 des souris), le nombre total doit être augmenté de 33 %. En parallèle, une nouvelle approche a été désigné où les tumeurs des souris sont dissociées puis cultivées sous forme d'organoïdes afin de réaliser des expériences in-vitro ultérieures et de diminuer le nombre des souris.
Raffinement
Étant donné que les souris après l'induction à un agent chimique (tamoxifène) seront gardées en vie pour une période bien définie, des bonnes conditions d'hébergement seront respectées. Les souris seront hébergées en groupes de 4 - 5 souris par cage dans un environnement enrichi contenant des maisons en carton, des copeaux et des morceaux de coton afin qu'elles se fabriquent des nids. Des points limites spécifiques et une grille de score a été définie et les chirurgies sont réalisées sous anesthésie et analgésies.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un système digestif présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. Grâce à une mutation particulière dans ce modèle de souris le cancer du côlon est initié et les cellules intestinales colorées peuvent être suivies dans les organes de l'animal. Les souris sont à des stades très précoces de la maladie et ne subissent pas par conséquent de soufrance.
Étude du rôle physiopathologique de la sumoylation – étude d’une inhibition transitoire de la sumoylation pendant le développement embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant une souffrance légère à modérée. Des femelles gestantes reçoivent une à trois injections abdominales d'une molécule inhibant la sumoylation, subissent une échographie, puis sont mises à mort pour prélever leurs embryons. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable sur les femelles gestantes en s'appuyant sur un projet précédent, et signale que les femelles ne peuvent être réutilisées après trois injections. Il étudie le rôle de la sumoylation dans le développement embryonnaire et juge l'étude sur "organisme entier" indispensable.
Objectifs
Les modifications post-traductionnelles jouent un rôle majeur dans le contrôle de l’activité des protéines et régulent, de ce fait, les processus cellulaires fondamentaux. Parmi celles-ci, la modification par SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier) a été reconnue comme un processus majeur de l’activité de la cellule eucaryote. Notre laboratoire dispose de plusieurs souris génétiquement modifiées permettant l’inactivation de la sumoylation via l’invalidation du gène. Comme l’invalidation complète du gène induit une forte létalité embryonnaire, jusqu’à ce jour, nous avons utilisé 2 modèles principaux : - Des souris qui permettent une inhibition de 50% du gène - Des souris permettant d’induire un KO inductible du gène Malgré ces modèles, il est difficile d’étudier l’impact de la sumoylation sur un organisme entier et dans le développement embryonnaire. Il a été montré que la sumoylation jouait un rôle majeur dans le développement embryonnaire : une souris génétiquement déficiente pour SUMO meurt in utero à 5,5 jours du stade embryonnaire. De plus, il a également également été montré in vitro que la sumoylation était très importante pour l’identité cellulaire des cellules souches embryonnaires Nous souhaitons aujourd’hui regarder in vivo les effets d’une hyposumoylation transitoire au cours du développement embryonnaire.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de cette étude est de mieux comprendre le rôle majeur de la sumoylation dans le développement embryonnaire. ce qui permetrait à terme d’envisager des traitements pour les nombreuses maladies lié au develleppement embryonnaire et/ou permettre de trouver des traitements anti cancéreux car on sait que les changements d’indetités cellulaires sont extremement important dans de nombreux cancers.
Procédures
Les animaux de ce projet seront injectés en IP 1 à 3 fois ; (20sec par injection). Une échographie sera réalisée sur les femelles (30secondes)
Impact sur les animaux
Les Nuisance et effets indésirables sont : Le stress ou la douleur lié à linjection en Intrapéritonèale. La fiche Sécurité de la molécule utilsée, nous donne la dose maximum tolérée chez le rat et nous avons l’expérience de cette molécule grâce à notre précédent projet. En théorie, nous n’attendons pas d’effet sur les femelles gestantes en injectant à 6.5 jours du stade embryonnaire..
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récupérer les embryons ou car elles ne peuvent pas être réutilisés car elles ont reçu 3 injections de molécule.
Remplacement
Ces travaux mettant en jeu plusieurs types cellulaires et phénomènes différents nécessitent une étude sur l'organisme entier, ce qui impose le recours à des animaux. Le but de cette procédure est de mettre au point un modèle d’hyposumoylation transitoire dans le modèle murin.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris -Les souris seront de même fond génétique (C57BL6/J) afin de limiter les variations liées. - Nous réaliserons un maximum d’analyses sur une même souris quand cela est possible. - Des analyses statistiques seront faites à l'aide de modèles à effet mixte, afin de prendre en compte les effets techniques indésirables. Les effets de l’hyposumoylation causés au cours du développement embryonnaire seront comparés entre le groupe de souris traité avec la molécule utilisée et le groupe de souris contrôle. Pour une puissance statistique fixée à 80% et un risque alpha de faux positif fixé à 5% nous utiliserons des groupes de 10 souris femelles afin d'assurer l'obtention d'un nombre suffisant de souriceaux (au moins une cinquantaine). -Ces expériences seront à chaque fois effectuées 3 fois à l’identique pour s'assurer de la reproductibilité des observations. Cependant si les deux premières expériences donnent des résultats similaires, la 3ème série ne sera pas effectuée. - Les deuxième procédure n’aura lieu que si la première nous permet d’induire une perte de la sumoylation transitoire sans que cela ne provoque une létalité embryonnaire.
Raffinement
Afin de limiter la douleur et le stress -Les animaux sont élevés à un nombre maximum de 7 animaux par cage. Les cages contiennent des copeaux et sont enrichies avec du coton permettant aux souris de recréer des « espaces /niches » comme dans les conditions de leur habitat ancestral. -L’injection sera pratiquée par une personne expérimentée, puis les animaux seront suivis 2 fois par jour pendant les 16 h d’action de la molécule utilisée , puis 3 fois par semaine après. Ce suivi permettra d’éviter ou minimiser l’apparition des points limites et d’adapter des soins préventifs plus spécifiques pour les groupes suivants si apparition de points limites. D’après notre projet précédent, nous savons qu’une injection n’induit pas d’effet délétere sur les souris non gestantes. Nous n’attendons donc pas d’effet délétère sur les femelles gestantes en injectant à 6.5 jours du stade embryonnaire. Cependant, nous nous baserons sur l’apparition de signes cliniques généraux décrits dans la grille d’évaluation de la douleur recommandée par le comité d’éthique et la SBEA (Structure bien être animale). Les animaux seront mis à mort s’ils présentent des signes avérés de souffrance, des soins adaptés (réhydratation, enrichissement…) seront alors mis en place.
Choix des espèces
La souris de laboratoire (Mammifère) est largement utilisée à travers le monde, pour sa proximité évolutive avec l’homme : cette large utilisation témoigne de (a) la maîtrise de son élevage sous forme de lignées consanguines, (b) sa reproduction facile et rapide à laquelle sont couplées des portées d’effectif élevé (c) de la relative facilité de modification génétique transmissible/héritable. Des souris adultes seront utilisées, agée entre 6 à 15 semaines, âge idéal pour le reproduction.
Impact de la « cellule d’origine » sur le phénotype de la tumeur
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Chaque souris, immunodéficiente et pré-pubère, subit deux chirurgies pour l'"humanisation" d'une glande mammaire puis la greffe de cellules tumorales humaines, et développe ensuite une tumeur du sein. Le porteur reconnaît le développement d'une pathologie potentiellement grave et cherche à comprendre comment la "cellule d'origine" façonne le type de tumeur. Il valide des étapes préalables in vitro mais juge le modèle in vivo "indispensable" pour reproduire l'environnement tumoral.
Objectifs
Au cours des dix dernières années, les progrès des technologies de séquençage et de la biologie computationnelle ont conduit à une nouvelle ère de médecine de précision en oncologie. Les tests génomiques permettent d'adapter la prise en charge clinique à chaque patient cancéreux en fonction des altérations génomiques des cellules cancéreuses. L'état actuel de l'oncologie de "précision" repose sur l'administration de médicaments ciblés capables de contrôler les voies mutées. Malgré les grands espoirs que suscite cette approche, seule une fraction des cancers répond aux interventions "ciblées". Le succès décevant de la médecine génomique dans le domaine du cancer est dû à une relative inefficacité à détecter des altérations exploitables ainsi qu’à un manque de compréhension fonctionnelle de la dépendance des voies moléculaires d'une masse tumorale donnée. Il est donc crucial de définir le schéma cellulaire et moléculaire de causalité conduisant à la progression tumorale et à la résistance thérapeutique. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment l'initiation du cancer du sein peut conduire à différents sous-types de tumeurs mammaires avec une réponse spécifique aux thérapies. Plus précisément, nous voulons examiner comment la cellule de l’épithélium mammaire soumise à la première agression oncogénique - la "cellule d'origine" - peut avoir un impact sur la tumeur résultante en termes de paysage moléculaire et de réponse au traitement. Dans ce but, nous voulons mettre en place un modèle expérimental dans lequel nous pouvons suivre l'effet d'un oncogène sélectionné dans différentes cellules à l'origine de la hiérarchie de différenciation de l'épithélium mammaire et ensuite étudier la tumeur résultante.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre comment une agression oncogénique donnée dans des cellules différentes de l’épithélium mammaire (les cellules d’origines) donne naissance à des tumeurs dont les caractéristiques phénotypiques et l’agressivité varient. Ceci permettra par la suite de mieux comprendre les mécanismes de l’initiation tumorale et de prédire l’évolution d’une tumeur et sa réponse aux traitements.
Procédures
L’ensemble des animaux subira deux procédures chirurgicales (sous anesthésie+analgésie) : l’humanisation de la paire de glandes mammaires numéro 4 qui durera environ 20 minutes et l’implantation des cellules tumorales dans la glande mammaire humanisée qui durera approximativement 15 minutes. L’induction in vivo sera réalisée par l’injection ip de doxycycline qui durera quelques secondes pour chaque souris.
Impact sur les animaux
Les animaux seront transplantés avec des cellules tumorales et développeront donc une pathologie potentiellement grave. Les gestes chirurgicaux et l'anesthésie associée ainsi que l’injection de doxycycline constitueront une nuisance sur les animaux. Les manipulations et les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
A l'issue de la procédure, les souris seront mis à mort et les tumeurs seront prélevées, dissociées afin d’analyser l’immunophénotype et les caractéristiques moléculaires des cellules tumorales.
Remplacement
En amont de l’étape in vivo, l’expression des oncogènes et leur impact seront validés in vitro avant d’envisager leur transplantation. Cependant, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma, l’angiogenèse péritumorale, le contexte cytokinien, sont des mécanismes cruciaux lors de la croissance tumorale et qui ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro et c’est pourquoi le modèle expérimental in vivo reste actuellement indispensable.
Réduction
Nous nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant l’obtention de résultats statistiquement robustes. Pour cela, nous nous appuierons sur la méthodologie de calcul disponible sur le site http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/ qui permet d’estimer statistiquement la fréquence de cellules à l’origine de l’apparition de tumeurs.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture et eau ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de des lanières de papier compacté utiles à la nidification et d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. Les procédures de transplantation seront réalisées sous anesthésie associée à une analgésie afin d’éviter toute douleur. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l’apport d’un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). Des souris pré-pubères de 3 à 4 semaines seront incluses dans les procédures expérimentales, avant le développement du tissu épithélial mammaire. En effet, le développement de la glande mammaire est un processus postnatal. A la naissance, chez la souris, le rudiment mammaire comprend un canal primaire bien formé et quelques ramifications secondaires. La glande mammaire reste quiescente jusqu’au début de la puberté (4 semaines), puis les canaux mammaires s’allongent et se ramifient intensivement, envahissant progressivement tout le stroma adipeux qui entoure la glande. Il est donc nécessaire de faire la résection de la glande mammaire et l’injection de fibroblastes humains avant la formation des canaux mammaires afin d’« humaniser » la glande mammaire murine. Deux à quatre semaines après l’« humanisation » des glandes mammaires, les souris pourront alors être greffées avec des cellules épithéliales mammaires humaines transformées par des oncogènes classiques des cancers du sein chez la femme.
Induction de la satiété par électrostimulation des voies nerveuses sympathiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 523 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance majoritairement sévère (1 506 individus). Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec pose de fibre optique et injection intracérébrale de virus, l'implantation d'électrodes spinales ou abdominales, un régime gras et sucré destiné à les rendre obèses, puis des séances répétées d'électrostimulation sur cinq semaines. Le porteur reconnaît que ces impulsions peuvent déclencher des comportements d'automutilation, auquel cas la stimulation est arrêtée. Il vise un dispositif médical contre l'obésité et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne peut aborder la question, la souris restant selon lui un prérequis réglementaire au développement préclinique.
Objectifs
Ce projet vise à développer une méthode médicale pour traiter l'obésité en utilisant une technique d'électrostimulation du système nerveux. Contrairement aux traitements médicamenteux actuels, qui ont montré une faible efficacité dans la perte de poids, les interventions chirurgicales comme le bypass gastrique sont actuellement les options les plus efficaces pour traiter l'obésité. Cependant, ces interventions chirurgicales sont irréversibles et peuvent présenter des risques à long terme ainsi que des effets indésirables. Des études récentes ont suggéré que les effets bénéfiques du bypass gastrique sont liés au système nerveux sympathique. En conséquence, la stimulation électrique de ce système pourrait représenter une alternative moins invasive à la chirurgie pour traiter l'obésité. Plusieurs données scientifiques soutiennent cette approche, notamment la démonstration de l'inhibition des signaux nerveux spécifiques responsables de l'augmentation de la prise alimentaire. Le développement d'un dispositif médical utilisant l'électrostimulation du système nerveux pour réguler la prise alimentaire et le métabolisme pourrait être une solution prometteuse pour lutter contre l'obésité. Dans ce projet, l'objectif est d'étudier l'effet de l'électrostimulation du système nerveux sur la régulation de la prise alimentaire. Pour cela, des souris génétiquement modifiées sont utilisées comme modèle animal, permettant de surveiller en temps réel l'activité des neurones responsables de la satiété chez l'animal éveillé.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de réduire efficacement le poids chez les personnes obèses ou en surpoids. Cependant, cette surcharge pondérale peut entraîner plusieurs problèmes de santé tels qu'une élévation de la tension artérielle, un excès de triglycérides et un excès de sucre dans le sang, pouvant à long terme conduire au diabète de type 2 et/ou à des maladies cardiovasculaires (infarctus) et/ou hépatiques (cirrhose). Par conséquent, le développement de traitements plus efficaces est nécessaire pour lutter contre l'obésité. Les expériences menées dans le cadre de ce projet nous permettront d'évaluer, dans un modèle préclinique, les effets de l'électrostimulation des nerfs périphériques ou de la moelle épinière sur la perte de poids chez des animaux rendus obèses.
Procédures
Dans une première série d'expériences, les animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 30 minutes au cours de laquelle nous poserons une fibre optique et réaliserons une injection intracérébrale de virus à l'aide d'un cadre stéréotaxique. Les souris seront soit sacrifiées 3 semaines après la chirurgie par surdosage d’anesthésique pour le prélèvement des cerveaux après perfusion intracardiaque, soit suivies pour un enregistrement en fibre optique pendant 3 sessions d'une heure après un jeûne de 5 heures sur 10 jours, avec isolement en cages individuelles pendant la durée de l'enregistrement. Aucun prélèvement n'est prévu pour cette procédure. Dans d'autres expériences, les animaux subiront deux procédures chirurgicales de moins d'une heure chacune. La première consistera à poser une fibre optique et à injecter par voie intracérébrale un virus, le tout après avoir immobilisé la tête de l'animal sur un cadre stéréotaxique. La seconde consistera à implanter des électrodes de stimulation au niveau spinal ou abdominal. Une semaine après la chirurgie, les animaux seront mis à jeun pendant 5 heures, puis seront soumis à une électrostimulation après avoir été isolés en cages individuelles. Cette électrostimulation sera effectuée selon différents protocoles pendant une durée maximale de 5 semaines, avec un total de 30 sessions de stimulation de 10 minutes par semaine, réparties sur 3 jours hebdomadaires. Aucun prélèvement n'est prévu pour cette procédure. Enfin, concernant certains animaux, ils seront nourris avec un régime enrichi en graisses et en sucres pendant 9 semaines. Ensuite, ces animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 45 minutes, comprenant l'implantation d'électrodes de stimulation au niveau spinal ou abdominal. Une semaine après la chirurgie, les animaux seront placés dans des cages métaboliques pour habituation pendant une semaine puis seront électrostimulés pendant 10 minutes avant chaque repas (fournis toutes les 2 heures) en suivant différents schémas temporels. Cette électrostimulation sera poursuivie pendant 3 semaines avant la mise à mort. Aucun prélèvement n'est prévu.
Impact sur les animaux
Toutes les expériences présentées dans cette demande comportent une phase chirurgicale incluant les éléments suivants : • Injection sous-cutanée d'analgésique préopératoire ; • Perte de poids et douleur durant les 2 à 3 premiers jours chez les animaux après l'intervention chirurgicale ; • Surveillance et manipulation des animaux durant les 4 jours de récupération post-chirurgicale (pesée, palpation) ; • Risques chirurgicaux inhérents à toute opération chirurgicale, tels que les risques d'infection ou de rupture des fils de suture ; • Mobilité entravée par la connexion aux générateurs externes pendant la période d'enregistrement et d'électrostimulation. Par ailleurs, les impulsions électriques peuvent causer un inconfort temporaire chez l'animal, ce qui nécessitera une évaluation et une limitation de la durée au maximum. De plus, certaines expériences impliquent un changement de régime alimentaire pouvant entraîner une prise de poids anormale chez cette souche murine et éventuellement des problèmes de malocclusion. Enfin, bien que les animaux soient en général hébergés avec leurs congénères, des périodes d'isolement (hébergement individuel) seront nécessaires : • pendant les enregistrements par fibre optique (maximum 5 heures par jour, tous les deux jours, pendant une durée maximale de 5 semaines) et • lors du suivi métabolique dans des cages dédiées (3 semaines en tout).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort dès la fin des expériences pour des analyses anatomopathologiques et histologiques.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucune méthode in vitro ou in silico scientifiquement validée pouvant servir d'alternative à l'expérimentation animale pour aborder les questions soulevées par ce projet. En effet, l'étude de l'obésité ne peut être adéquatement réalisée in vitro en raison de sa nature complexe. Elle requiert une approche in vivo, prenant en compte l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. Ainsi, l'utilisation d'une espèce le plus proche possible de l'espèce humaine s'avère nécessaire, car la physiologie digestive est caractéristique de chaque groupe phylogénétique. Par exemple, l'utilisation d'animaux modèles de type insectes ou nématodes n'est pas réaliste pour de telles études. En revenanche, la souris posséde un système digestif proche de celui de l'homme même s'il présente des spécificités dont nous devrons tenir compte. Par ailleurs, l'usage d'un modèle expérimental in vivo murin s'avère essentiel en tant que prérequis pour la phase de développement préclinique, selon les autorités régulant la mise sur le marché de dispositifs médicaux.
Réduction
Le nombre de souris a été minimisé tout en restant suffisant pour obtenir des résultats exploitables. Compte tenu de l'expérience pratique des chercheurs, nous estimons qu'un maximum de 17 souris sera nécessaire pour élaborer les différentes étapes du modèle pour la mise au point de la phase chriurgicale. Les chercheurs ont déjà utilisé des points de repère anatomiques et pratiqué des gestes chirurgicaux sur des cadavres de souris, mais l'utilisation d'animaux vivants est nécessaire avant de passer à la phase d'optimisation des paramètres de stimulation. Quant à la deuxième phase, étant donné que le nombre de paramètres d'électrostimulation possibles est pratiquement infini et afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, nous utiliserons des modèles de régression linéaire. Nous estimons qu'au maximum, 582 souris seront nécessaires pour cette procédure. Ce nombre total de souris est une estimation maximale, car nous effectuerons les expérimentations sur des lots de 10 animaux et des évaluations seront effectuées toutes les 20 souris. Ainsi, si 10 paramètres d’électrostimulation satisfaisants sont identifiés (permettant de réduire l'activité des neurones de la satiété) avant la fin de la procédure, nous mettrons fin aux expérimentations. En ce qui concerne les effets de l'électrostimulation sur la prise de poids, nous avons déterminé le nombre d'animaux par une approche statistique reconnue. Étant donné que notre stratégie expérimentale repose sur la comparaison du poids des animaux électrostimulés par rapport à ceux qui ne le sont pas, nous aurons besoin au maximum de 924 animaux, sachant que nous testerons différents schémas d'administration de l'électrostimulation pour les 10 types de stimulation sélectionnés lors de la phase préliminaire. Ce nombre total de souris est également une estimation maximale, car nous arrêterons les expérimentations dès qu’une combinaison de stimulation/schéma d’administration permet de diminuer significativement le poids des animaux.
Raffinement
• Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (tubes en carton pour se cacher, briques de bois à grignoter). • Une période d’acclimatation d'au moins 7 jours aura lieu, au cours de laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera effectué. Il convient de noter que pour la phase mesurant l'impact de l'électrostimulation spinale sur le prise de poids, les animaux recevront un régime alimentaire enrichi en graisse et en sucre et seront observés au moins 3 fois par semaine par les expérimentateurs afin de surveiller leur état de santé général. • Les chirurgies seront réalisées par du personnel compétent, et les animaux seront placés sous anesthésie et analgésie pour prévenir toute souffrance. Les animaux seront observés deux fois par jour pendant les quatre jours suivant l'opération. Les soins post-opératoires incluront notamment l'administration d'analgésiques pendant 3 jours, ainsi que l'administration d'un traitement anti-inflammatoire stéroïdien dans l'eau de boisson, qui sera maintenu pendant les 2 jours suivants. • Les effets potentiellement douloureux de l'électrostimulation seront évalués tout au long de la procédure, afin de mettre fin à l'électrostimulation dès que des signes de douleur apparaissent. Plus particulièrement, des comportements tels que des sauts de l'animal, une course de la souris ou des comportements d'automutilation entraîneront l'arrêt immédiat de l'électrostimulation en cours, y compris les intensités supérieures. • Les effets sur la prise de poids seront évalués sur un nombre d'animaux strictement nécessaire pour évaluer les effets à long terme de l'électrostimulation. • Enfin, des critères limites ont été définis pour anticiper toute détérioration de l'état de santé général des animaux, qu'ils soient sous anesthésie ou conscients. Si nécessaire, des protocoles de soins appropriés seront appliqués. En cas de détérioration de la santé de l'animal, la mise à mort sera effectuée immédiatement sur décision du responsable de l'étude.
Choix des espèces
L'espèce murine sera utilisée en raison des données de la littérature démontrant une implication du système nerveux dans la prise alimentaire sur ce modèle. De plus, c'est la seule espèce pour laquelle un large panel d'animaux modifiés génétiquement existent, permettant ainis de mesurer l'activité neuronale par photométrie. Nous utiliserons des animaux adultes, car l'objectif est de développer un dispositif médical pour les sujets adultes (âgés de ≥ 8 semaines).
Création de lignées de poissons zèbre génétiquement modifiées pour la recherche en neuroscience
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
44 200 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à terme, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objet est de créer des lignées génétiquement modifiées, huit par an sur cinq ans, vendues comme prestation à des laboratoires publics ou privés, chaque poisson étant identifié à trois mois par une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie. Le porteur reconnaît que les modifications génétiques peuvent provoquer des phénotypes dommageables comme une scoliose ou des troubles de la reproduction. Les individus non modifiés sont tués, dix par lignée étant gardés pour l'entretien puis tués à dix-huit mois, et le recours au poisson est justifié par la part de gènes partagés avec l'humain et l'usage d'un "organisme entier".
Objectifs
Pour comprendre certaines maladies qui touchent l’être humain, les chercheurs ont besoin d’un modèle animal qui puisse se rapprocher le plus possible du génome humain. Il a été montré que le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains dont 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. C’est pourquoi nous l’avons choisi pour créer des lignées génétiquement modifiées afin de fournir ces dernières à des laboratoires privés ou publics dans le cadre de prestations. Ces lignées seront alors délivrées à l’organisme demandeur pour réaliser ses expériences. L’objectif est de créer 8 lignées par an durant les 5 ans à venir.
Bénéfices attendus
Notre plateforme a pour mission de fournir de nouvelles lignées de poissons zèbres à la communauté de chercheurs utilisant le modèle poisson zèbre pour comprendre certaines maladies humaines et progresser dans leur traitement.
Procédures
Les poissons doivent être identifiés génétiquement à l’âge de 3 mois. Pour cela ils sont isolés et anesthésiés successivement afin de minimiser la souffrance de l’animal lors du prélèvement de tissu de la nageoire caudale qui est réalisé par la suite. Un seul prélèvement est réalisé par individu, ne durant qu’une minute. Une fois la biopsie terminée, le poisson est remis à l’eau dans un bac de réveil. Il ne sera réhabilité dans un aquarium d’élevage qu’après rétablissement complet de l’anesthésie. Cette biopsie ne doit entrainer aucune séquelle sur la nage ou l’alimentation du poisson. Il est nécessaire de maintenir l’animal isolé jusqu’à l’obtention des résultats d’analyse (maximum 2 semaines). Il est possible qu’un phénotype dommageable apparaissent sur l’ensemble des animaux suite aux modifications génétiques.
Impact sur les animaux
Les poissons vont être pêchés à l’épuisette provoquant un stress et un frottement sur le corps de l’animal. Le risque lié à l’anesthésie est présent mais reste limité car l’anesthésie n’est pas une anesthésie très profonde ni très longue. Un traumatisme peut faire suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale, qui est une petite plaie de quelques millimètres. Il s’en suit ensuite un processus cicatriciel qui prend 2 semaines durant lequel le poisson est isolé. Il est possible que les modifications génétiques entraînent des phénotypes dommageables, par exemple une scoliose ou un problème lors de la reproduction.
Devenir
Au cours du projet, les animaux produits qui ne sont pas génétiquement modifiés seront euthanasiés. Nous conserverons 10 individus par lignée produite qui permettront d’obtenir et de garantir le maintien de la lignée nouvelle lignée. Enfin, ces animaux seront également euthanasiés à l’âge de 18 mois après confirmation de l’implantation de la lignée dans le laboratoire demandeur. Les animaux ne seront pas conservés au-delà afin d’éviter qu’ils ne développent des anomalies qui s’intensifient avec le vieillissement des animaux ou qu’ils ne deviennent le réservoir d'infection.
Remplacement
Des recherches ont montré que le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains parmi lesquels 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, cela en fait donc un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. De plus, le fait que les œufs de cette espèce soient transparents et accessibles la rend plus intéressante pour l’injection, le suivis du développement larvaire et l’imagerie. C’est pourquoi notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre. L’espèce animale et notamment l’organisme entier utilisé ne peut donc être remplacée. Cela nécessite une approche in vivo sur l’animal.
Réduction
Aux vues de la physiologie du poisson-zèbre et de notre expérience sur la création de lignées génétiquement modifiées au cours des dernières années, nous estimons que le minimum requis de lignée à créer est de 8 par an sur les 5 ans à venir. Nous allons générer 850 individus fondateurs (F0) et 255 individus de la génération suivante (F1) soit 8 lignées x (850 F0 + 255 F1) x 5 ans = 44200 poissons zèbres. Afin de ne produire que le nombre d’individus nécessaire à la création de ces lignées, nous essayerons d’insérer un rapporteur fluorescent lorsque cela sera possible. Ce qui nous permettra de sélectionner et de garder que les poissons génétiquement modifiés diminuer le nombre de poissons à élever par 4 d’après nos précédentes études soit élever 11 050 poissons zèbre.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera particulièrement observé. Ainsi les paramètres environnementaux comme la qualité de l’eau, la température et le cycle lumineux seront à surveiller. La température de l’air devra être comprise entre 25 degrés Celsius et 27 degrés Celsius et le cycle lumineux de 14-10 avec aube et crépuscule. Le poisson zèbre est une espèce grégaire, ils seront donc placés en groupe de 5 à 20 congénères adultes maximum dans les aquariums d'élevage. Seul les poissons à génotyper seront isolés et maintenus dans le système afin de garantir un environnement contrôlé. Cela leur permettra de maintenir un contact visuel avec leurs congénères. Ils seront surveillés quotidiennement et un affichage assurera la traçabilité et le respect de la durée de l’isolement. Pour préserver l'ensemble des poissons hébergés, une limite d'âge de 18 mois sera appliquée pour éviter que les animaux vieillissants puissent être le réservoir d'infection. En effet, la durée de vie moyenne d’un poisson zèbre est de 24 mois. De la nourriture vivante sera fournie 2 fois par jour afin que les animaux puissent exercer un comportement de chasseur pour se nourrir. Si les animaux montrent des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Pour cela nous utiliserons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels. Cela permettra d’évaluer quels poissons doivent être euthanasiés ou non. Si nous observons des problèmes physiques nous ferons une évaluation pour en définir la gravité et mettre en place des solutions adaptées pour garantir le bien-être des animaux. Si cela s’avère une demande d’autorisation sera effectuée.
Choix des espèces
Le modèle poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains dont 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. C’est pourquoi nous avons choisi d’utiliser ce modèle pour créer des lignées génétiquement modifiées. De plus, il atteint l’âge de la maturité sexuelle à 3 mois et les femelles peuvent pondre jusqu’à 200 œufs par ponte et ce chaque semaine. Le fait que les œufs de cette espèce soient transparents et accessibles la rend plus attrayante. L’élevage d’un nombre important d'individus est aisé et la caractérisation génétique est peu traumatique. Ils seront donc utilisés pour générer une lignée afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses recherches sur le modèle. La création de lignée nécessite d’utiliser des animaux en âge de se reproduire, dans notre cas le poisson zèbre atteint ce stade à partir de 3 mois et nous ne les utiliserons pas au-delà de 18 mois. Le prélèvement pour génotypage se fait aux alentours de 3 mois, lorsqu’ils ont atteint une taille suffisante. Ils seront utilisés pour générer une lignée mutante stable afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses expériences sur le modèle.
Etude des conséquences de l’inactivation et de la surexpression de gènes impliqués dans des maladies neurodeveloppementales
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
15 946 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une laparotomie au cours de laquelle l'utérus est exposé et chaque embryon transpercé par un capillaire de verre avant l'application d'un courant électrique, technique d'électroporation in utero destinée à modifier l'expression de gènes dans le cerveau en développement. Les femelles sont tuées pour collecter embryons et nouveau-nés, ces derniers subissant une injection dans le cerveau ou une perfusion intracardiaque terminale, tous étant tués pour prélever les cerveaux. Le porteur affirme que la complexité du cortex ne peut pas être recréée in vitro et conclut à la nécessité de la souris.
Objectifs
Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Un grand nombre de gènes y ont été reliés. Notre objectif est de comprendre les rôles de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies. Chez certains patients avec des maladies du développement cortical, il existe des mutations dans des gènes qui montrent une forte probabilité d’être la cause de la maladie. Ces pathologies sont associées aussi bien à des défauts de prolifération, de migration et de différenciation neuronale. Comprendre les mécanismes par lesquels la mutation entraine la pathologie est essentiel pour faciliter le diganostic d’autres maladies et envisager un traitement. Pour comprendre ce qu’il se passe dans les neurones, nous allons adopter une approche génétique visant à modifier l’expression ou la fonction des molécules étudiées. Nous utiliserons l’électroporation in utero chez la souris. Cette technique permet l’introduction de matériel génétique contrôle et muté dans les cellules progénitrices de la zone ventriculaire du cerveau en développement, permettant donc l’étude de la structure, de la fonction et du développement du système nerveux central. Elle offre l’avantage d’un contrôle spatio-temporel de la délivrance d’ADN, permet des études de perte et de gain de fonction et est simple, rapide et efficace. On pourra ainsi étudier l’effet d’un gène : # sur la prolifération : électroporation au stade embryonnaire (un seul stade par gène selon le pic d’expression du gène étudié) et analyse du devenir des cellules modifiées 1 ou 2 jours plus tard. Dans ce cadre, les mères recevront une ou deux injection(s) nous permettant des analyses de données plus fines# sur la migration des neurones : électroporation au stade embryonnaire et analyse du devenir des cellules modifiées 3 ou 4 jours après # sur la différenciation et la connectivité neuronale en introduisant le gène d’intérêt au stade embryonnaire et en analysant 2, 4, 8 ou 21 jours après la naissance .
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de comprendre la fonction de protéines ou d'autres molécules impliqués dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquels leur déplétion ou surexpression conduit à des troubles du neurodéveloppement. Ce projet aura des retombées pour les patients. En effet, notre collaboration avec des cliniciens nous permet de tester par cette approche des variants retrouvés chez des patients présentant des maladies du développement du cerveau. Comprendre les mécanismes peut permettre d’envisager des pistes thérapeutiques.
Procédures
Les femelles gestantes vont subir une injection d’analgésique (environ 5 secondes), suivie d’une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, pour une durée de 1 à 10 secondes pour chaque embryon). La durée totale de la chirurgie n'exèdera pas 45 minutes ( en moyenne 25 minutes pour un chirurgien expérimenté). Un courant électrique sera appliqué sur la paroi utérine, en 5 pulses de 50 ms espacés de 1 seconde (temps total entre 5 et 6 secondes par embryon). Elles seront par la suite placées dans des cages isolées. Certaines recevront une ou deux injections (5 secondes) 1-2 jours après la chirurgie. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (entre 1 et 10 secondes). Certains nouveaux nés vont subir une injection d’analgésique (environ 5 secondes) puis d’un anesthésique (environ 5 secondes) avant de subir une chirurgie de perfusion intracardiaque terminale sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
La barrière cutanée des femelles gestantes donc rompue en plusieurs endroits (site d'injection dans le dos entre les omoplates, aiguille très fine, cicatrice de la laparotomie sur le ventre), il en résulte une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Elles seront par la suite placées dans des cages isolées et de ce fait privées de congénères pendant quelques jours de convalescence. Certaines recevront une ou deux injections sous cutanées 1-2 jours après la chirurgie, pouvant entrainer un stress et d'autre(s) rupture(s) le la barrière cutanée. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin aux stades embryonnaires ainsi que l'application d'un courant électrique sur leur tête. Certains nouveaux nés vont subir une injection d’analgésique puis d’un anesthésique (pouvant entrainer du stress) avant de subir une chirurgie terminale de perfusion intracardiaque.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles sont mises à mort pour collecter les embryons ou dès collecte des nouveaux nés. Les embryons ou nouveaux nés sont mis à mort pour collecter les cerveaux.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cortical qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération de gènes sur le développement embryonnaire cortical.
Réduction
Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, aucune nouvelle expérience ne sera effectuée avant qu’une analyse complète des précédentes ne soit réalisée. Les experiences (prolifération, migration, maturation) seront choisies en fonction de la nature du gène étudié, son profil d’expression et du phénotype observé chez les patients. Aussi toutes les expériences ne seront pas systèmatiquement éffectuées. Seules celles relevantes seront faites. En ce qui concerne les études post-natales, et afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés et d’éviter le cannibalisme des souris, nous avons adapté nos croisements pour obtenir des souris moins agressives et meilleures nourrices. La bonne maitrise de la technique chirurgicale acquise par l’équipe tout au long de ces dernières années permet d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons (40-80%) ce qui limite fortement le nombre de femelles gestantes manipulées. Nous prévoyons aussi dans cette étude 10 femelles gestantes pour la formation de nouveaux expérimentateurs afin de nous assurer de leur succès et d’un bon taux de survie.
Raffinement
Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Avant le début de l’expérience, les femelles reçoivent une injection d'analgésique 30 minutes avant l’anesthésie. Durant l’expérimentation les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse. Leurs yeux sont protégés de la deshydratation. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’anesthésie. Un anti-inflammatoire non-stéroïdien, est injecté à la fin de l’opération afin de prendre le relais de l’analgésique pendant 24h. L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections postchirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement.
Choix des espèces
La technique d’électroporation dans le cerveau a été mise au point chez la souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par animal rend cette méthode efficace. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neuro-développementales chez l’homme. 1) Etude de la prolifération : Femelles adultes gestantes de 13 jours ou 14, stades auxquels la proliferation des progeniteurs est à son maximum. Le choix du stade se fera en fonction du profil d’expression deu gène d’intérêt (un seul stade sera retenu pour les expériences, celui avec le pic d’expression de la protéine d’intérêt) : l’électroporation du matériel génétique d’intérêt en même temps qu’un marqueur fluorescent permettra de suivre la prolifération de ces cellules. Analyse à 14 ou 15 jours de gestation, stade d’étude de la prolifération cellulaire. 2) Etude de la migration cellulaire : Femelles adultes gestantes de 13,5, 14,5 ou 15,5 jours, stades auxquels les neurones migrent le long de la glie pour atteindre leur localisation finale. L’electroporation à ces trois stades permettra de visulaiser la migration de types neuronaux diffèrents (nés à chacun de ces stades). Analyse à 18,5 jours de gestation pour les visualiser grâce à un marqueur fluorescent électroporé en même temps que le matériel génétique à étudier. 3) Etude de la maturation neuronale et connectivité : femelles adultes gestantes de 15,5 jours (stade auquel les neurones callosaux sont générés). L’electroporation des embryons à ce stade permettra d’intégrer le gène à étudier uniquement dans ces neurones et de suivre leur développement grâce à un marqueur fluorescent. Etant donné que les étapes majeures de la formation du corps calleux sont la croissance des axones, le passage dans l’autre hémisphère et la phase terminale de l’invasion par les axones du cortex contralatéral à 2, 4 et à 8 jours après la naissance respectivement et le branchement des axones à 21 jours post-natals, nous prévoyons 4 stades afin d’évaluer ces différentes étapes.
Ciblage thérapeutique d’une population cellulaire impliquée dans la résistance tumorale prostatique chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lésions précancéreuses de la prostate leur sont induites par des injections répétées, puis elles reçoivent pendant 28 jours des composés par injection intrapéritonéale ou par gavage, seuls ou combinés. Le porteur affirme que l'induction n'entraîne "pas de douleur ni de souffrance dans la fenêtre choisie" et n'attend pas d'effet indésirable des composés testés, l'objet étant de cibler une population cellulaire liée à la résistance du cancer. Il indique que des études en culture ont précédé le projet et envisage des organoïdes en trois dimensions s'ils reproduisent fidèlement les tumeurs.
Objectifs
Le cancer de la prostate est la 3ème cause de mortalité par cancer chez l'homme. Dès lors qu'il est invasif, il conduit inévitablément au décès du patient par échappement aux traitements actuels. Notre laboratoire et d'autres ont identifié des populations des cellules épithéliales résistantes aux traitements dans des modèles "souris" qui reproduisent l'évolution du cancer de la prostate chez l'homme. Par des analyses moléculaires, nos collaborateurs ont identifié des molécules régulatrices de cellules résistantes aux traitements. Ces facteurs réprésentent donc des cibles thérapeutiques potentielles pour les formes aggressives du cancer de la prostate. L'efficacité des composés chimiques ciblant ces facteurs a déjà été demontré par nos collaborateurs dans des systèmes cellulaires en culture. Nous aimerions continuer leur charactérisation dans le modèle de souris pour étudier l'effet de ces drogues sur les tumeurs prostatiques aggressives.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'effectuer l'analyse des potentielles cibles thérapeutiques sur un modèle du cancer de la prostate aggressif.
Procédures
Les animaux seront sujets à des traitements par des injections au niveau de l'abdomen pendant 5 jours pour induire l'apparition des lésion précancéreuses prostatiques. Une fois que les lésions précancéreuses deviennent sufisamment avancées (3 ou 5 mois après injection initiale), des injections quotidiennnes d'un des composés en intra-péritonéale pendant 28 jours seront réalisées (30 souris/lot). Un autre composé sera administré aux souris par gavage tous les 3 jours pendant 28 jours (30 souris/lot). Enfin, une thérapie combinée sera également vérifiée avec un composé injecté en intrapéritonéal et l'autre - administré par gavage à la même souris (30 souris/lot). Les injections intra-péritonéales comprennent une préhension de souris et l'injection en elle-même ce qui prend environ 10 secondes. Les gavages comprennent une préhension de souris et le gavage en lui-même, environ 15 secondes sont réquises pour effectuer ce geste par le personnel formé.
Impact sur les animaux
Les injections répétitives peuvent induire l'irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d'injection. Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables liés aux gavages.Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables liés aux composés administrés. L'induction des lésions précancereuses dans notre modèle de souris conduit à une augmentation de taille de prostate mais ne cause pas de douleur ou de souffrance dans la fenêtre choisie pour cette étude d'après les analyses longitudinales de cette lignée effectués dans le cadre du projet antérieur.
Devenir
Tous les animaux de l'étude seront mis à mort et sa prostate sera utilisé pour les analyses moléculaires et cellulaires.
Remplacement
Des études préliminaires ont été ménées par nos collaborateurs sur les modèles cellulaires en culture pour montrer l'efficacité des drogues sur les cellules épithéliales similaires à celles retrouvées dans notre modèle de souris. Nous allons mettre en place des cultures d'organoides (cultures cellulaires en 3D) à partir des souris non-traîtées et si ces derniers reproduisent de manière assez fidèle les charactéristiques moléculaires de nos tumeurs, nous envisageons de les utiliser davantage dans le cadre de ce projet.
Réduction
Nous prévoyons d'utiliser 30 souris par lot expérimental dont 10 souris pour les analyses histologiques, 10 souris pour les analyses de populations cellulaire et 10 souris pour les expériences sur les organoides. A l'aide des calculs statistiques, nous avons estimé que 10 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet de traitement sur les populations cellulaires étudiées.
Raffinement
Immédiatement après et la semaine suivante les injections intra-péritonéales, la souris sera surveillée afin de détecter les signes de douleurs, des irritations ou d'inflammation du site d'injection. De plus, les injections seront réalisées en altérnant les côtés d'injection. Immédiatement après le gavage oral, la souris sera surveillée pour détecter les signes de passage de traitement dans les conduits respiratoires. Suite aux traitements, les souris seront pésées quotidiennement. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage en cas de perte de poids. Tout animal en souffrance sans possibilité de soulagement sera sorti de l'étude et mis à mort.
Choix des espèces
Notre modèle de souris récapitule de manière fidèle l'évolution des lésions précancéreuses et du cancer de la prostate chez l'homme. Etant donné que le but de l'étude est d'évaluer l'efficacité des traitements, nous allons étudier l'effet systémique de ces traitement ce qui est impossible en utilisant les systèmes in vitro. Seuls les souris mâles adultes seront utilisés pour ce projet car l'induction de lésions précancéreuses doit se faire sur des prostates matures et donc après la puberté.
Développement post-natal de la souche KI-L178A : Impact physiopathologique du blocage de l’interaction du tPA avec les récepteurs NMDA.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 240 tuées sans réveil et le reste dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou modéré. Issues d'une lignée génétiquement modifiée bloquant l'interaction entre le tPA et un récepteur cérébral, elles sont caractérisées du stade nouveau-né à l'âge adulte par des tests sensorimoteurs, cognitifs et émotionnels, une partie subissant la pose d'un cathéter et un amincissement du crâne pour l'imagerie du couplage neurovasculaire. Le porteur signale une possible perte de poids, des douleurs post-opératoires et des déficits fonctionnels, l'objet restant de comprendre le rôle physiologique de cette interaction. Il affirme le "caractère de stricte nécessité" des procédures et l'impossibilité de les remplacer.
Objectifs
L'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une sérine protéase, connue pour être synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour intervenir dans la fibrinolyse. Ces propriétés font que le tPA est utilisé comme traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. Le tPA est également considéré comme un neuromodulateur au sein du système nerveux central (SNC). Il est produit par les neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales. Il est impliqué dans de nombreux processus physiologiques. Le tPA est connu pour interagir avec différents récepteurs et que l'interaction entre le tPA et un récepteur d'intérêt (tPA/NMDAR) était impliquée dans certains processus physiologiques et pathologiques (AVC, processus inflammatoires). Afin de mieux comprendre le rôle spécifique de cette interaction et de pouvoir élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à celle-ci, nous avons généré, avec la clinique de la souris une nouvelle souche de souris. La spécificité de cette nouvelle souche est une mutation entrainant le blocage de l’interaction du tPA avec ce récepteur d'intérêt. Ainsi, dans ce projet, nous allons caractériser phénotypiquement ces souris et leurs contrôles en conditions physiologiques au cours du développement (des stades post-nataux jusqu’au stade adulte) et évaluer l’impact du blocage de cette interaction sur l’unité neurovasculaire, par l’étude du couplage neurovasculaire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre l’interaction entre le tPA et notre récepteur d'intérêt dans des processus physiologiques.
Procédures
1-Prélevements : La totalité des animaux seront mise à mort pour prélèvement des organes (n=240, durée de la procédure : 15 minutes). 2/3- Comportements : La totalité des animaux seront soumis (selon les groupes établis) à l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; n=240, durée de la procédure : 30minutes/tests). 4-Couplage Neurovasculaire : Chaque animal fera l'objet d’une pose de cathéter intraveineux pour l'injection de traitements (n=120, durée de la procédure : 15 minutes). Puis le modèle de couplage neurovasculaire sera réalisé (n=120, durée de la procédure : 1 heure). Après un amincissement du crâne, un train de stimulation des vibrisses sera effectué sous imagerie (fUS ou Doppler/Speckle).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du SNC.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (AVC, SEP, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’évaluation du couplage neurovasculaire, les souris seront sous anesthésie générale (isoflurane 2% O2/N2O 30/70 puis médétomidine à 0,1 mg/kg) et sous anesthésie locale (Xylocaine 5%, nébuliseur). Les yeux des souris seront couverts (vitamine A en gel et gel oculaire) afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques, les souris KI-L178A déficientes pour le site d’interaction du tPA sur la sous-unité GluN1 du NMDAR. Ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Les procédure 1 et 2 concernent une évaluation développementale de l’influence du blocage de l’interaction du tPA avec les NMDAR chez les animaux, à savoir des stades P0, P3, P5, P15, P30 et P60. Concernant les autres procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires.
Cartographie fonctionnelle et spatiale du tPA endogène au cerveau, en conditions normales ou ischémiques.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 10 tuées sans réveil. Une lignée génétiquement modifiée rend le tPA cérébral fluorescent, et une partie des souris subit un accident vasculaire cérébral provoqué au laboratoire, suivi d'une imagerie à trois, six, douze et vingt-quatre heures avant le prélèvement du cerveau. Le porteur signale une possible perte de poids, des douleurs post-opératoires, une détresse et des déficits fonctionnels, l'objet étant de cartographier l'origine cellulaire de cette protéase. Il affirme le "caractère de stricte nécessité" du recours à la souris et l'absence de méthode de remplacement.
Objectifs
L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une protéase clé du système fibrinolytique sanguin. Par ses propriétés, le tPA est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. Le tPA est aussi un élément clef dans le système nerveux central (SNC), mais l’élucidation des sources cellulaires de tPA est limitée par un manque d’outils de détection fiable. Cette question est pourtant majeure, pour comprendre comment le tPA favorise ou limite les fonctions et la survie neuronale. L’objectif de cette première étude est de mieux comprendre l’origine cellulaire et les fonctions du tPA dans le SNC par des approches ex vivo/in vivo en se basant sur un nouvel outil original d’étude : une souris génétiquement modifiée, qui d’une part exprime le tPA (associé à une protéine fluorescente) pour le rendre détectable, et d’autre part permet de déléter spécifiquement celui-ci dans les cellules du SNC sans altérer son expression dans les autres compartiments. Cette lignée de souris sera utilisée pour des études histologiques et fonctionnelles, en conditions physiologiques ou dans un modèle d’AVC ischémique développé au laboratoire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles pour comprendre le rôle complexe d’un acteur clef de la physiopathologie cérébrale. Cette meilleure compréhension permettra d’identifier des cibles thérapeutiques pour la prise en charge des patients victimes d’un AVC ischémique.
Procédures
Procédure 1 : Prélèvement sous anesthésie (sans réveil). Procédure 2 : - Chirurgie sous anesthésie ; évaluation des lésions cérébrales et des transformations hémorragiques par imagerie cérébrale : J+3h, J+6h, J+12h, J+24h. - Prélèvement sous anesthésie (sans réveil)
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : une perte de poids/arrêt de la prise alimentaire et de boisson, des douleurs post-opératoires, des signes de détresse, du stress, des déficits fonctionnels.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser autant que possible le nombre minimal d’animaux adéquat, afin de correspondre au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible. Les tests statistiques utilisés pour les résultats de l’étude comprendront des tests non-paramétriques (Test de Kruskal-Wallis, suivi du test post-hoc de Dunn’s) ou un t-test si la distribution des échantillons suit une loi normale (Shapiro-Wilk).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Etude de la maturation du BDNF dans les plexus choroïdes de souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
92 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Elles reçoivent une injection intraveineuse d'une protéase fluorescente, le tPA recombinant, avant un prélèvement de liquide cérébro-spinal, un prélèvement de sang intra-cardiaque et l'extraction du cerveau, une partie servant d'abord à un apprentissage de la pose de cathéter. L'objet est de comprendre si les plexus choroïdes participent à la maturation du BDNF, les retombées pour les patients victimes d'accident vasculaire cérébral ou de sclérose en plaques restant renvoyées à un horizon thérapeutique lointain. Le porteur affirme le "caractère de stricte nécessité" du recours aux souris et l'impossibilité d'un remplacement.
Objectifs
Les plexus choroïdes, structures cérébrales dont le principal rôle est de produire le liquide cérébro-spinal (LCS), sont aussi capables de sécréter de nombreux facteurs neurotrophiques dont le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF). Le BDNF existe sous sa forme précurseur (pro-BDNF) ou, après protéolyse, mature (mBDNF). Malgré leur localisation parfois commune, le mBDNF et le pro-BDNF se distinguent parfois dans leurs (dys)fonctions neurologiques. Différentes protéases semblent capables de réaliser la maturation du pro-BDNF en mBDNF, notamment l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Le tPA est une protéase synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour favoriser la fibrinolyse, grâce à sa capacité à activer le plasminogène en plasmine. Il est également sécrété par les neurones et par d’autres types cellulaires du système nerveux, tels que les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes. Par ses propriétés fibrinolytiques, le tPA recombinant (rtPA) est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. En plus de participer à la maturation du BDNF, l’ARNm (acide ribonucléique messager) du tPA est parfois retrouvé dans les mêmes régions cérébrales que celui du BDNF. De plus, le tPA et le BDNF sont présents dans les mêmes vésicules au niveau des neurones, co-transportés et co-libérés par les dendrites neuronales. Le tPA a précédemment été identifié dans les plexus choroïdes, suggérant également une synthèse endogène de cette protéase dans ces structures. De plus, le tPA vasculaire peut être transporté par des vésicules à travers les plexus choroïdes. Ainsi l’objectif de cette étude est de determiner si les plexus choroïdes peuvent être une zone de maturation et de libération de BDNF et si le tPA (endogène ou exogène) est un acteur de la maturation et/ou de la sécrétion de BDNF dans le LCS par des approches in vivo chez des souris entièrement déficientes en tPA (tPANull) et des souris contrôles (tPAWT).
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales sur la maturation du BDNF dans les plexus choroïdes et sa modulation potentielle par le tPA à des fins thérapeutiques. En effet, une meilleure compréhension de la maturation du BDNF nous aidera d’une part à évaluer le potentiel effet du tPA vasculaire, et d’autre part, à envisager d’améliorer les performances de patients dans des conditions pathologiques, par le couple pro/m-BDNF.
Procédures
L'unique procédure réalisée, consistera en une injection intraveineuse de tPA recombinant couplé à un fluorochrome chez des souris entièrement déficientes en tPA et des souris contrôles, pour suivre son passage du compartiment vasculaire vers le parenchyme cérébral et détecter sa présence en immunohistochimie à différents temps. De même, du LCS et du sang seront prélevés pour réaliser diverses études protéiques et transcriptomiques. - Souris Swiss : phase d’apprentissage (Pose d’un cathéter veineux et prélèvement intra-cisternal de LCS). - Souris contrôles : injection I.V saline ou rtPA. - Souris déficiente : injection I.V saline ou rtPA. Mise à mort des souris de la phase d’apprentissage, immédiatement après le prélèvement intra-cisternal. Mise à mort des souris contrôles/déficientes à différents temps post injection : +10 minutes, à +30 minutes et à +60 minutes. Pour chaque animal : un prélèvement de LCS sera effectué, puis un prélèvement de sang en intra-cardiaque et enfin le cerveau sera extrait.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour cette procédure sans réveil : du stress lié à la manipulation des animaux.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (AVC, SEP, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, la procédure expérimentale décrite dans ce projet a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards aux normes. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront pesés tous les jours et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques suivant l’approche chirurgicale. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’ensemble des procédures, les souris seront sous anesthésie générale (et sous anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir leur déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature.
Examens IRM sur modèles rongeurs en provenance d’établissements utilisateurs extérieurs
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 200
600 rongeurs, 400 souris et 200 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal peut subir jusqu'à six examens d'IRM sous anesthésie gazeuse de quatre heures, parfois avec injection d'un produit de contraste au gadolinium, le porteur signalant un risque de non-réveil après la narcose. Il s'agit d'un service de plateforme mutualisant un appareil d'imagerie pour des équipes extérieures, chaque animal étant ensuite réintégré au protocole autorisé dont il relève, où les procédures se poursuivent. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ou in silico ne permet d'étudier le cerveau entier et présente l'IRM répétée comme un moyen de réduire le nombre d'animaux.
Objectifs
L'imagerie par résonance magnétique (IRM) du petit animal est une technique non invasive et non destructive des tissus in vivo. Elle permet l'étude longitudinale et tri-dimensionnelle notamment du cerveau normal et pathologique. Les divers types de contrastes et de modalités structurelles, fonctionnelles et spectroscopiques font de l'IRM une technique de choix pour la recherche en neurosciences expérimentales. Les applications de l'IRM expérimentale sont notamment le phénotypage d'une cohorte d'animaux, le suivi longitudinal de la progression d'une maladie ou d'un traitement thérapeutique, la validation de nouveaux biomarqueurs d'imagerie. Une IRM à très haut champ magnétique ainsi que des antennes dédiées à l’imagerie du cerveau de souris et de rat sont des déquipements de pointe qui peuvent apporter des informations déterminantes dans des projets scientifiques variés impliquant le petit animal via l’utilisation d’un large spectre de protocoles d’imagerie standards mais aussi avancés et innovants. Ce projet a pour but de faciliter la mise en place de collaborations avec des équipes externes pour réaliser des études d’imagerie IRM sur des modèles rongeurs de diverses pathologies ou des modèles de rongeurs sains afin d’investiguer des questions plus fondamentales sur le fonctionnement cérébral. Pour atteindre cet objectif, des expériences sur animaux anesthésiés doivent être menées.
Bénéfices attendus
Ce projet présente des bénéfices scientifiques à long terme aussi bien pour la plateforme que pour les équipes utilisatrices. Du point de vue scientifique, il permet d’intégrer de nouvelles données d’imagerie pour répondre à une question scientifique précise (expliquée dans les projets scientifiques autorisés par le ministère de l’étude concernée) et aider à la compréhension de pathologie humaine sur les modèles animaux en vue d’un traitement thérapeutique ou de l’aide au diagnostic. D’autre part, dans le cas d’étude longitudinale l’imagerie par résonance magnétique (IRM) présente un grand intérêt en réduisant le nombre d’animaux.
Procédures
Les animaux, 600 au total incluant 400 souris et 200 rats, seront soumis à des examens d'imagerie par résonance magnétique (IRM) sous anesthésie gazeuse avec ou sans injection intraveineuse dans la veine de la queue d’un agent de contraste à base de gadolinium selon le besoin de l’étude. La procédure IRM dure 4h maximum (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal). Les examens pourront être répétés au maximum 6 fois sur le même animal avec un délai de 72h minimum de récupération.
Impact sur les animaux
Différents risques sont identifiés : (i) Risques liés à l’anesthésie: stress thermique (hypothermie), difficultés cardio-respiratoires, non récupération de la vigilance suite à la narcose ; (ii) Risques liés à l’injection intraveineuse de produit de contraste : douleur au point d’injection , hématome, saignement possible très localement ; (iii) Risques liés au transport (stress) lors du changement d’établissement utilisateur.
Devenir
A l’issue des examens IRM (imagerie par résonance magnétique), les animaux seront réintégrés dans leur hébergement d’origine pour réaliser les procédures décrites dans le projet scientifique global autorisé par le ministère de l’étude concernée. Les examens IRM ne couvrent qu'une étape dans le cadre du projet scientifique global. Il s'agit ici d'une utilisation continue des animaux et non d'une réutilisation car les animaux ne peuvent être remplacés par d'autres. Ils sont inclus dans un projet scientifique global autorisé par le ministère et subissent une suite de procédures (avant et après les examens IRM) décrites dans le projet global.
Remplacement
Il n’existe pas d'alternatives (études in vitro, in silico ou sur animaux invertébrés) qui permettent d’étudier des mécanismes cellulaires, moléculaires, métaboliques complexes à l’échelle global du cerveau. Le rongeur est une des espèces les plus appropriées pour les études d'imagerie par résonance magnétique (IRM) dans un contexte neurologique, d’autant plus que l’IRM permet l’étude longitudinale des paramètres d’intérêt de façon non invasive.
Réduction
600 animaux au total sont inclus dans le projet dont 400 souris et 200 rats. Le nombre d’animaux est réduit au maximum. Des études pilotes et tests statistiques ont préalablement étaient réalisés pour estimer le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une puissance statistique satisfaisante pour chaque étude. Les tests statistiques seront dépendants des différentes études qui auront une phase d’imagerie dans leurs protocoles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans leur établissement utilisateur avec les mesures de raffinement et conditions d’hébergement décrites dans projet initial autorisé par le ministère. Les animaux sont transportés de leur lieu d’hébergement initial vers le laboratoire au calme dans une cage adaptée avec de la nourriture, de l’eau à dispositions des animaux ainsi que l’enrichissement mis en place dans leur hébergement d’origine. L’arrivée se fait au niveau du quai de livraison où l’expérimentateur réalisant les IRM (imagerie par résonance magnétique) amène les animaux dans la pièce de préparation à l’aide d’un chariot en empruntant un monte charge. Les animaux sont laissés dans leur cage pendant 30 min à 1h dans la pièce de préparation, et une vérification de l’état des animaux (état du poil, comportement dans la cage, position des oreilles et du museau) est réalisée à la fois par l’expérimentateur réalisant les IRM et une personne responsable des animaux de l’établissement extérieur. La tête des animaux est maintenue immobile par un système de contention (barres d’oreille et mors à dent) intégré au berceau. Un anesthésique local est appliqué au niveau des points d'appui des barres d'oreilles, un gel ophtalmique est appliqué pour limiter la déshydratation oculaire. De la vaseline sera également appliquée avant d’introduire la sonde rectale. Tout au long de l’examen IRM (4h maximum), la profondeur de narcose et la température interne de l'animal sont contrôlées. La procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal sorti pour vérification en cas de souffrance/angoisse chez les animaux pendant l’IRM, repérée par : une respiration anormale (trop rapide ou trop basse malgré l'ajustement d'anesthésique) ou une température anormale (trop élevée ou trop basse malgré l'ajustement de la consigne de température du bain marie ou de la modification de l’anesthésie). Nous accorderons également une grande importance à la période de réveil (chambre thermostatée, stimulation régulière de l’animal). Une personne référente des animaux à imager sera présente de façon à guider l’expérimentateur qui réalise l’IRM et à contrôler au mieux l’anesthésie de l’induction au réveil complet de l’animal.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les principales espèces utilisées sur notre plateforme, leur taille permet de les utiliser dans ce type de machine pour acquérir des séquences capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribue à répondre aux questions scientifiques posées. De plus, les rongeurs permettent l’étude de comportements complexes et de nombreux modèles de rongeurs génétiquement modifiés sont développés pour mimer des pathologies humaines. En raison de sa taille, le rat possède un cerveau plus facile à imager (plus gros). Il est donc plus facile d’obtenir un meilleur signal chez le rat, notamment dans des zones cérébrales de petite taille. Cependant, de nombreuses pathologies cérébrales sont préférentiellement induites et étudiées chez la souris que nous pouvons imagées plus aisément avec des antennes adaptées. Le stade de développement sera décrit dans le projet initial autorisé par le ministère de l’étude concernée. L’âge minimum requis pour passer un examen par imagerie par résonance magnétique (IRM) est fixé à 3 semaines (rats et souris confondus), en raison des contraintes de berceau IRM que nous possédons à la plateforme IRM et de l’anesthésie gazeuse qui sera optimale sur des animaux sevrés qui ont acquis une capacité respiratoire suffisante. De même pour la récupération, elle sera plus facile si on travaille sur des animaux qui sont sevrés.
Développement d’outils pour la thérapie des cancers de la prostate résistants à la castration
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 530 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous la peau de cellules tumorales de prostate humaine, 180 d'entre elles subissant en outre une castration, avant l'administration répétée de composés de thérapie génique pendant onze semaines et le prélèvement terminal du sang et des tumeurs. Le porteur décrit une technologie "prometteuse" relevant de la médecine de précision, dont les bénéfices pour les patients sont renvoyés au futur, l'étape immédiate étant de mesurer l'efficacité de composés déjà criblés in vitro. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne peut se substituer à la souris pour cette phase préclinique.
Objectifs
Le cancer de la prostate est l'un des cancers les plus courants dans les pays développés. Les patients atteints d'un cancer localisé peuvent être traités par chirurgie ou radiothérapie, tandis que la castration est utilisée comme traitement initial pour les patients atteints d'une maladie avancée. Bien que la plupart des patients répondent initialement à cette thérapie hormonale, une résistance peut apparaître dans les deux ans, ce qui signifie que le cancer de la prostate devient résistant à la castration. Les chimiothérapies actuelles ne permettent qu'une survie de 12 à 18 mois, provoquant 9000 décès par an et faisant de ce cancer l’un des plus mortels. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de cancer de la prostate résistant à la castration. Une stratégie appelée thérapie d'acides nucléiques ou thérapie génique peut améliorer les traitements actuels en ciblant les gènes actifs après la castration pour retarder ou empêcher l'apparition de la résistance aux traitements. La thérapie génique présente un intérêt thérapeutique pour notre laboratoire. Nous avons développé des composés qui ont été utilisés pour induire la mort des cellules tumorales in vitro et pour réduire la progression tumorale in vivo chez la souris. Notre laboratoire souhaite réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de nos composés de troisième génération. Les modèles que nous utiliserons sont basés sur la transplantation de cellules de prostate humaines résistantes aux traitements à des souris immunodéficientes, capables de mimer la maladie observée en clinique. Il n'existe actuellement aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l'expérimentation animale durant cette étape préclinique.
Bénéfices attendus
La thérapeutique génique est de plus en plus considérée comme une solution prometteuse pour la prise en charge des cancers de la prostate. Elle s'intègre dans la médecine de précision et permet de fabriquer un traitement individualisé en quelques semaines, pour une guérison plus rapide et efficace. Contrairement aux médicaments classiques, qui peuvent prendre jusqu'à dix ans pour être développés et cibler spécifiquement la mutation génétique responsable de la tumeur, la technologie génique agit directement sur des gènes impliqués dans la prolifération tumorale. Notre technologie est conçue pour contourner les principales limites de l'expansion du marché des composés géniques, notamment la faible biodisponibilité, la toxicité et la difficulté à atteindre les tissus cibles. En utilisant des lipides comme vecteurs de délivrance des composés géniques, nous sommes en mesure d'augmenter la stabilité, la solubilité et la spécificité de nos composés. De plus, notre technologie offre également la possibilité de co-délivrer sélectivement des agents diagnostiques ou thérapeutiques, ce qui ouvre de nouvelles perspectives pour la médecine personnalisée. En résumé, notre technologie représentent une avancée majeure dans la lutte contre les cancers de la prostate, en offrant une approche plus ciblée, efficace et personnalisée pour le traitement de cette maladie complexe.
Procédures
Les interventions sont les suivantes : a) Xénogreffe sous-cutanée : Les 1530 animaux de ce projet seront injectés sous-cutanément avec des cellules tumorales prostatiques sous anesthésie. Cette procédure dure environ 3 minutes par animal. b) Castration : Cette procédure concerne un groupe de 180 souris. Elle sera réalisée directement après la xénogreffe pour les animaux concernés, sous anesthésie. La durée maximale de la castration est de 30 minutes par souris. c) Suivi par imagerie : Cette procédure sera effectuée pour un groupe de 180 souris. La fréquence des imageries dépendra de la vitesse de croissance tumorale : une fois par semaine les deux premières semaines, puis une imagerie tous les 15 jours pendant 11 semaines de traitement. Le temps d'imagerie sera adapté à chaque modèle de tumeur. d) Traitement : L'administration des composés thérapeutiques se fera pendant 7 jours consécutifs pour les 450 souris dans la procédure d'évaluation de la spécificité des composés, et 3 fois par semaine pendant 11 semaines pour les 1080 souris dans la procédure d'évaluation de l'efficacité thérapeutique. Nous utiliserons l'injection intrapéritonéale, qui ne durera que quelques secondes par souris et ne nécessitera pas d'anesthésie. À la fin de l'étude, ainsi qu'en cours d'étude si nécessaire en fonction des critères limites, les souris seront euthanasiées et le sang ainsi que les tumeurs de tous les individus seront collectés.
Impact sur les animaux
L'injection de cellules tumorales chez les souris peut causer des effets indésirables tels que des douleurs, une faiblesse générale et une perte de poids. De même, l'injection d'oligonucléotides peut également provoquer des réactions indésirables telles que des inflammations et des douleurs au site d'injection. En outre, la castration peut également avoir des effets négatifs sur le comportement et la santé des souris, tels que des changements hormonaux et des modifications de l'activité locomotrice. Les modalités d'imagerie choisi n'entrainent pas d'algie chez l'animal. Cependant, l'induction anesthésique est une source de stress potentiel avant et pendant l'imagerie et l'acte chirurgical.
Devenir
À la fin de l'étude, les souris seront euthanasiées. Le sang et les tumeurs de tous les individus seront collectés pour des analyses post-mortem afin de contrôler la toxicité de nos composés et de valider la spécificité de chaque composé testé.
Remplacement
Afin de vérifier la pertinence des composés développés dans le laboratoire, le premier criblage sera effectué in vitro sur des modèles cellulaires en culture. Seules les composés positives démontrant leur efficacité in vitro seront utilisées dans les études in vivo du présent projet. Cependant, le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie. La souris immunodéficiente est un modèle de choix puisqu'elle permet le développement et le suivi de lignées tumorales humaines, de mimer la maladie observée en clinique. L'induction des tumeurs par xénogreffes chez la souris est une technique maîtrisée et documentée. Il n'existe actuellement aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l'expérimentation animale durant cette étape préclinique.
Réduction
Pour chacun des composés, nous nous limiterons au nombre minimum d'animaux tout en restant une statistique fiable permettant de caractériser leur efficacité sur les modèles de xénogreffes de cellules tumorales de cancer de la prostate. Nos approches pour évaluer l'efficacité de chaque composé étudié comprendront des groupes témoins. Afin de réduire au minimum le nombre d'animaux et dès que cela sera possible, ces groupes témoins seront communs à plusieurs tests d'efficacité. Par ailleurs, nous réaliserons des études pilotes sur un petit nombre d'animaux par groupe afin de garantir une bonne tolérance aux molécules et d'adapter les doses à administrer avant de passer aux tests d'évaluation d'efficacité thérapeutique sur un nombre plus important d'animaux.
Raffinement
Nos études in vivo seront réalisées de manière séquentielle pour déterminer l'action des drogues sur le développement tumoral. Des études pilotes seront menées sur un petit nombre d'animaux afin de vérifier leur tolérance aux molécules et d'ajuster les doses à administrer à notre souche de souris. De plus, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant des méthodes non invasives sur les animaux. Enfin, nous améliorerons les conditions d'hébergement des animaux en proposant de la litière enrichie (copeaux de bois compactés et/ou coton) et en maintenant les souris en groupe de 4 à 5 individus pour éviter le stress lié à l'isolement. Les souris seront hébergées dans des cages ventilées, dans une pièce avec des cycles de lumière obscurité de 12 heures, où la température et l'hygrométrie seront constamment contrôlées. Elles auront un accès libre à la nourriture et à l'eau. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d'intervenir rapidement dès le moindre signe de souffrance. Pour minimiser la souffrance et le stress des animaux, les manipulations pourront être effectuées sous anesthésie gazeuse pour un endormissement et un réveil rapides, et une analgésie sera administrée en cas de signes de douleur. Tout signe ou comportement anormal tels que des difficultés respiratoires, une souris prostrée ou en retrait, ou une perte de poids supérieure à 20% du poids initial des animaux entraînera la fin de l'expérimentation et leur euthanasie immédiate afin d'éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie (ici le cancer de la prostate). Sur cette base, en adéquation avec nos objectifs, le modèle murin apparaît le plus pertinent. La xénogreffe désigne la transplantation d'un greffon d'un individu ou d'une lignée d'une espèce donnée chez un individu hôte d'une espèce différente. L'accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de nos approches. En effet, un contexte immunitaire permissif est essentiel pour favoriser la prise tumorale et éviter la réaction de l'hôte vis-à-vis du greffon. Pour la réalisation de xénogreffes de lignées tumorales humaines, cette espèce constitue le modèle in vivo le plus adapté : la maîtrise zootechnique (élevage/confinement); la praticabilité chirurgicale (technicité, accessibilité du site sous-cutané ou orthotopique); les connaissances actuelles et la diffusion dans le domaine scientifique (littérature, collaborations). Les animaux utilisés dans ce projet sont des souris mâles âgées de 6 semaines qui ont atteint leur maturité sexuelle, afin de garantir la sécrétion d'hormones masculines qui ont une influence sur le développement du cancer de la prostate chez l'homme.