Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Production in vivo d’un anticorps monoclonal dirigé contre un marqueur de l’hémostase destiné à l’industrie du diagnostic in vitro
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
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- Système respiratoire
- Système urogénital
34 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de pristane puis d'hybridomes qui déclenchent une tumeur et une accumulation de liquide d'ascite dans l'abdomen, décrite comme source de détresse, avant un prélèvement terminal. Le projet produit in vivo un anticorps monoclonal destiné à des kits de diagnostic industriels, le porteur affirmant que la production in vitro n'a pas été validée et concluant à une "nécessité incontournable". Le recours à 34 000 souris pour produire un anticorps par la méthode d'ascite ressort comme l'élément marquant de ce projet.
Objectifs
L’objectif du projet est de produire in vivo chez la souris un anticorps monoclonal (Mab) ultra-spécifique d’un produit terminal de la dégradation de la fibrine. Ce Mab entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs IVD exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique et la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif.
Bénéfices attendus
L’obtention in vivo de cet anticorps monoclonal permettra le maintien de la production de kits de diagnostic essentiels à la définition d’un statut clinique. Cet anticorps entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs de diagnostic in vitro (IVD) exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique avec la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. Il est à noter que ces kits, ont joué un rôle clé dans la crise sanitaire liée à la maladie à coronavirus (COVID-19). Les instances scientifiques ont permis de définir un lien entre le taux du produit de dégradation de la fibrine dosé par les kits dépendant de cet anticorps et la gravité de la maladie COVID-19 (mauvais pronostic pour le patient).
Procédures
Mise en quarantaine des souris dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation Après respect d'une semaine de quarantaine, à J1 les souris reçoivent une injection d’un agent d’amorçage. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de cet agent est précédée 30 minutes avant par l’injection en sous-cutanée d’un antalgique. A J22, après expansion clonale, les hybridomes sont injectés en IP unique à raison de 4.106 cellules/souris. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. Suivi quotidien des animaux. Les animaux présentant des signes d’inconfort sont euthanasiés et ponctionnés de manière éthique. Récupération unique et terminale d’ascite par paracentèse dès apparition. Injection IP ou SC, durée de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Chez l'animal, une douleur et une détresse peuvent résulter de l'injection intrapéritonéale (IP) de l'amorce (pristane), de l'inoculation IP des cellules tumorales, et de la croissance des cellules tumorales dans la cavité abdominale (effets primaires) sous forme de plaques péritonéales qui s'infiltrent dans la paroi abdominale ou les organes abdominaux. Plus précisément, il semble que l'injection par voie IP produit un niveau de détresse modéré; on décrit que la production d'ascite et la croissance de tumeurs causent de la souffrance chez les patients humains. De plus, les changements pathophysiologiques et pathologiques complexes peuvent provoquer une détresse chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont concernés, les souris sont toutes euthanasiées en fin de protocole. L’ensemble des animaux inclus dans un cycle de production sont euthanasiés avant paracentèse.
Remplacement
L’alternative la plus logique pour la production de cet anticorps serait une production in vitro. Malheureusement, à ce jour, l’anticorps n’a pu être caractérisé techniquement et validé cliniquement que sur des lots issus de production en condition in vivo. L’ensemble des résultats concernant la capacité de certains clones à produire in vitro les mêmes anticorps selon le même cahier des charges requis pour les dispositifs IVD concernés, démontre la nécessité incontournable de poursuivre la production de ce Mab en condition in vivo (incapacité des hybridomes à tolérer un transfert en extension d’échelles notamment de rendement de production et ou de qualité fonctionnelles des anticorps obtenus). Les besoins de santé publique de ces dispositifs IVD exploitant cet anticorps, et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. La société nous demandant de réaliser des productions d'anticorps in vivo, est consciente de l’aspect éthique de l’expérimentation animale et s'engage à ne recourir à la production in vivo que dans des cas de stricte nécessité. En parallèle, de ce protocole, les essais de passage en in vitro se poursuivront notamment via la mise en œuvre d’essai de tris des clones présentant les taux de sécrétion d’immunoglobulines les plus élevés. Il est également à noter que pour les nouvelles versions de cette gamme de produit, les anticorps utilisés seront fabriqués avec des anticorps produits uniquement avec un process « in-vitro » (développement en cours)
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire. Nous pourrons nous baser sur l’expérience acquise sur les anciens protocoles réalisés sur ces clones. L’utilisation de souris anciennes reproductrices permet également de ne pas utiliser d’animaux jeunes spécifiques au projet, mais d'utiliser des souris qui étaient vouées à être euthanasiées. Les expériences de sélection des clones possédant les meilleures capacités de sécrétion, devraient permettre à minima de réduire le nombre d’animaux engagés par protocole. La dernière demande d’autorisation concernait 21000 souris par an, la nouvelle demande impliquerait 17000 individus annuellement, soit une diminution d’environ 19%. A ce jour 1 souris permet la réalisation de 1400 tests.
Raffinement
Les recommandations (issue de CNREEA et parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris seront appliquées. L’unique paracentèse sera réalisée après euthanasie de l’animal, afin de limiter les manipulations de l’animal toujours sources de stress. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de l’agent d’amorçage est précédée 30 minutes avant par l’injection d’un antalgique. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 2 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion…) et signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 3 niveaux : normal, souffrance légère mise en œuvre d’antalgies à envisager, souffrance sévère arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les animaux bénéficient d'un hébergement, d’un environnement, d'une certaine liberté de mouvement, de nourriture, d'eau et de soins appropriés à leur santé et à leur bien-être. Afin de faciliter la sociabilité des souris, elles ne sont pas isolées dans une cage et des objets d'enrichissement sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont euthanasiés et prélevés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore.
Choix des espèces
Les hybridomes concernés ont été obtenus par fusion de splénocytes de souris et de myélome de souris, selon la méthode de Milstein et al (1975). Les clones obtenus n’ont jamais pu être produits autrement que chez la souris. Le Mab obtenu et validé dans les dispositifs IVD concernés, est un Mab obtenu et produit chez la souris. Les souris doivent être de même souche (syngéniques) à la fois pour l'immunisation en vue de la création du clone d'hybridome et pour la production subséquente de Mab, de sorte que les tissus utilisés soient histocompatibles. Les souris Balb/c représentent le meilleur choix puisque les cellules myélomateuses parentales employées dans le processus de fusion proviennent de cette souche. Les souris utilisées préalablement pour la reproduction présentent l’avantage pour la production de l'ascite parce que leur musculature abdominale a déjà été étirée (Falkenburg, 1998). Les animaux utilisés sont de préférence des femelles adultes Balb/C (anciennes reproductrices), car elles présentent une prédisposition physiologique favorisant une dilatation de leur paroi abdominale en diminuant le risque de compression d‘organe (respect des 3R).
Variations neurobiologiques en lien avec des différences de comportements sociaux chez plusieurs espèces de macaques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Macaques rhésus : 40
Autres primates : 40
120 macaques de trois espèces vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés, chaque animal subissant un examen IRM d'une à quatre heures sous anesthésie générale. Le projet compare la neuroanatomie et les comportements sociaux des espèces pour étudier l'hypothèse du "cerveau social" des primates. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale et que les rongeurs ne conviennent pas, l'étude de cerveaux post-mortem ne suffisant pas selon lui. Les retombées annoncées relèvent de la connaissance fondamentale, avec la constitution d'atlas anatomiques.
Objectifs
L'hypothèse du "cerveau social" évoque la possibilité que certaines parties du cerveau des primates soient dédiées à la gestion des interactions sociales et la représentation abstraite de la structure du groupe social. En étudiant l'évolution biologique du système nerveux de différentes espèces de macaques montrant des comportements sociaux différents (ici Macaca mulatta, M. fascicularis et M. tonkeana), le but ultime de nos recherches est de participer à l'étude du fonctionnement et des origines du cerveau social des primates. À terme, notre projet de recherche permettra de comparer les comportements et la neuroanatomie de différentes espèces de primates non-humains. Un maximum de 120 macaques (jusqu’à 40 individus de chaque espèce de macaques) sera étudié. Leurs comportements sociaux seront étudiés par des observations éthologiques classiques et des prises de données semi-automatisées. Leur neuroanatomie fonctionnelle sera étudiée par une technique d’imagerie par résonnance magéntique peu invasive (IRM). Des études complémentaires sont déjà effectuées par notre équipe sur des échantillons post-mortem de cerveaux de macaques. L’étude de macaques vivants est indispensable pour étudier, entre autres, l’activité cérébrale au repos des macaques (accessible dans le cadre d'acquisitions de données IRM chez le primate non-humain anesthésié). Nos recherches permettront de mieux comprendre l’architecture du système nerveux des primates en relation avec leurs comportements sociaux. Ces connaissances fondamentales pourraient apporter de nouvelles perspectives concernant les cibles biologiques dans la prise en charge des maladies mentales humaines se caractérisant par des comportements sociaux inadaptés à la vie en société.
Bénéfices attendus
Les retombées potentielles de ce projet scientifique seront multiples. Elles permettront de mieux comprendre l’évolution et l’architecture du système nerveux des primates en relation avec leurs comportements sociaux. D’un point de vue fondamental, elles permettront d’émettre de nouvelles hypothèses concernant les causes biologiques des différences de socialité observées au sein du genre Macaca. Nos recherches participeront à établir des atlas de l’anatomie du cerveau pour des espèces de macaques, encore actuellement inconnue comme c’est le cas du macaque de Tonkean. D’un point de vue pratique, nos recherches pourraient nourrir de nouvelles perspectives quant aux cibles biologiques en lien avec des maladies mentales humaines, se caractérisant par des comportements sociaux maladaptés à la vie en société.
Procédures
Les animaux seront soumis à un examen IRM non invasif d’une à quatre heures sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Toutes les nuisances sont considérées comme légères. Les nuisances sont limitées au stress, en lien avec la capture, séparation des congénères, au transport et à l’anesthésie (nausée, hypothermie, désorientation).
Devenir
Les animaux impliqués dans ce projet de recherche vivent en semi-liberté en groupe naturalistique multi-mâles, multi-femelles. L’utilisation des animaux dans le présent projet n’a pas d’impact sur leur santé physique et mentale future, d’où la possibilité de les garder en vie.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non-animale à ce projet. Au vu des différences comportementales, neuroanatomiques et phylogénétiques, l’utilisation de rongeurs n’est pas une alternative envisageable pour décrire les différences de neuroanatomie fonctionelle corrélant avec les différences de socialité au sein du genre Macaca. Notre équipe étudie aussi des échantillons de cerveau post-mortem de différentes espèces de macaques. Toutefois, cette étude post-mortem ne permet pas d’acquérir des données de neuroanatomie fonctionelle, impliquant ainsi la nécessité d’étudier des individus vivants dont nous pouvons observer les comportements sociaux et les corréler aux images neuroanatomiques.
Réduction
D’après la littérature, un nombre raisonnable d’individus pour étudier la neuroanatomie d’une espèce de primates non-humains, mâles et femelles, est de 30-40 individus. Notre projet impliquera donc un maximum de 40 individus par espèce considérée. Nos données seront comparées aux acquisitions IRM existante en libre accès web. La neuroanatomie de certaines espèces que nous étudierons (macaques rhésus et macaques crabiers) est déjà décrite dans la littérature. Toutefois, ces études concernent des sujets vivants dans des environnements peu ouverts et au sein de groupes sociaux peu nombreux – ce qui influence la neuroanatomie des individus. Les aménagements du site offrent des configurations de groupes sociaux unique, permettant ainsi d’avoir accès à des données neuroanatomiques plus fidèles et plus représentatives des conditions écologiques dans lesquelles ces animaux vivent à l’état sauvage.
Raffinement
Les animaux vivent en groupe social dans des parcs en semi-liberté. L’examen d’imagerie (IRM) auquel ils sont soumis est non invasif et sera réalisé sous anesthésie générale avec surveillance vétérinaire. L’examen IRM n’occasionne pas de capture supplémentaire des animaux, il sera réalisé à la faveur de leur contrôle sanitaire périodique.
Choix des espèces
Afin d'étudier l'évolution du cerveau social des primates, il est nécessaire d'impliquer différentes espèces de primates non-humains. En effet, les différences interspécifiques ont une importance cruciale concernant des mécanismes d'évolution biologique étudiés. De plus, nous savons qu'il existe un lien entre la phylogénie et les comportements sociaux au sein du genre Macaca. Ainsi, il existerait une dimension héréditaire et génétique, entre socialité et neuroanatomie chez ces différentes espèces de macaques. Par conséquent, l’utilisation du modèle macaque en IRM est indispensable et pleinement justifié par la nature et les objectifs de notre projet de recherche. Les animaux seront impliqués dans notre procédure à partir de l’âge de 18 mois, ce qui correspond à un âge supérieur où le sujet serait sevré en condition naturelle.
Rôle des glucocorticoïdes dans la régénération musculaire
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés subissent une amputation de la première phalange pour génotypage, puis les animaux reçoivent des injections de tamoxifène et une injection de cardiotoxine qui détruit le muscle, dont on étudie ensuite la régénération sous glucocorticoïdes. Le porteur affirme que le recours à un "organisme entier" est nécessaire parce que cellules immunitaires et hormones interviennent dans la régénération, et indique n'attendre aucun effet secondaire majeur. Les bénéfices thérapeutiques évoqués restent une compréhension des mécanismes, sans application décrite à court terme.
Objectifs
Dans le cadre d’une blessure les glucocorticoïdes comme la cortisone peuvent être prescris pour leurs effets anti-inflammatoires efficaces mais dont la prise prolongée peut induire une perte de la masse musculaire. Les études sur les effets des glucocorticoïdes réalisées in vitro sur des cellules en culture montrent des résultats souvent contradictoires. Ainsi, malgré cette utilisation courante le mode d’action précis grâce auquel les glucocorticoïdes produisent leurs effets bénéfiques comme délétères sont encore mal connus. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les glucocorticoïdes sont impliqués dans la dégénérescence et la régénération musculaire via certain type de cellule immunitaire. Cette étude permettra aussi de mieux décrire, in vivo, le lien entre une partie du système immunitaire et les cellules souches du muscle. Enfin, grâce à ce projet nous espérons pouvoir identifier le meilleur moment pour administrer les traitements aux glucocorticoïdes en évitant les effets secondaires indésirables.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle des glucocorticoïdes dans des conditions physiologiques de régénération musculaire. Ce projet permettra aussi de décrire les effets induits par des traitements aux glucocorticoïdes. Nous pourrons ainsi disséquer les conséquences d’un potentiel dysfonctionnement du système immunitaire sur les processus d’inflammation mais aussi les conséquences sur la réparation des fibres musculaires. En comprenant les cibles et le rôle précis des glucocorticoïdes des traitements pourront être développer pour cibler un type cellulaire en particulier et être administrés au moment adéquat.
Procédures
Les animaux issus des croisements sont identifiés par tatouage au doigt ou amputation de la première phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées. Tatouage et biopsie sont alors non douloureux. La phalangéctomie nous permettra de récupérer une biopsie des animaux afin de déterminer leurs génotypes. Les animaux vigiles, c’est-à-dire non anesthésiés, seront soumis principalement des injections de différents types ne nécessitant pas de contention de plus de 30 secondes. Une première vague d’injection de tamoxifène, permettant l’invalidation du récepteur des glucocorticoïdes, sera réalisée une fois par jour pendant 5 jours. Ensuite, l’induction de la lésion musculaire se fera sur des animaux endormis à l’aide d’un gaz à savoir l’isoflurane. Les animaux endormis recevront une injection unique de cardiotoxine dans chacun des tibias. Une fois l’animal endormi cette procédure dure environ 1,5 minute. Durant la régénération musculaire, les traitements par glucocorticoïdes seront réalisés grâce à une injection par jour sur une période allant de 1 à 7 jours maximum. L’injection unique d’une molécule, pour visualiser la prolifération cellulaire, sera réalisée par injection sur des animaux vigiles deux heures avant leur mise à mort. Le prélèvement de sang sera réalisé via l’artère temporo-mandibulaire sur des animaux vigiles juste avant leur mise à mort et représentera 25% de leur volume corporel. Enfin, pour l’anesthésie létale les animaux vigiles seront injectés avec un mélange de xylazine/kétamine afin de subir une chirurgie. Cette dernière consiste à réaliser une perfusion de paraformaldéhyde intracardiaque cœur afin que le système circulatoire permette au fixateur d’atteindre tous les organes. Cette technique permet de fixer et préserver les tissus de manière homogène.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. La phalangéctomie et le tatouage sont des techniques d'identification utilisées depuis plusieurs décénies dans le laboratoire et ne présentent pas d'effets secondaires majeurs. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant. En effet, 7 jours de traitement aux glucocorticoïdes ne provoquent normalement pas d’atrophie musculaire. Ainsi, nous n’attendons pas d’effets secondaires majeurs causés les molécules injectées. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).
Devenir
A l'issue de la procédure tous les animaux expérimentaux seront mis à mort pour réaliser des analyses moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes et synthétiques (dexaméthasone) sur la régénération musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, lors de la régénération musculaire, les cellules du système immunitaire provenant de la circulation sanguine sont impliquées mais aussi d’autres facteurs comme les hormones. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un animal entier afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte (exemple : niveaux d’hormones circulantes). Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production d’un nombre assez important d’individu, contribuant à la production de résultats significatifs.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire sur la régénération musculaire ont mené à une bonne connaissance du modèle ainsi que des traitements à réalisés. Ainsi, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement et disposons de protocoles précis pour chaque expérimentation. Par ailleurs, les deux pattes des souris seront systématiquement utilisées afin de réduire de moitié le nombre d'animaux requis.
Raffinement
Dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Néanmoins, si l’un des animaux atteint un point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort par afin d'éviter toute souffrance inutile. Par ailleurs, après injection, les souris seront attentivement suivies. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …). De plus, le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’administration du composé induisant un dommage musculaire. Enfin, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement pouvant entrainer des effets secondaires délétères sur les animaux.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude. Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront des mâles entre 10 et 15 semaines pour éviter les variations causées par la puberté. La régénération musculaire se faisant en plusieurs étapes, nous effectuerons une cinétique. Dans un premier temps, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la dégénérescence musculaire et l’inflammation en analysant les souris à 1, 3 et 5 jours après injection de la cardiotoxine. Puis, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la régénération musculaire et les mécanismes anti-inflammatoire en analysant les animaux à 7, 14, 28 et 60 jours après l’injection de la cardiotoxine. Un groupe d’animaux sera également analysé en l’absence de traitement à la cardiotoxine, constituant ainsi le jour 0. Pour la majorité des expérimentations nous utiliserons les souris de la lignée constitutive ne nécessitant pas d’injection au tamoxifène. Néanmoins, si nous observons des phénotypes sur ces souris, nous voudrions exclure une cause développementale c’est pour cela qu’il nous sera indispensable d’utiliser une seconde lignée inductible. Il est difficile à cette étape de prévoir à quel stade nous utiliserons ces souris car cela dépendra du phénotype des souris issues de la lignée constitutive.
Optimisation de la prise de greffe hématopoïétique chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est irradié puis reçoit une injection intrafémorale décrite comme douloureuse, et une partie est transplantée avec des cellules souches hématopoïétiques humaines, avant euthanasie pour quantifier la prise de greffe. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne reproduit ce processus in vitro et que la transplantation chez l'animal est le "seul outil" disponible. Les retombées annoncées pour les patients greffés de moelle osseuse sont renvoyées au conditionnel et au long terme.
Objectifs
L’utilisation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) suscite un fort intérêt médical du fait de leur potentiel de régénération et de différenciation. Elles sont présentes dans la moelle osseuse et sont à l’origine des cellules sanguines. Elles sont utilisées au cours des transplantations hématopoïétiques dans le but de traiter les patients atteints de leucémies ou de maladies génétiques affectant les cellules du sang (leucocytes, globules rouges, plaquettes). L’une des limites de la greffe cependant, provient de la faible proportion de CSH capables de migrer vers les niches hématopoïétiques localisées dans la moelle osseuse et de s’y implanter. La grande majorité des CSHs est en réalité perdue ou détruite avant d’atteindre la moelle osseuse. Ainsi, une proportion importante des greffons, notamment ceux issus des sangs de cordons ombilicaux présentant de faibles quantités de CSHs, ne peut pas être utilisée pour la greffe. Une solution permettant d’augmenter le nombre de greffons disponibles consiste à augmenter la proportion des CSHs « utiles », c’est à dire capables de s’implanter dans la moelle osseuse. Cette amélioration permettrait en outre de limiter les risques d’échec de greffe chez les patients transplantés. Dans ce contexte l’objectif de notre projet est d’évaluer l’effet de l’injection de molécules impliquées dans le guidage des cellules vers les niches hématopoïétiques médullaires, en association ou non avec des complexes stabilisateurs, préalablement à l’injection des CSHs, sur l’efficacité de l’implantation des CSHs humaines dans la moelle osseuse. Les expériences de transplantations seront réalisées dans un modèle de souris n’ayant pas de système immunitaire, ne rejetant donc pas la greffe de cellules humaines.
Bénéfices attendus
Cette étude permettrait d’établir la preuve de concept que l’injection de molécules (sélectionnées sur la base de leur effet sur les CSHs) augmente la prise de greffe des cellules souches hématopoïétiques (CSHs) lors d’expérience de transplantation. A terme, ces résultats concourront à l’optimisation des protocoles de transplantation de cellules hématopoïétiques chez l’humain, dans le but d’augmenter les chances de réussite thérapeutique et le nombre de patients pouvant bénéficier d’une greffe de moelle osseuse.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une irradiation, étape nécessaire à une bonne prise de greffe (entre 3min environs et 5 min environ selon la lignée de souris) et à l’injection intrafémorale d’une molécule sélectionnée sur la base de son activité sur les CSHs. Cette injection qui dure quelques minutes sera réalisée sous anesthésie (1h environ) avec une prise en charge analgésique. Certains animaux seront également transplantés avec des CSHs humaines par voie intra veineuse. L’injection de CSHs qui ne dure que quelques secondes est réalisée sous anesthésie et analgésie. Ces procédures permettront de tester 5 molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs
Impact sur les animaux
L’injection dans l’os est douloureuse. Elle sera effectuée sous anesthésie et sera accompagnée d’une prise en charge analgésique. Les animaux seront irradiés pour permettre la prise de greffe. L’irradiation non létale des souris n’est pas sensée provoquer de douleur ou d’altération majeur de leur santé. Une perte de poids peut être observée dans de rare cas mais elle est transitoire (une semaine environ). Seule une infection potentielle peut s’avérer dangereuse mais elle est limité au maximum grâce au maintien des animaux dans un environnement stérile et à un traitement antibiotique durant 1 mois dans l’eau de boisson.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de quantifier, dans la moelle et dans le sang, la concentration de la molécule étudiée pour les études de pharmacocinétique ainsi que la proportion de CSH humaines présente dans la moelle des souris pour les expériences de transplantation.
Remplacement
La prise de la greffe au cours des transplantations de CSH est un phénomène complexe et il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant de mimer ce processus in vitro. Le passage par une expérience de transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des CSHs à se loger au niveau de la moelle osseuse et ainsi d’identifier des molécules capables d’améliorer cette étape.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, nous déterminerons sur un petit nombre de souris les conditions expérimentales optimales de transplantation en fonction de chaque molécule testée. L’effet de cinq molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs sera évalué. Notre expérience ainsi que la littérature dans le domaine nous montrent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe et par expérience est de 6 animaux afin que nous puissions rendre des résultats statistiquement significatifs sur le plan hématologique. Nos expériences préliminaires par étapes successives nous permettront d’optimiser les paramètres expérimentaux et de vérifier que ce nombre d’animaux est valide lorsque l’on combine injection intra-fémorale d’une molécule à tester et injection intra-veineuse de cellules hématopoïétiques.
Raffinement
Pour limiter au maximum l’impact sur le bien-être des animaux, toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale grâce à un mélange anesthésique/analgésique. Par ailleurs, une prise en charge analgésique sera effectuée si besoin au site de l’injection intra-fémorale. Enfin une surveillance accrue sera réalisée entre le moment de l’irradiation et l’euthanasie de l’animal afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'humain. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de l’hématopoïèse après transplantation de CSHs. Souris jeunes adultes (10-12 semaines) afin d’être dans des conditions dans lesquelles la prise de greffe est optimale.
Caractérisation de l’impact d’un virus respiratoire sur la progression tumorale de cellules KP KO pour les protéines adaptatrices recrutées par les TLR et de l’IFNAR1 dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules tumorales pulmonaires puis une infection nasale par le virus Influenza sous anesthésie, avant des traitements de chimiothérapie ou d'immunothérapie, la croissance tumorale pouvant provoquer détresse respiratoire et perte de mobilité. Le porteur affirme qu'il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et justifie le choix de la souris parce que "toutes les études similaires sont menées chez cet animal". Les bénéfices avancés pour les patients atteints de cancer du poumon restent une meilleure connaissance des facteurs de résistance aux traitements.
Objectifs
Nous souhaitons caractériser l’impact d’un virus respiratoire sur la progression tumorale de cellules tumorales pulmonaires et comprendre les mécanismes mise en oeuvre lors de la reconnaissance virale. Pour ce faire, nous utiliserons des lignées cellulaires présentant ou non des adaptateurs moléculaires impliqués dans le processus de reconnaissance du virus respiratoire Influenza A. Nous nous interessons également à la réponse aux différents traitements.
Bénéfices attendus
Les traitements actuellement préconisées dans le cadre d'un cancer pulmonaire sont la radiothérapie ou la chimiothérapie et éventuellement en association avec l'immunothérapie ou thérapie ciblée. Cependant, il est nécessaire de poursuivre des recherches pour mieux connaître les facteurs pouvant impacter la progression tumorale et la résistance au traitements. C'est pourquoi, nous souhaiterions déterminer le rôle des adaptateurs ou récepteurs de la reconnaissance virale en combinaison avec de la chimiothérapie ou immunothérapie.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, la durée de l'expérience est de 1 mois. Les animaux recevront une injection de cellules tumorale (2250 animaux) par voie intraveineuse avec au préalable une anesthésie générale. La durée de l'acte est de quelques secondes à une minute. De plus, avant l'infection respiratoire, les souris sont anesthésiées à l'aide de cette même préparation puis l'infection par voie nasale (2250 animaux) peut avoir lieu. Le temps nécessaire une infection est de 20 minutes maximum. Nous testerons également la résistance aux médicaments et la voie d'administration du traitement (chimiothérapie ou anti-monoclonal) est une injection intra-veineuse (1800 animaux) et l'acte prend moins de 10 secondes. Les souris recevront une anesthesie gazause. Lors des traitements par chimiothérapie : deux à 5 injections sont prévues pour les sels de platine. Enfin, lors du traitement par immunothérapie, 5 injections d'anticorps seront réalisées. De plus, lors de l'imagerie du petit animal, nous utilisons un anesthesique gazeux pendant 10 min (2250 animaux).
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales par voie intra-veineuse peut causer une douleur ou un inconfort d’où l’utilisation d’une anesthésie injectable. Les souris peuvent souffrir de faim ou de soif lors d’une infection virale et lors d’une croissance rapide de la tumeur instillée, l’animal peut présenter des signes de souffrances, d’une détresse respiratoire et une diminution de la mobilité de l’animal. De plus, les effets indésirables liés à l’infection virale peuvent être multiples. Lorsque nous procédons à une infection virale par voie nasale, il est nécessaire d’endormir les souris à l’aide d’une anesthésie injectable pouvant entrainer une hypothermie. Enfin, l’administration de médicaments se fait par voie intra-veineuse Et, l’animal recevra une anesthésie gazeuse pour limiter toute souffrance, et ensuite, l’injection intra-veineuse peut être entrepris.
Devenir
Les souris sont euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les poumons dans le but d’analyser par des techniques multiparamétriques, l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral et la réponse virale.
Remplacement
Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. En effet, les cellules en culture ne permettent pas d'appréhender le processus de progression tumorale et l’infiltrat immunitaire dans sa globalité
Réduction
Les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles. Nous avons établi 15 souris/groupe. Nous utiliserons un pied à coulisse pour mesurer le volume tumoral aux cours du temps et des techniques d'imagerie non invasive pour l’apparition des métastases. Le nombre d’animaux impliqué dans l’étude est de 2250. Nous utiliserons un test statistique permettant de comparer les moyennes des souris instillées par rapport aux contrôles.
Raffinement
Raffiner, la méthodologie utilisée, ce qui implique la notion de points limites, si des signes de souffrances sont visibles. De plus, les animaux auront un temps d'acclimatation de 8 jours avant d'être expérimentés. Les animaux seront observés de façon quotidienne et seront gardés en groupes de 5 et hébergés dans des cages appropriées offrant suffisamment d’espace vital. Un milieu enrichi adapté est prévu pour l’hébergement des souris. Notre stratégie d’observation consiste en une surveillance quotidienne par les animaliers d’une part et nous assurons en plus une surveillance suivi d’un contrôle 3 fois par semaine dès que les souris ont été infectée par injection intra-nasale avec recherche de signes d’altération de l’état général (souris recroquevillée, amaigrissement (3 pesées hebdomadaires) et de difficultés respiratoires. Lors des injections de cellules tumorales pulmonaires et au moment de l’infection intra-nasale, les animaux seront sous anesthesie générale. Afin d'éviter que les animaux ne soient en hypothermie, nous les plaçons sur un tapis à 37°C. En cas de signe de souffrance les souris seront euthanasiées. Nous utiliserons une anesthesie gazeuse afin d’observer l’apparition des tumeurs par une technique d’imagerie pour éviter d’euthanasier l’animale. Nous utiliserons également de l’anesthesie gazeuse lors des injections intra-veineuses.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour conduire nos expériences avec avant tout dans un souci d’intégration de nos recherches dans un contexte scientifique où toutes les études similaires sont menées chez cet animal. Il s’agit d’une espèce pour laquelle notre animalerie est parfaitement adaptée, qui se manipule facilement. Nous utilisons des souris C57Bl/6 albinos qui est une lignée de souris dont la mutation provient d’une mutation spontanée dans la lignée C57Bl/6. Cette lignée est couramment utilisée pour les expériences de bioluminescence. Les animaux commerciaux sont utilisés à l'âge de 7 à 9 semaines. Ce stade de développement a été choisi car les souris sont sevrées, ont atteint leur taille adulte et ont un système immunitaire mature.
Etude chez la souris de l’impact d’une inflammation lors des premiers jours de vie sur la prédisposition à l’obésité. 1/2
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
3 225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les mères suivent un régime hypergras et chaque souriceau subit jusqu'à quatorze interventions, dont neuf injections d'une molécule inflammatoire dès le lendemain de la naissance, une ouverture du crâne sous anesthésie pour l'imagerie et des prélèvements sanguins répétés à la queue. Le porteur décrit un retard de croissance, des troubles comportementaux et moteurs, et prévoit l'euthanasie pour prélever cerveau, foie et pancréas. Il affirme qu'il est impossible de reproduire hors de l'organisme les connexions étudiées, les bénéfices pour l'humain étant renvoyés à un éventuel traitement de l'obésité.
Objectifs
La naissance prématurée (avant la fin normale de la grossesse) est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Dans les pays industrialisés, en raison de l'amélioration des soins intensifs néonataux, le nombre des nourrissons prématurés qui survivent au-delà de l’enfance est en hausse. Il existe néanmoins une inflammation importante chez 20 à 40% de ces enfants à la naissance, qui peut s’étendre au cerveau et y entraîner des lésions. Ces lésions sont à l’origine de handicaps, de déficits des certaines capacités intellectuelles et de troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte et sont regroupées sous le terme d'Encéphalopathie du Prématuré (EDP). En plus de ces déficits, des études récentes ont démontré qu’1 enfant prématuré sur 5 développe de l’obésité pendant l’enfance. L'obésité est le principal facteur de risque pour le diabète de type 2. Pour comprendre comment une inflammation au moment de la naissance peut favoriser le développement d’une obésité et du diabète, nous utiliserons un modèle de EDP chez le souriceau combiné avec un régime hypergras des mères pendant la lactation. Les mères seront soumises jusqu’au sevrage de leurs petits soit à un régime hypergras soit à un régime contrôle sous forme de croquettes plus ou moins riches en graisse.
Bénéfices attendus
Comprendre pourquoi la naissance prématurée et l’inflammation à la naissance peuvent favoriser l’apparition d’une obésité et d’un diabète peut permettre de proposer des régimes alimentaires ou des traitements pour prévenir et éviter ces maladies chez l’homme.
Procédures
Les mères seront soumises jusqu’au sevrage des petits (21 jours) à un régime hypergras ou à un régime contrôle (croquettes plus ou moins riches en graisse). Chaque souriceau sera soumis à 14 interventions au plus. 1/ Ils recevront 2 injections intrapéritonéales (dans le ventre, au niveau de l’abdomen, dans la cavité où se trouvent les organes digestifs, l’injection est faite un peu au-dessus de l’aine) par jour de la molécule inflammatoire ou du contrôle (matin et fin d’après-midi) du jour après la naissance (P)1 à P4, puis une le matin du P5. Il y aura donc au total 9 injections, de quelques secondes chacune. 2/ A 4 semaines, sous anesthésie générale, une ouverture de l’os du crâne sera réalisée sur un lot d’animaux pour des mesures d’imagerie, pendant lesquelles du glucose sera administré. Cette mesure dure de 1h à 1h30 en totalité. 3/ Pour savoir si les animaux développent un diabète, un autre lot de souris recevra de l’insuline et la glycémie sera mesurée à t=0’, 5’, 10’, 15’, 20’, 30’, 40’, 60’, 90’ et 120’ sur une goutte de sang récupérée par légère piqure au bout de la queue (animal éveillé). Chaque prélèvement dure quelques secondes. Le même test sera reproduit 48h plus tard, en remplaçant l’insuline par du glucose (une seule dose de chaque). L’efficacité d’un anti-diabétique sera testée sur un lot de souris spécifique (1 injection par jour pendant 3 jrs à partir de 4 semaines). Deux heures après la 3ème injection, un test d’insuline sera réalisé comme décrit précédemment. Le lendemain, un prélèvement de sang au niveau de la veine sous-mandibulaire sera réalisée sous anesthésie, avant euthanasie par dislocation cervicale. 4/ D’autres animaux seront utilisés pour l’analyse de leur métabolisme. Ceci nécessite leur isolement dans des cages individuelles appelées « cages métaboliques », permettant le recueil des urines, des selles et des gaz. Une habituation à l’isolement en cages individuelles classiques sera réalisée auparavant. Au total les animaux resteront isolés pendant 2 semaines : 1 semaine d’habituation puis 1 semaine en cage métabolique. 5/ A 6 semaines, un autre lot d’animaux subira le test de « l’arêne » où les souris se déplaceront librement pendant 10 min sous une caméra pour évaluer leur comportement. 6/ A 4 et 6 semaines, une perfusion intracardiaque de liquide sera réalisée sur certains animaux, sous anesthésie générale et avec analgésie, pour éliminer le sang des vaisseaux des organes qui seront prélevés et étudiés post-mortem.
Impact sur les animaux
- L’injection intrapéritonéale peut créer une infection locale dans la zone d’injection - Chez les animaux inflammatoires, on peut observer un retard de croissance (taille et poids inférieurs à la normale) et des troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible...) et moteurs. - Un «graissage» du pelage peut être observé chez les animaux sous régime hypergras, car les miettes de croquettes qui tombent dans la cage lors de la prise alimentaire des animaux entraînent un dépôt lipidique dans la cage. - Une accélération du rythme de la respiration peut survenir chez les animaux à tous les stades. - La chirurgie crânienne peut entraîner dans de rare cas la mort de l’animal. Cela n’a pas d’impact sur le nombre d’animaux utilisé. - La récupération d’une goutte de sang à 10 reprises en 2h après administration d’insuline ou de glucose à 4 semaines peut engendrer un peu de stress chez les animaux, et parfois une hémorragie si la coagulation naturelle ne se fait pas normalement. - L’isolement en cage métabolique peut induire un stress.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure pour permettre le prélèvement des organes et du sang, et comprendre si l’inflammation au début de la vie peut causer un diabète. Le rôle du cerveau, du foie, du pancréas et du système immunitaire sera analysé.
Remplacement
Notre étude s’intéresse aux liens entre le cerveau et l’utilisation des lipides par l’organisme. Il est impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques) toutes les connexions concernées.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été obtenu grâce aux données du laboratoire, de la littérature et d’une estimation statistique. Si les résultats obtenus à mi-projet sont suffisamment clairs, il sera réduit de moitié.
Raffinement
Avant sevrage, les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. Des grilles de surveillance en fonction de l’âge des animaux seront utilisées pour s’assurer de leur bien-être et déterminer l’atteinte éventuelle des points limites. Une surveillance quotidienne règlementaire est respectée dans l’établissement. Une surveillance spécifique des animaux du projet est par ailleurs appliquée : - Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, et jusqu’à P10, on surveillera quotidiennement l’apparence, le poids, et le positionnement des animaux au sein du nid. - A partir de P10, avant sevrage, la surveillance aura lieu deux fois par semaine. - Après sevrage, les animaux sont surveillés toutes les semaines au moment du change des cages et les vendredis après-midi (avec prise de poids) avant le weekend. Les scores de surveillance prendront également en compte une éventuelle prise de poids susceptible de gêner la locomotion de l’animal. Si le score atteint le niveau du point limite, l’animal sera euthanasié selon les méthodes réglementaires. Une semaine d’habituation en cage individuelle classique sera réalisée avant celle passée en cage métabolique. Une anesthésie générale sera réalisée lors des mesure d’imagerie, et pour le prélèvement sanguin des souris ayant reçu le traitement anti-diabétique. Avant la perfusion intracardiaque de liquide, une analgésie et une anesthésie seront réalisées.
Choix des espèces
Dans le cas de l’étude de l’inflammation cérébrale, les études scientifiques montrent que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau, car les régions principales de cet organe (qui correspondent aux fonctions motrices et intellectuelles), et ses cellules sont très proches de celles de l’homme. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; les observations pourront donc être extrapolables au nouveau-né humain. Les différents temps d’exploration et de prélèvements choisis ensuite permettent de suivre les animaux jusqu’au stade jeune adulte.
Mise en place d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïètiques murines dans des souris immunocompétentes
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une irradiation totale du corps avant l'injection de cellules souches, avec des prélèvements sanguins toutes les deux semaines, puis pour certaines des immunisations répétées. Le porteur décrit un affaiblissement possible après l'irradiation, perte de poids, léthargie, diarrhées et suppurations oculaires liées aux injections rétro-orbitaires. Il affirme que les événements moléculaires du développement des lymphocytes B sont impossibles à reproduire in vitro et que le recours aux animaux est "indispensable", l'euthanasie servant à prélever les organes de l'immunité.
Objectifs
Les lymphocytes B sont des cellules de l’immunité adaptative sécrétrices d’anticorps dirigés contre les agents étrangers au soi. Pour produire des anticorps, le lymphocyte B doit se différencier en une cellule sécrétrice d’anticorps, aussi appelée plasmocyte. Notre laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur les évènements moléculaires qui concourent à cette différenciation. Cette dernière induit dans la cellule d’importantes modifications qui sont sous le contrôle d’un grand nombre de facteurs clés agissant pour certains sur le stress cellulaire et sur des évènements qui pourraient conduire à un cancer. Nous avons très récemment montré que des enzymes ayant les capacités de phosphorylation des protéines et jouent un rôle primordial dans ce processus de différenciation en plasmocytes. Dérégulées, ces enzymes contribuent à la survenue et au maintien de cancers issus des lymphocytes B (lymphomes) et plasmocytes (myélome). Nous souhaitons confirmer in vivo chez la souris le rôle des ces enzymes dans ce processus de différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. Ce projet comporte trois volets: 1) Le premier consiste à la mise en place technique d’une transplantation de cellules de la moelle osseuse en vue d’une production nouvelle de cellules sanguines chez la souris immunocompétentes ; 2) Dans un deuxième temps nous transplanterons des cellules de moelle issues de souris modifiées génétiquement et aptes à développer des cancers; 3) Enfin, nous transplanterons des cellules préalablement modifiées avec perte des capacités à produire les enzymes d'intérêt. Les animaux ainsi modifiés permettront l’étude précise des évènements moléculaires qui participent à la différenciation en cellule normale ou tumorale, selon le cas.
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient permettre une meilleure compréhension du rôle des kinases PIM dans la biologie du lymphocyte B normal ainsi que dans le développement des tumeurs induites au cours de cette différenciation, les lymphomes et le myélome.
Procédures
Notre modèle de greffe dans des souris immunocompétentes implique au préalable une irradiation totale des souris avant l'injection des cellules. Les cellules seront injectées dans le sang après une anesthésie gazeuse des animaux. L'injection sera de très courte durée, de l'ordre de quelques secondes. Des prélèvements sanguins itératifs (1 fois toutes les 2 semaines) seront ensuite réalisés pour tous les animaux. Le prélèvement sanguin ne nécessite aucune anesthésie et n'excèdera pas 1 minute. Enfin des immunisations seront appliquées sur certains animaux (aucune anesthésie requise) dès 3 mois post-greffe pour les animaux dont la reconstitution sanguine a été jugée optimale. L’immunisation sera soit unique ou itérative (2 ou 3 injections espacées de 1 semaines à 1 mois selon les modèles), avec des injections de très courte durée, de l'ordre de quelques secondes.
Impact sur les animaux
L'irradiation des animaux peut engendrer un affaiblissement notable de leur vitalité, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées quotidiennement durant la phase post-irradiation (au moins 1 semaine) pour détecter une potentielle absence de prise de greffe et apparition de signes d’affaiblissement immunitaire (perte de poids, léthargie, dos courbé...). Afin de lutter contre la perte de poids (en lien avec des diarrhées induite par l'irradiation), un apport gélose pourra être utiliser pour faciliter l'absorption des aliments et la réhydratation des souris. Enfin, le développement de suppurations des yeux peut aussi apparaitre suite aux injections rétro-orbitales. Une vigilance particulière au cours du suivi quotidien des animaux en post-greffe sera donc porté sur cet effet possible.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution de toutes les cellules du sang et sur développement de la réponse immunitaire et des tumeurs.
Remplacement
Le projet est basé sur des études préliminaires in vitro ayant démontrées l'importance des kinases PIM chez l’Homme dans la différenciation normale du lymphocyte B en plasmocytes et leur implication dans le développement des cancers. Les évènements moléculaires impliqués dans le développement des cellules du système immunitaire, et tout particulièrement des lymphocytes B sont à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro. Le recours à des animaux est donc indispensable pour cette étude.
Réduction
Afin de réduire le nombre nécessaire d’animaux, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (organes de l'immunité, moelle osseuse et sang) afin de réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes chez la souris, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal. Enfin, la taille des groupes de souris est choisie de façon à permettre une interprétation des données statistiquement valides, que l’expérimentation soit donc réalisée de façon productive et sans nécessiter d’avoir à refaire ces tests. Le nombre de 10 souris par lot est choisi assez élevé pour pallier le fait que ces expérimentations ont une reproductibilité assez faible. En effet, l'irradiation totale et la greffe subséquente de cellules sont des procédures avec une forte variabilité, et un risque non négligeable de perte d'animaux en période post-irradiation.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Également, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel.
Choix des espèces
Les souris sont de bons modèles d'étude notamment pour caractériser des mécanismes physiologiques ainsi que comprendre les processus de cancérogénèse étant donné leurs facilitées d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leur similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Le modèle murin est aussi le plus utilisé actuellement pour le développement tumoral et étudier la tumeur dans son microenvironnement. Enfin, de nombreux outils sont maintenant disponibles pour l’étude des structures anatomiques, cellules et gènes dans cette espèce (anticorps, séquence de référence) dans les modèles murins, facilitant alors l'analyse des données. Pour notre projet, les cellules de la moelle osseuse des souris donneuses seront greffées dans des souris receveuse de même fond génétique afin d’éviter le rejet de greffe. L’expérimentation sera commencée sur des animaux à partir de 4 semaines d’âge et jusqu’à 3 mois de vie. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 12 mois.
Impact d’un ARN circulaire issu de l’oncogène majeur d’un herpès virus aviaire chez la poule
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
96 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Inoculées avec le virus de la maladie de Marek, elles subissent huit prélèvements de sang et trois prélèvements de plumes, et le porteur indique s'attendre à ce que la majorité développe la maladie, avec fièvre, paralysie, lymphome, perte de plumes ou mort subite. Les oiseaux sont hébergés en isolateurs qui restreignent leurs mouvements, et ceux présentant des symptômes graves sont euthanasiés après confirmation du diagnostic. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ne permet d'étudier la latence virale et qu'aucun autre modèle animal ne convient, ce virus n'infectant que les gallinacés.
Objectifs
Le virus de la maladie de Marek est un herpès virus aviaire hautement contagieux et entrainant des lymphomes mortels pour les animaux dans un délai de quelques semaines. Ce virus est actuellement sous contrôle grâce à des protocoles de vaccination très stricts, bien que ceux-ci ont montré des failles dans les dernières années. Ce virus est également un outil en recherche biomédicale de par son côté modèle d’oncogenèse viro-induite. L’objectif de ce projet est d’approfondir les connaissances sur l’oncogenèse induite par ce virus. Alors que celle-ci a été longtemps réduite au résultat de l’expression d’un facteur de transcription viral dérégulant la biologie cellulaire des cellules infectées de manière latente, les découvertes successives d’acides ribonucléiques (ARN) non-codants impactant le cycle viral et l’oncogenèse viro-induite ont remis en cause ce modèle. Dans le cadre de ce projet, nous proposons qu’un ARN non-codant nouvellement découvert et encodé à partir du même gène permettant l’expression de l’oncogène majeur du virus puisse avoir un impact sur l’apparition de la lymphomagenèse. Pour répondre à cette question deux virus OGM ont été produits en laboratoire et testés in vitro avant cette approche in vivo. L’approche in vitro a montré ses limites car l’effet est suspecté de se produire durant la latence du virus, qui n’est pas observable dans les modèles cellulaires. Ce projet nécessitera au maximum l’utilisation de 96 poules.
Bénéfices attendus
L’étude de l’impact de l’ARN circulaire étudié sur l’oncogenèse requiert un volet in vivo pour répondre à la question de recherche. Actuellement, et depuis leur première description en 2018, aucun ARN circulaire viral n’a été décrit pour ses rôles promouvant l’oncogenèse viro-induite in vivo. Le virus de la maladie de Marek est un modèle adéquat pour investiguer ce pan inexploré de l’oncogenèse viro-induite. Au travers de ce projet, nous espérons comprendre le rôle de l’ARN circulaire associé au locus de l’oncogène majeur du virus de la maladie de Marek. Les bénéfices sont donc à répartir sur plusieurs niveaux : 1- Maladie de Marek : Meilleure compréhension du cycle viral et de la tumorigenèse viro-induite 2- Biologie moléculaire : Descriptions de nouvelles fonctions des ARN circulaires, notamment viraux 3- Virologie : Description d’un pan très récent de la virologie.
Procédures
une inoculation de virus sur animaux vigiles + 8 prélèvements de sang sur animaux vigiles + 3 prélèvements de plumes sur animaux vigiles. Durée de chaque acte : moins d’une minute.
Impact sur les animaux
1/ L’hébergement des animaux en isolateurs est nécessaire dans le cadre des recherches portant sur le virus de la maladie de Marek. Cependant, l’hébergement en isolateurs peut induire une compétition sur les ressources alimentaires en fonction de la fréquence des nourrissages. Ce type d’hébergement réduit également la liberté de mouvement des animaux. 2/ La maladie de Marek est une maladie virale hautement contagieuse et fatale pour la majorité des animaux infectés. Il est attendu que la majorité des animaux de l’étude soient atteints de la maladie durant le temps de l’étude. Parmi les symptômes possibles : fièvre, paralysie, mort subite, lymphome, perte de poids, perte de plumes, difficultés respiratoires, ailes pendantes, boiterie. 3/ Les prises de sang et prélèvements de plumes entraineront un stress récurrent chez les animaux concernés. Ces manipulations entraineront également des douleurs ponctuelles : un animal dont la contention serait mal assurée pourrait se faire mal ou se blesser ; l’injection intramusculaire peut entrainer une douleur au niveau du site d’injection et les prises de sang peuvent être sources d’hématomes au site de prélèvement. Les prélèvements de plumes entrainent une douleur ponctuelle pour l’animal.
Devenir
En fin d’expérience, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser différents prélèvements d'organes et de plumes.
Remplacement
Il est impossible de remplacer le modèle par des approches in vitro ou in silico car les méthodes actuelles n‘offrent qu‘une approche limitée de la maladie. Notamment, il n‘est pas possible d‘étudier in vitro la latence virale, responsable de la lymphomagenèse. L’utilisation d’un autre modèle animal, moins sensible, est également impossible car cet herpès virus n’infecte que les gallinacés.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque lot a été établi afin d’être en conformité avec le principe de réduction des règles de bien-être animal et de manipuler un nombre d’échantillons suffisants pour établir si les différences mesurées entre lots sont statistiquement significatives et donc non dus au hasard. Les meilleurs tests statistiques seront appliqués dans les comparaisons des différents groupes pour permettre un traitement optimal des données.
Raffinement
Une visite des animaux est effectuée 2 fois par jour par le personnel technique qualifié afin de détecter l’apparition de symptômes de la maladie ou tout autre signe anormal lié à la santé et au bien-être des animaux. Les animaux présentant des symptômes graves de la maladie de Marek seront euthanasiés après confirmation du diagnostic par le responsable du projet. Les animaux présentant des symptômes légers feront l’objet d’une surveillance accrue pour détecter l’apparition de nouveaux symptômes. L’ensemble des gestes techniques est assuré par du personnel formé et compétent, ce qui limitera le stress des animaux. La contention est effectuée en douceur et les prélèvements sont le plus rapide possible. Les prélèvements de plumes et de sang sont réalisés simultanément pour limiter le stress. Le nombre de prélèvements a été réduit au minimum et espacés au minimum de 7 jours pour limiter la manipulation et la souffrance liées aux prélèvements répétés. Dans le cas des prélèvements de plumes, de petites plumes seront prélevées, ce qui limite la douleur par rapport aux prélèvements de plus grosses plumes. Afin de limiter la douleur lors de l’inoculation du virus, nous utiliserons des seringues avec des aiguilles fines et courtes. Les injections seront réalisées sous PSM (poste sécurité microbiologique) avant l’entrée des animaux dans les isolateurs afin de faciliter la manipulation, notamment la contention des animaux et ainsi rendre l’injection plus simple et moins stressante pour les animaux. des vers de farine seront testés comme aliment de récompense après les prélèvements. Des points limites adaptés ont été définis.
Choix des espèces
Le virus de la maladie de Marek ne provoque des lymphomes que chez les gallinacés. L’utilisation de la race choisie permet d’obtenir des effets plus importants et donc, de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l’étude. De plus, chaque année, malgré la vaccination, des élevages de poulets présentent des cas de maladie de Marek malgré la vaccination. Cela peut être dû à une mauvaise vaccination, à des souches hypervirulentes ou à des environnements très contaminés. Pour des raisons techniques, les poulets seront infectés à l’âge de 14 jours. Ils seront euthanasiés à maximum 75 jours d’âge. L’âge d’inoculation de 14 jours a été déterminé car il permet de commencer les prélèvements sanguins dès le début de l’expérience, tout en restant suffisamment sensible à la maladie pour obtenir des résultats robustes en un minimum de temps.
Role des inhibiteurs ERAP dans un modèle de psoriasis chez des souris humanisées BRGSF-HIS
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
440 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Un psoriasis leur est induit par application d'imiquimod avec épilation, puis elles reçoivent par gavage ou injection des inhibiteurs candidats, avec des prélèvements sanguins répétés en rétro-orbitaire sous anesthésie. Le porteur décrit une contention et des gestes générateurs de stress, et prévoit l'euthanasie pour prélever rate et peau. Il revendique un "fort besoin médical" pour le psoriasis et affirme que les modèles plus simples, invertébrés, ne permettent pas de valider l'approche.
Objectifs
Les ERAPs sont des cibles thérapeutiques intéressantes pour traiter les maladies auto-immunes et autoinflammatoires. Les ERAP 1 et 2 sont des amino-peptidases intracellulaires (métalloprotéases) chargées de la transformation finale des antigènes peptidiques pour présentation par les molécules du CMH de classe I. Ils régulent ainsi la réponse immunitaire adaptative par les lymphocytes T cytotoxiques (LcT) et affectent l'immunodominance en impactant le répertoire peptidique global présenté par le CMH-I. Les enzymes ERAP ont des rôles complémentaires et des fonctions importantes in vivo. Un certain nombre d'haplotypes ERAP sont liés au risque de souffrir de diverses maladies auto-immunes ou auto-inflammatoires, notamment le psoriasis. Un obstacle scientifique est la disponibilité de petites molécules inhibitrices d'ERAP efficaces, sélectives et biodisponibles. Aucun inhibiteur d'ERAP n'a été évalué in vivo jusqu'à présent et les rapports sur la modulation de l'immunopeptidome par les composés ERAP ne sont pas disponibles. L'objectif du projet est d'identifier des inhibiteurs pharmacologiques d’ERAP à travers méthodes intégrés de chimie médicinale (du criblage fonctionnel de la présentation de l'antigène combiné au profilage des immunopeptidomes dans les cellules des patients) et l’évaluation préclinique de leur efficacité thérapeutique dans un modèle de psoriasis chez des souris presentant a systeme immunitaire humain (souris BRGSF-HIS).
Bénéfices attendus
Ce projet et les composés identifiés pourraient ouvrir la voie à des traitements personnalisés des maladies autoimmunes/auto-inflammatoires. A terme, nous souhaitons proposer de nouvelles options thérapeutiques pour la psoriasis qui est maladies à fort besoin médical.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins réalisés en rétro-orbitaire, à partir de J8 et chaque 2 jours après le début du protocole de traitement avec IMQ, jusqu'au sacrifice (J16). Ces prélèvements seront effectués sous anesthésie gazeuse à l'isofluorane 2%. Le volume maximal prélevé sera égal à 200μL. Pour chaque souris, le prélèvement sanguin durera au maximum 5 minutes, y compris la durée de l'anesthésie
Impact sur les animaux
Concernant les molécules candidates qui seront administrés, leur toxicité est préalablement testée par nos partenaires et leur administration tiendra compte des études de toxicité et de pharmacodynamique afin de ne pas avoir d'effets indésirables qui pourraient interférer avec les résultats de l'expérimentation. Cependant, les souris seront soumises à des procédures pouvant générer un stress, comme la contention, afin d'effectuer des traitements de gavage oral ou des ponctions intrapéritonéales ou un prélèvement sanguin sous anesthésie à l'isoflurane à 2 %.
Devenir
A l'issue de la procedure tous les animeaux seront euthanasiés sous anesthésie à l'isoflurane à 2% afin de prélever des échantillons de rate et de peau sur lesquels seront évalués tous les paramètres histologiques et biomoléculaires nécessaires pour définir l'efficacité ou non des composés testés.
Remplacement
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, le criblage d'une série d'inhibiteurs d'ERAP1/2 préalablement modélisés et synthétisés par l'équipe partenairesera réalisé sur des modèles cellulaires, par quantification LCMS-MS. De plus une évaluation de la sécurité sera exprimée sous la forme d'un rapport IC50 et CC50 (test cellulaire à haut contenu d'apoptose ou de nécrose (Caspase-3/7 activité Propidium iodure) et évalué la plateforme Equipex Imaginex. Les inhibiteurs candidats seront préalablement testés par des expériences de pharmacodynamiques afin de garantir une exposition et une voie optimale avant les tests chez les souris BRGSF-HIS
Réduction
Dans le respect des règles des 3R, le nombre minimum d'animaux sera utilisé pour garantir une analyse statistique correcte prenant également en compte la variabilité de l'expression des gènes d'interet et les differents paramètres mesurés. Le nombre d’animaux par groupe de n= 10 est calculé par une approche statistique qui integre la dispersion des valeurs individuelles et qui a été déterminé suite à des expériences pilotes ou sur la base des précédentes publications.
Raffinement
Afin de limiter la douleur, surtout pendant la phase d'épilation, toutes les souris seront traitées avec une injection sous cutanée de buprenorphine a la concentration de 0.05 mg/Kg. Les animaux sont observés et pesés d’une manière quotidienne pour une attention particulière aux points limites suivants: -une modification du comportement (prostration, poils hérissés, cris, blessure) - une perte de poids supérieur à 15%. Les souris montrat de signe de mal-être seront euthanasiées sous anesthésie gazeuse à l'isofluorane 2%.
Choix des espèces
La souris est une espèce modèle très bien documentée dans la littérature scientifique, offrant des outils optimisés pour l’étude des réponses immunitaires et des mécanismes physiologiques intégrés. Des modèles plus simples (invertébrés) ne permettent pas de valider les approches proposées. Le modèle expérimental murin de psoriasis que nous avons choisi d’utiliser est référencé et validé scientifiquement dans de nombreuses publications. Le modèle murin est donc le plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants tout en évitant au maximum la douleur et la souffrance chez l’animal. De plus, la souris BRGSF représente le modèle le plus immunodéficient généré à ce jour, avec un défaut des compartiments lymphoïde et myéloïde murin et représente donc un modèle animal fortement adapté pour la xénogreffe su systeme immunitaire humaine. La souris BRGSF représente le modèle immunodéficient plus efficace généré à ce jour, avec un défaut des compartiments lymphoïde et myéloïde murin, et représente donc un modèle animal fortement adapté pour la xénogreffe de tumeurs humaines et/ou du système immunitaire. L'inflammation cutanée de type psoriasis induite par l'Imiquimod (IMQ) semble liée à une production de cytokines, notamment d'IL23, par les cellules dendritiques. Dans le modèle BRGSF-HIS, nous proposons un boost de cellules dendritiques en utilisant hFlt3L. Comme les souris n'expriment pas ERAP2, l'utilisation d'une version humanisée semblerait être un solution pertinent pour tester les effets des nouvelles molécules basées sur l'inhibition des ERAPs dans la psoriasis. Le souris BRGSF-HIS seront utilisée a 12 semaine de vie, qui représentent le temps pour une reconstitution optimale d'un système immunitaire humain.
Mécanismes des récepteurs du glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement chez la souris 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles subissent une ou deux chirurgies du cerveau, implantation d'électrodes de deux à six heures et injection de virus, suivies d'enregistrements de l'activité neuronale et de tests de mesure de l'anxiété et de la peur. Le porteur décrit une recherche fondamentale sur des récepteurs au glutamate et affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour préserver un réseau neuronal intact chez le rongeur. Les applications thérapeutiques pour les troubles anxieux sont annoncées à long terme, l'euthanasie servant à des analyses histologiques post-mortem.
Objectifs
Le projet, qui se déroulera dans deux établissements, a pour but d’étudier des récepteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le système nerveux central des vertébrés. Ces récepteurs jouent un rôle central dans la communication et le fonctionnement de nos neurones, ainsi que dans les mécanismes associés à l’apprentissage et la mémoire. Ces récepteurs au glutamate étant également impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), ils constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’un des récepteurs au glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement, dans un cadre physiologique et pathologique. Il s’agira notamment de comprendre l’importance de ces récepteurs dans la formation et la stabilisation des souvenirs associant un contexte à une émotion donnée et leur implication dans les comportements liés à l'anxiété. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à la réactivation et la coordination de plusieurs structures cérébrales pendant l'exécution et la consolidation des souvenirs aversifs dépendante du sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements in vivo chez des souris libres de leurs mouvements et endormies. L'identification des processus de formation de souvenirs émotionnels est essentielle pour comprendre comment ces processus sont affectés dans la maladie. Ce projet devrait permettre des avancées scientifiques sur les mécanismes et la diversité des récepteurs du glutamate, sur la régulation des signalisations neuronales et des fonctions cérébrales et comportementales associées. Notre travail ouvrira de nombreuses perspectives tant avec des implications importantes sur notre compréhension de la neurotransmission et le développement de nouveaux agents protecteurs contre les troubles neurologiques et psychiatriques. Ainsi des retombées sont attendues tant dans le domaine fondamental qu’appliqué (développement de nouvelles stratégies thérapeutiques).
Bénéfices attendus
Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ces troubles touchent environ 15 à 20 % de la population à un moment ou un autre de leur vie. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.
Procédures
Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr) avec ou sans comportement (1h maxi / jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) comportement (mesure de l’anxiété ou de la peur), 2) injection de virus + comportement, 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones + comportement. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui, selon les besoins, pourra permettre des prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes (hors enregistrement de l’activité neuronale et comportement) est réalisés sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement nécessaire à la préservation des électrodes implantées (stress modéré) ; comportement (stress modéré).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem).
Remplacement
Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.
Réduction
Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 2104 animaux.
Raffinement
Après leur réception, les animaux sont habitués aux expérimentateurs par une manipulation bienveillante pendant 5jrs (5min) de manière à réduire le stress lors des procédures. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes ou individuellement et disposeront d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur, les animaux seront exclus du protocole. Les procédures comportementales sont modérément aversives et brèves et n'induisent pas d'angoisse sur le long-terme.
Choix des espèces
Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Sa robustesse et ses capacités d'apprentissage la qualifient comme un modèle idéal d'étude de la mémoire chez les mammifères. Nous utiliserons des souris non génétiquement modifiées et des souris génétiquement modifiées dans le cadre de ce projet. Ces souris se développent normalement et ont un comportement général sans anomalies évidentes. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.
Effet d’un inhibiteur d’histones désacétylases sur l’instabilité des triplets CTG dans un modèle murin de la dystrophie myotonique de type 1
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de la dystrophie myotonique de type 1, elles reçoivent jusqu'à trente-six injections sous-cutanées sur douze semaines pour tester si une molécule réduit l'expansion d'ADN caractéristique de la maladie. Le porteur indique que les injections répétées peuvent causer des irritations et des ulcérations de la peau, et que les souris sont tuées à la fin pour des analyses incompatibles avec leur maintien en vie. Il présente cette étude comme un travail pilote et précise que les 12 souris proviennent de croisements déjà réalisés pour d'autres projets.
Objectifs
La dystrophie myotonique de type 1 est une maladie qui touche plusieurs organes tels que le muscle et le cerveau. Elle se caractérise principalement par un trouble du tonus musculaire et une détérioration progressive des fonctions neuromusculaires. Cinq formes cliniques ont été décrites dans la population atteint de la dystrophie myotonique de type 1. Parmi ces cinq formes, il y a une forme tardive qui se caractérise par une cataracte et une forme congénitale qui se caractérise par des problèmes musculaires et cognitifs très sévères. Le défaut génétique de cette maladie correspond à une expansion d'un morceau d'ADN dont la taille augmente généralement au cours des générations et dans les tissus. Plus la taille est grande, plus les symptômes sont sévères et l’âge d’apparition précoce. L’objectif principal du projet est d’identifier de nouveaux facteurs impliqués dans la diminution de la taille du morceau d'ADN et donc de ralentir la progression de la maladie. L’objectif du projet est de tester les effets d'une molécule chimique sur la taille du morceau d'ADN chez la souris et ainsi savoir si cette molécule pourrait être utilisée comme outils thérapeutique.
Bénéfices attendus
Chez les patients atteints de la dystrophie myotonique de type 1, la taille du morceau d'ADN dans les tissus augmente avec l’âge du patient et est corrélé avec la progression des symptômes de la maladie. Plus la taille du morceau d'ADN est grand plus les symptômes sont sévères. Il est donc important de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à réduire la taille de ce morceau d'ADN dans l’ensemble des tissus et donc à ralentir les symptômes chez les patients. Il a été montré qu’une molécule chimique peut réduire la taille de ce morceau d'ADN dans des modèles cellulaires. Une étude pilote chez l’animal permettra de savoir si cette molécule, peut également réduire la taille de ce morceau d'ADN dans plusieurs tissus tels que le muscle après 3 mois de traitement. Cette étude permettra également de savoir si l’effet de cette molécule est homogène entre les tissus et de mieux comprendre son mode d’action, in vivo. À ce jour, aucun traitement curatif n’est disponible pour la dystrophie myotonique de type 1. Cette étude pilote est une étape importante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Le temps de la procédure est de 3 min. Les injections sous-cutanées seront réalisées 3 fois par semaine sur une période de 12 semaines. Le nombre maximum d’injections sera de 36 par souris. Les injections seront réalisées sur animal vigile. Les injections de la molécule d’intérêt se fera sur un lot de 6 animaux et les injections de l’adjuvant se fera sur un autre lot contrôle de 6 animaux. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à l’issue de la période de traitement afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Impact sur les animaux
Les souris hemizygotes, qui vont être utilisées dans ce projet, ne présentent aucun phénotype. Dans le cadre de ce projet, une procédure d’injection sous-cutanée va être utilisée. Les animaux pourront ressentir une douleur ponctuelle réversible liée aux injections. Les injections répétées peuvent causer des irritations et des ulcérations de la peau et des muqueuses. Les injections répétées seront réalisées à des endroits différents afin de diminuer les risques d’apparition de plaie, d’ulcère… Aucun effet indésirable résultant de la molécule ou de l’adjuvant a été répertorié dans la littérature.
Devenir
Afin de pouvoir analyser la distribution de la taille du morceau d'ADN dans différents tissus, les 12 souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure. Les différentes analyses de biologie moléculaire réalisée dans le cadre de l’étude pilote ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux.
Remplacement
Il a été montré qu’une molécule chimique réduit le morceau d'ADN dans les cellules. Si certains mécanismes cellulaires peuvent être étudiés en culture, seule l'utilisation d'un modèle animal permet d'étudier les mécanismes tissu-spécifiques. C’est pour cela qu’un modèle murin de la dystrophie myotonique de type 1 est utilisé dans l’étude pilote. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de cette molécule sur la taille du morceau d'ADN dans différents tissus tels que le muscle qui est l’un des tissus les plus atteints chez les patients.
Réduction
Afin d'optimiser et de réduire le nombre d'animaux, les 12 souris utilisées dans cette étude pilote proviendront de croisements réalisés pour d’autres projets du laboratoire qui ont été autorisés. Sur la base de nos expériences préliminaires, une analyse statistique a permis d’estimer à 6 le nombre de souris nécessaire par condition (Molécule versus Adjuvant). Le nombre d’animaux est minimisé dans le cadre d’une étude pilote avec un protocole mis en place précédemment par des collaborateurs internationaux.
Raffinement
Les conditions d'hébergement des animaux seront adaptées pour réduire à son minimum le stress et la souffrance animale. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température (20-24 degrés) et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (éclairage 6h30-18h30). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec des nids de lanière kraft. La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de celui-ci. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de la boisson, la nourriture et de l’état des animaux. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration de la molécule et de l’adjuvant pour visualiser tout signe de toxicité imprévue qui nécessiterait l’euthanasie de l’animal. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent.
Choix des espèces
Un modèle murin de la dystrophie myotonique de type 1 sera utilisé dans le cadre de ce projet. Dans ce modèle de souris, la taille du morceau d'ADN malade augmente au cours des générations et dans les tissus. Notre choix s'est donc orienté vers ce modèle afin de valider le rôle de notre molécule sur la dynamique de ce morceau d'ADN, in vivo. Les souris hémizygotes d’intérêt seront inclues au début de la procédure à l’âge de 3 mois. Les souris seront euthanasiées à l’âge de 6 mois après 3 mois de traitement. Les changements de la taille de ce morceau d'ADN sont facilement détectés dans les tissus de souris âgées de 3 mois par les méthodes de biologie moléculaire utilisées au laboratoire. Il a été montré que les variations de taille de ce morceau d'ADN sont plus importantes chez des souris de 6 mois comparées aux souris de 3 mois.
Impact de l’immunisation contre la réponse anti-virale sur le développement de mélanome spontané murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
303 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent au moins cinq injections intramusculaires et cinq prélèvements de sang rétro-orbitaux sous anesthésie, et développent un mélanome sur le dos pouvant produire des métastases pulmonaires et des difficultés respiratoires. Le projet part de l'hypothèse, formée pendant la crise du Covid-19, que des auto-anticorps liés au vieillissement favoriseraient la croissance tumorale. Le porteur formule les retombées au conditionnel, ce mécanisme "pourrait ouvrir" une nouvelle piste de traitement, et affirme que les modèles cellulaires ne permettent pas d'étudier le système immunitaire.
Objectifs
L’immunosurveillance est la capacité du système immunitaire à lutter contre les cellules tumorales. Le système immunitaire devient cependant moins efficace au cours du vieillissement, favorisant le développement de tumeur. Pendant la crise du Covid-19, il a été montré que le vieillissement s'accompagnait de la présence d’auto-anticorps qui luttent contre les défenses immunitaires. Ces auto-anticorps compromettaient notamment la réponse contre le SARS-CoV2 et favorisaient les formes graves de la maladie. Nous émettons donc l’hypothèse que ces auto-anticorps favoriseraient aussi le développement tumoral dans le mélanome, cancer caractérisé par sa rapide agressivité. L’objectif de ce projet est de tester l’impact de la production d’auto-anticorps dans le développement de mélanome chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra potentiellement de décrire un nouveau mécanisme favorisant le développement tumoral et la résistance au système immunitaire dans le mélanome. Cela pourrait ouvrir une nouvelle perspective de traitement pour les patients atteint de cette maladie. En effet, malgré l’essor récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie, la plupart des patients rechutent avec un mélanome résistant.
Procédures
Les animaux subiront au minimum 5 injections intra-musculaires (qui dureront moins d'une minute sur animaux vigiles), ainsi que 5 prélèvements rétro-orbitaux réalisés sous anesthésie gazeuse, qui dureront quelques minutes. Les petits (à J14 minimum) subiront un prélèvement d'oreille par poinçage, à l'état vigile. Le prélèvement durera moins d'une minute. Tous les animaux seront soumis à de la contention.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont l'apparition de tumeur localisée aléatoirement sur le dos et possiblement métastatiques pouvant entrainer des difficultés respiratoires (métastases pulmonaires). Le prélèvement rétro-orbitaire et le poinçage des oreilles peuvent engendrer une irritation et une douleur de l'oeil ou de l'oreille. La contention va également leur générer du stress.
Devenir
Les animaux n'étant pas réutilisés dans un autre projet, ils seront mis à mort à la fin de chaque procédure ou avant si un point limite est atteint.
Remplacement
Des études préliminaires sur des modèles cellulaires ont été réalisées et ont permis de démontrer l'efficacité de l'immunisation. En parallèle, des analyses complémentaires ont été et seront réalisées sur des prélèvements de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, ces modèles ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet.
Réduction
Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet (n=92) a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. De plus, un animal permettra d’obtenir des résultats dans plusieurs expériences (pousse tumorale, analyse histologique de la tumeur, analyse marqueurs sanguins).
Raffinement
La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux en générant le moins de stress possible par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine, et 3x lorsque la tumeur apparaitra. Une anesthésie gazeuse sera utilisée lors du prélèvement rétro-orbitaire pour diminuer le stress de l’animal, et des gouttes de Collyre seront appliquées avant le prélèvement pour éviter les risques d’irritation de l’oeil. Les animaux sont hébergés en groupe, avec de l’aliment et de la nourriture ad libitum.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études du mélanome car c'est un modèle proche de la pathologie humaine reproduisant les caractéristiques histologiques. Nous disposons également d'outils, d'expériences et de compétences solides pour réaliser cette étude dans les meilleures conditions chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, pour la maturité sexuelle pour la reproduction et âge standard pour l'étude du système immunitaire.