Oncologie

40 agneaux vont être utilisés, accompagnés de 20 brebis non comptées comme cibles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous gardés vivants. Ils subissent des tests comportementaux, la pose répétée de ceintures à capteur cardiaque, deux prises de sang et des prélèvements de laine, pour évaluer l'effet d'un enrichissement du milieu sur leur bien-être et leur développement. Le porteur décrit un stress de courte durée lié aux manipulations et aux isolements. Il inscrit cette étude sur le bien-être dans une visée d'élevage "durable" et de recommandations pour l'élevage commercial.

Objectifs

L’objectif scientifique de ce projet est de tester l’effet d’un enrichissement multimodal des agneaux, dès le plus jeune âge et jusqu’à 2 mois après sevrage sur le bien-être des agneaux, le développement de leurs capacités cognitives et leur réactivité à une phase d’élevage classique source de stress pour les agneaux : le sevrage. L’hypothèse est que l’enrichissement du milieu de vie des agneaux sera pertinent (induisant donc bien un bénéfice comportemental pour les agneaux, selon la définition de Bloomsmith, 1991), qu'il les placera dans un état émotionnel positif leur permettant de mieux affronter une situation stressante (le sevrage), tout en leur offrant une diversité d’activités possibles pouvant détourner leur attention de l’absence de la mère, et qu’il entraînera un meilleur développement cognitif leur permettant d’être plus efficace lors d’un test de type labyrinthe (test de flexibilité comportementale). Pour ce faire, deux lots d’animaux seront constitués : un lot témoin (T) avec des animaux élevés classiquement, avec leurs mères jusqu’au sevrage, et un lot enrichi (E) avec en plus de l’élevage classique appliqué au lot témoin l’apport de différents objets d’enrichissement afin d’offrir aux agneaux une diversité de stimulations, touchant plusieurs de leur sens, dont le toucher et l’olfaction, et couvrant différents types d’enrichissements. Les objets d’enrichissements prévus sont au nombre de 8 : une brosse en L avec ressort, une brosse fixe simple, une plateforme multi-niveaux, un ballon suspendu, une boîte diffusant des odeurs à valence positive pour les agneaux accompagnée d’une barrière de séparation, et trois objets suspendus pour des manipulations orales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, le cas échéant, de faire la preuve de concept que l’enrichissement multimodal dès le plus jeune âge des agneaux est pertinent, permettant d’améliorer le bien-être des agneaux tout au long de leur croissance, et notamment au cours de phases d’élevage stressantes comme le sevrage, en favorisant leurs émotions positives, en stimulant et en développant leurs capacités cognitives et en améliorant leur robustesse. Ce projet permettra aussi de formuler des recommandations pour la mise en place d’objets d’enrichissement du milieu pour les agneaux en élevage commercial.

Procédures

Les 20 brebis ne seront soumises à aucune intervention. Les 40 agneaux seront soumis à : - 3 tests comportementaux, impliquant de les manipuler pour les sortir du parc d’élevage et de les isoler, au moins partiellement, de leurs congénères - 5 mises en place et 5 retraits des ceintures nécessaires pour maintenir le capteur de l’activité cardiaque, impliquant de les manipuler pour les sortir du parc d’élevage et de les isoler, au moins partiellement, de leurs congénères, de les mettre en contention pour la pose / retrait du matériel. - 2 prises de sang, réalisées à l’occasion de la mise en place du matériel de mesure de l’activité cardiaque, évitant ainsi des manipulations supplémentaires sur les animaux, hormis bien sûr la prise de sang. - 3 prélèvements de laine, réalisés pour 2 d’entre eux à l’occasion de la mise en place du matériel de mesure de l’activité cardiaque, évitant ainsi des manipulations supplémentaires sur les animaux, hormis bien sûr la tonte de la zone concernée. Le 3e prélévèment implique de les manipuler pour les sortir du parc d’élevage et de les isoler, au moins partiellement, de leurs congénères, et de les mettre en contention pour réaliser la tonte de la zone concernée.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress de courte durée dans quelques phases du projet : manipulation par l'homme pour mesures physiologiques, tests de réactivité émotionnelle, test de flexibilité comportementale du fait d'une brève contention, d'une exposition à un environnement nouveau et/ou d'un isolement social. Les enrichissements du milieu peuvent éventuellement être source de compétition pour les animaux (et donc d’une augmentation des comportements agonistiques), mais dans le cas de cette étude le nombre d’objets d’enrichissement (8 pour 20 agneaux) mis à disposition des animaux est suffisant pour que ce phénomène de compétition ne soit pas négatif pour les animaux.

Devenir

A l’issue de chacune des 2 procédures les animaux sont maintenus en vie et poursuivent l’expérimentation.

Remplacement

Ce projet a pour vocation de déterminer l'influence de l'apport d'enrichissements multimodaux sur le bien-être et sur le développement du comportement. Il est donc nécessaire d’étudier les animaux cibles, dans notre cas des agneaux, pour pouvoir appréhender leur comportement. NB : Le manque de connaissances scientifiques sur l’enrichissement multimodal dès le plus jeune âge chez les agneaux empêche la construction de modèles in silico pour cette étude.

Réduction

Au total 40 agneaux accompagnés de leurs mères, soit 20 brebis, sont utilisés dans l’expérimentation. Notre effectif statistique est donc de 20 agneaux par lot (les mères n’étant pas la cible de l’expérimentation). Cet effectif est nécessaire pour appréhender la variabilité inter-individuelle du comportement et des paramètres physiologiques (activité cardiaque et cortisolémie) ainsi que l’effet maternel (agneaux appairés à leur frère/sœur). Les modèles statistiques (modèles de regression linéaires et non linéaires généralisés mixtes) tiendront compte de l’effet du traitement (avec ou sans enrichissments), de l’effet de la mère et de l’effet de la période/répétition des mesures. Afin de minimiser le nombre d’animaux en expérimentation, les agneaux de ce projet serviront aussi à la mise au point méthodologique de dosage de cortisol dans la laine. Cette méthode de dosage n’est pas encore complétement au point et plutôt que de réaliser une expérimentation supplémentaire les prélèvements réalisés dans ce projet serviront à affiner la méthode d’extraction et de dosage. Si la méthodologie se révèle être réalisable et fiable au niveau des résultats, ces derniers seront utilisés pour répondre aux objectifs de l’étude. Si ce n’est malheureusement pas le cas, les prélèvements réalisés sur les agneaux auront permis de faire avancer le développement méthodologique sans avoir à faire appel à d’autres animaux expérimentaux. NB : L’absence d’études préexistantes similaires (enrichissement multimodal dès 15 jours d’âge chez l’agneau et jusqu’à 130 jours d’âge) ne permet pas de s’appuyer sur des données de variablité préexistantes pour affiner le nombre d’individus afin de maximiser les chances de voir des différences significatives entre nos deux lots (témoin vs. enrichi).

Raffinement

L’objet même de l’étude est de valider la possibilité de raffiner par l’enrichissement multimodal du milieu de vie des animaux en comparant deux lots : un lot témoin (environnement classique d’élevage) et un lot enrichi. Dans tous les cas, les agneaux vivent en groupe social (avec la mère jusqu'au sevrage). Le sol est paillé pour améliorer leur confort. De même, les animaux sont hébergés dans des salles chauffées dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés. La surveillance des animaux (brebis et agneaux) des deux lots sera quotidienne afin de détecter le plus précocément possible tout problème de santé, indépendant de notre protocole. Les prises de sang seront réalisées sur des agneaux déjà habitués à la manipulation et à la contention par l’homme (via les trois périodes d’habituation à la pose des ceintures et capteurs pour les mesures d’activité cardiaque), ce qui permettra de minimiser le stress des agneaux et d’avoir ainsi des cortisolémies pertinentes pour l’étude. Le stress induit par les tests en environnement nouveau sera réduit par un passage avec un congénère connu lors de la prémière exposition. A terme, les analyses de cortisol dans la laine, si leur mise au point au cours de cette expérimentation se révèle faisable et pertinente, permettra de réduire le stress subi par les agneaux dans de futurs projets en limitant le recours aux prises de sang.

Choix des espèces

L'objectif est de contribuer à améliorer les connaissances et les recommandations sur l'élevage des ruminants, plus particulièrement en bâtiment, via l'apport d'enrichissements. Ceci dans une optique d’élevage durable et d'amélioration du bien-être. Le projet s’intéresse aux agneaux allaités par leurs mères, ce qui correspond à la très grande majorité des agneaux élevés en France en élevage ovin allaitant. Les ovins apparaissent donc comme étant à la fois une espèce cible (représentant une part importante de l’économie agricole française avec plus de 3,7 millions de brebis allaitantes en 2019 et environ le double d’agneaux) et une espèce modèle pertinente pour l’étude sur les ruminants. Le projet vise à déterminer l'influence de la présence d'enrichissement au jeune âge sur le développement comportemental et le bien-être des individus. Au regard de cet objectif, nous suivrons 40 agneaux de leur naissance jusqu'à la fin de la période d’engraissement (environ 130 jours).

35 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau puis des nanoparticules par voie intraveineuse et des irradiations, une partie étant tuée précocement pour l'analyse des tissus, afin de tester une thérapie photodynamique activée par rayons X. Le porteur relie le passage en gravité modérée aux anesthésies et transports répétés vers le site d'imagerie. Il conclut que le remplacement n'est "clairement pas possible" pour reproduire une tumeur cérébrale.

Objectifs

ll s'agit de valider le bénéfice d'une thérapie photodynamique activée par des rayons X sur un modèle de tumeurs cérébrales orthotopiques implantées chez la souris. Ce projet permettra de renforcer les effectifs et les résultats issus d'une étude préliminaire afin d'avoir une meilleure robustesse statisitique. L'utilisation de souris satellites (souris mises à mort précocémment pour l'observation des tissus au microscope pour observer l'effet précoce du traitement) permettra de caractériser par histologie les effets du traitement X-PDT régulièrement après l'adminitration du traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet mené en recherche préclinique permettra d'estimer si cette approche expérimentale est applicable par la suite chez l'Homme. Il permettra à long terme de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de ce type de tumeurs cérébrales très aggressives (glioblastome) en médecine humaine.

Procédures

Procédure 1 : Xénogreffe intracérébrale : implantation de cellules tumorales dans le tissu cérébral (35 souris au total pour une durée d'1h environ par animal, répété une seule fois en début d'étude) Procédure 2 : Administration intra-veineuse des nanoparticules sur souris vigiles 1h avant les irradiations : cette procédure ne nécessite pas d'anesthésie, la technique étant parfaitement maitrisée par les membres du laboratoire (durée 1min, 19 souris concernées avec 2 réitérations)

Impact sur les animaux

Anésthésie chimique ainsi que transport sur site d'imagerie répétés d'où passage de la saisine en classe modérée.

Devenir

Procédure 1 "xénogreffe intracérébrale" (implantation de cellules tumorales dans le tissu cérébral) : tous les animaux sont gardés en vie (implantation tumorale étant l'étape clé indispensable du projet) Procédure 2 "administration des traitements" : tous les animaux sont gardés en vie (pour permettre par la suite d'évaluer l'efficacité des traitements) Procédure 3 "suivi par imagerie" : tous les animaux sont gardés en vie sauf si un animal a atteint un des points limites décrit précédemment, il sera dans ce cas mis à mort à l'issue de la procédure. En outre, les animaux satellites (souris mises à mort précocémment pour l'observation des tissus au microscope pour observer l'effet précoce du traitement) pour lesquels le temps cinétique prévu est atteint (Jn+4, Jn+11, Jn+18) seront mis à mort à l'issue de la procédure en vue d'analyses histologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse au traitement in vivo de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes (intravasation, extravasation, envahissement du parenchyme cérébral, angiogénèse...). De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires (cellules tumorales, cellules endothéliales, stroma...). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal. L’évolution de l’intensité de bioluminescence sera un indicateur d’efficacité des traitements. De plus, chaque groupe sera caractérisé par une courbe de survie. Les survies moyennes seront comparées par test de Kruskal-Wallis suivi d’un test post-hoc si la différence entre tous les groupes est significative.

Réduction

Les données issues d'une étude antérieure nous ont permis de réaliser un premier suivi en imagerie de la croissance des cellules U251 -Luc implantées en stéréotaxie (procédure chirrugicale permettant d'implanter les cellules tumorales directement dans une région bien précise du cerveau), en traitant par la voie X-PDT. Les résultats étant prometteurs, il est cependant nécessaire de compléter les effectifs pour avoir une meilleure fiabilité statistique mais les données générées par cette première étude seront exploitées permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés dans cette étude complémentaire. L'estimation de l'efficacité de la thérapie par imagerie par Bioluminescence nécessite un suivi longitudinal des souris. Chaque animal sera son propre témoin ce qui constitue une stratégie permettant une utilisation judicieuse des animaux et assure une rigueur scientifique

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie à NancycloTEP, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger. De plus, une analgésie sera administrée lors des procédures invasives (chirurgie d'induction tumorale)

Choix des espèces

Souris : pour nos expérimentations, nous travaillerons sur des modèles de tumeurs humaines implantées chez des rongeurs immunodéprimés. Ces modèles sont très largement décrits dans la littérature et sont très pertinents dès lors qu'il s'agit d'évaluer de nouveaux agent diagnostiques ou thérapeutiques Des souris âgées de 6 semaines sont utilisées, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas de stéréotaxie de Paxinos et Franklin.

26 veaux de quatre à huit semaines vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 20 tués à l'issue et 6 gardés en réserve, réaffectés s'ils ne servent pas. Une injection de lipopolysaccharide provoque une inflammation, puis 20 prélèvements sanguins sur 72 heures retirent jusqu'à 262 mL de sang par animal, pour tester l'association d'un anti-inflammatoire et d'un antibiotique. Le porteur prévoit une mise à mort par tige perforante et exsanguination, les produits testés n'ayant pas d'autorisation de mise sur le marché. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la diffusion des principes actifs et juge "indispensable" le recours à l'animal entier.

Objectifs

Ce projet présente 4 différents objectifs: 1- Étudier les symptômes cliniques après une stimulation par LPS par administration sous cutannée 5.0 µg/kg par animal. 2- Évaluer la sécurité et l'efficacité d'une injection sous-cutanée d'un AINS en association avec un antibiotique longue action après une provocation expérimentale au Lipopolysaccharide (LPS) en comparaison avec l'antibiotique longue action seule (sous-cutané) et l' AINS seul (sous-cutané) en tant que monoproduits et une solution saline. 3- Évaluer les propriétés pharmacocinétiques des doses sélectionnées de l'AINS en association avec l'antibiotique longue action. 4- Évaluer l'évolution de certains marqueurs inflammatoires pertinents après le traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en avant les bénéfices de l'association de l'AINS avec l'antibiotique longue action, l'efficacité et la sécurité de cette administration conjuguée. Cela permettra de mettre en avant l'action de ce complexe sur les marqueurs de l'inflammation.

Procédures

La première étape est de créer le modèle inflammatoire. Pour cela, les 20 animaux sélectionnés recevront une administration de LPS ( Lipopolysaccharide provenant des bactéries Escherichia Coli) à la dose de 5.0 µg/kg soit 1 mL/50 kg. Puis les animaux seront répartis en 4 groupe de 5 animaux. Ils auront une administration sous cutanée de formulations tests c'est à dire d'une injection sous-cutanée d'un AINS en association avec un antibiotique longue action en comparaison avec l'AINS seul, l'antibiotique longue action seule en tant que monoproduits et une solution saline. Volume administré: 1 mL/40 kg. Puis Des prélèvements de sang seront également réalisés, 20 temps de prélèvements sur 72h (T0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 9, 12, 18, 24, 28, 32, 48, 56, 72 h aprés administration. La collecte de sang sera effectuée à l'aide d'un vacutainer avec des tubes d'héparine de lithium (LiHe) et d'héparine de sodium (SoHe) et des aiguilles stériles de taille appropriée. Les aiguilles seront remplacées entre chaque veau et chaque prélèvement. Les échantillons de sang seront prélevés au niveau des veines jugulaires. Les sites de prélèvement seront alternés autant que possible. Volume total prélevé: 262 mL de sang par animal sur 72h. La création du modèle inflammatoire se fait le jour des administrations des produits tests et consiste à faire une administration en sous cutannée. Toutes les administations se font sur une seule journée. Les prélèvements sanguins seront réparti sur 3 jours. La phase animale de ce projet se terminera 72h aprés l'administration des éléments tests.

Impact sur les animaux

Il est possible d'observer des effets indésirables. Il peut s'agir d'une forte fièvre, modification de la respiration, modification du comportement général des animaux ( exemple déambulation, toux...), présence éventuelle d'écoulement occulaire ou nasal.

Devenir

A la fin de ce projet, tous les animaux traités seront euthanasiés selon les bonnes pratiques vétérinaires et la réglementation en vigueur, car ces animaux auront reçu des éléments tests sans AMM. Méthode physique: étourdissement à l'aide d'une tige perforante suivi de l'exsanguination. L'exsanguination consiste à la section des veines jugulaires et/ou artères carotides. Il est prévu 6 animaux réserves. Si les 6 animaux réserves ne sont pas utilisés ils pourront dans ce cas être replacés. La décision sera prise par le vétérinaire responsable.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire la diffusion d'un ou de plusieurs principes actifs dans le sang et leurs effets sur l'animal, il est donc indispensable de recourir à l'animal entier.

Réduction

Dans cette étude, il est prévu d'inclure 26 animaux ( 20 animaux administrés et 6 animaux de réserve). C'est le nombre d'animaux minimum requis pour avoir des résultats interprétables.

Raffinement

Les animaux auront une période d'acclimatation d'au minimum 2 semaines. De leur arrivée à la fin de l'étude, les veaux seront logés en groupes de 5 animaux. Les veaux seront couchés sur de la paille dans un système de litière profonde, de la paille propre étant fournie si nécessaire. Une attention particulière sera portée au raffinement et à l’enrichissement du milieu autant que possible. La thermorégulation et la ventilation des logements des animaux ne seront pas contrôlées puisque les logements sont ouverts sur l'environnement extérieur. L'éclairage naturel sera utilisé. La température et l'humidité du logement des veaux seront enregistrées pendant la phase animale.

Choix des espèces

Les veaux sont particulièrement sensibles aux LPS, et constituent donc une espèce de choix pour créer un modèle de l'inflammation. Les jeunes veaux sont très sensibles aux maladies respiratoires et constituent donc un modèle approprié à utiliser pour tester l'efficacité des produits contre les maladies respiratoires. Ils constituent également l'espèce cible de ce produit. Les veaux auront 4 à 8 semaines le jour de l'administration

4 995 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des bactéries, greffées de cellules tumorales ou exposées à des substances cancérigènes, puis traitées par antibiotiques, immunothérapies ou phages, pour étudier la réponse immunitaire de la vessie. Le porteur reconnaît que l'infection peut causer des douleurs et qu'une tumeur à croissance rapide peut obstruer l'urètre. Il décrit ces travaux comme visant une "meilleure compréhension" des mécanismes immunitaires et affirme le recours à l'animal "absolument nécessaire", faute d'alternative.

Objectifs

Notre objectif est de comprendre la réponse immunitaire à l'infection, au cancer et aux immunothérapies dans la vessie. Cette compréhension nous permettra d'identifier des cibles pour les futures imunothérapies afin d'améliorer le traitement des infections, des cancers et d'autres maladies de la vessie.

Bénéfices attendus

Nous espérons avoir une meilleure compréhension du fonctionnement de la réponse immunitaire dans la vessie et comprendre les mécanismes par lesquels les approches thérapeutiques, telles que la vacciantion ou la phagothérapie, améliorent l'immunité contre la maladie.

Procédures

les animaux seront infectés par des bactéries, ou implantés avec des cellules tumorales, ou recevront des substances cancérigènes pour développer des tumeurs. Ensuite, les animaux seront traités avec des médicaments, tels que des antibiotiques, des immunothérapies ou des phages.

Impact sur les animaux

Bien que nous ayons mis en place un plan pour éviter les effets néfastes, il est possible que les animaux ressentent des douleurs dues à une infection, comme c'est le cas chez l'homme, ou que des tumeurs à croissance rapide provoquent une obstruction urétrale. Nous pouvons surveiller ce scénario pour éviter cette possibilité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de toutes les procédures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est absolument nécessaire pour ce projet puisqu’il n’existe aucune autre alternative pertinente pour ce genre de projet. En outre, ces études doivent être effectuées in vivo, parce qu’il est nécessaire que les organes et les systèmes impliqués soient intacts afin de bien comprendre la migration cellulaire et la réponse immunitaire (innée et adaptative).

Réduction

Réduction : Le nombre de souris a été calculé pour utiliser le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'analyse statistique, sur la base d'expériences antérieures. Dans la mesure du possible, un seul groupe témoin sera utilisé pour plusieurs groupes expérimentaux afin de réduire le nombre total de souris nécessaires, sans compromettre l'intégrité de l'expérience.

Raffinement

Raffinement : Tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress, l'inconfort et la douleur des animaux. Cela comprend une surveillance régulière, l'administration de médicaments antidouleur approuvés si les souris souffrent (aspect voûté, piloérection) et la détermination de points limites avant de commencer l'expérimentation (perte d'un pourcentage prédéterminé de poids, par exemple) (le tout conformément à la réglementation européenne).

Choix des espèces

Les souris sont un bon modèle pour étudier les réponses immunitaires contre les bactéries. Il a été démontré empiriquement que les infections des voies urinaires chez la souris reflètent, dans de nombreux aspects essentiels, l'état de la maladie observée chez l'homme. Il a été démontré que la voie utilisée par les pathogènes identifiés comme uropathogènes chez la souris est également utilisée chez l'homme, ce qui justifie l'utilisation de la souris comme un modèle approprié pour l’infection des voies urinaires. Des travaux précédents de notre laboratoire ont démontré que la réponse des souris traitées par BCG-thérapie pour le cancer de la vessie est très similaire à celle observée chez l'homme, justifiant à nouveau la souris comme un modèle utile pour l'étude de l'immunothérapie dans la vessie. On va utiliser les souris de 6 à 24 semaines. Cet âge chez la souris équivaut à l’âge adulte chez l’homme. Dans un très petit nombre d'observations, nous analyserons la vessie de souris néonatales non manipulées qui n'ont pas encore été sevrées, âgées de 0 à 28 jours, afin d'identifier spécifiquement le moment où les populations de macrophages résidents dans la vessie divergent en deux populations distinctes et si cela dépend du passage de l'allaitement à l'alimentation solide. Nous pensons avoir besoin de 8 à 10 souris par point temporel, 4 points temporels étant prévus. Donc, 40 souriceaux femelles et 40 souriceaux mâles

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par chirurgie stéréotaxique une greffe intracérébrale de cellules de gliome pédiatrique du tronc cérébral, tumeur incurable, pour tester l'effet de l'inhibition du gène VRK3 sur sa progression. Le porteur indique que les animaux développeront des troubles neurologiques et une ataxie liés à la tumeur. Il décrit ces modèles, suivis par bioluminescence, comme un "outil indispensable" faute de pouvoir reproduire l'infiltration tumorale hors de l'animal.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales constituent la première cause de mortalité et de morbidité par cancer chez l'enfant et l'adulte jeune. Les gliomes malins infiltrants du tronc cérébral (ou DIPG), qui représentent 10 à 15% des tumeurs cérébrales pédiatriques, sont les formes les plus graves et les plus mal connues sur le plan biologique. Ces tumeurs sont universellement incurables et constituent le plus grand défi thérapeutique de l'oncologie pédiatrique à ce jour. Nous avons initié un programme de recherche pour caractériser ces tumeurs et montrer qu’elles sont très différentes des gliomes de l’adulte et des tumeurs corticales de l’enfant. Des mutations originales de l’histone H3, quasi-constantes dans les DIPG et jamais décrites dans aucun autre type de cancer, ont été découvertes. Il s’agit donc d’un mécanisme oncogénique complètement inédit et intimement lié au développement de cette partie du cerveau. Par ailleurs, les DIPG ne forment jamais de masse tumorale, mais infiltrent les structures cérébrales normales puis se disséminent dans la totalité du cerveau. Nous avons récemment réussi à développer des modèles expérimentaux de tumeurs cérébrales issus de tumeurs de patients atteints de DIPG. Ces modèles que l'on peut suivre par bioluminescence, développent des signes cliniques neurologiques entre deux et quatre mois post-greffe, et histologiquement la tumeur se développe en infiltrant le tronc cérébral. Ces modèles sont encore très rares et sont un outil indispensable pour l'exploration de thérapies prometteuses. Afin d’identifier les gènes nécessaires à la survie cellulaire du DIPG, une étude de screening par shARN ciblant l’ensemble des kinases humaines a été réalisé sur quatre lignées in vitro. Plusieurs gènes ont été identifiés dont VRK3. Les résultats de ce crible ont été confirmés in vitro par shARN et Crispr/Cas9 sur un plus grand nombre de lignée cellulaire de DIPG. Pour les études vivo, des constructions spécifiques de shRNA et Crispr/Cas9, dirigées vers le gène VRK3, inductibles par la doxycyline ont été réalisés afin d’éteindre le gène dans les cellules tumorales après la greffe.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la réduction ou le ralentissement du volume ou de la croissance tumorale dans le cerveau de souris, comme modèle de la maladie humaine, après inhibition du gène VRK3 par induction de 845mg/kg de doxycycline dans l'alimentation. En effet, in vitro, nous avons pu voir que l'inhibition du gène VRK3 était létal sur les cellules. Nous nous attendons à cette létalité sur les cellules tumorales in vitro ou bien un ralentissement de leur croissance.

Procédures

Chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale (durée 30 minutes). Injection de luciférase en IP 10ml/kg sous anesthésie locale à raison d'une injection tous les 15 jours pour observer la bioluminescence (durée 1 minute).

Impact sur les animaux

L’inhibition de VRK3 sera spécifique aux cellules tumorales, car les constructions seront intégrées uniquement dans ces dernières en amont de la greffe, nous ne nous attendons donc pas à observer des signes de toxicité systémique chez la souris. Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liés aux symptômes tumoraux (trouble neurologiques perceptibles; ataxie).

Devenir

Mise à mort de tous les animaux pour prélèvements des cerveaux et analyses ex-vivo.

Remplacement

Une singularité des gliomes du tronc cérébral résulte dans leur phénotype systématique d’infiltration des structures normales, l’absence de masse tumorale et l’importante capacité d’invasion du tronc cérébral dans un premier temps, puis plus largement du cerveau au décours de la maladie. Ces particularités résultent des interactions des cellules tumorales avec leur stroma qui ne peuvent être appréhendées que dans des modèles vivo, où la variété et complexité du microenvironnement tumoral peut être reproduite.

Réduction

Nos xénogreffes intracérébrales de DIPG que nous pouvons suivre par bioluminescence, développent des tumeurs avec un temps de survie des animaux de façon reproductible. Le nombre minimal nécessaire et suffisant a été calculé au plus juste par calcul de puissance (GPower). Les contrôles ont tous été vérifiés et validés ou supprimés.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale (injections). Les animaux seront pesés deux fois par semaine et examinés trois fois par semaine au début de la maladie, puis quotidiennement avec des tumeurs au stade avancé. Ils seront hébergés au minimum par 2 avec un enrichissement de la cage type sizzlenest et recevront des anti-douleurs dès l’arrivée des premiers symptômes neurologiques ou de douleur. L'eau et la nourriture seront donnés ad libitum. La nourriture sera adaptée en cas de symptômes (DietGel).

Choix des espèces

L'utilisation de modèles de souris immunodéprimées (Swiss/Nude) permet la greffe de tumeurs humaines. Les animaux utilisés auront entre 4 et 6 semaines correspondant à l’âge du jeune adulte. Nos études préalables nous ont montrées qu'il n'y avait pas de différences de prise de greffe chez des animaux juste sevrés (3 semaines) et des animaux adultes (plus de 6 semaines). Cependant, le développement de la tumeur étant lent (entre 2 mois et 1 an selon les modèles), nous utiliserons des animaux jeunes afin de ne pas avoir un état général dégradé qui pourrait être dû à la dégénérescence du modèle en fin de protocole.

768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 tuées comme donneuses de moelle osseuse et 720 transférées vers un autre protocole de tests comportementaux. Rendues obèses par un régime gras pendant 18 semaines, elles reçoivent du busulfan induisant une myélodysplasie, une greffe de moelle et des prélèvements sanguins répétés, pour étudier le rôle de la protéine DNase1L3 dans le syndrome métabolique et la dépression liés à l'obésité. Le porteur décrit la perte de poids et l'anémie post-busulfan comme "transitoires". Les 720 survivantes prolongeront l'expérimentation dans une animalerie dédiée aux tests d'anxiété et de dépression, sous une autre autorisation.

Objectifs

Nous avons observé que la déficience en DNase1L3 rend les souris plus susceptibles au développement du syndrome métabolique induit par l’obésité. Un de nos objectif courant est de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires de la DNase1L3 dans le contexte de l’obésité. De plus, l’obésité induit des troubles neuropsychiatriques comme la dépression. Un deuxième objectif de notre travail est d’évaluer l’impact de la déficience en DNase1L3 sur la survenue des syndromes neuropsychiatrique induits pas l’obésité. Tous les concepts, incluant l’état de l’art, le rationnel de notre étude ainsi que sa méthodologie sont décrits dans la section suivante.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mettre en évidence le rôle de la DNase1L3 dans la régulation de l’inflammation chronique induite par l’obésité ainsi que ces mécanismes d’actions. De plus, il nous permettra de déterminer si une dérégulation de la DNase1L3 peut contribuer aux troubles neuropsychiatriques induits par l’obésité. Ainsi notre projet pourra conduire aux développements de nouvelles approches thérapeutique basées sur la supplémentation en DNase1L3 afin de limiter l’inflammation chronique induite par l’obésité qui est à l’origine du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques.

Procédures

Les souris sont soumises à un régime riche normal et riche en graisse durant 18 semaines. Une myélodysplasie est induite par le Busulfan durant 4 jours. Une reconstitution des souris myélodysplasique est faite par transfer de cellules de moelle osseuses . La reconstitution se fait par une seule injection et a lieu en 1 mois. Des prises de sang retroorbitaires sont effectué toutes les six semaines. Un test de tolérance au glucose par injection i.p de glucose et prise de sang a la base de la queue est effectué toutes les 6 semaines aussi.

Impact sur les animaux

1. Placer les animaux sur un régime riche dans le temps imparti pour l’expérimentation augmente leur poids d’une manière considérable sans causer une altération significative de l’état général de l’animal. 2. La génération de souris chimérique nécessite l’induction d’une myélodysplasie par un traitement aux Busulfan. Ce traitement induit une perte de poids

Devenir

Procédure 1 : 288 animaux sont inclus dans cette procédure. 48 animaux sont utilisés en tant que donneur de moelle osseuse et sont euthanasiés par dislocation cervicale a l’issue de cette procédure. Le prélèvement de la moelle osseuse ne peut être effectue que sur des animaux morts. Le reste des animaux (240), constituent les animaux chimériques receveur de moelle osseuse qui seront gardés en vie et donc inclus dans les procédures qui suivent. Procédure 2. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à un régime normal (360) et un régime riche en graisse (360). Tous les animaux de cette procédure sont gardés en vie en passent dans la procédure 3. Procédure 3. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à des prises de sang. Tous les animaux de ces procédures sont gardés en vie en passent dans la procédure 4. Procédure 4. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à un test de tolérance au glucose. Tous les animaux de ces procédures sont gardés en vie et transférés dans l’animalerie NutriNeuro ou ils seront soumis à des tests comportementaux. Une autre DAP a été soumise pour cela.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologiques observés chez l'homme, peut apporter la preuve du rôle de la DNase1L3 dans le développements d’un syndrome métabolique et dans la régulation des troubles neuropsychiatriques qui découlent de l’inflammation induite par l’obésité. De plus les études comportementales afin d’évaluer le développent de l’anxiété et des états dépressifs ne peuvent être réalisé que sur des animaux vivants. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro ou ex vivo, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité de la régulation des états mentaux par les processus inflammatoires.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Afin de réduire le nombre d’animaux nous avons également optimisé leur utilisation. En effet sur les mêmes animaux nous allons à la fois évaluer la survenue du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques. Cela nous permet de réduire l’utilisation des animaux d’un facteur deux.

Raffinement

1.Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bienêtre (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur : Les prises de sang retro-orbitaires sont réalisés sur des animaux anesthésiés afin de réduire l’inconfort de cette procédure. De plus, les prises de sang réalisées à l’extrémité de la queue incluent une anesthésie locale pour réduire la douleur qui peut être induite par cette procédure.

Choix des espèces

Nous utiliserons les souris C57Bl/6 pour cette expérimentation. Les souris déficientes pour la DNase1L3, DNase1, TLR9 et IFNAR sont uniquement disponibles dans cette espèce et sur ce fond génétique. De plus, elles sont très sensibles aux régimes alimentaires pour l'induction de l’obésité (Surwit et al., Diabetes, 1988). Comme l’Homme, elles développent une obésité, un diabète de type II, une stéatose hépatique et des troubles neuropsychiatriques (dépression et anxiété) un fois exposées à un régime riche en graisse, alors qu’avec une alimentation standard, elles restent minces et ne développent pas de problèmes métaboliques ni de troubles neuropsychiatriques. En plus des souris congénique B6/SJL (pep boy, CD45.1) seront utilisées pour réaliser des chimères de moelle osseuse. Leur utilisation est necessaire afin d'évaluer l'efficacité de nos greffes qui est rendu possible par l'analyse de l'expression du variant de la molécule CD45. Les souris seront nourries dès l’âge de 12 semaines par HFD. L’exposition des souris C57BL/6 de cet age à un régime HFD ad libidum conduit à une obésité et au développent du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques assez proche de ceux se développant chez l’homme. Les premières manifestations apparaissent environ 6 semaines après l’introduction du régime HFD mais l’hyperglycémie, l’insulino-résistance, la stéatose hépatique ainsi que les troubles neuropsychiatriques sont observées vers 18 semaines post régime HFD (Surwit et al. ; Diabetes, 1988).