Oncologie

361 rongeurs, 280 souris et 81 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs du défaut génétique de la maladie de stockage du glycogène de type III, ils reçoivent une injection unique d'un vecteur de thérapie génique à doses croissantes, quatre anesthésies générales, des prélèvements sanguins répétés et des tests de force musculaire, avant une mise à mort pour prélever les organes. L'objectif est de déterminer la dose efficace de cette thérapie génique en développement non clinique, en vue d'une future application chez l'humain. Le porteur affirme que le ciblage simultané de trois tissus n'est pas réalisable in vitro et que les deux espèces sont nécessaires, seul le rat reproduisant l'atteinte cardiaque.

Objectifs

La maladie de stockage du glycogène de type III (ou GSD III pour glycogen storage disease III) est une maladie génétique héréditaire rare causée par des mutations dans le gène AGL (pour amyloglucosidase glucanotransférase) qui fabrique l’enzyme débranchante du glycogène nommée GDE. Cette enzyme joue un rôle essentiel dans la transformation du glycogène, molécule de stockage composée de successions de glucose, en unité élémentaire de glucose dans les muscles et le foie. Dans la pathologie, le glycogène non décomposé s’accumule dans les muscles squelettiques et cardiaque et dans le foie, altérant leurs fonctions. L'apparition de la maladie commence dès la petite enfance et comprend l'hypoglycémie, l'hyperlipidémie (excès de graisses dans le sang) et l’élévation des taux sanguins d'enzymes hépatiques causée par la mort des cellules du foie. Au niveau du foie, les symptômes tardifs peuvent inclure une hépatomégalie (foie anormalement gros), reflétant une affection chronique (cirrhose) et, parfois, des tumeurs hépatiques non cancéreuses. Des maladies du cœur peuvent apparaitre. Les fonctions immunitaires sont altérées. Certaines personnes sont de petite taille. Aucun traitement curatif n'existe à ce jour. Notre étude vise à définir la dose efficace d’un traitement de thérapie génique ayant pour but de réintroduire un gène fonctionnel fabriquant la GDE dans les cellules hépatiques et musculaires. Un vecteur recombinant dérivé d’un virus portant le gène AGL fonctionnel sera injecté à doses croissantes dans des modèles de souris et de rats porteurs du défaut du gène agl et l'effet de la thérapie génique sera évalué au cours du temps au niveau des fonctions musculaires, cardiaques et hépatiques.

Bénéfices attendus

A court terme, les effets bénéfiques du traitement chez les souris et les rats porteurs du défaut du gène agl devraient permettre de stabiliser ou de diminuer l'accumulation de glycogène au niveau du foie et des muscles squelettiques et cardiaques, ce qui devrait entrainer une régénération des tissus, une amélioration de la masse et de la force musculaire et une amélioration de la fonction cardiaque. Ce projet de développement non clinique devrait permettre de déterminer la dose minimale efficace du traitement sur tous les organes cibles afin d'envisager, dans un second temps, une application clinique pour le traitement de la GSDIII par thérapie génique.

Procédures

Les souris et les rats recevront tous une injection intraveineuse unique de vecteur thérapeutique en début de protocole : chaque injection ne prendra pas plus de 2 minutes. Pour réaliser l’ensemble des tests et prélèvements, les souris et les rats recevront 4 anesthésies générales par voie intrapéritonéale. Chaque injection ne prendra pas plus de 2 minutes. Les souris subiront 3 mesures de test fonctionnels de suspension et de test d'agrippement et trois mesures de l'activité électrique musculaire espacées chacune de 2 mois. Chaque mesure ne prendra pas plus de 20 minutes. Les souris subiront 4 prélèvements de sang espacés de 2 mois, dont un prélèvement terminal avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 10 minutes. Les souris subiront une mesure de force musculaire juste avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les souris seront euthanasiées après la mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques. Les rats subiront 3 mesures d’électrocardiogramme et d’échocardiogramme. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les rats subiront 4 prélèvements de sang espacés de 2 mois, dont un prélèvement terminal avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 10 minutes. Les rats subiront une mesure de force musculaire juste avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les rats seront euthanasiés après la mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des périodes de jeûne contrôlé de 4 heures avant les prélèvements sanguins, ce qui pourraient entrainer une sensation de faim, de stress et une hypoglycémie. Ils seront maintenus en contention manuelle ou dans une boite à contention pour les injections intraveineuses, ce qui pourrait entrainer un stress. Certains actes d’évaluation fonctionnelle seront réalisés sous anesthésie gazeuse, ce qui pourrait entrainer une confusion de l’animal au réveil en cas de surdosage. Des douleurs locales pourraient être ressenties au moment du prélèvement d’un petit morceau de queue ou d’oreille (acte réalisé pour l’identification des animaux), au moment des injections intraveineuses du produit thérapeutique, des injections intra-péritonéales d’anesthésique, des injections sous-cutanées d’analgésique, ainsi qu’un moment des prélèvements de sang par voie sous-mandibulaire. Des lésions locales de type inflammatoire accompagnées de douleurs localisées pourraient être causées par la pose d’électrodes transcutanés au moment de la mesure de l’activité électrique du muscle ou lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire réalisés sur animal éveillé, notamment si un animal présente des blessures aux griffes ou aux pattes au moment du test. Toutes les nuisances possibles sont localisées et réversibles, ce qui constitue pour l’animal un niveau global de contrainte modérée.

Devenir

P1 et P2: Euthanasie. P3: toutes les souris hétérozygotes seront euthanasiées, toutes les souris homozygotes seront utilisées dans la procédure 1, une partie des souris wild-type sera utilisée dans la procédure 1 (14 souris) et le reste des souris wild-type sera euthanasié (56 souris).

Remplacement

Le projet consiste à mesurer l'effet thérapeutique du transfert génétique du gène agl au niveau du foie, du cœur et des différents muscles squelettiques: ce test n'est pas réalisable dans les modèles cellulaires car il est impossible de cibler trois tissus simultanément in vitro et d’étudier la biodistribution relative de notre molécule thérapeutique entre les différents organes cibles. L'utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée dans notre projet.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction du nombre de souris, nos prévisions d'effectifs sont basées sur des calculs de statistiques prédictives visant à observer une amélioration de la fonction musculaire dans les 2 modèles murins utilisés (souris et rats). Ces calculs permettent de prévoir un effectif de 7 souris et de 8 rats par groupe et par sexe, les deux sexes devant être inclus dans les études de recherche de dose thérapeutique afin de prendre en compte une éventuelle variabilité des effets liée au sexe (soit 14 et 16 individus par groupe pour les souris et les rats, respectivement). Pour les études réalisées sur les souris, 4 doses seront testées en parallèles d’un témoin non traité et d’un groupe de référence d’animaux en bonne santé, et 3 doses seront utilisées pour les études réalisées sur les rats avec les mêmes groupes témoins, soit un total de 84 souris et de 80 rats pour l’ensemble de l’étude.

Raffinement

Les souris et les rats étant des animaux sociaux, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements spécifiques s'avéraient nécessaires. Les animaux recevront une injection unique du traitement par veine caudale, et subiront 3 prélèvements de sang au cours des 4 mois du protocole (un avant le traitement et un tous les deux mois). Ces prélèvements seront réalisés au niveau d'une veine du museau sur animaux vigiles maintenus en contention (souris) ou sous anesthésie gazeuse (rats). Les animaux subiront également un prélèvement de sang d’un volume plus important au moment de l’euthanasie, par prélèvement au niveau du sinus rétro-orbital, sous anesthésie générale. Au cours du protocole, tous les animaux seront soumis à différents tests fonctionnels permettant de mesurer l’effet du traitement au niveau des muscles squelettiques (souris et rat) et du cœur (rats seulement). Les tests douloureux seront réalisés soit sous anesthésie gazeuse, soit sous anesthésie générale et un antalgique fort sera administré par voie sous cutanée avant de le réaliser. Le même antalgique sera également administré pendant les 48 heures qui suivront la fin de certains tests. Tous les tests fonctionnels seront effectués dans une salle dédiée isolée du lieu d'hébergement, dans un environnement calme. Les animaux seront également pesés deux fois par semaine pendant tout le protocole afin de détecter le moindre signe de souffrance.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles les plus couramment utilisés par la communauté scientifique du domaine pour estimer l'efficacité d'approches thérapeutiques sur les pathologies génétiques. Le modèle de souris de la GSDIII permet une évaluation fonctionnelle très complète de différents groupes musculaires, mais ne reproduit pas l’atteinte cardiaque des individus affectés par la GSDIII. Le rat est le seul modèle reproduisant cet aspect de la pathologie. L'utilisation des deux modèles de GSDIII permettra de valider l’effet du traitement sur l’ensemble des organes affectés par la pathologie. Les souris et les rats seront de jeunes adultes âgés de 4 mois au moment du traitement et de 8 mois à la fin du protocole. La caractérisation préalable des deux modèles a permis de déterminer que la pathologie sera déjà présente au moment du traitement, ce qui permettra de tester l’effet de réversion de la pathologie, et non pas sa simple prévention. Ce choix permet de se rapprocher au plus juste de la pathologie humaine, qui sera traitée majoritairement après l’apparition des symptômes.

256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lignées génétiquement modifiées privées de gènes clés du métabolisme sont créées, puis soumises à des prélèvements sanguins répétés, à des tests de tolérance au glucose après jeûne et à une diète cétogène presque totalement dépourvue de sucres, avant une mise à mort pour prélever les organes. L'objectif est de mesurer les contributions respectives du foie et du rein dans la production des corps cétoniques, avec une visée translationnelle vers l'usage humain de la diète cétogène. Le porteur affirme que l'étude des délétions géniques tissu-spécifiques n'est faisable que sur des souris.

Objectifs

Le projet a pour objectif de déterminer les contributions relatives foie et des reins dans la production des corps cétoniques lors d’une administration d’une diète cétogène. Pour pouvoir déterminer les contributions des deux organes à la foi dans l’anabolisme (synthèse) des corps cétoniques (par les deux organes) et dans le catabolisme (utilisation) par le foie, les enzymes clé pour la synthèse (HMGCS2) et l’utilisation (OXCT1) des corps cétoniques seront deletée dans le foie ou les reins (OXCT1) et dans le rein (SCOT1) pour générer de lignées knock out tissues spécifiques. La génération des lignées de souris constitue le premier objectif du projet. Le deuxième objectif est d’étudies le métabolisme de ces lignées de souries pendant une diète contrôle, enrichie en gras et sucres et cétogène.

Bénéfices attendus

Le projet présenté vise à améliorer les connaissances scientifiques sur le métabolisme des corps cétoniques. Dans les humaines, la diète cétogène est utilisé dans des conditions cliniques particulières come approche nutritionnel reconnu (épilepsie) ou dans des études exploratoires (certains types de cancer, ou comme diète avant une chirurgie bariatrique). Notre projet pourra apporter des nouveaux acquis scientifiques utiles dans ce contexte translationnelle vers l’utilisation de la diète cétogène dans l’homme.

Procédures

L'intervention principale sur les animaux consistera dans des prélèvements sanguins et prélèvement de queue pour génotypage. La prise de la glycémie chaque deux semaines (7 fois pendant le protocole nutritionnel) sera faite à l'état vigil après 6 heures de jeûne. Une ponction de la veine caudale (4-5 microlitres de sang) permettra de mesurer la glycémie au glucomètre. La tolérance au glucose sera évalué à 8 et 16 semaines (2 fois pendant le protocole nutritionnel) à l'état vigil après 6 heures de jeûne, suite à une injection intra-péritonéale de glucose 2mg/g du poids de la souris. Pour cela, des ponctions de la veine caudale (4-5 microlitres de sang) seront effectués à l'extrémité de la queue aux temps 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes, afin de suivre la courbe de la glycémie et de l'insulinémie. L'incision de la queue sera réalisée au temps t0, puis les prélèvements suivants seront effectués par simple grattage du caillot sanguin. Lors des prélèvements d'un fragment minime de queue pour le génotypage l’utilisation d’une crème anesthésiante à la lidocaïne sera envisagée afin de minimiser toute douleur et/ou souffrance associée au prélèvement.

Impact sur les animaux

Par rapport aux données de la littérature sur les souris sauvages (wild-type), les protocoles d’alimentation cétogène présentés dans ce projet ne devraient pas être susceptibles de générer des effets indésirables. Néanmoins, si l’administration de la diète cétogène (presque totalement dépourvue en sucres) devrait générer de la souffrance (inappétence, perte de poids, troubles comportementales), notamment dans les lignées transgéniques, le protocole sera terminé et les souris retournées à la diète standard avant mise à mort. La génération de souris transgéniques pourrait aussi engendrer un phénotype dommageable. Celui-ci pourrait consister dans des effets sur les paramètres métaboliques qui pourraient être manifestes à la naissance tels que hypo or hyperglycémie ou cétoacidose. Pour déceler ces événements, si les nouveaux nés montreront des signes de souffrance, la glycémie et cétonemie seront mesurées avec le kit Nova pro glu/ket qui mesure la glycémie et cétonemie de façon simultanée. Si avérées, ces évènements mèneront à l’arrêt de la génération de la ligne transgénique.

Devenir

Les protocoles se termineront avec une prise de sang retroorbitale (après anesthesie), et mise a mort par dislocation cervicale pour pouvor recuperer differents organes et tissues. La necessité de faire les analyses biochimiques justifie la mise à mort et recuperation de ces tissus et organes.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l’analyse des effets des diètes au niveau de l’organisme et, d’un point de vue mécanistique, l’étude des Knock-outs tissue-spécifiques pour les gènes Oxct-1 et HMGCS2 ne peut être faisable que sur des souris.

Réduction

Notre stratégie de réduction, tout en restant dans de limites imposée par la nécessité d’obtenir une puissance statistique satisfaisant, nous permet d’avancer une demande d’utilisation de 256 souris au maximal.

Raffinement

Dans ce projet nous essayerons de raffiner et optimiser les procédures expérimentation pour réduire au maximum l’inconfort et les stress subie par les animaux. En plus, les protocoles ont été prévus de façon d’obtenir le plus d’informations possible de chaque animal en imposant, en même temps, le "moindre coût" en terme de mal être des animaux. Le raffinement dans le protocole expérimentale s’applique tout au long de la vie des animaux, et en particulier pendant la durée des protocoles nutritionnels. Pour satisfaire les conditions de raffinement, nous planifierons les protocoles de façon à éviter des perturbations susceptibles de procurer le stress de l’animal. De plus, les recours à l’anesthésie/analgésie est prévu pour les prises de sang et nous utiliserons des procédures d’euthanasie appropriées (dislocation cervicale) et sous anesthésie. Ces procédures de raffinements nous permettront aussi de générer des résultats de meilleure qualité et d’exploiter au mieux les résultats obtenus lors de l’expérimentation.

Choix des espèces

Comme notre projet est à l’interface entre le métabolisme et la signalisation cellulaire, le recours au model murin nous permettra i) dans les études nutritionnelles sur les souris wild-type d’obtenir des données nouvelles et originales dans le contexte de la grande quantité de littérature décrivant les effets d’une diète obésogène sur les souris et ii) en ce que concerne les études mécanistiques en utilisant les modèles KO, tissue-spécifiques, d'éclaircir les métabolisme des corps cétoniques et des effets bénéfiques potentielles de la diète cétogène. L’intervention nutritionnelle (diète contrôle, hypercalorique, cétogène) débutera chez des souris âgées de 5 semaines et se poursuivra pendant 16 semaines consécutives. Il est important que le protocole nutritionnel débute peu de temps après le sevrage pour maximiser les effets métaboliques. La présence de troubles métaboliques (hyperglycémie, intolérance au glucose …) chez la souris sous diète hypercalorique/hyperglycémique après 8 semaines de régime est connue, permettant de valider les potentiels effets bénéfiques d'une diète cétogène administée après les 8 semaines de diète hypercalorique/hyperglycémique. A la fin du protocole, les souris seront âgées de 21 semaines.

250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de tumeurs mammaires 4T1, elles passent des examens d'IRM sous anesthésie, les effets indésirables déclarés se limitant au développement de la tumeur. L'objectif est de concevoir et valider des agents de contraste ciblant la nétrine-1 pour détecter plus tôt le cancer mammaire métastatique. Le porteur décrit très brièvement les procédures et affirme que l'étude préclinique ne peut se faire que sur un "organisme vivant entier".

Objectifs

Le projet a pour objectif la conception et la validation de nouveaux agents de contraste qui ciblent spécifiquement la nétrine-1, pour le diagnostic précoce du cancer mammaire de type métastatique.

Bénéfices attendus

Les bénfices de ce projet concerne la possiblité d'une détection précoce du cancer mammaires pour une prise en charge plus rapide et plus éfficace

Procédures

les animaux passeront des examens d'imagerie non invasive in vivo d'IRM

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont liés au développement de la tumeur 4T1. Une grille descoring a été établie et des points limites ont été définis.

Devenir

à l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par disclocation cervicale

Remplacement

le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisque l’étude préclinique en particulier ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.

Réduction

le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Pour ces procédures expérimentales, la stratégie d’observation des animaux retenue est l’observation des animaux et l’imagerie in vivo. La bonne connaissance de l’état clinique normal de la souche de souris utilisée nous permettra d’observer précisément et d’interpréter rigoureusement les signes cliniques de souffrance des animaux. Les souris seront observées chaque jour de la semaine et les critères comportementaux et tumoraux pris en comptes pour l’évaluation du pallier de douleur (point limite) sont présentés dans les procédures. Les mêmes animaux seront utilisés pour les différents temps du suivi. Cette approche permet de réduire de façon notable le nombre d’animaux nécessaires à 10 par groupe pour en avoir 5 de taille homogène, nombre nécessaire permettant l’obtention d’une étude avec des souris homogènes en taille de tumeurs par stade de développement tumoral. Des tests t non paramétriques avec correction de Welch seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris (n=5).

Raffinement

les animaux sont observés scrupuleusement afin de respecter leur bien-être et d’éviter au maximum la douleur au moment de l’expérimentation. Des points limites prédictifs ont été mis en place. Durant les acquisitions d’imagerie les animaux seront anesthésiés

Choix des espèces

La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigénèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Les tumeurs mammaires métastatiques 4T1 étudiées sont spécifiques du modèle murin. 5 - 6 semaines, stade où les bourgeons mammaires ne sont pas complètement développés et où les conditions hormonales de la souris sont adéquates pour la croissance tumorale.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la patte sous anesthésie, puis elles reçoivent un traitement par injection intrapéritonéale trois fois par semaine, l'implantation dans la patte pouvant gêner son usage et provoquer une nécrose cutanée. L'objectif est de comprendre le rôle de la protéine NLRP3 dans les lymphocytes T CD8 et la réponse antitumorale, recherche fondamentale rattachée à l'immunothérapie anti-PD1 à laquelle seuls 20 % des patients répondent. Le porteur affirme que le recrutement des cellules au site tumoral ne peut être étudié in vitro et que la souris est la seule espèce transgénique disponible.

Objectifs

NLRP3 est une protéine largement décrite pour son rôle dans l’inflammation. L’inflammation va impacter alors d’autres cellules de l’immunité appelées lymphocytes T CD8. Il y a quelques années, nous avons démontré que NLRP3 possède des fonctions dites non-canoniques, c’est-à-dire indépendantes de l’inflammasome notamment dans les lymphocytes T CD4. Les cellules T CD8 ont beaucoup de caractéristiques communes aux lymphocytes T CD4. Nos données préliminaires obtenues in vitro, laissent penser que NLRP3 est présent dans les lymphocytes T CD8. Au regard de ces résultats, nous souhaitons aujourd’hui comprendre le rôle de NLRP3 dans la biologie des lymphocytes T CD8 et l’effet sur la réponse immunitaire anntitumorale. Pour discriminer les effets dépendants de l’inflammation et de NLRP3 endogène aux CD8, nous avons croisé des souris CD8cre avec des souris NLRP3flox nous permettant d’obtenir des souris dans lesquelles seuls les CD8 sont déficients pour NLRP3. Ainsi, en comparant les cellules T CD8 infiltrant les tumeurs des souris C57Bl6, NLRP3 totalement déficientes pour NLRP3 et CD8cre x NLRP3flox, nous pourrons déterminer comment la déficience en NLRP3 impacte la biologie de lymphocytes T CD8 et la réponse immunitaire anti-tumorale.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : - A l’heure actuelle aucune étude n’a évalué le rôle de NLRP3 dans les lymphocytes T CD8. Cette étude permettra d’apporter des connaissances nouvelles. - L’immunothérapie par anti-PD1 est une stratégie thérapeutique de plus en plus utilisée en cancérologie humaine. Malheureusement seul 20% des patients répondent à cette thérapie. Cette étude pourrait permettre d’évaluer si le ciblage de NLRP3 pourrait être une alternative ou un complément pour réactiver les lymphocytes CD8 antitumoraux et améliorer la réponse immunitaire antitumorale. Plusieurs études ont tenté de décrire le rôle de NLRP3 dans la tumorigenèse et la réponse immunitaire antitumorale. Dans toutes ces études, seules les fonctions de NLRP3 dépendantes de l’inflammasome et de l’IL-1b ont été explorées. Grâce à notre étude, nous pensons pouvoir affiner les résultats de la littérature en dissociant les effets de NLRP3 dans ses fonctions canoniques et non canoniques

Procédures

Les animaux recevront une injection de cellules tumorales en sous cutanées dans la patte sous anesthésie générale à l’isoflurane. Puis 3 fois par semaines, les animaux, vigiles, recevront un traitement par injection intrapéritonéale. Nous profiterons de cette manipulation pour mesurer la taille des tumeurs grâce à un pied à coulisse. En fin d’expérience, es animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l’isoflurane.

Impact sur les animaux

Les tumeurs seront induites en sous cutanées dans la patte. En effet, il a été observé que le recrutement des cellules immunitaires était de meilleur qualité à ce site d’injection. De ce fait, une des nuisances pouvant être observée est une difficulté à se servir de la patte en question. Une autre nuisance qui pourrait être observée est la formation de nécrose cutanée. Afin de limiter ces nuisances, les souris seront observées tous les 2 jours et les points limites tiendront compte de ces effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience car nous étudierons les cellules immunitaires présentes dans les tumeurs, rate et ganglions.

Remplacement

Nous avons déjà réalisé un certain nombre d’expériences in vitro pour caractériser les différences entre les CD8 issus de souris C57Bl6 et les CD8 déficients pour NLRP3. Ceci nous a permis d’identifier des marqueurs d’intérêt et phénomènes à explorer in vivo. Malheureusement, le recrutement au site tumoral et l’implication dans la réponse immunitaire antitumorale ne peuvent pas être appréhendés in vitro à l’heure actuelle car ce sont des mécanismes trop complexes qui font intervenir plusieurs acteurs cellulaires et moléculaires. Une fois que nous aurons obtenus les résultats de cette étude chez la souris, le décryptage des mécanismes moléculaires mis en œuvre sera réalisé in vitro.

Réduction

Dans un souci de réduction, les expériences ne seront réalisées que 2 fois et par des personnes parfaitement formées aux gestes permettant d’optimiser la reproductibilité. De plus, chaque expérience de croissance tumorale sera accompagnée d’une analyse de l’infiltrat immunitaire afin de récolter un maximum d’informations sur les mêmes souris sans avoir besoin de recommencer les expériences.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Ils seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (la fréquence de surveillance sera bien entendu augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux). Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal monterait des signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées sous la peau, puis une partie reçoit des traitements par gavage cinq jours par semaine et par injection intrapéritonéale deux fois par semaine, la tumeur pouvant atteindre 1 000 mm³. Le porteur décrit une gêne légère par geste dont l'accumulation devient modérée, et cherche à confirmer in vivo que bloquer le facteur CTGF limite l'agressivité tumorale dans le cancer du rein. Les retombées cliniques annoncées, de nouvelles combinaisons de médicaments, restent au conditionnel, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les interactions entre compartiments cellulaires.

Objectifs

Les tumeurs du rein sont très riches en vaisseaux sanguins. Une des stratégies thérapeutiques est de bloquer la formation de ces vaisseaux par des traitements anti-angiogéniques. Malheureusement, les patients développent des résistances au traitement et la maladie progresse inéluctablement. Notre équipe cherche à comprendre les mécanismes moléculaires qui expliquent l’apparition de résistance chez les patients atteints de cancer du rein à cellules claires. Nos résultats in vitro montrent que les cellules libèrent des molécules en réponse au traitement. Parmi ces molécules, nous avons identifié le facteur de croissance des tissus conjonctifs (CTGF), et nous avons montré que CTGF participe à l’agressivité tumorale. Par conséquent, nos résultats suggèrent que le ciblage de CTGF pourrait représenter une stratégie thérapeutique innovante. Nous souhaitons confirmer in vivo que bloquer CTGF permettrait de limiter l’agressivité tumorale voir induire la mort des cellules tumorales. Cette étude nous permettra de conclure sur la pertinence de l’utilisation d’un anticorps anti-CTGF dans le traitement du cancer du rein à cellules claire métastatique.

Bénéfices attendus

La validation de nos résultats in vitro sur un modèle in vivo nous permettrait dans l’avenir de développer des stratégies thérapeutiques ciblant CTGF dans le traitement des RCC. Cette démarche fondamentale et translationnelle permettra d’améliorer l’efficacité des drogues par l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques / biomarqueurs de résistances. Un transfert vers la clinique avec de nouvelles voies thérapeutiques incluant des combinaisons innovantes de médicaments serait l'accomplissement de ce projet.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales (une injection par souris). Ces souris seront divisées en 2 groupes. Un groupe ne subira aucun traitement, seul un suivi de la croissance tumorale sera réalisé. Pour le second groupe, lorsque la tumeur atteindra un volume suffisamment important, des traitements seront administrés aux souris en gavage et/ ou en injection intrapéritonéal. Le traitement par gavage sera réalisé 5 fois par semaine et le traitement en intrapéritonéal 2 fois par semaine. Ces injections, que ce soit de cellules tumorales ou du traitement administré, ne dureront que quelques secondes chaque fois. Le traitement par gavage, réalisé à l’aide d’une canule de gavage est également une procédure très rapide. Enfin, aucune autre intervention ne sera réalisée sur l’animal vigil ou endormi. Les souris seront monitorées quotidiennement afin d’assurer une bonne gestion de la douleur. Chacune des souris de ce projet sera suivie à l’aide d’une fiche de score adaptée à son traitement puis mise à mort à la fin de la procédure expérimentale ou si l’animal atteint un point limite. Si aucun point limite n’est rencontré, les traitements auront lieu durant 4 à 5 semaines jusqu’à atteindre un volume tumoral de 1000 mm3.

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les injections sous-cutanées de cellules tumorales ainsi que les gavages sont associés à une gêne voir douleur de type légère. Ces actes expérimentaux ne nécessitent cependant aucune anesthésie. Ces cellules tumorales ne metastasent pas. Les animaux seront mis à mort suffisamment tôt afin d'éviter l'apparition de nécroses au niveau des tumeurs. Néanmoins, s'agissant d'un protocole impliquant i) l'injection de cellules tumorales, et ii) des traitements par gavage (5 jours /7) et en intrapéritonéal (2 fois par semaine), qui, individuellement, vont générer une douleur légère et du stress mais dont l’accumulation par animal entraine une nuisance globale modérée.

Devenir

Le prélèvement des tumeurs nécessitera la mise à mort des souris.

Remplacement

Aucune méthode alternative ou modèle in vitro n’existe pour mimer les interactions qui existent entre les différents compartiments cellulaires (endothelial, epithelial, stromal, etc).

Réduction

Avant de passer au modèle in vivo, toutes nos expériences ont été préalablement validées in vitro. Nous avons également effectué une large recherche bibliographique. Les effectifs ont été choisis afin d’obtenir des résultats significatifs avec le nombre de souris minimum. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous baserons sur les données de la littérature et sur nos résultats antérieurs pour les doses administrées de composés pharmacologiques. Le nombre minimum de souris est établi à 10 par groupe pour être statistiquement significatif (en nous basant sur le fait que les traitements expérimentaux induiront une diminution de la prise/croissance tumorale d’au moins 20%). Enfin, nous utiliserons un test statistique paramétrique (test Anova) afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de données statistiquement exploitables statistiquement.

Raffinement

Pour limiter la douleur modérée que notre procédure expérimentale pourrait induire, nous avons établi une grille d’observation visant à définir les points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et qui indique les mesures que nous prendrons à l’apparition des premiers signes de douleur ou de perte de poids. D'autre part, en plus du personnel de l’animalerie, un suivi sanitaire tri-hebdomadaire puis 5/7 jours (à partir du début des traitements) sera réalisé par les membres de l’équipe (expérimentateurs) à l’aide d’une feuille de score adaptée au modèle (Annexe 1). La fréquence de ces examens sera intensifiée en fonction des symptômes relevés sur un animal jusqu'à la disparition du problème ou la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

Les modèles murins sont les modèles les plus répandus pour étudier l’effet de drogue ou traitement par anticorps sur la croissance tumorale. Notons également que cette espèce est facilement manipulable. Dans ce projet, nous utilisons des souris immunodéficientes ce qui nous permettra d’utiliser des modèles humains de RCC. Les souris utilisées seront de jeunes femelles adultes agées de 7 à 8 semaines.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont implantées dans le tronc cérébral, l'injection étant pratiquée sur des souriceaux de deux jours, puis des médicaments sont administrés avant une mise à mort par dislocation cervicale pour prélever les tumeurs. Le porteur situe le projet face aux tumeurs du tronc cérébral de l'enfant, cancer au taux de survie proche de zéro, l'objectif immédiat restant de valider une nouvelle lignée tumorale et l'association de deux médicaments. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit la complexité observée in vivo et que cette souche de souris immunodéficiente ne peut être remplacée.

Objectifs

Les tumeurs du tronc cérébral sont actuellement les cancers les plus mortels chez l’enfant, avec un taux de survie proche de zéro. La découverte et la validation de nouveaux traitements des tumeurs du tronc cérébral permettront de faire un pas important pour soigner les enfants souffrant de ce cancer, toujours incurable en 2021

Bénéfices attendus

Démontrer que la nouvelle lignée de tumeur du tronc cérébral forme des tumeurs chez la souris NGS et que ces cellules constituent un bon modèle d'étude pour mieux comprendre le développement de la tumeur et pour tester des médicaments. Démontrer que l’association de deux nouveaux médicaments bloque la formation de tumeur chez la souris.

Procédures

Implantation de cellules tumorales en intracrânien dans le tronc cérébral. Administration de médicaments.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée avec la greffe de cellules tumorales dans le tronc cérébral et la formation de tumeur dans le cerveau. Dans certaines conditions du projet, des agents anticancéreux seront administrés aux animaux afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales à cette nouvelle thérapie. La plupart des manipulations sur les animaux seront réalisés sous anesthésie générale.

Devenir

Les 320 souris de ce projet seront euthanasiées par dislocation des vertèbres cervicales afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse pas des arppoches moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris immunodéficience. Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.

Réduction

Le test statistique utilisé sera le test l’ANOVA (test très généralement utilisé pour ces études). D’après la littérature scientifique, le nombre d’animaux nécessaire par lot pour détecter 50% de différence inter-lots avec 50% d’écart type intra lots est de 10.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages de type 2L à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de « woodwoll » (Safe, France). En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal sera euthanasié sans attendre (cf. grille jointe en annexe). En tenant compte de ces points limites adaptés et conformément au paragraphe 3 de l’annexe VIII de la directive 2010/63 CE, nous proposons comme classement pour l’ensemble de nos procédures le degré modéré. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures (cf. paragraphe 4).

Choix des espèces

1. La souche de souris NSG est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. La capacité d’extrapoler les résultats. 3. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 4. L’existence des équipements nécessaires à l’étude. 5. La pertinence des installations de l’Animalerie. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.

410 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 150 reproductrices euthanasiées à six mois et 260 produites transférées vers un autre projet déjà autorisé. Cette demande porte sur le seul élevage d'une lignée à phénotype dommageable, dont les individus développent des plaies dorsales et une perte de poil à partir de six mois, sans autre intervention. La souffrance déclarée tient donc à la lignée génétiquement modifiée elle-même, produite pour étudier le rôle de l'enzyme KDM6B dans le diabète de type 2. Le porteur affirme que la souris est le "modèle de référence" de l'obésité et du diabète et qu'aucune méthode sans animaux vivants ne peut remplacer ces procédures.

Objectifs

L’inflammation est reconnue comme un déterminant majeur de la mise en place du diabète de type 2 (DT2) et de ses complications cardiovasculaires. L’inflammation est notamment conduite par une activation de certaines cellules du système immunitaire (monocytes circulants et des macrophages tissulaires). La susceptibilité à développer un diabète de type-2 et de souffrir des complications cardiovasculaires semble être également associée à des facteurs environnementaux. Des études récentes suggèrent que ces facteurs environnementaux se traduisent par une modification de l’expression des gènes (notamment inflammatoires) par des mécanismes dit épigénétiques (modification de l’expression d’un gène sans modification de sa séquence génétique). L’enzyme KDM6B (Histone Lysine Demethylase 6B) est impliquée dans ses modifications épigénétiques. L'objectif du projet est de définir les conséquences de l'invalidation de KDM6B spécifiquement au niveau des macrophages, sur l’inflammation et l’homéostasie glucidique chez des souris.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait démontrer l'importance des modifications épigénétiques dans la mise en place et le développement du diabète de type 2 et dans ses complications. Ce projet de recherche fondamental a pour objectif de définir les conséquences de l'invalidation de KDM6B spécifiquement au niveau des macrophages, sur l’inflammation et l’homéostasie glucidique chez des souris. A terme, moduler l'activité de KDM6B pourrait être proposé comme une nouvelle approche thérapeutique pour contrôler l'inflammation afin d'atténuer le risque de diabète de type 2.

Procédures

Cette demande d'autorisation de projet est uniquement une demande pour l'élevage d'une lignée à phénotype dommageable. En effet, les souris KDM6b MKO et WT peuvent développer des plaies au niveau du dos à partir de l'âge de 6 mois : perte de poil et lésions cutanées. Avant l'âge de 6 mois, les animaux ne présentent pas de phénotype dommageable. Les animaux ne subirront pas d'intervention.

Impact sur les animaux

La lignée murine KDM6B MKO est une lignée à phénotype dommageable. En effet, les souris KDM6b MKO et WT peuvent développer des plaies au niveau du dos à partir de l'âge de 6 mois : perte de poil et lésions cutanées. Avant l'âge de 6 mois, les animaux ne présentent pas de phénotype dommageable.

Devenir

Les 150 animaux en accouplement seront euthanasiés à l'age de 6 mois. Les animaux produits par les accouplements seront utilisés pour créer les groupes expérimentaux d'un autre projet déjà autorisé.

Remplacement

Afin de prouver l'implication de la protéine KDM6B, dans le développement du diabète de type-2, la stratégie d'invalidation génique dans des cellules spécifiques comme les macrophages a été utilisée. Ces souris sont actuellement disponibles. De plus, la souris est le modèle de référence dans l'étude de l'obésité et du diabète Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit à son maximum. 150 souris seront placées en accouplement : à raison de 5 accouplements en parallèle à renouveler tous les 6 mois durant 5 ans : 3 souris (1 mâles + 2 femelles) x 5 accouplements x 10 semestres = 150. 260 animaux seront produits afin d'être utilisés dans un autre projet déjà autorisé.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés et ont un accès ad libitum a la nourriture. Les conditions de température et d'hygromètrie sont controlées et monitorées tous les jours. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h). Pour s’assurer du « bien être » des souris, elles bénéficieront de coton et de « maisons » en carton afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un « nid ». Les souris seront sous surveillance journalière. Les points suivants seront considérés comme points limites : 1. Tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire 2. Modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos vouté) 3. Anomalies pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : ulcères, tumeurs, fractures... 4. Apparition de plaies/lésions au niveau du dos.

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques utilisés ont déjà été validés chez la souris. Les souris sont faciles à manipuler et la présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Les animaux seront mis en accouplement à partir de l'age de 56 jours qui est l'age de maturité sexuelle des souris.