Oncologie

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolées en cage individuelle pendant plus de quatre semaines, elles reçoivent un régime riche en fructose et trois injections intrapéritonéales, puis subissent un test du labyrinthe en croix surélevé et un test de nage forcée pour mesurer anxiété et dépression. Le porteur reconnaît un stress modéré lié à l'isolement, aux injections et à la nature même des tests. Il présente ce projet comme "essentiel" et affirme l'impossibilité de modéliser hors de l'animal le lien entre microbiote, cerveau et comportement.

Objectifs

Pendant des milliers d'années, les humains ont consommé moins de 5 g de fructose par jour. Au 19ieme et 20ieme siècles la baisse du prix du sucre et la conversion industrielle du glucose en sirops de maïs à haute teneur en fructose à l'échelle mondiale a entraîné une augmentation drastique de la consommation de sucre ce qui a multiplié par un facteur 40 la consommation de fructose. Cependant plus de 50% de la population adulte et 80% des enfants de moins de 5 ans ne peuvent pas absorber complètement une charge de 25 g de fructose, alors que l'apport quotidien moyen est de 50-80 g. Ainsi, les changements dans les habitudes alimentaires ont créé des conditions de malabsorption du fructose. Or le fructose apparait de plus en plus comme un facteur de risque pour le développement de troubles fonctionnels cérébraux (apparition de troubles cognitifs, émotionnels et troubles du comportement alimentaire). Cependant les mécanismes liant fructose et troubles de l’humeur demeurent inconnus. Nous avons montré que la consommation excessive de fructose de par la malabsorption à laquelle elle est associée entraîne de profondes modifications du microbiote intestinal et de la production d’une molécule par l’intestin, la cholécystokinine, qui participe à la régulation de l’ingéré alimentaire. Or le microbiote intestinal est de plus en plus reconnu comme étant impliqué dans les troubles de l’humeur et du comportement alimentaire. Nous émettons l’hypothèse que des modifications du métabolisme du microbiote induites par l'ingestion de fructose pourraient donc participer indirectement au développement de troubles de l'humeur et à la modification du comportement alimentaire. Nous émettons également l'hypothèse que ces changements de comportement sont en lien avec l'habilité de ce microbiote à activer la production de cholécystokinine. Ces 2 hypothèses seront testées dans ce projet. Pour cela deux modèles de souris génétiquement modifiées présentant une malabsorption du fructose ainsi que des souris ne présentant pas cette altération seront utilisées. Le projet comprend une procédure permettant d’évaluer l’ingéré alimentaire ainsi que l’état état d’anxiété et de dépression en réponse à une malabsorption du fructose et en présence ou pas d’inhibiteur pharmacologique de la cholécystokinine. Les souris recevront un régime contenant 20% ou pas du tout de fructose pendant 3 semaines et 5 jours.

Bénéfices attendus

L'impact d'une alimentation déséquilibrée sur les fonctions cérébrales est une préoccupation de santé publique. La surconsommation de fructose a été pointée par l'Anses comme potentiellement nocive. Jusqu'à présent, la plupart des études se sont concentrées sur l'impact négatif de la surconsommation de fructose sur le syndrome métabolique. Des études épidémiologiques suggèrent que les régimes enrichis en fructose favorisent le dévelopement de comportements de type anxieux ou dépressif. Récemment le rôle du microbiote dans ce type de comportement a été décrit. Compte tenu de nos données préliminaires il apparait plus que probable que dans le contexte de l'ingestion excessive de fructose (et donc de sa malabsorption), le microbiote participe à ses effets déléteres notamment sur les troubles de l'humeur. Ce projet est essentiel à la compréhension des mécanismes de régulation du stress et de l'anxiété par le fructose.

Procédures

Les animaux recevront un régime riche en fructose susceptible de diminuer leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Les animaux vigiles recevront 3 injections intra péritonéales durant l'ensemble de la procédures (quelques secondes par injection). L'ensemble des animaux seront soumis à 2 tests comportementaux (un test du labyrinthe en croix surélevé de 5 minutes et un test de nage forcée de 6 minutes) afin de mesurer leur niveau d'anxiété et de dépression.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle pendant 4 semaines et 5 jours ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux malabsorbant le fructose réduisent de 5 à 10% leur ingéré alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition à un régime contenant 20% de fructose. Le poids et l'ingéré de ces animaux sera surveillé quotidiennement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 20% du poids initial. Les animaux soumis aux tests d'anxiété et dépression subiront un stress modéré lié à la nature même des tests. Ce stress durera le temps du test (5 minutes pour le labyrinthe en croix et 6 minutes pour la nage forcée). L'injection IP pratiquée par un expérimentateur expérimenté constitue un stress modéré notamment dû à la contention. Ce stress est cependant très limité dans le temps (quelques secondes seulement). Aucune douleur n'est attendue durant le protocole.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthansié à la fin de la procédure

Remplacement

le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les liens entre composition du microbiote, cerveau et comportement alimentaire/comportement d'anxiété-depression.

Réduction

Afin de réduire de nombre d'animaux nous proposons dans cette étude d'étudier le comportement alimentaire et le comportement d'anxiété et de dépression sur les memes animaux. Un nombre de 20 animaux par groupe a été calculé afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives (P value de 5% avec une puissance de 80% ) compte-tenu de la variabilité connue des paramètres.

Raffinement

L’ensemble des animaux bénéficiera d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abris en propylène rouge.Les animaux seront surveillés quotidiennement (surveillance visuelle plus suivi de l'ingéré alimentaire et du gain de poids). Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau excel quotidiennement. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considéré comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de deux jours seront également considérés comme des points limite entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont d'une lignée C57Bl6 car on dispose dans cette lignée de souris génétiquement modifiées permettant l'étude des mécanismes de régulation du comportement lié à la malabsorption du fructose (un sucre majeur de notre alimentation). Ce modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies liées à l’alimentation et nous avons une expertise propre sur ces modèles animaux. Des animaux adultes sont utilisés, comme dans nos études préliminaires, car le microbiote est stable à ce stade.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections intrapéritonéales de traitements par contention à l'état vigile, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine, pour étudier comment restaurer l'efficacité de la chimiothérapie dans des cancers du sein et colorectaux. Les points limites prévoient la mise à mort quand la tumeur atteint 250 mm², en cas de diarrhée prolongée, de perte de poids supérieure à 20 % ou d'automutilation. Le porteur affirme que la question "ne peut être abordée qu'in vivo" et revendique un usage de 540 souris respectueux du bien-être des animaux non-humains.

Objectifs

Les dernières années ont vu l'émergence du concept de l'activation du système immunitaire contre le cancer, qui à son tour détermine le succès à long terme des traitements anticancéreux. Nous allons étudier comment compenser la perte de fonction du gène Fpr1 pour restaurer l’efficacité de la chimiothérapie in vivo. Les modèles expérimentaux in vivo sont les seuls moyens d’approche possibles car la réponse immunitaire n’a pas lieu dans les modèles in vitro ou ex vivo. Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction de FPR1, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-cancéreux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction de FPR1, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-carcéraux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal. Nous préconisions que l’accomplissement de ce projet fournira des connaissances sur la régulation de la réponse immunitaire aux cancers pour la mise en place de stratégies thérapeutiques ciblées.

Procédures

Les animaux seront soumis a : - L’injection de cellules tumorales en sous cutané sur l’animal anesthésié par inhalation d’isofluorane - L’injection des traitements intra péritonéaux par contention de l’animal vigile - Un suivi de la croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis a : - Une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie - L’injection de traitements intra péritonéaux par contention de l’animal vigile - Un suivi de la croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine Ces différentes manipulations pouvant entrainer du stress chez l’animal, tout sera mis en œuvre pour le limiter. Notamment, l’injection de cellules tumorales sera faite sous anesthésie sur le dos de l’animal afin de réduire les phénomènes de gêne que peut engendrer la croissance tumorale. Les injections de traitements et le suivi de la croissance tumorale seront effectuées par contention de l’animal vigile, technique parfaitement maitrisée par les expérimentateurs dans le but de limiter l’exposition des souris à des anesthésiques.

Devenir

Les souris seront euthanasiées dès l’atteinte des points limites suivants : lorsque les tumeurs atteindront 250 mm2, en cas de diarrhée prolongée (>4 jours); en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial; comportement général anormale (prostration, auto-mutilation, perte de fourrure).

Remplacement

La question scientifique ne peut être abordée qu’in vivo car il n’est pas possible d’étudier l’implication du système immunitaire sur le développement du cancer dans des systèmes in vitro.

Réduction

Nous souhaiterons effectuer cette étude sur un total de 540 souris pour permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Notamment, les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Le modèle choisit est très bien documenté dans la littérature et les protocoles solidement établies au sein de notre laboratoire, permettant ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous utiliserons des souris transgéniques viables, fertiles, de taille normale et ne présentent pas d'anomalies physiques ou comportementales. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et/ou tunnels en cartons). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - Les souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées dans cette étude. Afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses ou l’apparition de lésions cancéreuses induites, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation. Au sein de notre laboratoire, les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis. - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une cécité est provoquée en sept jours par injection de méthylnitrosourée, qui détruit les photorécepteurs, puis les souris subissent deux tests comportementaux visuels dont la nature n'est pas précisée et une électrorétinographie sous anesthésie, pour comparer des animaux sauvages et des animaux dépourvus de la protéine FMRP. En s'appuyant sur la littérature, le porteur affirme que cette perte rapide de la vue n'engendre ni anxiété ni signe de souffrance. Il décrit le modèle animal comme "indispensable" et renvoie une éventuelle thérapie génique chez l'homme au conditionnel.

Objectifs

Parmi les troubles de la vision, les maladies rétiniennes sont une cause importante de morbidité oculaire et de déficiences visuelles. Des études de population ont rapporté une prévalence des troubles rétiniens, en particulier des troubles de la dégénérescence rétinienne (DR), allant de 5,35 % à 21,02 % chez les personnes âgées de 40 ans et plus. La dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique et la rétinopathie pigmentaire sont les manifestations pathologiques les plus courantes de la DR qui conduisent à une cécité irréversible. Ces pathologies visuelles sont dues à l'apoptose des cellules neurales de la rétine ou des tissus de soutien adjacents, principalement en raison de dommages oxydatifs cumulatifs et prolongés. Bien que les manifestations cliniques de ces maladies aient été entièrement élucidées, il est clair que les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents restent à comprendre. Très récemment, un nouveau régulateur pivot de l'apoptose et de la réponse au stress oxydatif a été mis en évidence dans le tissu cérébral : la protéine FMR (FMRP). Dans la rétine, cette protéine est également connue pour être directement associée à des déficits fonctionnels rétiniens. Notre projet vise donc à mieux étudier le rôle de la FMRP dans les mécanismes de la DR. L'identification de nouveaux acteurs dans le processus de dégénérescence de la rétine nous permettra de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles stratégies de prévention pour une meilleure prise en charge des patients. Actuellement il n’existe aucun traitement curatif de ces pathologies. Sur la base de ces résultats récents et de l'implication bien connue des mécanismes de stress oxydatif et d'apoptose dans la dégénérescence rétinienne, notre projet vise à mieux caractériser le rôle de la FMRP dans un modèle murin de dégénérescence rétinienne. La question est de mettre en évidence le rôle de FMRP, dans un modèle murin validé de DR, en comparant les résultats de souris sauvages (WT) versus des souris n'exprimant pas FMRP (KO FMR1).

Bénéfices attendus

Notre stratégie expérimentale (utilisation conjointe des souris KO FMR1 et d’un modèle validé de DR) vise à mieux comprendre le rôle de la FMRP dans les mécanismes de la DR, et donc de caractériser si FMRP est une bonne cible thérapeutique dans les DR. Des stratégies ciblées de thérapie génique pourront être envisageables chez l'homme sur la base de ces travaux.

Procédures

1/ Injection i.p (traitement unique), 2/Manipulation pour analyses comportementales (2 tests - 30 minutes) dans le but de caractériser les conséquences de la DR sur des comportements "visuels", et 3/Anesthésie pour l'étude de la fonction rétinienne (ElectroRétinoGraphie ou ERG) (anesthésie unique - 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle « MNU ou MethylNitrosoUrea» de DR utilisé est extrêmement utilisé et validé dans la littérature. Ce modèle va induire une mort spécifique des cellules de la rétine (photorécepteurs), entrainant une perte rapide (7 jours) de la vision chez la souris. Cette perte de la vision est similaire à celle retrouvée chez les patients atteints de DR. Une étude récente utilisant un modèle similaire de DR induite par le MNU a montré l’absence de comportement anxieux ou de souffrance 1 à 2 semaines après injection d et, ceux malgré la perte rapide des paramètres visuels (acuité etc…). Ainsi, dans notre schéma expérimental, la perte rapide de vision n’engendre pas de comportements anxieux ou manifestation comportementale de souffrance (douleur, prostration, hyperactivité etc..).

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort en fin de la procédure, et ce par dislocation cervicale. Ainsi, à chaque temps expérimental (Jour 1, 2, 3, 5 et 7 post-traitement), un lot d’animaux sera mis à mort directement après l'étude de la fonction rétinienne et ce, encore sous anesthésie.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude de la DR ne peut se faire que sur un organisme vivant entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico. Dans le cadre de ce projet s’intéressant au rôle de FMRP dans les DR, le modèle animal reste indispensable dans la compréhension des interactions cellulaires au niveau de la rétine (neurones et cellules gliales). Bien que les expériences in vitro sur cultures cellulaires soient utilisées (lignées cellulaires de cellules rétiniennes : cellules de Müller), aucun modèle expérimental in vitro n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la réponse et la communication cellulaire entre les différents acteurs de la DR.

Réduction

Notre objectif est d’obtenir une bonne robustesse de l’analyse statistique tout en réduisant le nombre d’animaux par lot. Ainsi, le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Pour ce projet in vivo, il y a 5 temps expérimentaux (Jour 1, 2, 3, 5 et 7) avec 8 souris traitées et 8 souris non traitées par génotype (WT et KO FMR1) et par temps soit 32 x 5 = 160 souris au total. A chaque temps expérimental, l’ensemble des animaux seront analysés en comportement et fonction rétinienne (ERG). Puis la moitié des animaux sera mise à mort pour l’étude histologie (prélèvement des yeux) et l’autre moitié sera mise à mort pour les analyses de biologie moléculaire (prélèvement de rétines). Chaque expérience sera répétée trois fois pour une reproductibilité des résultats soit 480 souris au maximum pour 3 ans. Ainsi, nous obtiendrons pour chaque paramètre testé (comportement et ERG) 24 points expérimentaux par temps et par génotype ce qui est un minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats.

Raffinement

Une surveillance et une manipulation quotidiennes des animaux seront effectuées pendant la période d’acclimatation (15 jours) et d’expérimentation. Ces manipulations permettront de limiter le stress de l’animal lors du traitement (injection unique i.p). Par ailleurs, selon les données de la littérature, les animaux traités ne présenteront pas de phénotype autre que la perte de la vision. Les animaux seront hébergés en cage à cap standard au nombre maximum de 5 souris par cage. Nous disposerons dans les cages dès le début de l'expérience, des boules de coton compactées comme enrichissement du milieu. Par ailleurs, l’état général des animaux sera évalué quotidiennement durant toute la durée de l’expérience pour détecter tous signes éventuels de souffrance (3 points limites mis en place). On ne s’attend pas à avoir d’atteinte du point limite dans notre étude. Néanmoins une grille de score quotidienne sera tenue durant le temps d’expérimentation. Les animaux seront mis à mort s’ils présentent des signes de souffrance.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, le modèle animal reste indispensable dans la compréhension des interactions cellulaires rétiniennes et leurs conséquences comportementales. Pour notre projet, l’utilisation de la souris est primordiale puis que le couple structure/fonction de sa rétine comme le processus de la DR sont proches de ceux observés chez l’homme. De même, l’existence d’un modèle murin KO FMR1 (disponible au laboratoire) va faciliter l’étude du rôle de FMRP dans la DR.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intramusculaires ou intraveineuses de formulations d'ARN messager, puis une injection intrapéritonéale d'un substrat luminescent avant plusieurs séances d'imagerie sous anesthésie, pour comparer six nanoparticules lipidiques et trois structures d'ARNm destinées à des vaccins anticancer et à la régénération tissulaire. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement fiable n'est disponible et que le recours à l'animal est "indispensable" pour tenir compte des interactions avec l'"organisme". Les souris sont tuées à la fin pour quantifier l'ARN dans les organes.

Objectifs

Le projet consiste en l'augmentation de l'efficacité de la vaccination anticancer par ARN et dans l’augmentation de l’efficacité de nos stratégies de régénération tissulaire à base d’ARNm. Nous voulons comparer différentes formulations et différentes structures d’ARNm. Les fins thérapeutiques sont la vaccination ARNm et la régénération tissulaire. Il n'existe pas de système permettant de modéliser l'interaction croisée des formulations d’ARNm de différentes structures avec l’organisme. De tels résultats ne peuvent pas être obtenus par des expériences in cellulo. C’est pour cette raison que l’utilisation de modèle animaux est indispensable pour évaluer l’impact des différentes formulations et structures d’ARNm sur la traduction des ARNm in vivo. Dans ce projet, nous allons tester des LNP :6 types de nanoparticules lipidiques (LNP) ainsi que 3 différentes structures d’ARNm pour maximiser l’expression de l’ARNm in vivo. L'optimisation des séquences d'ARNm et de leur formulation permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de sélectionner pour chaque formulation la structure d’ARNm entraînant la plus forte expression in vivo après injection intramusculaire ou intraveineuse.

Procédures

Les souris vont recevoir des injections intramusculaires ou intraveineuses de formulations ARNm. Les souris recevront par voie intrapéritonéale le substrat de la luciférase avant imagerie à 6h, 24h et 48h. Les souris seront anesthésiées sous isofluorane (2%) durant les injections intramusculaire ou intraveineuse des formulations ainsi que durant l'injection intrapéritonéale du substrat de la luciférase.

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à une douleur suite à l’injection des formulations mis à part la douleur induite lors de l'injection liée à l'aiguille. Nous prendrons en compte la douleur générée ar les injections intramusculaires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour quantifier l'ARNm dans les organes où le signal a été détecté.

Remplacement

L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines structures augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études sur l'animal entier sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. Etant donné la complexité des processus mis en jeu, aucune méthode de remplacement fiable n’est disponible.

Réduction

l’effectif des souris mis en oeuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive, le suivi longitudinal permettra de diminuer le nombre d'animaux

Raffinement

les méthodes utilisées seront mises en oeuvre par du personnel formé (niveau chirurgie) et les points limites sont validés par le comité éthique local. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive chez la souris.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris Balb/c car c'est ce modèle qui a été utilisé dans nos expériences précédentes de vaccination ARNm et de régénération tissulaire. Le modèle souris permet d'évaluer les capacités des formulations ARNm dans une espèce à cycle de vie court où les mécanismes immunitaires sont les mêmes que chez l'Homme mais à des échelles de temps compatibles avec un criblage de formulations et de structures ARNm. Des souris adultes (à partir de 8 semaines) ayant un système immunitaire mature seront utilisées.

24 souris privées de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de deux tumeurs sous la peau, une injection intraveineuse d'une sonde fluorescente et une injection intratumorale d'un candidat médicament anticancéreux ciblant le récepteur TLR3, suivies de séances d'imagerie sous anesthésie à 24, 48 et 72 heures. Le porteur affirme avoir déjà vérifié l'absence de toxicité et l'efficacité aux mêmes doses, et présente l'étude comme une preuve de concept destinée à préparer un essai clinique chez l'homme. Sur le remplacement, il conclut que "seul un modèle animal" permet d'observer l'apoptose dans un "organisme" complet.

Objectifs

=> RATIONNEL : Le TLR3 est un récepteur de l'immunité permettant au corps de se protéger des infections virales. Le concept du TLR3 comme cible anticancéreuse existe depuis près de 30 ans, même si son mécanisme exact n’est connu que depuis peu. L’activation de ce récepteur entraine une mort programmée, appelée apoptose, spécifique des cellules cancéreuses (pas des cellules normales), ainsi qu’une inflammation locale ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes d’action induit une autovaccination à long terme contre la tumeur. Une nouvelle famille d’activateurs de ce récepteur a récemment été découverte (dont le candidat médicament de cette étude), homogène, actif, spécifique et très peu toxique. => BUT DU PROJET : L’objectif de cette étude est d’utiliser une sonde fluorescente afin de suivre le mécanisme d’apoptose cellulaire induit après administration du candidat médicament en injection locale, ainsi que sa spécificité pour les cellules tumorales exprimant le récepteur TLR3, in-vivo. Ce mécanisme sera regardé dans la souris par une analyse non invasive par imagerie de fluorescence sur tous les organes. Cette analyse quantitative au cours du temps sera effectuée grâce à un outil innovant de tomographie de fluorescence. Pour analyser la spécificité de l’apoptose des cellules tumorale exprimant le TLR3 (et non sur les organes ou tissus sains), induite par le candidat médicament, ce dernier sera injecté dans deux tumeurs (flanc-droit / flanc-gauche), avec les modèles exprimant le TLR3 sur un flanc et celui ne l’exprimant pas sur le flanc opposé. Chacune de ces tumeurs sera traitée par injection locale du candidat médicament à des doses connues comme efficaces dans ces modèles. Une injection a temps unique du candidat médicament sera effectuée, afin de suivre ses effets dans le temps. La sonde fluorescente marquant spécifiquement les cellules apoptotiques sera utilisée par injection intraveineuse 2h avant le premier point de cinétique, pour un signal durant jusqu’à 3 jours post-injection. Les analyses de fluorescence quantitatives sur l'ensemble du corps de l'animal (en 3D), seront effectuées sur animaux vivants sous anesthésie gazeuse respectivement à 24h, 48h et 72h après traitement. Afin de dissocier l’effet d'inflammation de l’effet d’apoptose induit par le candidat médicament, les souris utilisées ne posséderont pas de système immunitaire.

Bénéfices attendus

Cette étude, comprenant une seule procédure, permettra de déterminer le mécanisme d’action d’apoptose spécifique des tissus cancéreux du candidat médicament dans un modèle physiologique complet et d’en apprécier la spécificité par rapport aux organes et tissus sains. Il s’agit d’une étude de recherche translationnelle, de preuve de concept et prospective, permettant de poser les bases d’une étude clinique (dans des conditions d’injection locales), et de déterminer les meilleurs biomarqueurs d’engagement de la cible ainsi que d’en définir une première approche qualitative et cinétique.

Procédures

Trois injections sont prévues dans cette expérience : 1/ La greffe tumorale bilatérale sous-cutanée (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris 2/ L’injection de la sonde fluorescente en intraveineuse (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris. 3/ Le traitement en injection intratumorale et sous-cutané péri-tumorale (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris. A ceci, s’ajoute l’analyse de la fluorescence sur l'ensemble des organes et tissus des souris, qui est un acte non invasif et non douloureux, mais qui nécessite cependant l’immobilité complète de l’animal par une anesthésie sous isoflurane et une contention empêchant tout mouvement.

Impact sur les animaux

# Des effets indésirables pour les animaux pourraient venir des modèles ou des traitements en eux-mêmes => L'absence de toxicité et l’efficacité du candidat médicament ont déjà été analysée sur ces mêmes modèles aux doses utilisées dans cette expérience avec d’excellents résultats. # Les actes d’injection (sonde fluorescente et candidat médicament) induisent une douleur ainsi qu’un stress => une anesthésie gazeuse sera effectuée lors de ces actes. # L’analyse de fluorescence n’est pas un acte douloureux, cependant il nécessite l’immobilité complète de l’animalsous anesthésie gazeuse et une contention empêchant tout mouvement. # La croissance tumorale (pouvant durer env 2 à 3 semaines) peut induire de nombreux effets indésirables (nécrose, perte de poids, mobilité réduite, stress, comportement anormal…). => ici les tumeurs seront analysées à une très faible taille, ce qui devrait limiter la majorité de ces effets indésirables. Cependant, une grille de score basée sur nos expériences précédentes nous permettra d’anticiper toute souffrance des animaux. De plus, la moindre plaie interférant avec les mesures de fluorescence, aucune souris ayant des plaies ou signes de nécroses ne sera incluse dans ces expériences.

Devenir

Tous les animaux ne pouvant pas rentrer en analyse (absence de croissance tumorale, présence de plaies interférant avec l’analyse ou autre critère éthique), seront mis à mort. Tous les animaux analysés seront mis à mort après la dernière analyse. En effet, aucun de ces animaux ne pourra être réutilisé. Cette mise à mort s’effectuera par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Remplacement

Seul un modèle animal permettra d’analyser des phénomènes d’apoptose indésirables au niveau des organes et tissus sains. Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de ce mécanisme d’action ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle préclinique complexe et physiologique est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique « first in human » (dans des conditions d’injection locale), et de déterminer les meilleurs biomarqueurs d’engagement de la cible ainsi que d’en définir une première approche qualitative et cinétique.

Réduction

Cette étude est menée dans un but prospectif. Ainsi l’utilisation de 5 souris par groupe et par modèle est considérée comme suffisant pour une validation de preuve de concept. Il est à noter que la greffe des deux tumeurs différentes (sur les deux flancs de la même souris), permet de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaires à cette étude sans compromettre les résultats scientifiques. Cette expérience s’effectue sur souris vivantes avec des analyses au cours du temps par des techniques douces d’imagerie, ce qui évite d’avoir à procéder à des actes chirurgicaux lourds ainsi qu’à des mises à mort de grands nombres d’animaux par des méthodes conventionnelles. Elle constitue en soit une réduction du nombre des animaux pour répondre à la question posée.

Raffinement

La mise en place d’une grille de score et d’une fréquence de surveillance des animaux adaptée à l’étude, permettra d'éviter toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera effectuée deux fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal, du poids corporel et du volume tumoral. Les souris seront greffées sur chaque flanc en injection sous anesthésie gazeuse. Il est à noter que les deux modèles de tumeurs ont des comportements et temps de croissance très similaire. La très petite taille des tumeurs attendue dans cette étude devrait permettre à la fois une bonne analyse de la fluorescence ainsi qu’une souffrance et une gêne physique minimale pour l’animal. Cette expérience s’effectue par imagerie de fluorescence sur souris vivantes avec des analyses au cours du temps, ce qui évite d’avoir à procéder à de nombreux actes chirurgicaux et mises à mort d’animaux, avec des méthodes conventionnelles. Elle constitue en soi un Raffinement des méthodes pour répondre à la question posée. L’imagerie par fluorescence est une analyse « douce », non invasive et non douloureuse mais nécessitant l’immobilité de la souris pendant l’acquisition des données. Pour réaliser une analyse, l'animal est donc placé sous anesthésie gazeuse et est ensuite placé dans une cassette de contention pour éviter tout mouvement. Cette dernière est ensuite glissée dans la chambre noire de l’appareil. L’acquisition dure environ 5 minutes. De l’air chauffé circule dans l’appareil et permet de maintenir la température de l’animal. Ce temps court d’analyse, permet à l’animal une récupération rapide et autorise de répéter les acquisitions selon la cinétique décidée. Les animaux sont ensuite placés sur un plateau chauffant avec une lumière chauffante pour qu'ils se réveillent rapidement dans de bonnes conditions.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques permettant de démontrer dans un modèle vivant que les organes et/ou tissus normaux ne sont pas touchés par ces mécanismes d’action pouvant induire une toxicité du candidat médicament. En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé. Qui plus est, il existe aussi de nombreux outils (souris sans système immunitaire, appareillage de fluorescence adapté...), qui permettent d'étudier précisément les différents mécanismes d’action de thérapies chez cette espèce. Une souche de souris sans système immunitaire sera utilisée pour analyser uniquement l’effet d’apoptose indépendamment des mécanismes du candidat médicament sur le système immunitaire qui pourraient interférer. De plus, s'agissant d'une souche de souris sans poils, l'acquisition de fluorescence s'en trouvera facilitée. Des souris sans système immunitaire de 7 semaines seront utilisées. A cet âge, les souris sont physiologiquement adultes (ce qui est nécessaire dans notre étude en terme d’assimilation, maturation des organes...) etc.

48 souris ob/ob, prédisposées à l'obésité et au diabète, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prises de sang hebdomadaires et plusieurs tests de tolérance au glucose et à l'insuline par gavage, avant mise à mort pour prélèvement du foie, du pancréas et d'autres tissus. Le porteur teste des extraits végétaux présentés comme "d'origine 100 % naturel" et n'attend "aucune nuisance" hormis chez les témoins. Il affirme être "contraint" d'utiliser des modèles animaux, l'homéostasie du glucose ne pouvant selon lui s'étudier in vitro.

Objectifs

Les objectifs principaux de la recherche sur le diabète de type 2 sont donc doubles : d’une part de mieux élucider les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les enjeux principaux de la recherche sur le diabète de type 2 sont donc doubles : d’une part de mieux élucider les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Chaque semaine un prélèvement de sang (25microlitres) sera réalisé pour mesurer la glycémie, la triglycéridémie et la cholestérolémie des souris. Deux tests de tolérance au glucose seront réalisés au jour 7 et 21. Au cours de ces tests, deux prélèvements de 20 microlitres de sang pour la mesure d’insuline au temps 0 et 30 minutes. Une mesure de glycémie sera effectuée à partir d’une micro-goutte de sang (1-2 microlitres) au temps 0, 15, 30, 60 et 120 minutes après le gavage oral. Un test de tolérance à l'insuline sera réalisé au jour 25. Au cours de ce test, une mesure de glycémie sera effectuée à partir d’une micro-goutte de sang (1-2 microlitres) au temps t0 t+30, t+60, t+90, t+120, t+150 et t+180 minutes pour évaluer la glycémie.

Impact sur les animaux

Les souris ob/ob développent de l'obésité et du diabète. A l'exception des souris contrôles recevant la solution véhicule. Les autres souris devraient voir leur homéostasie glucidique s'améliorer sans nuisances ou effets indésirables attendus.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issu de la procédure. Afin d'explorer les mécanismes anti-diabétiques de la metformine et des extraits végétaux, nous recolterons le foie, le pancréas le tissu adipeux gonadal, le muscle soléaire et le sang. Des analyses métaboliques,histologiques, biochimiques et transcriptomiques seront réalisées sur ces échantillons.

Remplacement

L’homéostasie glucido-lipidique est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes. Il est donc actuellement impossible d’étudier la physiopathologie du diabète d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux.

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.

Raffinement

Enfin, les procédures ont été réfléchies pour réduire au maximum le stress et les souffrances des souris soumises aux expérimentations. La cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les mécanismes impliqués dans la mise en place de l’insulino-résistance et du diabète. Il existe deux modèles murins de diabète de choix largement utilisés : les souris Db/Db et Ob/Ob. Ces modèles sont intéressants car ils possèdent les 3 stades de l’évolution du diabète observé chez l’homme : une phase très précoce ou les animaux sont normo-glycémiques et normo-insulinosensibles, une phase de 4 à 6 semaines ou l’insulino-résistance progresse mais est compensée par une sur-production pancréatique d’insuline, une troisième phase définie par une défaillance de la fonction pancréatique et l’établissement du diabète. Les souris seront âgées de 6 semaines au début du protocole. Il n’est pas possible d’obtenir des souris plus jeunes chez Charles River. Nous souhaitons initier le traitement des souris Ob/Ob à un âge très précoce lorsque les souris sont encore normo-glycémiques et normo-insulinosensibles. La littérature montre que l’insulino-résistance s’installe progressivement chez ces souris entre 6 et 10 semaines et les souris sont diabétiques après 12 semaines. Notre hypothèse est que l’apport en extraits végétaux permettra de retarder l’apparition du diabète ou d’en atténuer la sévérité.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales, un suivi hebdomadaire de la croissance des tumeurs par bioluminescence et une épilation sous anesthésie, avant mise à mort à l'atteinte de points limites ou à six mois. Le porteur relie ce travail aux tumeurs cérébrales de l'enfant et à des protéines d'origine rétrovirale, en attendant des retombées thérapeutiques présentées comme "très prometteuses". Il affirme que le modèle cellulaire in vitro ne reproduit pas le microenvironnement tumoral et qu'une validation sur "organisme entier" est "impérative".

Objectifs

Toutes les cellules de notre organisme partagent le même patrimoine génétique (notre ADN) mais l’expriment de façon différente selon le tissu auxquel elles appartiennent. L’ensemble de mécanismes biologiques impliqués dans cette régulation de l’expression des gènes est regroupé sous le terme « épigénétique ». Les bases moléculaires de ce processus se retrouvent au sein d’une structure très complexe qui permet l’empaquetage et la compaction de nos gènes dans le volume limité du noyau cellulaire. Les acteurs épigénétiques regroupent l'ensemble des facteurs qui contrôlent l’accès à la molécule d’ADN. Les tumeurs cérébrales de l’enfant sont au second rang des cancers pédiatriques par leur fréquence après les leucémies. L’absence de traitement efficace se traduit par une espérance de vie inférieure à 2 ans pour les enfants qui développent ces tumeurs. On retrouve dans 30 % des tumeurs cérébrales de l’enfant une mutation dans un gène qui code pour pour une protéine impliquée dans la régulation épigénétique de l'expression des gènes. Bien que cette mutation ait été directement impliquée dans la tumorigénèse, le mécanisme moléculaire sous-jacent reste à établir. Au cours de l'évolution, notre génome a intégré de nombreuses séquences d'ADN d'origines virales, qui sont en quelques sortes des "cicatrices" d'infections passées de notre espèce par des rétrovirus. Ces séquences rétrovirales constituent une large part de notre ADN. Bien que celles-ci soient épigénétiquement réprimées dans nos cellules dans les conditions physiologiques, elles peuvent être réveillées par des facteurs environnementaux. Cette activation peut ainsi conduire à l’expression de protéines rétrovirales qui peuvent être pathogènes, mais peuvent aussi acquérir une fonction physiologique bénéfique pour l’homme. Nos résultats préliminaires, obtenus in vitro à partir de cellules tumorales en culture, montrent que le facteur épigénétique muté dans les tumeurs cérébrales de l'enfant est nécessaire à l'expression de certaines protéines rétrovirales. Notre objectif est de montrer in vivo chez la souris que ces protéines ont une fonction protectrice qui agit contre la prolifération et la migration des cellules cancéreuses en favorisant le potentiel inflammatoire des cellules cancéreuses et leur interaction avec les cellules immunitaires.

Bénéfices attendus

Nos résultats représentent une piste très prometteuse dans la compréhension du cancer du cerveau chez l'enfant. Par ailleurs, la capacité des cellules cancéreuses à former des métastases, par dissémination à distance de leur site d’apparition, est la principale cause de mortalité chez les patients développant une tumeur solide. Si nous parvenons à montrer que certaines protéines rétrovirales ont une fonction anti-oncogénique, nous ouvrirons la voie au développement de nouvelles thérapies dans la recherche contre le cancer dans sa globalité, qui cibleraient spécifiquement les protéines rétrovirales endogènes.

Procédures

L'ensemble des souris de ce projet (168) subira une injection de cellules tumorales à l'age de 6 semaines (PE1), suivit d'une mesure de la bioluminescence pour suivre la croissance tumorale 1 fois par semaine, pendant 5 semaines (au minimum), 4 mois (au maximum) ou jusqu'à l'apparition d'un des points limites mis en place. Les injections des cellules tumorales se feront par voie intraveineuse ou sous-cutanée dans le flanc de l’animal. Les souris seront anesthésiées par voie gazeuse à l'isoflurane. Lors de l’anesthésie, un gel ophtalmique pourra être appliqué sur l’oeil afin d’éviter tout dessèchement de la cornée. Pour la mesure de bioluminescence, la D-luciferin sera injectée par voie intrapéritonéale. Les injections se feront dans la salle reservée aux souris sauvages. Dix minutes après l’injection l’animal sera placé dans l’imageur bioluminescent pour l’acquisition des images. L’imageur est construit avec système d’anesthésie gazeuse interne qui utilise le gaz isoflurane. Les souris seront épilés car le pelage noir de la souche C57BL/6 atténue l'émission de photons. Pour le processus d'épilation, les souris seront anesthésiées et une crème d'épilation sera appliquée.

Impact sur les animaux

Le seul phénotype dommageable attendu est l'apparition de tumeurs. Les souris seront suivies cliniquement quotidiennement et des points limites appliquées pour éviter toutes souffrances liées au phénotype.

Devenir

Toutes les souris agées de 6 semaines utilisées lors de la PE1 (168) suivront ensuite la PE2. Les souris seront suivies 1 fois par semaine pendant 5 semaines, au minimum, 4 mois au maximum après l'injection, tout le long de la PE2. Toutes les souris de la PE2 (168) seront sacrifiées à l'atteinte des points limites définis dans la PE1 le cas échéant, ou à l'age de 6 mois au plus tard.

Remplacement

Nos résultats préliminaires effectués dans des cellules en culture montrent que les protéines p53 et H3.3 sont nécessaires à l’expression de certaines protéines rétrovirales dans le génome murin. Nous faisons l’hypothèse que ces protéines ont une fonction protectrice qui agit contre la prolifération et la migration des cellules cancéreuses. Les mécanismes épigénétiques étant très dynamiques mais surtout tissus et individus spécifiques, il est impératif de valider l’ensemble de nos conclusions au sein d’un organisme entier. Le modèle de cellules tumorales en culture in vitro ne reproduit pas toutes les étapes de la tumorigenèse in vivo, car il ne tient pas compte du microenvironnement tumoral et donc ne pourra pas apporter le niveau d'information requis. Ces caractéristiques ne peuvent être récapitulées que par un modèle d'étude in vivo, à savoir dans notre étude, par injection de cellules tumorales dans des souris saines.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, le projet se déroulera en 2 étapes. La première étape (18 souris) sera une étude pilote de la tumorigénicité du modèle cellulaire utilisé qui permettra de mettre au point les meilleurs conditions expérimentales pour le développement des tumeurs (optimisation du nombre de cellules, site d'injections). L'étape 2 permettra de tester l'hypothèse de travail dans les conditions expérimentales définie lors de l'étude pilote, en réduisant le nombre d’animaux au minimum (15 souris utilisées pour chacune des 10 conditions expérimentales) tout en garantissant des résultats statistiquement analysables (tests non-paramétriques de Mann-Whitney U et de Kruskal-Wallis H, pour les comparaisons de 2 groupes ou de plus de 2 groupes, respectivement). Le nombre total de souris expérimentales sera de 168. Par ailleurs, notre étude pourra se développer de manière qualitative si l'expérience s'avère concluante, nous pourrons ainsi prélever les tumeurs primaires et les métastases afin de les étudier par immunohistochimie ou séquençage d'ARN.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale. Toutes les lignées utilisées étant modifiées afin qu’elles expriment de façon constitutive la luciférase, nous mesurerons les différences de croissance tumorale par des techniques non-invasives. Les tumeurs émettront un signal luminescent, qui sera détecté par imagerie afin de monitorer la taille des tumeurs primaires ainsi que la progression métastatique de celles-ci. Nous suivrons quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable, entre 5 semaines et 4 mois après l'injection. Comme point limite, les animaux seront mis à mort en cas de douleur évidente suivant les critères d’arrêt suivants : perte de poids supérieure à 20%, tableau de scoring de la douleur niveau 3 observé*, nécrose des tumeurs, taille des tumeurs atteignant 1 cm3, détection de métastases dissiminées. *Le tableau de scoring évoluera la douleur selon les critères suivants : (1) poids corporel ; (2) apparence physique ; (3) signes cliniques mesurables (température corporelle, fréquence cardiaque et fréquence respiratoire) ; (4) modifications du comportement non provoqué ou (5) après stimulation ; (6) aspect du site d’injection. Un certain nombre de point sera donné à chacune des 6 catégories selon des variables précises. Un score sera attribué en fonction du nombre total de point obtenu.

Choix des espèces

Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité d'utiliser des lignées transgéniques, temps de génération court, génôme connu, outils moléculaires). De plus, nos résultats préliminaires in vitro ont été obtenus dans des lignées cellulaires murines. D'autre part la souris possède 99% d'identité de gènes avec l'homme, et les mécanismes cellulaires à l'oeuvre et impliquant les variantes d'histones dont H3.3 sont conservés. La séquence protéique de H3.3 est 100% identique entre la souris et l'homme. Pour les expériences d’injection, nous avons choisi des fibroblastes embryonnaires de souris pour éviter tout rejet des cellules après injections. Nous utiliserons des souris adultes de 6 semaines pour l'injection des cellules tumorales, car il est important pour notyre hypothèse de travail que les souris aient un système immunitaire mature. En outre, l'utilisation de souris adultes mais jeunes permettra un suivit de la croissance tumorale jusqu'à 4 mois après l'injection le cas échéant sans dépasser un age maximum de 6 mois. En effet tous les animaux de cette étude seront mis à mort à l'age de 6 mois au plus tard le cas échéant (si aucun des points limites décrits n'est atteint).

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène cinq jours de suite pour supprimer le gène Pk2 dans les oligodendrocytes, puis sont anesthésiées pour une perfusion terminale du cerveau. Le porteur indique que ces injections répétées sont un facteur de stress douloureux et que la délétion peut entraîner des troubles locomoteurs, voire des crises d'épilepsie. Il relie ce travail fondamental à l'autisme et à la maladie d'Alzheimer chez l'humain, mais affirme qu'aucun modèle in vitro ni informatique ne peut reproduire ces interactions cérébrales.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : (1) créer deux lignées de souris dans lesquelles nous pouvons supprimer spécifiquement le gène Pk2 dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire. (2) étudier l'effet de la délétion de Pk2 sur les cellules de la lignée oligodendrocytaire.

Bénéfices attendus

Ce projet étudiera pour la première fois le rôle du gène de polarité Pk2 spécifiquement dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire. Nos expériences visent à comprendre le rôle de ce gène au niveau cellulaire. Chez l'homme, la déficience de Pk2 a été liée à l'autisme et des altérations de Pk2 ont été observées dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. Dans l'autisme, les circuits neuronaux qui sous-tendent certains comportements sont altérés et les oligodendrocytes jouent un rôle dans la stabilisation des circuits neuronaux et la facilitation des connexions neuronales. Notre recherche contribuera donc à évaluer si les oligodendrocytes pourraient être considérés comme une cible putative dans ces pathologies.

Procédures

Les animaux recevront une injection intrapéritonéale de tamoxifène pendant 5 jours consécutifs, après es souris resteront ensuite en vie jusqu'à la fin de la période expérimentale. Pour chaque injection, l’animal sera manipulé par l’expérimentateur entre trente secondes et une minute. L'injection aura lieu pendant ce temps et durera environ 10 à 15 secondes. À la fin de l'expérience, les animaux recevront une injection intrapéritonéale pour induire une anesthésie profonde afin de réaliser une perfusion transcardiaque sous anesthésie. Dans la mesure du possible, les animaux seront anesthésiés par inhalation d'isoflurane à 3 % avant l'injection pour l'anesthésie terminale afin de réduire davantage le stress. L'induction à l'isoflurane prendra environ 3 minutes et l'injection en intrapéritonéal de l’anesthésique prendra 10 secondes. Une anesthésie profonde est obtenue dans les 5 à 10 minutes en fonction de l'induction préalable à l'isoflurane.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale inflige aux animaux des injections intrapéritonéales pendant 5 jours consécutifs. Il s'agit d'un facteur de stress récurrent et d'une procédure qui peut être douloureuse pour les souris. La délétion de Pk2 dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire pourrait avoir un effet négatif sur les souris en entraînant des modifications de l'activité locomotrice et, potentiellement, le knockout pourrait conduire avec une faible probabilité à des crises d'épilepsie.

Devenir

Les souris recevront une injection intrapéritonéale de tamoxifène pour induire une invalidation génique conditionnelle. Les souris resteront ensuite en vie jusqu'à la fin de la période expérimentale. La durée maximale de la période expérimentale est définie comme étant de 8 semaines après la dernière injection (âge maximal de 100 jours ou 14 semaines). Cette période est nécessaire pour s'assurer que la délétion génétique est effective. Après un maximum de 8 semaines, nous serons en mesure d'étudier l'effet cellulaire de l’invalidation génique conditionnelle. À la fin de l'expérience, toutes les souris seront profondément anesthésiées et le cerveau sera préservé par perfusion intracardiaque de fixateur. Une analyse histologique ultérieure sera effectuée au niveau cellulaire. Cette procédure sera effectuée pour tous les animaux afin d'effectuer une analyse biologique et statistique des différentes étapes d'analyse prévues.

Remplacement

Le projet a pour but d'étudier la trajectoire développementale et de signalisation cellulaire de la lignée oligodendrocytaire dans le cerveau murin. La suppression des gènes induite par l'injection de tamoxifène est déterminée par l'âge de développement de l'animal et le stade cellulaire. Cette chronologie complexe ne peut être reproduite in vitro car les voies de signalisation putatives nécessitent des interactions intactes entre les différentes cellules du cerveau. Il n'existe aucun modèle informatique ou "in vitro" capable d'imiter ces processus biologiques tout en respectant la physiologie ; l'utilisation d'animaux est donc nécessaire pour étudier ce mécanisme biologique fondamental.

Réduction

Notre approche expérimentale nous permettra d'aborder les questions expérimentales avec les meilleures expériences possibles. Le nombre d'animaux sera réduit au minimum, tout en permettant des tests statistiques robustes et des expériences contrôle suffisantes. La production de souris sera optimisée en mettant en place un programme d'élevage qui correspond étroitement à la demande et qui est mis à jour tous les 3 mois. Nous élèverons le nombre minimum d'animaux nécessaires pour réaliser les expériences.

Raffinement

L'approche expérimentale est affinée par l'utilisation d'une délétion génétique conditionnelle qui minimise les effets indésirables sur les organes et les cellules non concernés. Ainsi, la délétion du gène Pk2 dans l'oligodendrocyte ne se produit qu'après l'injection d'un modulateur (tamoxifène). Cette injection est effectuée à des moments expérimentaux précis au cours du développement de la souris. Nous mettrons en œuvre les meilleures pratiques pour garantir le bien-être des animaux en ajoutant un enrichissement aux cages, en traitant si nécessaire les douleurs survenues, en limitant tout risque d'infection et en limitant la souffrance des animaux lorsque les objectifs expérimentaux sont atteints.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. Par définition, pour nos études intégrées évaluant l’impact d’une mutation d’un gène sur le cerveau et les troubles du comportement, l'utilisation de techniques in vitro ou d'organismes d'une plus faible sensibilité neurophysiologique (invertébrés par exemple) n'est pas appropriée pour les questions auxquelles nous cherchons à répondre. En outre, la création de modèles animaux est très importante. Par conséquent, nous pensons qu'il n'existe pas de remplacement disponible qui permettrait d'atteindre les objectifs scientifiques du travail proposé. Pour le maintien de l'élevage, nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines ou plus. L’invalidation génique chez les souris expérimentales sera induit à différents moments. Pour supprimer le gène Pk2 dans les cellules précurseurs des oligodendrocytes, des injections de tamoxifène auront lieu entre les jours postnatals 2 et 7 et entre les jours postnatals 28 et 40. Pour le ciblage des oligodendrocytes, les injections de tamoxifène auront lieu entre les jours postnatals 11 et 21 et 28 et 40. Toutes les analyses seront effectuées lorsque les souris seront âgées de 3 semaines à 14,5 semaines. L'analyse à ces différents moments est nécessaire d'un point de vue scientifique car nous analyserons le rôle de la Pk2 dans le développement des cellules de la lignée oligodendrocytaire et dans le maintien des oligodendrocytes chez l'animal adulte.