Oncologie

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à huit prélèvements sanguins sur une journée, aux veines mandibulaire, saphène et fémorale, pour mettre au point une technique de micro-prélèvement. Le porteur admet que des sites de prélèvement seront "abîmés" puisqu'il s'agit d'une mise au point, et fixe la validation à 90% d'animaux aux sites corrects. Il justifie le projet par la réduction du nombre d'animaux dans de futures études, tout en qualifiant le recours à l'animal d'"indispensable".

Objectifs

Ce projet consiste à effectuer huit prélèvements sanguins par animal en vigile via la technique du micosampling. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile par microsampling c'est à dire prélèvement à la veine mandibulaire, à la veine saphène et/ou à la veine fémorale (2 prélèvements maximum par site de 40 μl maximum). Nombre maximal de prélèvement par animal: 8

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet sont de développer une nouvelle technique de prélèvement, via le microsampling, qui permettra de faire 8 prélèvements de 40 µL maximum et donc de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés pour les prochaines études

Procédures

La veille des prélèvements de sang, les animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse: Isoflurane) pour pouvoir raser les pattes arrières des animaux. Avant de commencer les prélèvements, les cages hébergeant les animaux seront placées sous lampes chauffantes pendant environ 15 minutes pour faciliter les prélèvements et dilater les veines. Cette opération peut être renouvellée autant que nécessaire si besoin. Les sites de prélèvement sanguin ( veine mandibulaire, saphène ou fémorale droite ou gauche) seront alternés au maximum. 4 prélèvements seront fait au niveau des mandibules droites et gauche et 4 autres prélèvements seront réalisés au niveau des saphènes droite et gauche et fémorales droite et gauche (1 prélèvement par site) Les temps de prélèvement seront: T5min, T15min, T30 min, T1h, T2h, T4h, T6h, T8h. Volume de sang prélevé: 40 µL par temps de prélèvement

Impact sur les animaux

Il est probable d'avoir des sites de prélèvement abimés car c'est une mise au point de technique... Un suivi quotidien (voire plusieurs fois par jour, à chaque temps de prélèvement) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et pour une prise en charge rapide si besoin. Cette technique sera validée si 90 % des animaux présentent des sites de prélèvements convenables, non abîmés avec un bon aspect général des animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure , les animaux seront anesthésiés et euthanasiés par dislocation cervicale (possibilité d'exsanguination précédant la dislocation).

Remplacement

Le but de ce projet est de mettre en place une nouvelle technique de prélèvement sanguins ( le microsampling) chez la souris. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de valider cette technique sur un autre support , il est indispensable de recourir à l'animal de laboratoire.

Réduction

Dans ce projet, 40 animaux seront inclus pour une durée de 1 an. C'est le nombre d'animaux nécessaire et minimal requis pour obtenir des résultats fiables et reproductibles. Les animaux seront divisés en 2 groupes de 6, et les essais seront fait sur trois souches de souris différentes (souris SWISS, C57Bl6 et les souris SCID). Douze animaux seront utilisés pour chaque souche.

Raffinement

Durant toute la phase expérimentale, les animaux seront hébergés par groupe de 6 maximum dans une même cage comprenant de la litière et du matériel d'enrichissement (ex: nid, bois à ronger). Un suivi quotidien (à chaque temps de prélèvement) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et pour une prise en charge rapide si besoin.

Choix des espèces

La souris est l'espèce utilisée dans ce projet. Les souches SWISS, C57BL6 seront particulièrement utilisées . La souche SCID, pourra aussi être utilisée. Majoritairement adultes. Souris d'environ 20-40g

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un traumatisme crânien est provoqué chez des souriceaux de 17 jours, suivi pendant six mois d'une batterie de tests comportementaux (open field, poutre, échelle, test de Von Frey, labyrinthe en croix surélevé, labyrinthe de Barnes) et d'IRM sous anesthésie, pour étudier le rôle du facteur HIF1. Le porteur qualifie le traumatisme de "léger" et affirme que l'animal "ne montre aucun signe de douleur" une fois réveillé, alors que la procédure est classée en gravité modérée. Le bénéfice annoncé, cerner les conditions de séquelles après un traumatisme crânien pédiatrique, reste une perspective de recherche.

Objectifs

Chaque année 1,5 millions d'européens sont victimes d'un traumatisme crânien (TC) le plus souvent subit lors d'un accident de la route, d'une chute ou au cours de pratiques sportives. 70 000 personnes perdent la vie des suites du traumatisme et environ 100 000 ne présentent pas de récupération totale et demeurent handicapées, notamment chez les enfants et les jeunes adultes qui représentent une population particulièrement vulnérable en regard de ce type de traumatisme. Bien qu'au cours des dernières années un raffinement des procédures de prise en charge par les urgences et les hôpitaux a permis de réduire la mortalité des traumatisés crâniens, il est apparu qu'un grand nombre de patients souffrent par la suite de désordres chroniques invalidants tels que : épilepsie, dépression, démence progressive, etc. À ce jour, aucun traitement ne permet d'empêcher la mise en place de tels désordres à la suite d'un traumatisme crânien. Après un TC, les atteintes des vaisseaux ont pour conséquence de diminuer l’apport en oxygène aux cellules du cerveau. Cette baisse en oxygène (hypoxie) peut aller jusqu’à provoquer la mort de certaines cellules du cerveau. La réponse de l’organisme face à l’hypoxie est régulée par le facteur HIF1 (Hypoxia Inducible Factor). Nous voulons tester si ce facteur joue un rôle délétère dans les évènements cellulaires après un TC. Si tel est le cas, ce facteur représenterait une cible potentielle de traitement innovante et à fort intérêt thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu). D’autre part ce projet déterminera si la protéine HIF1 représente une cible thérapeutique intéressante dans le cadre du développement de traitements post-trauma chez l’enfant.

Procédures

Les 640 animaux subiront tous les procédures non-terminales suivantes : 1. traumatisme crânien léger unique sous anesthésie générale courte (5 minutes) pour moitié des animaux et anesthésie générale courte seule pour l’autre moitié (animaux contrôles dits « sham ») à 17 jours après la naissance. 2. Exploration comportementale sur animal vigile répétée à 1 et 7 jours après le trauma. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes (Open Field) et un test de coordination motrice sur échelle (Foot Fault) réalisés la même journée. 3. Exploration comportementale sur animal vigile répétée à 1 mois, 3 mois et 6 mois après le trauma. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes (Open Field), 2 tests de coordination motrice sur poutre et échelle (Beam walk et Foot Fault) d’environ 5 minutes chacun, 1 test de sensibilité tactile (Von Frey test) d’environ 5 minutes, 2 tests d’évaluation de l’état anxieux (Elevated Plus Maze et White/Black box) de 5 minutes et un test d’apprentissage spatial (Barnes Maze) qui nécessite des sessions quotidiennes de 5 minutes sur 5 jours. Chaque test sera effectué à un jour différent, ainsi chaque série comportementale comprendra 11 tests quotidiens d’environ 5 minutes répartis sur 2 semaines. 4. Exploration d’imagerie fonctionnelle par IRM réalisée sous anesthésie générale d’environ 1 heure répétée à 1, 3 et 6 mois après le trauma, un jour après le dernier test comportemental.

Impact sur les animaux

Notre projet repose sur l’utilisation d’un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile. Le traumatisme est réalisé chez l’animal anesthésié, et une fois réveillé l’animal ne montre aucun signe de douleur, il reprend immédiatement un comportement normal. Comme il s’agit d’un traumatisme léger, les conséquences à long terme ne sont pas anxiogènes ou douloureuses pour l’animal. Ces conséquences sont principalement des retards/défauts d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de la mobilité de l’animal. De plus, le modèle murin utilisé n’engendre pas de phénotype dommageable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, soit 640 animaux.

Remplacement

Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données (PubMed, Web of science, …) permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.

Réduction

Le projet concerne 640 souris mais permet de réduire le nombre d'animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet en effectuant un suivi longitudinal non invasif par imagerie. Nous planifions des groupes expérimentaux correspondant au nombre minimal permettant l'utilisation de tests statistiques visant à comparer les différents groupes : analyses multi-ANOVA avec répétition / analyses de régression entre les différents paramètres mesurés pour des tests comportementaux / IRM (voir annexes pour le plan expérimental).

Raffinement

Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme, en s'appuyant sur la mise en place d'une démarche de suivi des animaux permettant de limiter et traiter la souffrance éventuelle des animaux, et en employant les méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. L'ensemble des procédures mises en place dans le projet sera assuré par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales en adéquation avec les directives européennes. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. Les traumatismes crâniens seront réalisés sur animal anesthésié en utilisant des impacts calibrés. De plus, la cage de réveil est placée sur un tapis chauffant afin de prévenir toute hypothermie. Lors de la réalisation des tests comportementaux, les animaux ne se retrouveront isolés que peu de temps : 5mn pour la plupart des tests et 1h au maximum. Les protocoles expérimentaux s'appuient notamment sur l'utilisation d'un agoniste opioïde, la Buprénorphine, afin de prévenir ou traiter la manifestation de douleurs.

Choix des espèces

Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. De plus, le modèle murin permet l’utilisation de souches génétiquement modifiées. Notre projet s'appuie sur l'utilisation d’une de ces souches : des souris pour lesquelles le gène codant pour le facteur HIF1-alpha a été inactivé dans les astrocytes. Cette invalidation de gène n'induit pas d'effet sur le développement, la survie, la croissance et les fonctions neuromusculaires. Dans ce projet, les traumatismes crâniens seront réalisés sur des souris juvéniles à 17 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un TC en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 6 mois après le TC afin d’évaluer les conséquences à long-terme.

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ovariectomie puis une greffe de cellules tumorales dans l'utérus, suivie de plusieurs semaines d'imagerie sous anesthésie, pour tester un anticorps anti-Netrin-1 contre le cancer de l'endomètre. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer des douleurs abdominales et que les métastases pulmonaires peuvent entraîner des difficultés respiratoires, les animaux étant alors mis à mort. Le bénéfice annoncé, "améliorer la prise en charge" des patientes, reste général, et il affirme que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Le cancer de l'endomètre est le cancer gynécologique le plus diagnostiqué dans les pays développés, et son incidence ne cesse d'augmenter. L'objectif de ce projet est de créer un modèle de greffe de cellules tumorales dans l’endomètre des souris pour mimer au mieux les conditions micro-environnementales dans le but de caractériser l’action de l’anticorps anti-Netrin-1 sur la croissance tumorale. il permettra également par la suite d’utiliser ce modèle pour tester l’efficacité de l’anticorps anti-Netrin-1 en le combinant avec des traitements anti-cancéreux connus.

Bénéfices attendus

Améliorer la prise en charge et le traitement du cancer de l’endomètre chez les patientes atteintes de tumeurs avancées et/ou métastatiques.

Procédures

Ovariectomie et xénogreffes de cellules tumorales en orthotopique (1à à 15 minutes, une fois). Imagerie par ultrason (10 à 20 minutes, 1 à 2 fois par semaine pendant 7-8 semaines). Imagerie de la luminescence (10 à 15 minutes, 1 à 2 fois par semaine pendant 7-8 semaines).

Impact sur les animaux

Bien que la publication dans laquelle cette procédure est décrite ne fasse pas état d’effets indésirables particuliers, la croissance tumorale des tumeurs de l’endomètre peut générer des douleurs abdominales qui seront atténuées par traitement analgésique si l’animal montre des signes de souffrance. Si les signes de douleurs se poursuivent et sont accompagnés d’une baisse d’appétit et une perte de poids > 20%, l’animal sera mis à mort. Suivant la taille des tumeurs, il est possible que la mobilité des animaux soit réduite du fait de la localisation des tumeurs. La présence de métastases pulmonaires peut générer des difficultés respiratoires chez l’animal. Le comportement et la respiration de l’animal seront monitorés régulièrement et l’animal sera mis à mort si l’atteinte respiratoire devient trop grave.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, ou si un point limite est atteint en cours de procédure, par dislocation cervicale après anesthésie à l’isoflurane. Cela est nécessaire afin d'une part de limiter la souffrance de l'animal en cas d'atteinte de point limite et d'autre part de valoriser l'expérience par des analyses immuno-histochimiques et biochimiques sur différents tissus (sains et tumoraux) récoltés après la mise à mort de l'animal et d'ainsi identifer les mécanismes moléculaires impliqués.

Remplacement

Une attention particulière sera accordée à la règle des 3R afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire pour valider l’observation clinique et analyser les effets de la thérapie ciblée. Ces méthodes sont complémentaires d’expérimentations sur des cellules en culture qui sont largement utilisées en parallèle pour cette étude.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, l’abrasion puis l’injection de cellules tumorales seront réalisées au niveau des cornes utérines droite et gauche de l’animal, afin de générer 2 tumeurs par animal et ainsi réduire le nombre total d’animaux par deux. De plus, les procédures se feront de façon séquentielle et donc en fonction des premiers résultats, les expérimentateurs pourront réduire le nombre d'animaux nécessaires au total.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. L’ovariectomie et l’injection de cellules tumorales seront réalisées par un expérimentateur habitué et formé aux techniques de chirurgie expérimentale et l’animal sera anesthésié à l’isoflurane. Il est important de noter qu'en cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront euthanasiés dans le respect de la réglementation en fonction des signes de souffrance. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé, de manière non-invasive, soit par échographie soit par imagerie de fluorescence non-invasive, sous anesthésie, une fois par semaine tant que la taille de la tumeur est inférieure à 2 mm, puis tous les 3 jours jusqu'à ce que la tumeur atteigne le point limite de 50mm3. Ces techniques d'imagerie non-invasive permettent de réduire les manipulation et le stress de l'animal. Pour le traitement de la douleur, de la buprenorphine sera administrée avant le début de la procédure chirurgicale afin de prévenir toute douleur opératoire. Pour le traitement des douleurs post-opératoires, l'eau de boisson sera additionnée de paracétamol.

Choix des espèces

La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules. De plus, la souris immunocompétente permettra d’analyser la contribution du système immunitaire dans les effets observés après xénogreffes de lignées tumorales murines. Par ailleurs, les schémas d’administration des chimiothérapies (voie, doses, posologies) sont bien standardisés chez la souris, contrairement à d’autres modèles tels que le Zebrafish. L’expérimentation sera effectuée sur des souris femelles d’au moins 8 semaines, possédant un utérus mature et fonctionnel.

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq jours d'injections pour désactiver la signalisation thyroïdienne dans leur tissu adipeux brun, la moitié étant ensuite exposée à 4 °C pendant 72 heures avant un prélèvement de sang sous anesthésie et la mise à mort, pour distinguer l'action centrale et périphérique des hormones thyroïdiennes. Le porteur indique n'attendre aucun effet délétère des injections et que le froid abaisse la température corporelle durant les premières heures. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'est adapté et qu'une alternative cellulaire exigerait 128 animaux contre 32 ici.

Objectifs

Le tissu adipeux brun (TAB) est capable d’utiliser les lipides et le glucose pour les transformer en chaleur (thermogenèse). Ce processus est dépendant des hormones thyroïdiennes (HT). Il était jusque-là établi que les hormones produites par la thyroïde passaient dans le sang pour jouer leur rôle directement dans le TAB, (action périphérique). Mais des études montrent que l’administration d’HT dans le cerveau des souris active directement le TAB (action centrale). Cela suggère que le cerveau est la cible principale des HT, ce qui bouscule ce qui était précédemment établi. Ces résultats restent encore controversés. A court terme, l’objectif de ce projet est donc d’arriver à distinguer la part de l’action centrale et périphérique des HT pour ses fonctions métaboliques dans le TAB afin de tirer au clair les données contradictoires jusqu’alors publiées. Pour cela, nous utilisons une lignée mutante murine qui ne dispose plus de signalisation thyroïdienne spécifiquement dans le TAB. L’utilisation de cette lignée a mis en évidence de nombreux indices suggérant que le froid déclencherait la multiplication des cellules du TAB (afin d’augmenter la quantité de chaleur produite par le tissu) ainsi que la production de lipides (mécanisme appelé lipogenèse, nécessaire pour alimenter la thermogenèse du TAB), mais pas chez les souris mutantes. Cela suggère que ces mécanismes seraient contrôlés par les HT directement dans le TAB, et pas dans le cerveau. Ainsi, cette étude pose la question suivante : l’altération de signalisation thyroïdienne dans le TAB empêche t-elle une lipogenèse et prolifération efficaces, du TAB ? Actuellement, notre modèle murin est le seul à permettre la distinction entre l’effet central et périphérique des hormones, grâce à la spécificité tissulaire des mutations induites.

Bénéfices attendus

Ce projet présente deux bénéfices principaux. Premièrement, il viendra confronter les données publiées dans la littérature qui suggèrent que la cible des HT est le cerveau (qui médie ensuite les effets aux autres tissus) et non pas les tissus périphériques comme il était jusque-là pensé. La démonstration ou la réfutation de ces découvertes sont primordiales afin de comprendre comment les HT régulent le métabolisme et la dépense énergétique. Egalement, il est d’intérêt sociétal de trouver des innovations aux moyens de prévention/traitement de l’obésité et le TAB a dès sa découverte suscité un engouement particulier pour sa capacité à utiliser lipides et glucides et ainsi consommer des calories . Les HT participent au contrôle de la thermogenèse du TAB, puisque des souris hyperthyroïdiennes ont une forte activité du TAB, résultant en une plus grande dépense énergétique et une plus faible susceptibilité à l’obésité et aux désordres métaboliques qui lui sont associés. Toutefois, l’injection d’HT ne peut pas être considérée comme une option viable à ces problématiques puisqu’elle va également avoir des effets métaboliques sur le cœur ou les os, déclenchant des effets secondaires tels que la tachycardie ou l’ostéoporose, par exemple. Il est ainsi crucial de comprendre comment les HT régulent spécifiquement la thermogenèse du TAB, et notamment le métabolisme des lipides, afin de, à plus long terme et avec les progrès de la pharmacologie, concevoir de nouvelles molécules ne stimulant que les activités métaboliques des HT sur le TAB tout en s’affranchissant des effets secondaires néfastes.

Procédures

Les animaux vigiles seront injectés en intrapéritonéal quotidiennement pendant 5 jours avec un produit permettant d’induire la mutation de la signalisation thyroïdienne dans le TAB) via une contention manuelle. Pour réduire le stress généré par cette technique, les animaux seront préalablement contentionés manuellement sans injection, tous les jours pendant une semaine afin de les accoutumer à l’expérimentateur et à la contention. La moitié des effectifs seront ensuite exposés à 4°C pendant 72h, une température à laquelle les animaux arrivent à maintenir leur température corporelle (données publiées et données du laboratoire). Durant cette exposition, les groupes sociaux et un enrichissement de la cage seront maintenus pour faciliter le maintien de la température corporelle. Au bout de 48h au froid, une injection intrapéritonéale unique sera réalisée sur tous les animaux (avec un marqueur de prolifération des cellules), un geste auquel ils auront été accoutumés précédemment. Pour finir, un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie profonde puis les animaux seront mis à mort pour prélèvement des tissus d’intérêts.

Impact sur les animaux

Aucun effet délétère à l’injection du produit utilisé pour induire les mutations dans le TAB n’a jusque-là été observé aux doses utilisées ici . Ce protocole et ces doses ont été déterminées sur les recommandations de la bibliographie, en réduisant les doses préconisées aux doses minimales mises au point dans notre laboratoire permettant l’induction des mutations dans notre modèle murin. De la même manière, aucun effet délétère n’a été observé par une injection unique du produit utilisé pour marquer les cellules prolifératives) aux doses utilisées fréquemment dans notre laboratoire. Cette dose a été choisie sur la base des données bibliographiques ayant définies cette dose comme étant la dose la plus faible permettant le marquage de toutes les cellules prolifératives. Nous savons que l’exposition au froid fasse diminuer la température corporelle des souris les 4 premières heures avant de revenir proche de la normale au bout de 8h . De plus, les souris mutantes défendent leur température corporelle de la même manière que les animaux non-mutants à 4°C pendant 72h en présence de nourriture dans la cage. Les animaux mutants tendent à consommer légèrement plus de nourriture que les animaux contrôles pour défendre de manière similaire leur température corporelle . La présence de nourriture permet aux souris de palier à la baisse de température, c’est pourquoi des méthodes de facilitation d’accès à la nourriture seront mises en place. De la même manière, tout le matériel nécessaire à la réalisation d’un nid sera maintenu.

Devenir

Cette étude vise à comprendre le rôle des HT dans la prolifération et la lipogenèse du TAB en réponse au froid. Pour cela plusieurs prélèvements terminaux doivent être réalisés. En effet, l’entièreté du TAB doit être analysé pour mesurer les paramètres questionnés. Egalement, une quantité importe de sang doit être prélevée afin de contrôler le taux d’hormones thyroïdiennes circulant, une étape incontournable pour contrôler la pertinence de notre modèle transgénique.

Remplacement

Ce projet nécessite de manière incontournable l’utilisation d’animaux puisqu’elle vise à comprendre le rôle des HT spécifiquement dans le TAB . Aucun modèle in vitro n’est adapté pour répondre aux questions posées. Notamment, une lignée cellulaire provenant du TAB ne répond que très peu aux HT et cette réponse est très différente comparée au tissu in vivo. Une autre alternative in vitro a mis en évidence une limitation puisque dans nos conditions, un très grand nombre d’animaux serait nécessaire pour cette étude (nombre d’animaux estimé à 128, contre 32 en utilisant les animaux entiers). Par ailleurs, la lipogenèse (production de lipides, que nous étudierons dans cette expérience) est un processus impliquant directement plusieurs organes, notamment le foie, dont le métabolisme est lui-même contrôlé par le cerveau. Enfin , l’observation de la lipogenèse et de la prolifération est étudiée en réponse au stimuli principal en conditions physiologiques, à savoir une exposition au froid. Le froid est détecté par les récepteurs sensoriels présents à la surface de la peau. Aucun modèle non-animal n’est capable de récapituler cette complexité multi-organes ni de répondre directement au froid. L’étude de processus métaboliques impliquant nécessairement plusieurs organes en réponse à un stimuli environnemental implique l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les études préliminaires réalisées dans le cadre de ce projet nous permettent d’affirmer que 6 animaux par groupe sont suffisants pour détecter une différence de lipogenèse et de prolifération . Néanmoins, la quantité de TAB étant limitée (30mg) l’utilisation de ce tissu peut être délicate. Egalement, un des points limites peut être atteint lors de l’exposition au froid. En ce sens, le groupe d’animaux par groupe est augmenté à 8, toutefois, l’expérience sera d’abord réalisée avec 6 animaux : si aucun point limite n’est atteint et que les extractions aboutissent et répondent aux questions posées, les 2 animaux restants par groupe ne seront pas utilisés. Si un problème technique est rencontré, les animaux supplémentaires pourront être utilisés. Ainsi, nous utilisons le nombre minimal d’animaux en prévoyant une marge pour s’adapter aux limitations techniques que nous pouvons rencontrer. De cette manière, nous ne préovoyons pas de répétition d’expérience. Par ailleurs, la procédure a été optimisée afin d’en tirer le plus d’information possible, à savoir la lipogenèse et la prolifération en réponse au froid, afin de ne pas avoir à dupliquer cette exposition et ne pas utiliser plus d’animaux. Enfin, plusieurs tissus seront prélevés, puisqu’ils pourront être utilisés à posteriori afin de regarder les effets d’une exposition au froid sur ceux-ci, sans avoir à exposer d’autres animaux.

Raffinement

Les souris seront élevées et hébergées par groupe de 3-4 animaux par cage en milieu enrichi pour favoriser la nidation (coton de nidation, feuille de papier, bois à ronger), et ce même pendant l’exposition au froid. Nos expériences précédentes montrent une température des animaux plus faible les 8 premières. Ainsi, pendant cette première phase, les animaux seront surveillés toutes les heures afin de détecter le plus rapidement possible des comportements anormaux. Ensuite, les animaux seront surveillés la journée toutes les 4h, soit quatre points de surveillance quotidiens. En dehors de l’exposition au froid, les animaux seront surveillés et pesés tous les jours. La souffrance des animaux est évaluée au comportement, comportant entre autres la prostration, le pelage et la posture. Egalement, les animaux seront aussi pesés lors des visites (tous les jours) et pendant l’exposition au froid (deux fois fois par jour) afin de contrôler l’absence de perte de poids significative, définissant un point limite de l’expérience. Une attention particulière sera également portée à l’aggressivité entre les animaux. Si de l’aggressivité ou des blessures résultantes sont détectées, les animaux blessés/responsables seront écartés et les blessures soignées à la Vétédine. Les animaux blessés ne seront pas exposés au froid, ou retirés du froid afin de permettre une cicatrisation optimale de leur blessure.

Choix des espèces

Les récepteurs des hormones thyroïdiennes de la souris sont très similaires à ceux de l’homme et chez ces deux espèces les hormones thyroïdiennes stimulent la dépense énergétique. Comprendre comment les hormones thyroïdiennes stimulent ce processus chez la souris apportera donc de précises indications sur les mécanismes présents chez l’Homme et pourront, à terme, être utilisés pour développer de nouveaux composés pharmacologiques afin d’augmenter la dépense énergétique et ainsi lutter contre l’obésité et les désordres métaboliques qui lui sont associés. Ce modèle est aussi le plus utilisé de nos jours pour ce genre d’études ce qui nous permet d’une part de comparer directement nos résultats avec ceux publiés dans la littérature, et d’autre part de les comparer avec les résultats obtenus précédemment dans notre groupe. Nous nous intéressons à la régulation de la physiologie du TAB chez l’adulte, les souris utilisées auront donc entre 2 et 4 mois. Les animaux ne sont pas utilisés au-delà car le tissu adipeux brun tend à décroître avec l'âge.

54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois formulations à doses croissantes, jusqu'à 100 mg/kg, en injection unique puis pendant cinq jours, avec des prélèvements de sang à la mâchoire sur animal éveillé puis un prélèvement terminal au cœur, pour fixer la dose maximale tolérée en vue d'un dossier d'autorisation de mise sur le marché. Le porteur indique qu'il est probable que les animaux présentent des effets indésirables et fixe des points limites tels que convulsions, détresse respiratoire ou automutilation. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'effet de l'"organisme entier" sur les molécules et qu'il est "indispensable de recourir à l'animal de laboratoire".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer la dose maximale tolérée de trois formulations différentes. Chaque formulation sera administrée à la dose de 10, 50 et 100 mg/kg.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de déterminer la dose maximale tolérée pour les trois formulations testées aprés une administration unique ou une administration répétée pendant 5 jours. La classe thérapeutique du principe actif est Neurologie, le but étant de déterminer les doses cibles pour les futures études de toxicologie demandées par les autorités pour un dépôt de dossier AMM.

Procédures

- Les animaux auront une simple administration en période 1 puis aprés une période de repos d'au moins 3 jours, ils auront une administration répétées pendant 5 jours (administrations Intra péritonéale en période 1 et 2). - Les prélèvements seront de 3 prélèvements par animal en période 1 juste aprés administration à 30min, 2h et 6h. Puis les animaux auront une période de repos d'au moins 3 jours. En période 2, les animaux auront également 3 prélèvements aux même temps aprés la cinquième et dernière administration. Volume maximal prélevé: 60 µl Les prélèvements se font sur animal vigile (microsampling à la veine mandibulaire) ou sous anesthésie (prélèvement terminal en intra-cardiaque).

Impact sur les animaux

Le but étant de déterminer une dose maximale, il est fort probable d'avoir des signes d'effets indésirables sur les animaux. Les animaux seront observés au minimum deux fois par jours pour un prise en charge rapide de l'animal si besoin. Les points limites ou points d'arrêt anticipés sont: - Immobilité prolongée de l'animal, décubitus - Suffocation, convulsion, détresse respiratoire - Apparence physique dégradée, absence de toilettage (ex : poil ébouriffé ou souillé) - Changements majeurs de comportements (ex : automutilation, agitation intense...)

Devenir

Les animaux seront euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur. Suite à cette procédure, des tissus (coeur, cerveau, poumons, reins, foie, rate, pancréas, muscle et tube digestif) seront collectés pour analyse

Remplacement

Le but de ce projet est de déterminer une dose maximale tolérée. La classe thérapeutique des formulations testées: neurologie. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire les effets de l'organisme entier sur les molécules, il est indispensable de recourir à l'animal de laboratoire.

Réduction

Dans ce projet, 54 animaux seront inclus (27 male et 27 femelle). Les animaux seront répartis en 9 groupes de 6 animaux. C'est le nombre d'animaux minimal requis pour avoir des résultats interprétables.

Raffinement

Durant toute la phase expérimentale, les animaux seront hébergés par groupe de 6 dans une même cage comprenant de la litière et du matériel d'enrichissement (ex: nid, bois à ronger). Un suivi quotidien (2 fois par jour à minima) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, comportement de l'animal....).

Choix des espèces

La souris est l'espèce utilisée dans ce projet. Cette espèce est bien décrite et caractérisée dans la littérature et son utilisation est conseillée (OECD) pour les essais de produits pharmaceutiques. La souche C57BL6 est particulièrement utilisée dans le domaine de la neurologie. Jeune adulte. Stade de developpement requis pour ce type d'étude

1000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont inoculés avec des trypanosomes, prélevés chaque jour d'une goutte de sang à la queue puis exsanguinés sous anesthésie, une partie des souris étant exposée aux piqûres de mouches tsé-tsé pour étudier la transmission. Le porteur indique que l'infection peut rendre les animaux moribonds ou prostrés, le poil hérissé, et décrit des points limites déclenchant une euthanasie précoce. Il affirme que ces souches parasitaires ne peuvent pas être maintenues in vitro et que l'hôte vivant reste nécessaire pour tester molécules et vaccins.

Objectifs

L’objectif de ce projet est donc d’amplifier des souches sanguicoles de trypanosomes (Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma evansi, Trypanosoma brucei brucei, Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax) conservées en azote liquide, par passage sur souris et rats afin de a) produire des souches en quantité massive pour production d’antigènes parasitaires nécessaires aux tests de dépistage type ELISA et pour des études de caractérisation du protéome, du transcriptome et du secrétome des trypanosomes dans l’objectif de développer de nouvelles molécules afin de proposer des tests diagnostiques plus sensibles et spécifiques, b) réaliser des stabilats cryoconservés de trypanosomes pour entretien de notre cryothèque, c) réaliser des repas sanguins infectants de glossines (sur souris balb/c et génétiquement modifiées) pour étudier les modalités de la transmission vectorielle des trypanosomoses africaines humaine et animale, d) tester des molécules candidates afin de mettre au point un traitement contre les trypanosomes humaine et animale et d’étudier l’efficacité de certaines d’entre elles pour développer un vaccin anti-maladie. e) évaluer l’importance de la localisation des parasites dans le derme au cours de l’infection en fonction de l’espèce de trypanosome et valider sa valeur diagnostique.

Bénéfices attendus

Notre unité de recherche développe des approches multidisciplinaires visant à améliorer la compréhension des mécanismes infectieux dans les maladies induites par des protozoaires parasites de la famille des trypanosomatidae (les trypanosomes). Ces maladies transmises par des vecteurs (glossines essentiellement) sévissent dans des zones rurales pauvres des pays africains et constituent un obstacle majeur à l’installation humaine et au développement de l’élevage et de l’agriculture avec un fort impact socio-économique pour des populations déjà fortement appauvries. Des moyens de lutte existent, basés sur la lutte anti-vectorielle et l’utilisation d’outils diagnostiques et de traitements curatifs, mais bien qu’utilisés de façon raisonnée et intégrée, ils montrent de plus en plus leurs limites (chimiorésistances développées par les populations d’insectes et les parasites par exemple). Nos travaux s’inscrivent dans un souci d’amélioration des outils diagnostiques existants (amélioration et développement de tests de dépistages), d’identification de molécules ayant une action curative ou préventive, de mise au point d’un vaccin efficace pour protéger les populations humaines et animales et enfin, d’amélioration des outils de la lutte anti-vectorielle.

Procédures

Injections et prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés. 40 rats et 300 souris seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes (dans certains cas une immunosuppression sera, au préalable, réalisée par injection), un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 210 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum, une anesthésie par injection d’un mélange anesthésique sera ensuite réalisée suivi d’un repas de glossines de 10 minutes. 240 souris seront immunisées trois fois à deux semaines d’intervalle, puis seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 mois maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 30 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, 90 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes et une fois avec la molécule à tester et 30 souris seront inoculées une fois avec la molécule à tester. Sur ces 150 souris un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement pendant 10 jours. 60 rats seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé avant l’inoculation et quotidiennement pendant 10 jours, un prélèvement de peau à 2 endroits différents sera réalisé deux fois à J4 et J10 après l’inoculation.

Impact sur les animaux

Les animaux infectés voient une parasitémie se développer dans leur sang, les nuisances vont de l'asymptomatisme à un changement d’apparence physique tel que le poil hérissé pendant plus de 3 jours, avec un aspect général moribond ou un état de prostration. Les inoculations peuvent provoquer du stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des souris et rats seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de récolter les parasites ou le sérum des animaux.

Remplacement

Les souches parasitaires que nous utilisons ne peuvent pas être maintenues in vitro, elles sont extracellulaires et se développent dans le sang de leur hôte, voire dans le derme. Ils entretiennent avec l’organisme hôte des relations étroites de nature cellulaires et chimiques nécessaires à leur développement et il nous est impossible de les reconstituer en utilisant des milieux artificiels même complémentés. De même, les mécanismes de transmission à la glossine nécessitent également l’utilisation du modèle animal. Les « tests de molécules à visées thérapeutiques et vaccinales », bien que nous mettions en place des tests in vitro et ex vivo visant à étudier leurs effets sur les cellules de l’hôte, nécessitent l’hôte pour avoir une vue d’ensemble des mécanismes complexes mis en jeu lors d’une infection. La mise en évidence de parasites dans le derme ne peut se vérifier que par le mode in vivo.

Réduction

Les animaux utilisés sont reduits au strict minimum.

Raffinement

L'espériencce des utilisateurs a permis la définition de points limites qui permettent grâce au suivi quotidien des animaux et de leur parasitémie, de procéder à l'euthanasie précoce d'un animal qui commence à présenter des signes de malêtre.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont des espèces classiquement utilisées pour la multiplication des souches de trypanosomes africains. Elles développent une infection comprise entre 3 et 10 jours post-infection en moyenne en fonction de la souche parasitaire utilisée. Le cas échéant, des souris génétiquement modifiées pourront être utilisées pour l’étude des interactions hôtes/pathogènes/vecteur. Les rats sont utilisés lorsque la quantité de parasites à produire est plus importante (cas de la production d’antigènes parasitaires). Des souris et des rats adultes seront utilisés afin d’optimiser la quantité de parasites à produire ou de sérum à récolter.

Six cochons femelles de 20 à 25 kg vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque animal reçoit six incisions d'au moins huit centimètres sur le thorax pour comparer deux colles chirurgicales, avec de la buprénorphine en cas de douleur au réveil. Le porteur indique que les tissus sont prélevés après euthanasie pour analyser la cicatrisation. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'inflammation et la cicatrisation d'une plaie et qu'il est "indispensable de recourir à l'animal entier".

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer la réponse inflammatoire locale ainsi que le processus de cicatrisation d'une plaie aprés l'application de deux colles chirurgicales différentes utilisées pour des sutures cutannées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet sont de suturer des plaies superficielles de façon simple et atraumatique. Les colles chirurgicale favorisent l'hémostase locale, renforcent les sutures et assurent l'adhésion tissulaire.

Procédures

Dans ce projet, six porcs femelles de 20-25 kg seront incluses. Aprés une période d'acclimatation d'une semaine, les animaux seront anesthésiés de manière générale ( "pig cocktail" 0.1 mg/kg). Six plaies superficielles seront faites au niveau de la zone thoracique de chaque animal. Les plaies seront des incisions linéaires, verticales, 3 à gauche et 3 à droite d'au moins 8 cm de longueur.La durée d'intervention sera inferieure à une heure par animal. La manipulation des animaux et la réalisation des plaies seront faites par un personnel expérimenté et formé conformément à la réglementation en vigueur. En cas de douleur suite à la réalisation des plaies, lors du réveil des animaux suite à l'anesthésie générale, il sera possible d'administrer de la Buprénorphine (0.1 mg/kg) en intra musculaire toutes les 6 à 8 h si nécessaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont les problèmes de cicatrisation. Apparition d'hématome, ou infection au niveau de la plaie.

Devenir

A la fin de cette procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour prélever les site d'application pour l'analyse des tissus

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire une réponse à l'inflammation ou un processus de cicatrisation au niveau d'une plaie, il est indispensable de recourir à l'animal entier. L'animal ne peut pas être remplacé.

Réduction

Six animaux sont prévus dans ce projet. C'est le nombre minimal d'animaux requis par les textes reglementaires pour avoir des résultats interprétables et significatifs.

Raffinement

Les animaux seront hégergés individuellement à partir de l'acclimatation jusqu'à la fin de la phase animale. Cet hébergement en individuel est nécéssaire pendant l'acclimatation à cause du risque de bagarre car il faut éviter le contact entre les animaux (chevauchement) ce qui pourrait fausser les résultats de l'étude. Une attention particulière sera portée aux animaux pour avoir un enrichissement du milieu adapté pour éviter l'ennui: contact visuel et olfactif entre congénères, surface suffisante de l'hébergement, présence de jouets... Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place permettant l'observation générale des animaux.

Choix des espèces

La réponse de l'inflammation et le processus de cicatrisation entre l'espèce porcine et humaine sont trés proche et quasi similaire. Espèce de choix pour ce type d'étude. Jeune adulte Entre 8 -10 semaines Poids entre 20-25 kilos Le collagène dermique et le contenu élastique de la peau du porc sont équivalents à l’homme.

172 souris privées de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de gliome humain est greffée dans leur cerveau, suivie par imagerie de bioluminescence, puis un composé est injecté dans le cerveau et un anticancéreux administré par gavage, pour tenter de lever la résistance des glioblastomes au témozolomide. Le porteur invoque le secret d'un brevet pour ne pas décrire le composé et rapporte une sensibilisation de 45 % obtenue in vitro. Les souris sont tuées par perfusion de formol dans le cœur pour l'analyse histologique du cerveau.

Objectifs

Le glioblastome multiforme (GBM) est une tumeur cérébrale, à croissance rapide et dont le pronostic vital est mauvais puisque seulement 2% des patients survivent au-delà de 2 ans après le diagnostic. Les tumeurs sont constituées de multiples types cellulaires plus ou moins différenciés, parmi lesquels les rares cellules souches sont responsables de la résistance aux traitements anticancéreux et de la récurrence tumorale. La première phase du traitement consiste en une exérèse chirurgicale suivie de cycles répétés de radiothérapie et de chimiothérapie par prise orale de témozolomide (TMZ) permettant de ralentir la repousse tumorale. Le TMZ est l’anticancéreux le plus efficace à ce jour cependant les cellules cancéreuses deviennent résistantes au TMZ au fur et à mesure du traitement. Il n’existe pas d’alternative efficace au TMZ. Toute avancée permettant d’identifier des cibles moléculaires et cellulaires visant à réduire la capacité des cellules tumorales à résister au TMZ sera donc bénéfique pour les patients. Nous proposons d’utiliser un composé qui cible une molécule endogène des tumeurs cérébrales. Nous avons montré in vitro que ce composé et la stratégie utilisée permettaient de sensibiliser jusqu’à 45 % les cellules de gliomes à l’anticancéreux TMZ. Notre stratégie faisant l’objet d’un dépôt de brevet, nous ne pouvons pas donner plus de détail à l’heure actuelle car la plus stricte confidentialité est de rigueur. Nos données obtenues in vitro sur les lignées cellulaires de gliomes U251, U87 et T98G sont très encourageantes et nous proposons maintenant d’évaluer in vivo la capacité de notre traitement à sensibiliser les tumeurs au TMZ. Pour cela, le développement de tumeurs orthotopiques de gliomes, générées par injection de cellules tumorales humaines dans le cerveau de souris immunodéficientes est nécessaire (procédure expérimentale 1). Le développement tumoral sera suivi par imagerie de bioluminescence (procédure expérimentale 2) et le composé administré en intracérébroventriculaire (ICV) dès détection de la tumeur (procédure expérimentale 3). Les souris seront ensuite traitées par gavage avec le TMZ (procédure expérimentale 4) et suivies chaque semaine en bioluminescence pour mesurer le développement tumoral (procédure expérimentale 2). Lorsque les points limites seront atteints, les souris seront sacrifiées par perfusion intracardiaque de formol à 10 % (procédure expérimentale 5) et les cerveaux récoltés pour analyse histologique.

Bénéfices attendus

Le témozolomide (TMZ) est l’anticancéreux le plus efficace à ce jour pour traiter le glioblastome multiforme (GBM), cependant les cellules cancéreuses deviennent résistantes au TMZ au fur et à mesure du traitement. Il n’existe pas d’alternative efficace au TMZ. Toute avancée permettant d’identifier des cibles moléculaires et cellulaires visant à réduire la capacité des cellules tumorales à résister au TMZ sera donc bénéfique pour les patients. Nous proposons d’utiliser un composé qui cible une molécule endogène des tumeurs cérébrales. Nous avons montré in vitro que ce composé et la stratégie utilisée permettaient de sensibiliser jusqu’à 45 % les cellules de gliomes à l’anticancéreux TMZ.

Procédures

- implantation de tumeurs en intracérébrale (15 minutes par souris, 1 seule fois) ; - imagerie bioluminescente (10 minutes par souris,1 fois par semaine durant toute la pousse tumorale) ; - injection intracérébrale (10 minutes par souris, 1 seule fois lorsque la tumeur est bien établie) ; - gavage des souris (1 minute par souris, 1 fois par jour un semaine sur 2)

Impact sur les animaux

- Changement de l'état corporel (poids, pelage, écoulement oculaire/nasal) ; - Changement de comportement (posture, mobilité, automutilation) ; Comme décrit dans les points limites des procédures, ces effets indésirables sont cotés et l'animal est mis à mort s'il montre des signes de soufrances.

Devenir

Les animaux de chaques tâches sont gardés en vie à la fin des procédures 1, 2, 3 et 4 afin de pouvoir participer à la procédure suivante. Les animaux sont mis à mot à la fin de la procédure 5 car des analyses histologiques sont effectuées sur les cerveaux de chaque animal par la suite.

Remplacement

Nous avons montré in vitro sur des cellules de gliomes humains que le composé et notre stratégie sont efficaces. Nous continuons actuellement in vitro sur ces cellules toutes les études nécessaires à la caractérisation fine des mécanismes à l’origine de cette sensibilisation. Afin de déterminer si le traitement pourrait être utilisé chez l’Homme, il est nécessaire de le tester dans un organisme vivant. La souris NUDE est une souris mutante athymique qui présente une défaillance des lymphocytes T. La souris NUDE développe des tumeurs après greffe orthotopique de 200 000 cellules de U251. La souris NOD/SCID présente une défaillance des lymphocytes T et B et développe plus facilement des tumeurs à partir de petites quantités (1000) de cellules souches issues d’un gliome humain. Ces deux modèles murins sont immunodéficients ce qui limite le rejet des greffons de cellules de gliomes humains.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés afin d’obtenir des résultats significativement exploitables et valides.

Raffinement

Le composé et la stratégie ont été testés in vitro sur des cultures cellulaires. Ces expériences nous ont permis de déterminer des doses efficaces qui seront injectées in vivo. Toutes les procédures expérimentales seront réalisées dans un établissement autorisé et en stricte conformité avec le comité local de protection des animaux, les lignes directrices de l'UE (directive 2010/63/UE) et le Comité national français (2010/63) . Les souris utilisées seront des souris mutantes NMRI NUDE et NOD SCID. L’immunodéficience de ces souris permet le développement sans rejet des xénogreffes de cellules de gliomes humains. Les animaux seront hébergés et surveillés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément. La conception et l’application des procédures expérimentales, le soin et l’hébergement des animaux seront effectuées par du personnel compétent et formé. La plus grande vigilance sera apportée aux animaux afin de prévenir, minimiser et/ou abroger la souffrance et le stress. Dans ce but, des points limites spécifiques à chaque expérimentation seront clairement établis afin de prendre les mesures nécessaires au soulagement ou à l'arrêt de de la souffrance de l'animal. De plus toutes les procédures possiblement traumatisantes sont effecturées sous anesthésie gazeuse, avec une gestion de la douleur adaptée à chaque situation (utilisation d'analgésique).

Choix des espèces

Les souris utilisées seront des souris mutantes NUDE et NOD/SCID. La souris Nude est athymique et présente une défaillance des lymphocytes T. La souris NOD/SCID présente une défaillance des lymphocytes T et B. Ces propriétés rendent les souris immunodéficientes ce qui limite le rejet des greffons de cellules de gliomes humains. Les animaux seront utilisés "à l'âge adulte" c'est à dire à partir de l'âge de 2 mois, les glioblastomes étant des tumeurs survenant à l'âge adulte.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène puis d'un inhibiteur, un gavage à l'huile d'olive et des prélèvements sanguins à la queue toutes les heures pendant quatre heures, avant une exposition au froid à 6 °C durant quatre heures avec mesure de température rectale, pour étudier la résistance à l'obésité liée à l'absence de cavéoline-1 hépatique. Le porteur qualifie ces procédures de "légères" tout en déclarant une gravité modérée. Il présente au conditionnel de futures thérapies contre le diabète et l'obésité et décrit le maintien de la physiologie de l'"organisme" comme "nécessaire".

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La production de glucose par le foie favorise le développement du diabète de type 2 et l'obésité. Nous avons récemment identifié dans le foie une voie de production de glucose impliquant des vésicules. L'absence de cette voie vésiculaire spécifiquement dans le foie protège de l’hyperglycémie et de la prise de poids induite par un régime riche en graisses et en sucre. L’objectif de ce projet de recherche fondamentale est donc de déterminer si une diminution de l’absorption des lipides ou une augmentation de la thermogenèse sont impliquées dans cette protection.

Bénéfices attendus

A court terme, les bénéfices de ce projet sont de déterminer les mécanismes de régulation de la production de glucose par le foie et leurs conséquences sur le métabolisme énergétique. A long terme, cette caractérisation permettrait de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre du diabète et/ou de l'obésité.

Procédures

A l’âge de 8 semaines, les animaux subiront une injection péritonéale journalière de tamoxifène pendant 5 jours (douleurs légères). A l’âge de 25 semaines, les animaux subiront une injection intrapéritonéale (douleurs légères) d'inhibiteur de la clairance des triglycérides sanguins puis un gavage (douleurs légère) avec de l'huile d'olive. Des prélèvements sanguins à la queue (douleurs légères) seront effectués toutes les heures durant 4 heures (environ 20µL à chaque prise soit moins de 200µl au total). A l’âge de 27 semaines, les animaux seront soumis à une température de 6°C pendant 4h. En effet, une augmentation de la thermogenèse n’est pas observable à neutralité thermique, les souris doivent être exposées à de faibles températures pour stimuler ce processus. La température rectale sera mesurée avant et après chaque exposition au froid.

Impact sur les animaux

Les injections de tamoxifène induisent une modification génique, conduisant à la réduction la production hépatique de glucose, sans effet délétère sur la glycémie des animaux. Les effets de l’inhibiteur de la clairance des triglycérides sont transitoires et n’impactent ni le poids, ni la prise alimentaire, ni le bien-être des animaux. Toutes ces procédures légères réalisées une seule fois n'auront pas d'impact à long terme sur les 160 souris étudiées. La procédure est toutefois qualifiée de sévérité modérée.

Devenir

Les souris seront mises à mort à la fin du protocole selon une méthode autorisée par la législation afin de prélever les tissus pour étudier les mécanismes impliqués.

Remplacement

Cette étude ne peut pas être réalisée sur cellules ou organoïdes car la fonction étudiée (la production de glucose par le foie) a des impacts sur l’ensemble du métabolisme et implique des dialogues entre organes. Conserver la physiologie de l'organisme est nécessaire pour comprendre les mécanismes régulant la production de glucose hépatique et leurs impacts sur la physiologie. Les études de ce projet seront donc réalisées in vivo dans des modèles de souris transgéniques ciblant des modifications géniques spécifiques au foie.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des pathologies étudiées, des modèles animaux, et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept. Afin de pouvoir faire une analyse statistique, des groupes de 10 souris seront analysés. Au total, ce projet nécessitera 160 souris mâles et femelles transgéniques et contrôles.

Raffinement

Les souris seront élevées et hébergées par groupe en milieu enrichi pour favoriser la nidation (coton de nidation, bois à ronger) et contrôlé, seront observés quotidiennement et pesés régulièrement pour suivre leur prise de poids. Lors du gavage (parfaitement maîtrisée par les personnes en charge de l’expérimentation animale), la sonde sera préalablement trempée dans une solution d’eau sucrée pour favoriser la déglutition de l’animal. Pendant l’exposition au froid, les souris seront libres de leur mouvement et auront un accès libre à la nourriture et à l’eau. Ce projet sera réalisé chez la souris, dont les régulations métaboliques sont plus semblables à l’homme que les vertébrés inférieurs. La lignée murine choisie est sensible au développement du diabète et des maladies métaboliques et permet de comparer les résultats des souris contrôles avec nos lignées transgéniques utilisées sur le même fond génétique. Le diabète de type 2 se déclarant principalement chez l’adulte, l’étude sera réalisée sur des souris adultes. Les souris seront mises à mort à la fin du protocole ou lors de l’atteinte d’un point limite défini dans le projet selon les méthodes autorisées par la législation.

Choix des espèces

Les études portant sur le rôle de la production hépatique de glucose sur le métabolisme glucidique et énergétique réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme, tels que les rongeurs. Nous souhaitons utiliser dans nos expériences des souris C57BL/6J. Cette lignée murine a été choisie pour pouvoir comparer les résultats avec nos lignées transgéniques utilisées sur le même fond génétique et car c’est une souche sensible au développement du diabète et des maladies métaboliques. De plus, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles. Dans ce projet, nous étudierons la production hépatique de glucose à l’âge adulte car les maladies métaboliques étudiées (obésité, diabète) se développement avec l’âge dans notre modèle comme chez l’homme.