Oncologie
- Autre recherche fondamentale
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- Éthologie / comportement / biologie animale
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Impact des pesticides sur le neurodéveloppement et leur rôle dans l’apparition de troubles du spectre autistique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier le lien entre pesticides et troubles du spectre autistique. Les femelles gestantes reçoivent un cocktail de trois pesticides à faible dose et subissent une chirurgie pour insérer des marqueurs fluorescents dans le cerveau des embryons, et la descendance passe des tests comportementaux nommés, vocalisations, interaction sociale et tests moteurs. Le porteur indique attendre chez les petits des retards de développement, des défauts d'interaction sociale et des stéréotypies, qu'il juge sans souffrance, et tue la descendance pour prélever les cerveaux. Il affirme que l'expérimentation animale est "indispensable", aucun modèle alternatif ne reproduisant selon lui la complexité du développement cérébral.
Objectifs
Une altération durant le développement du cerveau peut mener à l’émergence de troubles du neurodéveloppement parmi lesquels figurent les Troubles du Spectre Autistique (TSA) dont la grande variété des symptômes suggère une origine multifactorielle. Chez les individus atteints de TSA, des anomalies du développement du cerveau, et en particulier d’une partie appelée « cortex cérébral », ont été mises en évidence. L’objectif de notre projet de recherche est de déterminer l’influence de facteurs environnementaux, tels qu’une exposition chronique à des résidus de pesticides, sur le développement de ce cortex cérébral, dans un contexte de prédisposition génétique. Il consiste donc plus particulièrement à traiter des animaux susceptibles de développer un TSA avec un cocktail de pesticides à faible dose (dose réglementaire autorisée dans l’eau du robinet en Europe). Nous déterminerons ainsi l’impact de ces pesticides dans l’évolution de cette maladie. Notre étude permettra de mieux comprendre l’action de pesticides ingérés quotidiennement à faible dose sur le développement cérébral de souriceaux sains ou prédisposés à développer un TSA, et d’identifier les cibles pour lutter précocement contre les potentielles malformations cérébrales induites par les pesticides.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra de caractériser l’impact d’une exposition à faible dose de pesticides sur le développement du cerveau pendant la gestation et la lactation sur des individus génétiquement prédisposés à développer un TSA (gpTSA). Cette étude aura un impact significatif car elle permettra d’identifier les stades du développement et les cibles cellulaires particulièrement sensibles aux facteurs environnementaux tout en caractérisant les défauts induits par ces polluants à l’échelle cellulaire ainsi que leur impact sur le comportement. De plus, elle offrira de nouvelles perspectives sur la précocité et l’étendue des effets délétères des polluants environnementaux sur le développement cérébral des individus sains ou gpTSA. Ces travaux permettront d’alerter sur l’impact délétère de l’ingestion chronique des polluants environnementaux même à des doses résiduelles tout en fournissant des pistes diagnostiques et/ou thérapeutiques pour lutter contre la survenue ou l’aggravation des symptômes associés aux TSA.
Procédures
Traitement des femelles/ femelles gestantes/ progénitures à une faible dose de 3 pesticides, 2 mois avant la mise en reproduction et jusqu'à la fin de l’expérimentation (environ 6mois). La première portée des femelles servira exclusivement à tests comportementaux : enregistrement des vocalisations à 3 jours et 7 jours (3x3min/souris), test d’interaction sociale à 21 et 60 jours (15 min), tests moteurs à 21 et 60 jours (10 min/souris). Durant la seconde gestation, il y aura une procédure chirurgicale sur la femelle gestante (environ 35 min) qui permettra d’insérer des marqueurs fluorescents dans le cerveaux des embryons. La progéniture sera utilisée pour : soit i) Tests comportementaux (vocalisations, interaction sociale, tests moteurs) de J3 à J60, soit ii) Imagerie à travers le crâne sur animal anesthésié (environ 30 min), soit iii) directement mise à mort pour prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
En ce qui concerne le traitement aux pesticides, d'après de précédentes études conduites chez la souris, même à long terme (10 mois), aucune souffrance, perte de poids, stress, ou comportement anormal n'a été relevé chez les animaux sauvages traités. Cependant en débutant les traitements dès la gestation, nous nous attendons à avoir un retard de développement (yeux, oreilles, motricité), des défauts d'interaction sociale ou encore des comportements répétés associés à l’autisme (stéréotypies), sans que cela n'induise de souffrance. Concernant la chirurgie sur femelle gestante, pour éviter la souffrance, l'animal bénéficie d'une anesthésique générale et d’une couverture analgésique (anti-douleur). Une grille de suivi est mise en place évaluant : la complexité du nid, la présence de sang dans la cage, la posture, la mobilité et l'état du pelage. Ces critères sont évalués quotidiennement durant les trois jours suivant l'acte chirurgical. En fonction du score obtenu durant cette évaluation, l'état de souffrance de l'animal est défini, ce qui va permettre de statuer sur la conservation de la femelle jusqu'à la date initialement prévue ou sur l’obligation d’abréger sa souffrance immédiatement.
Devenir
Mise à mort de la progéniture pour prélèvement des cerveaux afin d’explorer l’impact des pesticides au niveau cellulaire (morphologie, nombres, anomalies diverses). Les géniteurs seront également mis à mort dès lors qu'ils ne pourront être réutilisés pour reproduction (âge trop avancé, chirugie ou fin du projet).
Remplacement
L'expérimentation animale est indispensable dans ce travail car aucun modèle alternatif ne nous permet actuellement de reproduire la complexité du développement cérébrale des mammifères. De plus l'étude sur l'animal est indispensable afin de pouvoir associer des défauts au niveau cellulaire à des déficits comportementaux tels que des défauts d'interaction sociale.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d'animaux pour ce projet en ne générant que les animaux au type génétique d’intérêt pour la mise sous traitement. Nous avons également décidé de ne pas réaliser de chirurgie sur la première portée des femelles et de garder la progéniture pour des analyses de comportement afin d'éviter que la perte associée à la primiparité (première portée) des femelles ne se mêle à la perte associée à la chirurgie. Ainsi les femelles ne sont pas utilisées que pour une seule et unique portée (car une femelle ayant subi la chirurgie ne pourra servir qu’une seule fois pour nos expériences), cela réduit le nombre de femelles à utiliser mais également la perte estimée au sein de la portée en comparaison à la combinaison primiparité + chirurgie. Le nombre d’animaux à utiliser a été déterminer grâce à des calculs statistiques permettant de définir le nombre d’individus par groupe nécessaire à la mise en évidence de différences significatives entre les groupes non-traités et traités aux pesticides et les différents types génétiques. De plus la moitié des cerveaux collectés sera envoyé à nos collaborateurs de manière à réduire le nombre d’animaux générés pour l’ensemble du projet de recherche incluant la collaboration.
Raffinement
Le bien-être animal est au cœur de nos préoccupations, c'est pourquoi tout au long du projet, les souris seront quotidiennement et étroitement surveillées par un personnel qualifié. Chacune des procédures chirurgicales sera réalisée sous couverture anesthésique et analgésique. Une grille de suivi permettra de mesurer l’état de bien-être général des animaux suite à un acte chirurgical en se basant sur des indicateurs physiques et comportementaux permettant de mettre des limites strictes à la douleur potentiellement endurée par celles-ci. Le comportement sera réalisé par un seul manipulateur qui aura habitué les animaux à sa présence pour éviter toute forme de stress dû à la présence de l’expérimentateur. Avant chaque test de comportement, une étape d'habituation à la manipulation et à l'environnement sera effectuée afin de réduire le stress des animaux durant l’expérience. La manipulation des animaux sera faite dans le calme et avec douceur. La séparation mère/souriceaux sera réduite au maximum avec des temps de présence de la mère entre chaque expérience nécessitant une séparation.
Choix des espèces
La souris présente une grande similarité avec l'Homme. En effet, 98% de son génome trouve son équivalent dans le génome humain ce qui permet, dans la majorité des cas de pouvoir mimer une pathologie humaine via des modèles génétiquement modifiés. De plus c'est une espèce de petite taille et sa courte durée de gestation et l'importance de ses portées en fait un modèle mammifère idéal pour les projets de recherche. Les différentes étapes du développement cérébral chez la souris étant maintenant bien décrites, ce modèle est pertinent pour la recherche neurodéveloppementale. La taille des embryons de souris est suffisante pour l'injection des marqueurs fluorescents qui nous permettent de suivre le développement du cerveaux ainsi que pour toutes les analyses qui vont en découler. De plus, il existe chez la souris de nombreux tests comportementaux spécifiques et bien décrits permettant de dissocier un comportement "normal" d'un comportement lié à un trouble du spectre de l'autisme (interaction sociale, comportement répété). L'injection des marqueurs fluorescents dans les embryons aura lieu au jour 13 de gestation afin de pouvoir marquer l'ensemble des cellules d’intérêt afin de suivre leur développement dans le cerveau. Le temps le plus précoce d'analyse est le stade embryonnaire E18 (jour 18 de gestation) qui correspond à la migration des cellules d’intérêt vers leur lieu de prédilection, ensuite il y a le stade J3 (3e jour post-natal) qui correspond au pic de prolifération des cellules d’intérêt, J7 qui correspond à la fin de leur prolifération et à la migration d’une population de neurones qui nous intéresse, J21 qui correspond à la période de maturation des différents types cellulaires d’intérêt et la quasi-finalité de la mise en place des interfaces entre les vaisseaux et les populations cellulaires d’intérêt. Nous analyserons également le stade J60 afin de déterminer si les dommages précoces induits par les pesticides sont maintenu ou spontanément rétabli après la maturation du cerveaux.
Les maladies infectieuses comme menaces de populations d’oiseaux longévifs en France: surveillance et mécanismes de transmission d’agents infectieux
- Conservation des espèces
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 200 oiseaux sauvages, fous de Bassan et vautours fauves, vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avant d'être relâchés sur le lieu de capture. Chaque individu subit une prise de sang, deux écouvillonnages cloacaux et deux buccaux, et pour une partie la pose d'une balise GPS externe, pour étudier l'exposition à l'influenza aviaire et la transmission d'agents infectieux. Le porteur indique attendre très peu d'effets indésirables, la manipulation ne durant que quelques minutes. Il affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer" ces espèces, choisies parce qu'elles ont été fortement touchées par l'influenza aviaire en 2022.
Objectifs
Les objectifs du projets sont d'acquérir des données sur les processus de transmission d'agents pathogènes dans les populations d'oiseaux sauvages et leurs implications pour ces populations. En particulier, dans le contexte de l'émergence récente de l'influenza aviaire hautement pathogène dans les populations de nombreuses espèces d'oiseaux de la faune sauvages, il s'agit d'acquérir des données sur les proprotions d'individus exposés aux virus et les modalités de transmission des virus. Les acquisitions de données et d'échantillons seront insérée dans des suivis démographiques déjà pré-existants de deux espèces emblématique, le fou de Bassan _Morus bassanus_ et le vautour fauve _Gyps fulvus_.
Bénéfices attendus
Est attendue un meilleure connaissance de l'exposition d'espèces d'oiseaux sauvages aux virus de l'influenza avaire hautement pathogène, ainsi qu'à d'autres agents infectieux, ainsi que du rôle de certains individus dans la transmission des agents infectieux. Les résultats ont vocation à être publié dans articles scientifiques et pourront être utilisés pour des décisions concernant la protection de la biodiversité. Le projet apportera spécifiquement des informations sur l'expositon des fous de bassan et des vautours fauves des populations françaises aux virus de l'influenza aviaire hautement pathogène. Les données seront acquise dans le cadre de suivis intégrés des populations concernées, c'est-à-dire des suivis incluant aussi l'acquisition de données fines sur la démographique et l'écologie du déplacement des populations.
Procédures
Les animaux font l'objet de prélèvements sur animaux vigiles (1 prise de sang, 2 écouvillonnages cloacaux et 2 écouvillonnages buccaux) et pour une part d'entre eux la pose d'un GPS (balise externe) afin d'acquérir des données sur leurs déplacement. Ces interventions dure quelques minutes de manipulation, l'individu étant ensuite relâché en nature au point de capture.
Impact sur les animaux
Très peu d'effets idésirables ou nuisance attendus sur les oiseaux, car la manipulation ne va consister qu'en la réalisation d'une prise de sang de 1 ml et la réalisation d'écouvillonnages cloacaux et buccaux.
Devenir
Tous les individus seront relâchés libres dans leur population en milieu naturel, sur le lieu de capture, quelques minutes après la réalisation des prélèvements. Les individus n'auront pas été affectés par des effets indésirable et des mesures de biosécurités sont prises pour ne pas risquer de dissémination d'agents infectieux.
Remplacement
Les objectifs étant de déterminer l'exposition de populations des espèces considérées, le fou de bassan et le vautour fauve, aux virus de l'influenza aviaire, il n'est pas possible de remplacer les espèces considérées. En revanche, les résultats obtenus avec ces espèces emblématiques pourront avoir des implications pour d'autres espèces.
Réduction
Les tailles d'échantillons considérées ont été déterminées afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en s'assurant d'obtenir des données informatives. Les données qui pourront être collectées plusieurs années de suite permettront d'optimiser l'utilisation des informations, notamment celles concernant le statut sérologique des individus.
Raffinement
Les techniques de capture et de prélèvements ont fait l'objet d'un raffinement afin de provoquer le moins d'effet négatifs sur les oiseaux.
Choix des espèces
Les espèces choisies l'ont été car elles ont été fortement affectées par l'émergence de l'influenza aviaire hautement pathogène en 2022 et qu'elles ont des traits d'histoire de vie les rendant particulièrement susceptibles à des maladies infectieuses affectant la survie des adultes. Il est aussi tout particulièrement important d'obtenir des informations sur les modes de transmission des virus de l'influenza aviaire au sein et entre colonies de ces espèces sociales qui se reproduisent en colonies. Les individus capturés pour faire l'objet de prélèvements seront majoritairement des adultes. Des prélèvements sur des jeunes au nid pourront être effectués lorsque les conditions le permettront (bonne accessibilité, dérangement limité).
Effets de l’exposition précoce à un toxique issu de particules d’usure de pneu couplée à une hausse de température durant les premiers stades de vie d’un poisson lacustre patrimonial sténotherme froid, l’omble chevalier
- Conservation des espèces
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 664 ombles chevaliers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les effets d'un toxique issu des particules d'usure de pneu et d'une hausse de température. Les poissons sont exposés dès les premiers stades de vie à la molécule 6PPD-quinone par balnéation, puis filmés par groupes de cinq pour mesurer leur activité et leur vitesse de nage. Le porteur indique attendre une mortalité d'environ 10 % liée à la température et une hausse supplémentaire liée au toxique, et tue tous les individus, ces stades précoces étant jugés les plus sensibles. Il affirme que le modèle poisson n'est "pas remplaçable ni substituable" pour cette question.
Objectifs
Les lacs péri-alpins tiennent une place particulière en raison de leur réserve en eau douce, et des nombreux services écosystémiques rendus. Néanmoins, ces derniers constituent également une zone importante de stockage des micro-plastiques, dont la majorité serait des résidus de pneus dus à un intense trafic routier. Une étude a mis en évidence une forte contamination du lac Léman aux micro-plastiques dont 60% sont des particules de pneus (TWP pour tire wear particles). La connaissance des impacts de ces micro-plastiques sur la faune aquatique reste encore parcellaire, en particulier sur les poissons. Quelques études ont porté sur les produits issus de la dégradation de la gomme des pneus et de ses additifs, dont beaucoup sont toxiques pour les poissons. En effet, les 2/3 des TWP et autres débris déposés sur la route peuvent ruisseler avec la pluie. La molécule 6PPD-quinone (6PPD-Q), dont la source principale dans les milieux aquatiques provient du lessivage des particules de pneus à partir des routes, est connue pour sa forte toxicité pour les organismes piscicoles et sa présence en quantité non négligeable (jusqu’au mg/L) dans l’eau de ruissellement de chaussée. Elle a récemment été identifiée comme responsable du « syndrome de mortalité par ruissellement urbain » chez le saumon coho adulte et semble particulièrement toxique pour les salmonidés. Le mode d'action précis de la 6PPD-Q est toutefois encore inconnu sur les stade embryo-larvaire, même s’il semble être lié à une perturbation de la barrière hémato-encéphalique. Les effets de la 6 PPD-Q sur les premiers stades de vie de ces salmonidés sont encore indéterminés à notre connaissance. Les effets sont connus chez les larves de zebra fish, ou cette molécule n’entraine pas d’augmentation de la mortalité mais à des effets neurotoxiques et entraine de nombreuses malformations cardiaques. A ce titre, nous nous proposons d’explorer les effets de cette molécule sur les premiers stades de vie de l’omble chevalier qui est un salmonidé vivant dans les lacs péri-alpins. De plus, l’omble chevalier est un bon candidat pour ce projet car il possède un temps de vie embryolarvaire long (4-5 mois), connu et maitrisé par le laboratoire. De plus, l’étude de l'impact d'une molécule toxique est classiquement analysée au stade juvénile, stade qui permet plus facilement de mettre en évidence des effets sur la mortalité, le développement, effets tératogènes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise donc à produire des connaissances et un seuil de toxicité des effets de la contamination à la 6PPD-Q durant premiers stades de vie de l’Omble Chevalier, salmonidé vivant dans les lacs peri-alpins dans un contexte de réchauffement climatique.
Procédures
Les animaux feront l’objet de prise vidéos pour l’observation de leur comportement lors des stades d’alimentation exogéne (750 DPF) et juvénile (840 DPF). Ainsi, les animaux seront testés par groupe de 5, ils seront acclimatés durant 2h dans le système expérimental et seront filmés à l’aide d’une webcam connectée à un ordinateur placé hors de la salle de test (afin de ne pas déranger les poissons durant le test) durant 10 minutes. Ces tests permettent d’évaluer différents comportements, tels que l’activité, la vitesse de nage, grâce à un logiciel de suivi vidéo. Ainsi, la prise de vidéo ne devrait impliquer qu’un léger stress du au changement de bac.
Impact sur les animaux
Compte tenu du peu de connaissance de l’impact de la 6PPD-Q sur les poissons non modèle aux stades embryolarvaires, nous pouvons supposer que les effets devraient être modérés car les doses de 6PPD-Q testées sont des doses environnementales. La seule étude à notre connaissance portant sur les premiers stades de vie a été réalisée sur les larves de zebra fish, où peu de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) pour les concentrations testées dans ce projet. De plus, pour les animaux incubés à 8,5°C nous pouvons nous attendre, au vue de la littérature, à une hausse de la mortalité de 10%.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car d’après la littérature, les premiers stades de vie sont les plus sensibles aux molécules toxiques ainsi il sera inutile de poursuivre les expérimentations au-delà des stades de développements cruciaux choisis.
Remplacement
Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné le peu de connaissance sur les premiers stades de vie de poisson et en particulier sur les salmonidés qui semble particulièrement sensible à la 6PPDQ. Ainsi, le modèle poisson est pertinent pour cette étude car il n’est pas remplaçable ni substituable.
Réduction
mixtes (GLM). L’effectif de 60 individus par temps de prélèvement est un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses, mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). 1 440 individus seront utilisés et mis à mort (60 individus prélevés par temps de prélèvement * 2 conditions thermiques) * 6 conditionnements (témoin eau 0ng/l, témoin éthanol 1.5ng/l stade 200 DPF puis eau claire, 1.5ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le développement embryo-larvaire, 3ng/l stade 200 DPF puis eau claire ; 3ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le stade embryo-larvaire) * 2 stades de développement (740 DPF et 820 DPF) = 1 440 individus. Au total pour l’expérimentation, nous aurons besoins de 1 440 individus pour les mesures morphologiques et comportementales. Nous pouvons prévoir une mortalité maximum au cours de l’expérimentation d’environ 10% dû à la hausse de température durant le développement embryo-larvaire . Ainsi, 1584 (1440+1440*0,1) individus seront utilisés pour l’effet température. Si nous nous basons sur la seule étude de toxicité de la 6 PPD-Q réalisée au stade larvaire sur les larves de zébra fish à nos concentrations nous pouvons nous attendre à avoir de faible hausse de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) , les expérimentations sur l’omble chevalier adultes à nos doses ne montrent pas de mortalité , nous pouvons nous attendre à une hausse de 5% en raison de son affinité présumé pour les salmonidés. Ainsi, 1664 (1584+1584*0,05) individus seront utilisés au cours de l’étude
Raffinement
L’eau sera renouvelée au 2/5 (soit 16 L) tous les 2 jours à partir du commencement du nourrissage soit à 700 DPF pour éviter une accumulation de déchets métaboliques, favorable aux pics azotés et à la survenue de pathogènes. Les animaux seront visités au minimum 1 fois par jour durant la semaine et une fois durant les weekends, une surveillance rapprochée sera mise en place en cas de perturbation (hausse de la mortalité, sous-alimentation). De plus, dans chaque bassin, des galets seront installées pour permettre aux alevins de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière, les stades embryo-larvaire vivant dans des gravières à 50m de fond. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience à partir de 700 DPF.
Choix des espèces
L'omble chevalier est une espèce sentinelle du changement climatique des lacs alpins qui sont concernés par une forte pollution aux particules de pneu (responsable de 60% de molécules plastiques présente dans le lac léman). Ainsi, cette espéce est à la fois exposé aux particules plastiques et à la hausse des températures dans nos lacs alpins et péri-alpins. De plus, les stades embryonaires choisis pour cette étude sont connus pour être plus sensibles aux polluants.
Caractérisation de la fonction pancréatique de modèles murins du Syndrome de Wolfram
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
3 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, comme modèles du syndrome de Wolfram. Chaque animal subit un jeûne de 16 h, des injections intrapéritonéales et des incisions caudales répétées sur neuf mois, pour caractériser un diabète et tester cinq composés. Le porteur indique que le modèle Wolfram-like développe progressivement cécité, surdité et troubles vestibulaires, et que les animaux sont tués pour prélever leurs organes. Il affirme que ces modèles murins sont "indispensables", seul "recours mammifère autre que l'humain" à reproduire ces symptômes, alors que les retombées thérapeutiques restent une "preuve de concept" à venir.
Objectifs
Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par un diabète sucré de type 1, un diabète insipide, une surdité neurosensorielle, une atrophie optique bilatérale et des signes neurologiques. De même, le syndrome de Wolfram-like est caractérisé par un diabète sucré de type 1, une surdité neurosensorielle et une atrophie optique bilatérale. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de ces maladies n’existe. L'objectif principal de ce projet de recherche est de caractériser l'apparition du diabète dans deux modèles murins de ces maladies et déterminer le potentiel thérapeutique de cinq composés chimiques sur ce diabète.
Bénéfices attendus
Les stratégies thérapeutiques dans les syndromes de Wolfram et Wolfram-like sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Ce projet va permettre, dans un premier temps, de caractériser le diabète des modèles murins de référence pour le syndrome de Wolfram et Wolfram-like. Il permettra ensuite d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur ces deux modèles.
Procédures
Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : contrôle alimentaire (durée 16h) -identification par marquage à l'oreille - injection en intrapéritonéal sur animal vigile - incision caudale sur animal vigile (anesthésie locale via créme anesthésiante). Chaque animal sera identifié une fois. Les animaux subiront 1 contrôle alimentaire (durée 16h), 2 injections en intrapéritonéal (1 min) à au moins 3 jours d’intervalle, 2 incisions caudales (première fois coupure puis retrait de la croute) à 1 mois. Ces interventions seront répétées à 3 mois, 5 mois, 6 mois et 9 mois pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murins, pour un total de 5 contrôles alimentaires, 10 injections en intrapéritonéal et 10 incisions caudales sur une période de 9 mois.
Impact sur les animaux
Les effets attendus seront "légers" à "modérés". La procédure d'identification peut engendrer du stress. Le contrôle alimentaire sur un durée de 16h peut également engendrer un stress. L'incision pour les prélèvements de goutte de sang est superficielle mais peut engendrer un léger stress . Pour limiter le stress, les animaux sont habitués à la manipulation au préalable. Le modèle murin du syndrome de Wolfram-like développe progressivement des troubles neurosensoriels (cécité, surdité et syndrome vestibulaire) à partir de 21 jours après la naissance.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et les organes collectés pour procéder aux analyses de biologie moléculaire et d'immunohistochimie permettant la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu.
Remplacement
L'utilisation de modèles murins des syndromes de Wolfram et Wolfram-like pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes de ces pathologies dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement. L’utilisation de modèles animaux demeure essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.
Réduction
Nous avons basé la taille de notre lot sur les données bibliographiques de souris développant un diabète, non induit par un régime spécifique. Nous avons estimé que 12 animaux par groupe expérimental sont nécessaires et suffisants pour générer des données statistiquement robustes tout en prenant en compte une éventuelle variation inter-individuelle. De plus, des analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe et ce nombre sera révisé au besoin. De même, les animaux utilisés pour la réalisation des tests métaboliques seront ensuite euthanasiés et leurs organes collectés afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet. Ces tissus seront utilisés pour lors de nombreuses analyses, morphologiques, histologiques, afin de disposer du plus large éventail de données possibles à l’issue d’une procédure expérimentale et ainsi réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. Des points limites ont été établis afin de surveiller au plus près les altérations dues aux procédures prévues dans le projet . Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. En plus des procédures habituelles d’hébergement, une attention particulière sera portée à la litière des animaux. Si une augmentation de la production d'urine à la suite du développement d'un diabète est constatée, le fond de cage sera renouvelé plus fréquemment. Pour limiter l’agitation des souris présentant un syndrome vestibulaire, l’enrichissement sera renforcé dans les cages. Enfin, pour éviter que les souris présentant un syndrome vestibulaire ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur.
Choix des espèces
La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie multiorgane où les altérations neurosensorielles s'accompagnent de signes neurologiques, cognitifs et endocrinologiques. Un modèle rongeur permet de caractériser les signes d'altérations métaboliques dans un schéma physiologique global d'évolution de la pathologie et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. Les tests métaboliques seront réalisés sur les animaux à 1 mois, 3 mois, 5 mois, 6 mois et 9 mois pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murins.
Suivi en télémétrie de la dévalaison de l’anguille argentée en lagune
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
160 anguilles européennes vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être relâchées dans le milieu naturel. Chaque individu est capturé, anesthésié, puis équipé par chirurgie d'un émetteur acoustique et d'une marque RFID implantés sous la peau avec un à trois points de suture, pour suivre en télémétrie la migration de dévalaison en lagune. Le porteur indique que le stress de la capture et du marquage peut retarder la migration, et écarte les individus déjà blessés ou en mauvais état sanitaire. Il affirme qu'il est "indispensable" d'étudier des anguilles sauvages capturées dans le milieu, l'espèce étant présentée comme menacée d'extinction.
Objectifs
Ce projet a pour objectif (i) de mieux connaître la dynamique de dévalaison à l'intérieur d'un système lagunaire, (ii) d'étudier la diversité des comportements migratoires et (iii) d'évaluer le succès de deux projets de restauration de la continuité hydrobiologique.
Bénéfices attendus
L'analyse des détections enregistrées par les stations d'écoute fixes et mobiles permettront de : i) S'assurer du bon déroulé de l'opération de marquage et de la survie des individus, -ii) Etudier le comportement des individus relâchés après l'opération de marquage : sont-ils immédiatement mobiles ou non ? - iii) Etudier comportements migratoires des individus : est-ce qu'ils dévalent tous ou certains remontent-ils au contraire le cours d'eau ? -iv) Connaître à quel moment les individus prennent la direction de la mer -v) Evaluer combien d'individus parmi ceux qui ont été détectés partis des bassins amont parviennent jusqu'aux portes de la mer - vi) Estimer la durée nécessaire pour les individus de parcourir la distance entre l'embouchure des bassins et les portes de la mer -vii) Evaluer si les voies de connexion restaurées sont utilisées par les anguilles pour rejoindre la mer -ix) Mieux connaître la diversité des comportements de dévalaison. Les résultats obtenus pourront éventuellement permettre de formuler des préconisations pour la gestion des ouvrages de connexion, afin d'optimiser le retour en mer des anguilles.
Procédures
Capture dans un vereux (nasse) : relève toutes les 24h approximativement. Facultatif : Si trop de captures, mise en couve jusqu'à 3 jours maximum. Stabulation dans un bac obscur et aéré : de 5 min à 4h Bain anesthésiant: 5 à 15 min Injection analgésique : 2 s Marquage avec une fermeture de la plaie à l'aide de 1 à 3 points de suture : 2 à 5 min Phase de réveil sous surveillance : de 10 à 30 min Stabulation avant relâcher : de 5 min à 2h
Impact sur les animaux
Le stress de la capture et du marquage est susceptible de retarder la migration des individus.
Devenir
L’ensemble des animaux sera remis en liberté à la suite de leur marquage, ce qui est primordial pour répondre à l’objectif de l’étude.
Remplacement
L’étude portant sur le comportement de poissons en milieu naturel, l’expérimentation doit être réalisée avec des individus capturés dans le milieu, et ne peut donc s’affranchir de l’emploi de poissons sauvages.
Réduction
Le milieu étudié présentant des densités d'anguilles élevées, il est nécessaire de suivre un maximum d'individus afin de pouvoir obtenir des résultats robustes et représentatifs de l'ensemble des deux sous-populations ciblées. De plus, au niveau des embouchures des bassins ciblés, des individus peuvent se faire éventuellement prédater par des silures. Et entre l'embouchure des bassins ciblés et les portes de la mer, les anguilles peuvent être prélevées par les pêcheurs professionnels ou la prédation aviaire. Par conséquent, un nombre suffisamment élevé d'individus doivent être marqués pour optimiser les probabilités d'avoir suffisamment d'individus qui parviennent jusqu'aux sorties de l'hydrosystème du Vaccarès. Dans le cadre de cette étude pilote, un total de 40 individus par bassin et par saison de dévalaison (octobre à mai), soit un total de 80 pour une année de suivi, et 160 si deux années de suivi sont réalisées, seront marqués. Le choix de ce nombre est un compromis entre avoir suffisamment d'individus pour obtenir des résultats robustes (n>>30 par bassin et par saison de suivi) et avoir suffisamment de moyens financiers pour y parvenir (coût des marques acoustiques relativement élevées >400€). Si les retours d'expérience sont favorables, un déploiement à plus grande échelle sera éventuellement envisagé.
Raffinement
Un individu qui présente des marques externes de blessures prononcées (souvent d'origine de prédateurs aviaires) ou d'autres signes d'état sanitaire dégradé (kystes, parasites, opacité des yeux, etc.) ne sera pas utilisé dans le cadre de cette procédure. Le marquage des individus s'effectue sous anesthésie et analgésie pour limiter au maximum la douleur. Un individu qui présente un comportement anormal lors de son anesthésie: des signaux d'hyperventilation ou de tremblements sera immédiatement placé dans le bac de réveil et ne sera donc pas traité. Les bacs de stabulation seront noirs, de manière à favoriser l'obscurité et diminuer le stress des individus pendant les phases de stabulation (avant leur traitement et pendant la phase de réveil). La densité des individus par bac sera limitée à 40kg/L. Et les bacs seront brassés par des aérateurs pour favoriser le brassage et l'oxygénation de l'eau. Les bacs seront placés à l'ombre pour éviter que l'eau se réchauffe excessivement. Une fois un individu marqué, il pourra être détecté en continu à plusieurs points de passage, aux points de sorties des bassins ciblées ainsi qu'aux portes de la mer, de manière continue. Ces suivis télémétriques (RFID et acoustique) constituent un moyen de raffiner le suivi en capture-marquage-recapture, puisqu'il permet de suivre à distance le déplacement d'individus marqués (de recapturer leur signalement) sans avoir à les manipuler à nouveau.
Choix des espèces
L’anguille européenne est une espèce migratrice amphihaline catadrome qui présente un cycle de vie unique, et qui est actuellement menacée d'extinction. Afin de mieux comprendre ses déplacements et en particulier de mettre en place des dispositions pour optimiser son retour en mer, il est indispensable d’étudier des individus de cette espèce. Dans le cadre de cette étude, uniquement des anguilles femelles argentées de plus de 50 cm, ayant un poids suffisamment important (>400g) pour supporter l’implantation de transpondeurs sans affecter leurs constantes vitales, seront utilisées. L'implantation de transpondeurs correspond à un lestage total de 5.1g dans l'air, avec une marque RFID de 23 mm de long qui pèse 0.6 g et un émetteur acoustique de 9mm de diamètre qui pèse 4.5g dans l'air (et 2.7g dans l'eau). L’impact des implants est négligeable lorsque leur masse est inférieure à 2.5% de celle du poisson, ce qui se vérifie ici.
Rôle des récepteurs Toll-like dans l’inflammation, l’autoimmunité et le syndrome métabolique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Environ 1 200 sont tuées dès le génotypage pour ne pas porter le bon profil génétique, tandis que les 1 200 autres subissent un régime gras de cinq à six mois provoquant obésité et stéatose hépatique, des prélèvements sanguins et des tests de tolérance au glucose. L'objectif est d'étudier le rôle d'un récepteur Toll dans l'obésité et l'auto-immunité. Le porteur affirme que les souris partagent "99 % des gènes" avec l'humain et écarte les organoïdes, jugés incapables de reproduire l'atteinte de plusieurs organes.
Objectifs
L'obésité est une épidémie mondiale qui touche aussi bien les pays riches que les pays pauvres et constitue l'un des principaux problèmes de santé publique du XXIe siècle. Un lien entre l'obésité, le syndrome métabolique et les maladies auto-immunes et l'inflammation chronique associée a été suggéré, mais les mécanismes sousjacents sont encore inconnus. Toutes ces maladies ont augmenté de façon spectaculaire au cours des dernières décennies, continuent à augmenter, menacent de réduire l'espérance de vie et infligent un fardeau aux patients et à la société dans son ensemble. Les récepteurs de type Toll (TLR) des mammifères détectent des composants microbiens conservés, partagés par de nombreux micro-organismes, ainsi que des composants endogènes provenant de cellules mourantes ou blessées, et jouent un rôle essentiel dans le pilotage de l'immunité innée et adaptative. Récemment, les récepteurs de type Toll sont apparus comme un lien critique entre l'inflammation et la contribution à l'obésité et aux maladies auto-immunes, tant chez la souris que chez l'homme. En particulier, le récepteur 7 de type Toll, qui détecte l'acide ribonucléique simple brin, contribue au développement de l'obésité et des maladies auto-immunes, comme le lupus érythémateux systémique et le syndrome de Sjögren. Ainsi, cibler les récepteurs Toll-like pourrait être une nouvelle approche thérapeutique dans la prévention ou le traitement de l'obésité et des maladies auto-immunes et inflammatoires. L'objectif du présent projet est de mieux comprendre comment l'augmentation de la signalisation du récepteur 7 de type Toll dans certains types de cellules contribue à l'obésité et à l'auto-immunité et d'émettre l'hypothèse que la réduction de la fonction du récepteur 7 de type Toll pourrait prévenir le développement de l'obésité et de l'auto-immunité et leurs effets néfastes. Plus précisément, nous cherchons à explorer la contribution du récepteur 7 de type Toll par les cellules dendritiques, les cellules B et les cellules épithéliales thymiques dans le développement de l'obésité et de l'auto-immunité en utilisant des modèles de souris transgéniques.
Bénéfices attendus
L'obésité est liée à un risque plus élevé de troubles auto-immuns et inflammatoires. Au cours des dernières décennies, l'obésité et les troubles auto-immuns ont connu une augmentation parallèle significative dans les pays occidentaux/industrialisés. Il est donc impératif de développer de nouvelles stratégies pour la prévention et le traitement de ces maladies. Le modèle murin d'obésité induite par le régime alimentaire est devenu l'un des outils les plus importants pour comprendre l'interaction entre les régimes alimentaires occidentaux riches en graisses et le développement de l'obésité, tandis que les modèles murins de lupus ont permis de faire d'importantes découvertes sur l'implication du récepteur 7 de type Toll dans les maladies auto-immunes. Le récepteur 7 de type Toll joue un rôle important dans le développement de maladies auto-immunes comme le lupus érythémateux systémique et le syndrome de Sjögren ainsi que l'obésité. Afin de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles pour l'obésité, des études animales plus mécanistes sont nécessaires pour délimiter les mécanismes moléculaires et cellulaires exacts qui sous-tendent l'auto-réactivité dans l'obésité, ainsi que la diaphonie adipeuseimmunitaire dans l'organisme. Nos études feront progresser notre compréhension de la contribution du récepteur 7 de type Toll par différents types de cellules dans l'obésité et l'auto-immunité et pourraient déboucher sur de nouvelles pistes pour la prévention et le traitement de ces troubles qui réduisent l'espérance de vie et ont d'énormes conséquences socio-économiques.
Procédures
Les animaux pré-sevrés seront soumis à un prélèvement de tissus pour le marquage et le génotypage (2400 souris). Les animaux avec le génotype approprié (1200 souris) seront soumis à un régime riche en graisses ou à un régime standard à partir de l'âge de 1,5-2 mois et pour une période de 5-6 mois. Des prélèvements sanguins (durée : 4 minutes maximal) seront effectués sous anesthésie gazeuse une fois à l'âge de 3,4-4 mois et une fois à l'âge de 5-5,5 mois. Un test de tolérance au glucose sera effectué à l'âge de 6-7 mois et un test de tolérance à l'insuline sera effectué à l'âge de 7-7,5 mois, au cours duquel des prélèvements de sang seront effectués à 5 moments différents. La durée du test de tolérance au glucose et du test de tolérance à l'insuline est de 90 minutes, tandis que le prélèvement de sang durant ces procédures dure 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un prélèvement de tissus pour le génotypage et l'identification, ainsi qu'à une prise de sang. Ces procédures durent moins d'une minute et peuvent entraîner une gêne et un stress mineurs pour les animaux, comme une douleur ou un stress temporaire pendant la procédure, un risque d'infection ou de saignement si elle n'est pas effectuée correctement. Pour l'obésité induite par le régime alimentaire, les animaux seront nourris avec un régime standard ou un régime riche en graisses pendant une période de 4 à 6 mois. Le régime riche en graisses chez la souris peut entraîner une prise de poids importante, l'obésité, des troubles métaboliques, une stéatose hépatique et une inflammation de faible intensité. Il peut également avoir un impact potentiel sur les facteurs comportementaux et psychologiques et provoquer des troubles gastro-intestinaux en raison de l'altération du microbiote intestinal. En outre, la manipulation ou l'immobilisation des souris peut provoquer du stress et de l'anxiété, ce qui peut entraîner des changements physiologiques et comportementaux, tels qu'une augmentation du rythme cardiaque, des niveaux élevés d'hormones de stress et une modification des schémas d'exploration ou d'activité. Enfin, l'anesthésie chez les souris peut entraîner des nuisances potentielles ou des effets indésirables tels que la dépression respiratoire, la baisse de la température corporelle et des altérations de la fonction cardiovasculaire.
Devenir
Après le génotypage, les animaux avec le mauvais génotype seront mises à mort (~1200 souris), tandis que les animaux avec le bon génotype (~1200 souris) seront placés dans un régime riche en graisses ou un régime standard pendant une période de 5-6 mois et seront ensuite mises à mort pour une analyse plus approfondie. Si, au cours des procédures, les souris atteignent le point limite (score de gravité supérieur à 10), elles seront mises à mort.
Remplacement
L'obésité et les maladies auto-immunes sont des maladies chroniques complexes, qui impliquent des décennies de changements physiopathologiques et d'adaptation. Le modèle d'obésité induite par le régime alimentaire chez la souris entraîne des modifications de plusieurs organes par rapport aux souris témoins. De plus, les maladies auto-immunes sont souvent systémiques et affectent plus d'un organe, comme dans le cas du lupus érythémateux systémique ou du syndrome de Sjögren. Ce projet propose d'étudier ces processus dans des modèles murins de récepteurs Toll (TLR) de l'obésité induite par le régime alimentaire et d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents ; ceci nécessite l'évaluation des changements physiologiques et immunologiques d'un organisme vivant. D'autres alternatives ont été envisagées, notamment la culture de tissus ou les organoïdes ex vivo (par exemple, le tissu adipeux sur une puce), mais l'objectif principal de ce projet est d'étudier les changements dans divers organes (tissu adipeux, foie, rein, pancréas, thymus) pendant une longue période et l'interaction entre l'obésité et les troubles auto-immuns, ce qui n'est pas possible avec les alternatives susmentionnées.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d'animaux par expérience, nous suivons des protocoles actualisés et standardisés pour le modèle de souris obèse induit par le régime alimentaire et pour mesurer la résistance ou la sensibilité à l'insuline. Les calculs pour déterminer le nombre approprié d'animaux pour les procédures ont été instruits par des études rapportées dans la littérature et notre expérience antérieure sur des souris transgéniques dans le cadre du syndrome métabolique et de l'auto-immunité. Le nombre d'animaux à utiliser permettra de générer des données scientifiquement robustes. Chaque souris sera soumise à de multiples tests (jusqu'à une sévérité modérée) au lieu d'utiliser des animaux différents pour chaque test, et des analyses post mortem seront effectuées sur les tissus de tous les animaux afin de garantir que le maximum d'informations soit recueilli sur chaque animal. Afin de limiter la variabilité entre les différents génotypes de souris, nous utiliserons et comparerons toujours des souris de même origine génétique et appariées en âge et en sexe. En outre, et chaque fois que cela sera possible, nous comparerons des souris transgéniques avec des souris sauvages de la même portée, afin d'éliminer l'hétérogénéité due à la variabilité du microbiote.
Raffinement
Les souris seront manipulées de manière appropriée et elles interagiront fréquemment, ce qui réduira le niveau de stress pendant les procédures. Le prélèvement de sang dans le plexus rétro-orbitaire sera effectué sous anesthésie à l'aide d'une station d'anesthésie à gaz, tandis que le prélèvement de sang dans la queue sera effectué après l'application d'un anesthésique local sur la queue. En outre, afin de préserver le bien-être des animaux au cours de la procédure, les souris seront contrôlées fréquemment à l'aide d'une feuille de score appropriée pour le bien-être des animaux, afin de s'assurer qu'aucun animal ne dépasse un niveau de détresse strictement déterminé par le score. Des interventions humaines ou des points d'arrêt seront immédiatement mis en œuvre si l'on constate qu'un animal présente des effets indésirables inattendus.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies parce qu'elles sont très similaires aux humains, puisque les deux sont des mammifères et que 99% des gènes des souris sont similaires aux gènes des humains. En étudiant la physiologie des souris, nous pouvons obtenir des informations sur la façon dont les êtres humains développent des maladies. En particulier pour les maladies chroniques comme l'obésité et l'auto-immunité, les souris sont idéales car elles vivent peu (~2 ans). De plus, les souris génétiquement modifiées rendent cette espèce idéale pour l'étude des molécules individuelles du système immunitaire. Dans notre projet, nous étudions un récepteur de type Toll, qui est conservé au cours de l'évolution entre les humains et les souris, dans le développement de l'obésité et de l'auto-immunité, en utilisant des souris génétiquement modifiées. Ces souris sont donc le modèle le plus approprié pour atteindre les objectifs de cette étude. Pour les souris issues d'un accouplement hétérozygote, la collecte de tissus pour le génotypage et le marquage des souris sera effectuée à l'âge de 7-10 jours. En effet, les souris doivent être regroupées dans des cages en fonction de leur génotype au moment de leur sevrage (21 jours), et le génotypage doit donc être effectué avant cet âge. Les souris seront utilisées à l'âge de 2 à 8 mois afin d'étudier la progression de la prise de poids et de l'auto-immunité avec le temps, puisqu'il s'agit de troubles chroniques.
Étude du métabolisme et de l’activité locomotrice dans un modèle de souris résistant à l’obésité.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
66 souris vont être utilisées, chacune passant 48 heures isolée dans une cage de calorimétrie et subissant trois séances de rotarod, de grip test et de marche en équilibre sur une planche à trous, ainsi qu'un open field de 30 minutes, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les prises de sang se font sous anesthésie, et une partie des souris reçoit pendant six mois un régime enrichi en sucres et en lipides, que le porteur dit capable de conduire "à la longue à une obésité". L'équipe a créé une lignée privée d'un gène dont les souris résistent à la prise de poids, et veut comprendre cette résistance en les comparant à des souris témoins. Toutes sont tuées à l'issue pour l'analyse de leurs tissus. Le porteur retient des groupes de 12 souris pour deux génotypes et deux régimes, soit 48 souris, et écrit pourtant que "l'étude de 66 animaux sur 3 ans est nécessaire".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier la locomotion et le métabolisme chez des souris qui semblent résistantes à la prise de poids. En effet, nous avons développé un modèle de souris avec une perte d’expression d’un gène spécifique, et à notre surprise ces animaux sont résistants à la prise de poids. Des analyses complémentaires montrent une masse musculaire normale mais une non-accumulation de la masse graisseuse dans ces animaux à l’âge d’un an. Nous souhaitons donc explorer plus en avant ce phénotype, notamment via des analyses longitudinales de la composition corporelle, du métabolisme, de l’activité locomotrice et de la calorimétrie de ces animaux, complété par des analyses sanguines, et ceci à la fois en diète normale ou enrichie en lipides. Nous espérons que cette approche nous permettra de mieux comprendre la résistance à la prise de poids dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de l’activité locomotrice et du métabolisme.
Procédures
1 – Les prélèvements sanguins requièrent moins d'une minute. 2 – L’analyse de la masse corporelle se fera par qNMR, qui est une analyse non-invasive d’une durée de 1 minute. 3 - L’analyse du métabolisme se fera par des tests de Calorimétrie indirecte, qui se déroulent dans des cages d’hébergement individuelles pendant 48 heures. 4 – L’analyse de la locomotion des animaux se fera par une batterie de tests non invasifs réalisés sur une durée de 3 à 4 semaines selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Nous souhaitons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice chez des souris résistantes à la prise de poids, et ceci via des tests classiques et non invasifs. Nous souhaitons aussi analyser les paramètres biochimiques de ces souris et ceci via un prélèvement d’une faible quantité de sang. Ces analyses peuvent induire des contraintes décrites ci-dessous : -Une partie de l’étude du métabolisme se fait chez des animaux avec une diète enrichie en sucres et en lipides, ce type de régime peut conduire à la longue à une obésité avec ces problèmes associés (difficulté à se déplacer, etc.). Nous allons donc restreindre ce régime enrichi en sucres et en lipides à une période de 6 mois. - Toujours à propose de l’étude du métabolisme, celle-ci nécessite des tests se déroulant dans des cages d’hébergement individuelles, conduisant donc à un isolement des animaux pendant 48 heures. Toutefois ce test est de courte durée et une fois terminé, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec les mêmes dispositions d’avant le test (les mêmes souris dans la même cage, et les cages sont gardées dans le même état qu’avant le début du test, et ceci afin que les animaux retrouvent leur environnement). - Concernant les prélèvements sanguins, ceux-ci peuvent entrainer un stress et/ou éventuellement à une légère douleur. Les animaux seront donc anesthésiés quelques minutes avant le prélèvement sanguin.
Devenir
Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus pour des analyses histopathologiques et moléculaires.
Remplacement
Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris d’une maladie humaine génétique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de la locomotion et du métabolisme. Enfin, nous espérons que l’analyse de ce modèle murin permettra de mieux comprendre la faiblesse musculaire et la perte de poids de noter maladie d’intérêt.
Réduction
L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, et compte tenu de notre projet d’analyser deux conditions (souris contrôle ou souris sans notre gène d’intérêt) sous deux types de nourriture (normale ou enrichie en lipide), nous estimons que l’étude de 66 animaux sur 3 ans est nécessaire.
Raffinement
Afin de limiter la prise de poids des animaux, le régime enrichi sera limité à 6 mois. De plus, les prélèvements sanguins à la veine temporale superficielle se feront sous anesthésie. Les point limites seront alors déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après le prélèvement sanguin (changement du comportement : akinésie, prostration, paralysie, non réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure de prélèvement seront arrêtés si ces points limites sont atteints. Enfin, les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Néanmoins, si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. De plus, de la nourriture gélifiée sera de plus mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. Toutefois, en cas de douleur forte (isolement, immobilité, automutilation, cachexie, etc.) et/ou d’échec des traitements précèdent ; les animaux seront euthanasiés rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience sera stoppée.
Choix des espèces
Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude du métabolisme. Nous allons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice par des tests non invasifs sur 66 souris adultes, et ceci sur une période de 6 mois pour l'étude du métabolisme, à 15 mois pour l'étude de la locomotion, Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la perte de force et de la prise de poids des animaux.
Evaluation du potentiel immunorégulateur des vésicules extracellulaires : EVReg
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
202 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections de vésicules extracellulaires, des mesures de glycémie et des prélèvements sanguins, certaines développant un diabète auto-immun ou une maladie du greffon contre l'hôte, avant le prélèvement de leurs organes lymphoïdes. L'objectif est de mettre au point une mesure de l'activité immunomodulatrice de ces vésicules, en vue de la transposer ensuite vers des tests in vitro. Le porteur affirme que cette réaction immunitaire n'est "pas modélisable in vitro ni in silico" à ce stade.
Objectifs
L’objectif général de notre projet est l'évaluation du potentiel immunomodulateur des vésicules extracellulaires (EV) de sources cellulaires variées, à usage thérapeutique. Il n'existe actuellement aucun test standardisé dans la littérature pour évaluer le potentiel immunorégulateur des EVs. Selon les études en effet, les chercheurs utilisent des métriques très différentes (dosage des protéines totales, quantité d'une protéine, nombre de particules, activité enzymatique ...). Notre projet vise d’une part à proposer une méthode de qualification et de mesure objective de l'activité immunomodulatrice des EV de toutes provenances, et d’autre part l’identification des cibles immunitaires précises in vivo en fonction de la voie d’administration, dans le but de pouvoir dans un 2ème temps transposer l’évaluation thérapeutique des EV de l’in vivo vers des tests in vitro ou ex vivo.
Bénéfices attendus
La publication d'un test robuste de mesure des effets immunomodulateurs des EV permettrait la standardisation des pratiques entre laboratoires et entre EV de différentes sources ; elle permettrait également de valider les méthodes de production et de purification de façon à préserver ou maximiser le potentiel des EV.
Procédures
Les manipulations prévues sur animaux vigiles consistent en des pesées (192 animaux max, hebdomadaires ou bi-hebdomadaires), mesures de glycémie (60 animaux, bi-hebdomadaire), et injections intrapéritonéales (60 animaux, maximum bi-mensuel). Les manipulations sur animaux anesthésiés inclueront des injections (192 animaux max, EV administrées en 2 injections ou en injection unique), et ponctions sanguines (192 animaux max, prélèvements hebdomadaires). Les injections, ponctions sanguines, pesées et mesure de glycémie sont des opérations rapides d'une durée maximale de quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les interventions prévues sur les animaux ne doivent pas engendrer d’inconfort, de douleur ou de gêne notable, et sont de courtes durées. L’inconfort des injections i.d. ou des prélèvements au niveau du sinus rétro-orbitaire sera anticipé par une manipulation sous anesthésie générale gazeuse. Pour le suivi du diabète, la mesure de la glycémie sur microgoutte ponctionnée à la queue ne doit pas engendrer de douleur, et cette mesure ne nécessite qu’une contention légère et rapide. Dans le cadre du modèle de transfert de diabète, les symptômes et complications liés à une hyperglycémie (perte de poids, perte d’appétit, état clinique dégradé) sont évités par un diagnostic précoce. Les symptômes seront surveillés pour une prise en charge rapide le cas échéant. Dans le cadre du modèle d’humanisation, la maladie du greffon contre l’hôte engendre également des symptômes cliniques indésirables (perte de poids, apathie, symptômes digestifs…), mais le suivi du poids permet une détection rapide de l’apparition de la maladie, et les points limites décrits sont suffisamment précoces pour éviter une souffrance des animaux.
Devenir
Le devenir terminal des souris est la mise à mort pour prélèvement et analyse des cellules sanguines et des organes lymphoïdes, que le terme de l'expérience soit échu ou que les points limites soient atteints.
Remplacement
L'étude de la réaction immunitaire en fonction de la voie d'administration des EV n'est actuellement pas modélisable in vitro ni in silico. Le manque d'éléments de standardisation empêche le calcul à priori des doses équivalentes entre deux lots d'EV : notre projet vise précisément à améliorer cet état de l'art.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit par l'utilisation des noeuds lymphatiques individuels : chaque individu fournissant plusieurs noeuds lymphatiques, l'appariement des données avec contrôle interne par animal permet de réduire grandement le nombre d'animaux. Par ailleurs, l'utilisation d'une procédure de diabète accéléré permet, grâce à une pénétrance maximale de la maladie, de diminuer nettement le nombre d'animaux à observer dans le cas d'un diabète spontané. Les groupes ont été réduits au minimum pour permettre la validation de nos hypothèses. Des analyses statistiques permettront une exploitation des résultats d'incidence de diabète ou de maladie de greffon contre l'hôte, mais aussi de dosages des marqueurs immunitaires et inflammatoires du sang, et analyses ex vivo de la réactivité des organes lymphoïdes et populations cellulaires.
Raffinement
L'étude chez les souris traitées vs non-traitées comportera un suivi du poids, de la glycémie (selon les groupes), ainsi que systématiquement de ponctions sanguine terminale. Après l'euthanasie, les organes lymphoïdes, selon les groupes les pancréas, seront également prélevés pour études fonctionnelles in vitro, ou études moléculaires, biochimiques ou transcriptionelles. Les animaux ne sont pas manipulés avant une semaine d'acclimatation pour les nouveaux arrivants. Les animaux nés au sein de l'EU sont manipulés et habitués aux manipulations avant le début des procédures. Tous les animaux sont hébergés en cages par groupe de 5 maximum par fratrie et par sexe. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel de l'EU et par les expérimentateurs de façon pluri-hebdomadaire. Les cages sont nettoyées chaque fois que nécessaire (minimum une fois par semaine) en génant les animaux le moins possible, tout en maintenant en permanence de l'enrichissement changé régulièrement, incluant de la cellulose compressée, des jouets en bois (bille, quille), des hamacs, des igloos, des roues, des tubes en plastique rouge ou en carton, sans exclure l'utilisation d'autre enrichissement selon les disponibilités. Ce matériel est autoclavé avant utilisation.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle de diabète de type 1 auto-immun chez la souris NOD, modèle très bien décrit dans la litérature et utilisé depuis longtemps en laboratoire, permet d'accélérer les procédures mises en place tout en réduisant le nombre d'animaux. Ce modèle de diabète accéléré chez la souris permettra d'évaluer précisément ce que le projet prévoit de quantifier : l'effet immunomodulateur des EV. Par ailleurs, les autres modalités expérimentales disponibles dans cette espèce sont facilement disponibles, ce qui garantit une exhaustivité supérieure aux autres espèces. Les souris utilisées dans ce projet seront majoritairement des souris jeunes adultes au-delà de six semaines. En effet, les souris obtenues du fournisseur à l’âge de 6 semaines peuvent s’acclimater pendant 2 semaines avant d’être utilisées en protocole. Au-delà de 8 semaines, elles ont un poids suffisant et stabilisé autour de 25g, permettant d’avoir des lots homogènes et des résultats reproductibles. Seules les souris issues du modèle d'humanisation seront traitées entre 4 et 6 semaines, afin de maximiser la réussite de la greffe de cellules souches hématopoïétiques.
Impact de l’activation immunitaire maternelle sur les infections congénitales par le cytomégalovirus
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
996 rats vont être utilisés, tous mis à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Des rates gestantes reçoivent une injection destinée à activer leur système immunitaire et deux prises de sang, puis sont opérées sous anesthésie pour l'injection d'un cytomégalovirus dans le cerveau de leurs embryons, avec des avortements partiels possibles. Tatoués aux pattes dès le premier jour, leurs ratons passent un test de retournement sur le dos et un test d'éloignement du vide sur une plateforme de 8 cm, puis, selon les groupes, l'implantation d'électrodes sous anesthésie, des tests cognitifs et comportementaux non nommés portant sur l'anxiété, la mémoire spatiale et la sociabilité, et 72 heures d'EEG par télémétrie. Ces ratons infectés peuvent présenter dès leurs deux premières semaines des crises d'épilepsie déclenchées par la manipulation, associées à des morts subites, et le porteur attend du projet "des informations importantes" et la "possibilité" de prévenir un jour ces conséquences.
Objectifs
Les infections congénitales à cytomegalovirus (CMV) concernent environ 1% des naissances et représentent une cause majeure de troubles du neurodéveloppement (e.g. microcéphalie, polymicrogyrie, surdité, paralysie cérébrale, épilepsie, déficience intellectuelle...). Une influence neuropathologique à plus long terme a été évoquée, notamment sur la survenue d'autisme ou de schizophrénie. En dépit de leur fréquence et de leurs conséquences médicales et socio-économiques, la physiopathologie des infections congénitales au CMV reste peu étudiée et mal connue. Ainsi, les options préventives et thérapeutiques restent limitées. L’étude de modèles animaux pertinents, notamment chez la souris et le rat, utilisant les CMVs spécifiques de ces espèces, représente une approche de choix pour appréhender les mécanismes sous-jacents complexes et évolutifs, le développement du système immunitaire cérébral et des réseaux neuronaux, et leurs interactions réciproques. L'objectif principal de ce projet est d'explorer chez le rat l'impact de la réaction immunitaire au CMV et les conséquences de l'infection du cerveau en développement par le cytomégalovirus (CMV), à différents niveaux d’analyse : au niveaux moléculaire et cellulaire, au niveau des conséquences proximales pendant la période postnatale précoce et à plus long terme sur la cognition, le comportement et la survenue d'activités épileptiques spontanées.
Bénéfices attendus
Les infections congénitales par le cytomégalovirus sont fréquentes (0.7 à 1% des naissances) et représentent une cause majeure de pathologie neuro-développementale, avec des conséquences médicales sévères et un impact socio-économique important. Cependant, les mécanismes restent mal compris et peu abordés, et l'impact à long terme notamment reste mal connu. De ce point de vue, notre projet doit apporter des informations importantes pour apprécier ces conséquences, tout en ouvrant la possibilité de les prévenir en ciblant des altérations précoces du cerveau en développement.
Procédures
Une injection périphérique est pratiquée chez des femelles gestantes puis un prélèvement sanguin est réalisé 3h et 24h après l’injection. Après au moins 2 jours de récupération, les mêmes femelles sont opérées sous anesthésie générale, afin d’accéder aux embryons et d’injecter le CMV dans les cerveaux embryonnaires. Dépendant du nombre d’embryons, la chirurgie dure de 30 à 45 minutes ; le muscle et la peau sont suturés. Au premier jour postnatal, les ratons d’une même portée sont tatoués au niveau des pattes avant et/ou arrière, et suivis quotidiennement pendant les deux premières semaines de vie postnatale (mesures de masse corporelle, réalisation de tests sensorimoteurs (test du réflexe de retournement lorsque l’animal est placé sur le dos, test du réflexe d’éloignement du vide lorsque la tête de l’animal est dans le vide, l’animal étant posé sur une plateforme élevée d’environ 8 cm), observation de la survenue de crises généralisées d’épilepsie) ; chaque session de tests dure environ 2-3 minutes. Aux stades P18 et P30, une chirurgie sous anesthésie générale est réalisée sur certains animaux pour implanter une électrode permettant d’enregistrer les activités corticales précoces. Ces enregistrements sont réalisés chez l’animal éveillé pendant environ 30 minutes, puis sous anethésie générale légère pendant au maximum 2 heures. Après P60, d’autres animaux sont évalués au cours de test cognitifs et comportementaux non-invasifs, sans restriction d'eau ni de nourriture (anxiété, reconnaissance et mémoire spatiales, sociabilité). Des sessions d’entrainement sont réalisées afin de minimiser le stress. Une fois ces tests terminés, une chirurgie sous anesthésie générale est réalisée sur certains animaux pour implanter un système permettant d’enregistrer les activités corticales sans fil. Ces explorations fonctionnelles (vidéo-EEG télémétrique ; durée 72h) sont réalisées une semaine après la chirurgie chez l’animal vigile en activité dans sa cage.
Impact sur les animaux
Le composé injecté aux femelles gestantes peut déclencher une réaction transitoire (hyperthermie, hypoactivité, et hypophagie) qui se normalise après 24h. Un prélèvement sanguin est réalisé à 3h et 24h post-injection. Après au moins 2 jours de récupération, ces mêmes femelles sont opérées sous anesthésie générale pour accéder aux embryons et réaliser des injections dans les cerveaux embryonnaires. L'anesthésie des femelles gestantes peut engendrer des dépressions respiratoires, une hypothermie, une déshydratation. La chirurgie elle-même peut engendrer en post-opératoire sur des temps courts (1 à 3 jours maximum) de rares et faibles hémorragies vaginales, des avortements partiels, des douleurs abdominales, une diminution de la mobilité / inactivité, une perte de poids, une inflammation des sutures. Les femelles gestantes sont isolées lors de la période post-opératoire jusqu’à la mise bas. Leur bien-être après chirurgie est évalué quotidiennement par des mesures de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques. La majorité des femelles gestantes (>97%) récupèrent très bien après la chirurgie et la gestation se poursuit jusqu’à la mise bas. Chez les ratons nés après l’infection cérébrale au CMV in utero, un ensemble de phénotypes est attendu. Leur suivi quotidien au cours des deux premières semaines de vie postnatale a mis en évidence la survenue : d'hyperextension des membres inférieurs ; de crises d'épilepsie généralisées tonico-cloniques déclenchées par la manipulation, et correlée à la survenue de mort subite (sudden unexpected death in epilepsy, SUDEP) ; d’un défaut de développement de réflexes sensorimoteurs évalués par le test d'éloignement du vide (cliff aversion test) et le test de retournement (rigthing reflex). A plus long terme, nous anticipons des altérations fonctionnelles et comportementales chez les rats infectés par le CMV in utero, e.g. des activités épileptiques spontanées, des troubles du cycle veille/sommeil, des troubles cognitifs (mémoire spatiale) et des troubles de la sociabilité, mais cela doit être exploré et validé.
Devenir
Les femelles sont euthanasiés car elles ne peuvent pas être réutilisées. La descendance est mise à mort pour analyses post mortem.
Remplacement
Les mécanismes neurophysiopathologiques des infections congénitales par le CMV reposent de manière inhérente sur des interactions développementales multiples, entre la dynamique de l'infection virale elle-même, celle des réseaux neuronaux, et celle du système immunitaire cérébral. Il est évident que certains de ces évènements, ainsi que leur complexité, et leurs relations réciproques, ainsi que leurs conséquences à long terme comme envisagé dans le projet, ne peuvent être modélisés in vitro y compris en utilisant des cérébroïdes, et encore moins in silico. Cette constatation est évidente pour les études cognitives et comportementales. Une partie de nos expériences d'enregistrements des activités épileptiques sera réalisée in vitro (tranches aigues de cerveau), afin de réduire l’expérimentation sur l’animal vivant.
Réduction
Nous avons basé le nombre minimal d'animaux nécessaires sur la base de nos résultats antérieurs, et sur des calculs classiques de puissance statistique pour les tests les plus usuels. Nous optimisons la réduction des animaux utilisés de plusieurs manières : - chaque gestation et tous les embryons injectés in utero sont utilisés. - par ailleurs, le principe de réduction sera appliqué, car un animal jeune adulte passera à la fois les tests cognitifs et comportementaux, puis les enregistrements EEG ; les tissus cérébraux étant prélevés à l'issue de ces analyses. Ceci aura de plus l'avantage de permettre d'établir d'éventuelles corrélations entre plusieurs anomalies chez les mêmes animaux ayant passé l'ensemble des tests.
Raffinement
Le bien-être des animaux est évalué par des mesures de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques adaptés, y compris les weekends et jours fériés, consignés dans un registre (avec une fiche de suivi post-opératoire pour les femelles gestantes, qui permet d'établir un score, et une fiche de suivi des cohortes de ratons injectés au CMV). Chaque rate et sa portée est hébergée dans une cage avec nourriture et eau à volonté. L’environnement est enrichi avec des matériaux souples (papier foisonnant, litière en carrés de cellulose vierge) et un tunnel en carton permettant la confection d’un nid. Les femelles gestantes subissent une intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale, sur un tapis chauffant. Le rythme respiratoire des animaux est surveillé en permanence, et une injection intra-péritonéale de sérum physiologique est réalisée en fin d’intervention. Après leur réveil, les femelles sont placées sur un tapis chauffant pendant au moins 30 minutes. Un suivi post-chirurgical est réalisé : surveillance de la cicatrisation (nettoyage de la plaie et nouvelles sutures si détérioration), d’absence d'hémorragie vaginale, de la mise bas (euthanasie si retard de la mise bas supérieur à 24h), de la perte de poids (euthanasie si > à 20%), de l'hypothermie (froid au touché), des signes de douleur (prostration, agressivité, absence de réaction aux stimuli). En fonction du score obtenu, une injection d'analgésique ou d’anti-inflammatoire peut être pratiquée. Les ratons sont également suivis avec notamment une surveillance de leur état général et de leur prise de poids, et de l’apparition des phénotypes caractéristiques de notre modèle. Ces mesures seront quotidiennes de P1 à P14. Après P14, seul le poids sera mesuré, d’abord quotidiennement jusqu’à P20, puis 1 fois par semaine jusqu’à P30. Après sevrage (à P30), les animaux seront regroupés par sexe à 2-3 par cage dans un environnement enrichi (rouleaux de papier foisonnant et tunnel en carton). Le poids sera suivi une fois par semaine après P30. Autour de P60, les tests comportementaux seront précédés de plusieurs sessions d’habituation pour minimiser les effets du stress.
Choix des espèces
Les animaux que nous utilisons, en l'occurrence les rats, sont des rongeurs de petite taille et d’élevage facile, avec une gestation d'une durée adaptée aux exigences des travaux de recherche. Ils possèdent un système nerveux central dont le développement présente de nombreuses similitudes avec celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est cependant suffisamment complexe pour être représentative. D'une manière générale, ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes pathologiques du développement cérébral. Le rat est particulièrement adapté à des études électrophysiologiques, cognitives et comportementales. Dans le projet présenté ici, le choix de l'espèce est aussi orienté par l'utilisation d'une souche de cytomégalovirus de rat recombinante, car les cytomégalovirus, y compris ceux de rat, sont spécifiques d'espèce. Les rates gestantes seront âgées d'environ 10 semaines à 6 mois. Les infections in utero seront réalisées à E15, donc au début du dernier tiers de gestation, ce stade d'infection tenant compte de l'état de développement cérébral, d'impératifs méthodologiques, et conduisant à reproduire les conséquences neurologiques postnatales rappelant la pathologie humaine modélisée ici. L’étude des activités épileptiformes in vitro seras réalisée entre P14 et P17, période classique où le cerveau immature, correspondant à la période néonatale chez l'homme, présente une plus forte susceptibilité aux activités épileptiques. Les enregistrements des activités corticales précoces seront réalisés à P18 et à P30, qui sont des périodes classiquement utilisées pour ce type d’enregistrements. La recherche d'effets à plus long terme du CMV sera réalisée chez des jeunes rats adultes (P60 et au delà), permettant la réalisation efficace de tests cognitifs et comportementaux, ainsi que des enregistrements EEG télémétriques sur plusieurs jours consécutifs.
Optimisation des immunothérapies anti-tumorales utilisant le transfert adoptif de cellules T après expansion ex vivo : impact du micro-environnement lymphopénique généré
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 472 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Elles subissent l'ablation d'une phalange pour génotypage, une lymphopénie induite par radiothérapie ou chimiothérapie, une greffe de tumeur et de six à sept injections, avec une perte de poids possible. L'objectif est d'étudier le devenir de lymphocytes T anti-tumoraux transférés dans un environnement lymphopénique, les organes étant prélevés à l'issue. Le porteur affirme que ces questions "ne peuvent pas être abordées" par des méthodes in vitro ou in silico et invoque la proximité des systèmes immunitaires murin et humain.
Objectifs
L’objectif de ce projet s’inscrit dans l’optique de se rapprocher des approches thérapeutiques utilisées en immunothérapie anti-tumorale (à savoir chimiothérapie ou radiothérapie), et ainsi les protocoles établis dans l’équipe dans le cadre d’une précédente demande de saisines au transfert adoptif de cellules T anti-tumorales. Nous nous intéresserons aux aspects suivants : - Impact des diverses méthodes d’induction de la lymphopénie (radiothérapie vs chimiothérapie vs souris génétiquement lymphopéniques) sur le devenir des cellules T anti-tumorales. - Devenir des cellules T anti-tumorales après transfert adoptif dans des souris lymphopéniques (utilisant une des 3 approches) et en présence d’une tumeur solide ou liquide.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de notre projet sont tout d'abord une meilleure compréhension des mécanismes associés au devenir de lymphocytes T greffés dans divers environnements lymphopéniques (chimiothérapie vs radiothérapie) ainsi que les conséquences pour leur efficacité anti-tumorale. D'autre part, le développement de nouvelles stratégies anti-tumorales, basées sur les propriétés du système immunitaire pour cibler et éliminer les tumeurs, et auxquelles sont associés un conditionnement lymphopénique, a permis d’améliorer les traitements contre le cancer nous espérons que ces travaux permettront d'améliorer ces approches thérrapeutiques. Ainsi, des traitements basés sur l’injection de lymphocytes T sont maintenant approuvés en clinique pour le traitement de certains cancers hématologiques. Toutefois, malgré des résultats spectaculaires, des formes réfractaires à cette approche persistent. Différentes explications peuvent être invoquées incluant un défaut de persistance ou encore une altération de leur fonctionnalité qui pourraient être en partie la conséquence du conditionnement lymphopénique utilisé. Ainsi, il est crucial de déterminer les causes de ces échecs afin d’optimiser l’efficacité de ces nouvelles thérapies pour cet enjeu majeur de santé publique.
Procédures
Les animaux subiront différents types d'interventions, injections ou prélèvements pour lesquelles la douleur est faible à modérée et ne requièrent pas plus que quelques minutes par animal. Par souci du bien être animal et en fonction du type d'injection, l'intervention sera réalisée sous anesthésie ou contention appropriée de l'animal. En moyenne, un animal sera identifié/génotypé par ablation d'une phalange distale et subira par expérimentation: 6-7 injections intra.péritonéale (ip), 1 injection i.o (intra-orbitale) ou i.v (intra-veineuse) et, dans le contexte des études à plus long terme, pourra être prélevé (à l’aide d’un stylet au niveau de la veine mandibulaire) 1 fois toutes les 2 semaines au cours d’une expérience.
Impact sur les animaux
L'induction de l'état lymphopénique par chimiothérapie ou radiothérapie peut induire une perte de poids transitoire. Par ailleurs, la greffe de cellules tumorales peut également s'accompagner d'une perte de poids ou impacter l'étât général des souris. Toutefois, il est important de noter que la plupart des animaux seront co-injectés avec des cellules T ciblant les tumeurs, et ayant des fonctions anti-tumorales. Dès l'apparition de symptômes ou dès que les animaux atteignent un des points limites définis, les souris seront euthanasiées.
Devenir
L'ensemble des animaux sont sacrifiés en fin de protocole afin de prélever les organes d'intérêt et réaliser les différentes analyses décrites.
Remplacement
Le projet décrit dans le cadre de cette demande requiert une analyse intégrée in vivo de l’impact d’un état lymphopénique sur le devenir de cellules T anti-tumorales, en présence ou en absence de tumeurs. Ces questions ne peuvent pas être abordées à l’heure actuelle au moyen de méthodes alternatives in vitro ou in silico, et demandent ainsi de faire appel à des modèles animaux, murins dans le cas présent, en raison des grandes similitudes du système immunitaire murin et humain, ainsi que du panel important de modèles à disposition pour identifier les paramètres essentiel dans ces processus.
Réduction
Pour optimiser le nombre d’animaux maintenus et le nombre total d’animaux utilisés dans l’ensemble de l’étude, mâles et femelles adultes seront utilisés pour les expériences proposées. Par ailleurs, chaque fois que cela sera réalisable, les expériences seront combinées afin de partager les groupes contrôles employés. Les données obtenues dans nos précédents travaux ainsi que les données disponibles dans la littérature nous permettent d’évaluer le degré de variabilité expérimentale et ainsi estimer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires pour atteindre une significativité statistique.
Raffinement
Même si les lignées murines utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype induisant une souffrance ou angoisse à l’état basal, nous nous assurerons par plusieurs mesures de réduction des sources de stress potentiels: notamment, les animaux sont maintenus à plusieurs par cage et manipulés par maximum 2 personnes dédiées. Le milieu proposé est enrichi pour favoriser la construction de nids (cotons, cabanes). Au cours des expérimentations, une observation régulière des souris sera effectuée. Une fiche de suivi « clinique » a été établie pour réaliser l’observation des animaux en expérimentation, évaluer leur état et suivre précisement les points limites. En effet, les points limites sont ainsi clairement établis (perte de poids, état général, niveau de croissance tumorale) et détaillés pour chacune des procédures de ce projet.
Choix des espèces
Comme noté précédemment, le système immunitaire murin présentant de très fortes analogies avec le système immunitaire humain, il constitue un modèle de choix pour des projets intégratifs s’attachant à l’étude des constituants du système immunitaire. De plus, les modèles murins lymphopéniques et tumoraux, de par leurs similitudes avec les conditions pathologiques humaines, représentent des systèmes uniques d’étude de ces phénomènes. Ainsi, pour se rapprocher du traitement de la pathologie humaine, les animaux utilisés dans le contexte de ce projet seront des animaux adultes matures dont l’age sera compris en moyenne entre 8-14 semaines.
Rôle de la génétique de l’hôte dans l’infection et la transmission du virus Zika
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
8 385 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le virus Zika par injection, certaines par voie intracrânienne sous anesthésie, puis exposées sous anesthésie à des piqûres de moustiques, et peuvent perdre jusqu'à 30 % de leur poids avec apathie et paralysie partielle. L'objectif est d'étudier le rôle de la génétique de l'hôte dans l'infection et la transmission du virus, les souris étant tuées car porteuses d'un pathogène dangereux pour l'humain. Le porteur affirme que ces phénomènes se développent au niveau de l'"organisme entier" et que la souris permet des analyses génétiques "puissantes".
Objectifs
L’objectif global de ce projet est d’étudier le rôle de la composition génétique de l’individu dans sa sensibilité à l’infection par le virus Zika. En particulier, la transmission du virus de la mère au fœtus, l’apparition de troubles neurocomportementaux secondaires à l’infection et la transmission du virus Zika entre l’hôte et le moustique restent à élucider. Plus spécifiquement, ce projet prévu pour les 5 années à venir, a pour objectif de répondre aux questions scientifiques suivantes : 1. Quels sont les mécanismes responsables des différences de lésions cérébrales induites par l’infection par le virus Zika ? 2. Quels sont les mécanismes de transmission du virus Zika de la mère au fœtus ? 3. Quelles sont les conséquences neurocomportementales de l’infection par le virus Zika ? 4. Quelle est la variation de capacité à s’infecter (« infectabilité ») des souris en fonction de la souche de virus Zika ? 5. Quelle est la variation d’infectabilité des moustiques en fonction de la souche de virus Zika ? 6. Quelle est la variation d’infectabilité des souris en fonction de la souche de moustique ? 7. Quelle est l'influence du fond génétique des souris dans chacune des questions précédentes ? 8. Quels sont les variants génétiques de l’hôte responsables des différences de sensibilité chez la souris ?
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra de comprendre l’influence de la composition génétique de l’hôte dans la sensibilité à l’infection et dans l’infectivité par le virus Zika. La caractérisation poussée de l’infection par le virus Zika dans des lignées de souris sensibles ou résistantes permettra d’identifier de nouveaux gènes responsables de ces différences de sensibilité et d’infectivité. A plus long terme, ce projet permettra de faire progresser des connaissances fondamentales importantes pour comprendre le développement de la maladie et les mécanismes de transmission des maladies vectorielles. Il s'agit d'enjeux majeurs au regard du potentiel de réémergence du virus Zika au niveau mondial et des conséquences neurologiques dramatiques causées par cette infection.
Procédures
Des biopsies de queue seront effectuées sur certaines souris pour connaitre leur statut génétique, une fois au moment du sevrage pour une durée de quelques secondes. Les souris recevront une injection d’anticorps par voie intrapéritonéale une fois pour une durée de quelques secondes. La majeure partie des souris seront infectées avec le virus Zika par une injection (intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée ou intradermique) une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées avec le virus Zika par une injection intra-crâniale sous analgésie et anesthésie générale d’une durée de 15 minutes. Des prises de sang seront réalisées, au maximum 3 prélèvements sur 5 jours consécutifs. Chaque prise de sang durera environ 30 secondes. es tests d’évaluation du comportement non invasifs seront effectués sur certaines souris avec une durée de moins de 40 minutes et au maximum 2 fois par semaine (1 test par séance). Des repas sanguins de moustiques seront effectués sur certaines souris pour évaluer la transmission du virus entre la souris et le moustique et vice versa, sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes, au maximum 5 fois sur 7 jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Le projet s'articule autour de 5 procédures de sévérité modérée. Dans la plupart des cas, l'infection aura un impact très modéré sur l'état de santé des souris, avec une perte de poids inférieure à 5% et transitoire (quelques jours). Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante pouvant atteindre 30%, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie partielle. Des souris feront l’objet de tests d’évaluation du comportement non invasifs qui pourront générer un stress limité et transitoire (quelques heures). Des souris seront anesthésiées et soumises aux repas sanguins de moustiques durant la période de virémie qui est quasiment asymptomatique. Elles seront mises à mort avant l'apparition des symptômes induits par l'infection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront infectés par un pathogène dangereux pour l’Homme et/ou feront l’objet de prélèvements de tissus post-mortem.
Remplacement
Les phénomènes biologiques que nous devons étudier se développent au niveau de l'organisme entier (développement de l'infection, réponse immunitaire, conséquences neurocomportementales) voire à l’interface entre deux organismes indépendants (transmission du virus entre la mère et le fœtus ou entre la souris et le moustique) et imposent donc de recourir à des modèles animaux vivants. De plus, notre expérience sur ce virus montre que les résultats obtenus avec des cultures de cellules ne prédisent pas intégralement ce qui se passe dans un organisme entier. Les modèles animaux utilisables sont peu nombreux (primates non-humains, cobayes, hamsters et souris). Ce projet utilisera des souris car cette espèce permet de réaliser des études génétiques puissantes à l'aide de lignées génétiquement modifiées ou de lignées génétiquement très variées.
Réduction
Le calcul du nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure dépendra de la nature des variables et de la question posée. La conception de chaque expérience reposera sur une analyse statistique préalable pour optimiser la nature et l'effectif de chaque groupe, et éviter les biais expérimentaux. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques appropriés. Aussi souvent que nécessaire, il sera fait appel à des experts en biostatistique. L'évaluation de la charge virale dans une lignée ne requiert pas plus de 5 souris du même sexe d'après notre expérience. L’évaluation du comportement des souris requiert des nombres d’animaux un peu plus grands (10 à 12 souris du même sexe) du fait d’une variabilité intra-groupe plus importante. Ces éléments nous ont permis de calculer les effectifs pour chaque procédure en conciliant réduction du nombre d'animaux et puissance statistique pour conclure. Les analyses incluront des groupes d’animaux des 2 sexes sauf lorsqu'on sait déjà qu'il n'y a pas de différence dans le modèle utilisé. Certaines expériences feront l'objet de réplication mais uniquement lorsque ce sera nécessaire pour conforter la validité des conclusions. Ceci est mentionné et justifié dans chaque procédure.
Raffinement
Les inoculations par voie systémique et les prélèvements de sang entraînent une douleur passagère et légère qui ne justifie pas d'anesthésie ou d'analgésie. L’inoculation par voie intra-crâniale sera réalisée sous anesthésie générale et sous analgésie générale. Les repas sanguins seront effectués sur des souris anesthésiées. Les souris seront exposées aux moustiques sur un flanc, en alternant flanc gauche et flanc droit d'un repas sanguin au suivant. Après chaque repas sanguin, les souris recevront une injection de soluté de réhydratation isotonique pour compenser la perte volémique. Dans la majorité des cas, l'infection par le virus Zika se traduira par un impact très modéré sur l'état de santé des souris. Les animaux infectés seront toutefois surveillés quotidiennement pendant la période symptomatologique critique (précisée dans chaque procédure) avec plusieurs points limites : i) score clinique sur la base de 5 critères, ii) suivi de poids. Un gel nutritif sera placé dans les cages des animaux présentant un affaiblissement ou une parésie/paralysie pouvant laisser craindre qu'ils peinent à atteindre la mangeoire et après les repas sanguins de moustiques.
Choix des espèces
1. Nous disposons de bons modèles d'infection par le virus Zika chez la souris, y compris pour étudier la transmission entre souris et moustique (espèce compatible avec des repas sanguins répétés). 2. La souris est la seule espèce permettant de réaliser des analyses génétiques du niveau requis. 3. Des résultats antérieurs avec le virus Zika montrent la pertinence de cette espèce comme modèle animal d'infection par les flavivirus transmis par des moustiques et pour les analyses génétiques. 4. La dangerosité du virus Zika impose d'héberger les animaux en isolateurs, ce qui est facilement réalisable dans cette espèce et beaucoup plus difficile dans d'autres espèces. Pour la plupart des procédures, nous utiliserons des jeunes adultes (5-6 semaines) ou adultes (6-12 semaines) en nous basant sur la littérature et sur notre propre expérience. Nous utiliserons (détails dans les procédures 1 et 3) des souris jeunes de 1-3 semaines qui permettront d’étudier les effets de l’infection par le virus Zika sur le développement post-natal du cerveau. Nous utiliserons (détails dans la procédure 1) des fœtus entre 15 et 17 jours de développement pour étudier le syndrome congénital causé par le virus Zika.
Evaluation épigénétique des bovins laitiers : vers de nouveaux critères de santé, de bien-être dans des environnements diversifiés
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
6 000 vaches laitières vont être utilisées, gardées en vie dans les élevages à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une unique prise de sang à la veine caudale, d'environ une minute, présentée comme une gêne légère et transitoire. L'objectif est de constituer une large cohorte de vaches Holstein pour identifier leur épigénome et créer un nouvel index de gestion de l'élevage. Le porteur qualifie cette étape d'"absolument incontournable" et affirme que la démarche "ne peut être conduite qu'au niveau de l'animal entier".
Objectifs
Globalement le projet établira les relations entre variations phénotypiques observables, la génétique, l’épigénome et l’environnement. La démarche mise en œuvre va contribuer à mieux définir les caratéristiques de chaque individu et offrira de nouveaux modèles d’évaluation plus fiables. Pour l’élevage et les éleveurs, une retombée de l’outil consistera dans l’identification de nouveaux indicateurs de gestion intégrant des données épigénétiques. Cet outil sera aussi utilisé pour rechercher des animaux capables de s'adapter aux changements environnementaux de par leur plus grande plasticité épigénétique et génomique. Ces connaissances aideront à définir de nouvelles stratégies de sélection visant des animaux plus robustes aptes à exprimer leur potentiel dans des conditions variables tout en maintenant leur santé et bien-être pour un élevage durable.
Bénéfices attendus
La collection d’échantillons biologiques ainsi que l’ensemble des données fourniront pour la première fois l’opportunité de traiter une large cohorte de vaches Holstein et d’en identifier l’épigénome. Cette étude originale est une première pour le monde de l’élevage. Cette étape est absolument incontournable pour déterminer la puissance de l’outil d’épigénotypage que nous développons et définir un nouvel index de management apte à prendre en considération tout l’historique de vie de l’animal. Cette démarche met les derniers progrès technologiques et méthodologiques de la biologie au service d’un élevage responsable et durable.
Procédures
Les vaches seront soumises à une seule prise de sang à la veine caudale pour le projet. La durée de l'intervention sur chaque animal dure environ une minute.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins seront effectués lors de contensions prévues : soit au moment de l’alimentation aux cornadis soit au cours de la traite (robot de traite). La douleur occasionnée par l’aiguille de prélèvement est légère et transitoire. La ponction de sang est très limitée (2 x 5 ml) en proportion du volume sanguin de l’animal (de l’ordre de 50 litres total ; soit 1/10000ème).
Devenir
Les animaux restent dans les élevages à l'issue de la prise de sang.
Remplacement
Le projet est conduit sur l’espèce bovine pour l’espèce bovine. Il ne peut donc y avoir de remplacement. Il s’agit d’une démarche de biologie intégrative pouvant prendre en compte tous les processus biologiques et ne pouvant être conduite qu’au niveau de l’animal entier. Le choix de la race Prim’Holstein tient à sa prépondérance dans la production de lait française : nous étendrons l’étude à d’autres races laitières et allaintantes dès obtention des financements.
Réduction
Le nombre de vaches à inclure dans l’analyse est de l’ordre de 6000. Il est donc nécessaire d’inclure non seulement des vaches Holstein issues des fermes expérimentales qui offrent un suivi de conduite d’élevage mais aussi des vaches de fermes commerciales . Notre démarche s’apparente aux analyses épidémiologiques menées chez l’homme, le nombre important d’individus à inclure dans le protocole permet d’appréhender la grande variabilité phénotypique.
Raffinement
Une prise de sang à la queue représente une gène légère pour les vaches, et sans conséquences vu le volume de sang prélevé. Cependant, les animaux prélevés seront surveillés suite au prélèvement pour vérifier qu'il n'y a pas de problème. Le cas échéant, le vétérinaire de l'élevage sera appelé pour prendre en charge ledit problème.
Choix des espèces
Le projet s’interesse à l’espèce bovine et toute la démarche expérimentale proposée doit aboutir à la création d’un nouvel index de management permettant une intégration de l’historique de vie de l’animal. Cet index doit être un indicateur du bien-être et de la santé des vaches. L’établissement de cet index sera associé à une série de recommandations dont l’objectif final est l’expression du potentiel génétique de l’animal dans le respect de ses besoins. Une simple prise de sang reste un geste très peu invasif et peu douloureux, n’occasionnant qu’une gène transitoire. Toutes les vaches des élevages commerciaux identifiés et fermes expérimentales seront incluses dans le protocole, quelques soient leur âge, parité ou stades physiologiques (en cycle, en gestation, en lactation, tarie). Néanmoins leur statut sera noté avec précision.