Oncologie

580 souris et 190 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections de cellules cancéreuses dans le cerveau, le cœur ou une veine, ou de biomatériaux, puis des examens IRM sous anesthésie répétés deux fois par semaine, les tumeurs pouvant provoquer titubation, léthargie et perte de poids. L'objectif n'est pas de soigner mais de développer des séquences d'imagerie IRM plus rapides et quantitatives, destinées à terme à la clinique humaine. Le porteur qualifie l'imagerie du petit animal vivant de "maillon indispensable" et ne prévoit que des essais in vitro préliminaires.

Objectifs

L’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) apparait comme une technique d'imagerie pouvant remplacer le scanner du fait de son innocuité. Cette technique est devenue un outil de plus en plus utilisé pour le diagnostic médical, grâce à sa bonne résolution spatiale, son caractère non-traumatique et sa grande variété de contrastes. Ces progrès n'ont pu être réalisés sans d'importants développements méthodologiques. Afin de poursuivre ces avancées techniques, notre projet consiste à développer des stratégies pour analyser les systèmes biologiques dans une réelle approche intégrative en cherchant autant que possible à limiter la perturbation et l’influence de l’exploration sur le comportement du système analysé. Plus précisément il s'agit d'une part d'optimiser ou de développer de nouvelles méthodes en imagerie permettant d'obtenir des informations sur la structure et/ou la fonction d'une partie d'un organe ou sur la totalité de l'organisme dans le temps et dans l'espace et de mettre en évidence des dysfonctionnements. Ces méthodes ont pour objectifs d’être, à terme, utilisées en routine clinique chez l’homme. D'autre part, dans le cadre de développement de thérapies (cellulaires) ciblées, il est important de perfectionner ou d'inventer des méthodes innovantes de ciblage et de marquage cellulaire afin de les détecter et suivre leur devenir par IRM. Ces méthodes nécessitent l'injection d'un agent ciblant stable et biocompatible agissant comme des agents de contraste intelligents. Ce projet est donc basé sur le développement de séquences IRM sur le petit animal pour obtenir des informations précises et fiables, en 3D et en des temps d’acquisition rapides. C’est pour cela que des techniques originales d’acquisition des données seront développées, et combinées à des techniques de traitement du signal. Les principaux problèmes auxquels ces nouvelles méthodes devront répondre sont le manque de contraste du tissu d’intérêt, les mouvements respiratoires et cardiaques qui rendent les images floues, le signal hyperintense de la graisse, la sensibilité aux hétérogénéités de champ magnétique et la quantification précise, fiable et reproductible de paramètres physiques.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de, non seulement apporter plus de connaissances sur l’anatomie du cerveau, mais aussi de développer des méthodes IRM plus rapides, plus informatives, pour obtenir des diagnostics plus précoces et précis pour l’oncologie. Finalement, en ingénierie des biomatériaux, ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de la régénération tissulaire et vasculaire dans des organes profonds, avant leur transfert à l’homme.

Procédures

Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Un premier groupe de 70 souris et 30 rats sera soumis à une injection de cellules cancéreuses ou de biomatériaux dans le cerveau (en une seule fois, chirurgie ne dépassant pas 15min par animal) puis subiront des examens IRM (ne dépassant pas 1h par animal) répétés deux fois par semaine. Un deuxième groupe de 30 souris animaux sera soumis à une injection de cellules cancéreuses via une injection via le coeur (en une seule fois, intervention de quelques minutes) puis subiront des examens IRM (ne dépassant pas 1h par animal) répétés deux fois par semaine. Un troisième groupe de 30 souris sera soumis à une injection intraveineuse de cellules cancéreuses via la veine cave (intervention de quelques minutes) puis subiront des examens IRM (ne dépassant pas 1h par animal) répétés deux fois par semaine. Un quatrième groupe de 580 souris et 190 rats sera soumis à une injection intraveineuse de cellules cancéreuses ou d’agents de contraste IRM via la veine caudale (intervention de quelques minutes) puis subiront des examens IRM (ne dépassant pas 1h par animal) répétés deux fois par semaine. Un cinquième groupe de 60 souris et 40 rats sera soumis à une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses ou de biomatériaux (intervention de quelques minutes) puis subiront des examens IRM (ne dépassant pas 1h par animal) répétés deux fois par semaine.

Impact sur les animaux

Le création des modèles tumoraux et d’implantation de biomatériaux peuvent induire des douleurs dues aux chirurgies correspondantes, notamment au niveau de la tête et de l’abdomen. Les modèles tumoraux pourraient induire des effets indésirables sur le comportement de l’animal (titubation, léthargie), sur son apparence (yeux mi-clos, dos vouté), une perte de poids, des signes neurologiques tels que la tête penchée, et des signes de modification de la fonction respiratoire. L’implantation des biomatériaux devrait générer une inflammation locale et temporaire.

Devenir

Les suivis IRM sont nécessaires à l'évaluation de l’efficacité des nouvelles méthodes IRM dans la détection, le diagnostic et le pronostic. Afin de confirmer la détection de tumeurs ou de biomatériaux par IRM, les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure pour extraire des organes et tissus d’intérêt et ainsi réaliser des études histologiques.

Remplacement

Nous souhaitons développer des séquences IRM permettant un diagnostic plus précoces et fiables grâce à l’obtention d’images avec des résolutions spatiales et temporelles plus élevées, et des informations plus quantitatives. L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus. En revanche, nous réaliserons des expérimentations in vitro préliminaires avant tout passage à l’animal, concernant l’efficacité du marquage cellulaire et la détection des biomatériaux. Pour cela, les cellules marquées ou les biomatériaux seront piégés dans du gel d’agarose puis imagés. Cela permettra de réaliser une 1e optimisation des nouvelles méthodes IRM.

Réduction

Des contrôles sains seront nécessaires pour vérifier la validité des diagnostics IRM des animaux pathologiques. Cependant, du fait de la non-invasivité de l’IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum de trois jours entre chaque examen. De plus, les structures contralatérales (ou éloignées du site d’implantation) de chaque tissu d’intérêt serviront de contrôle interne. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront gardés dans des cages séparées, avec de l’enrichissement et de la nourriture et de l’eau à volonté. L'utilisation d'anesthésies gazeuses générales lors des procédures, d'une couverture analgésique pendant les chirurgies, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux et sans douleur. L’expérience d’IRM en elle-même ne génère aucun signe de souffrance visible. L’agent de contraste utilisé est quotidiennement employé lors des examens sur les patients. Cet agent de contraste n’entraîne pas d’effets secondaires. De plus, les animaux seront injectés à une dose 5 fois inférieure à la dose clinique. Une grille de scorage a été instaurée pour surveiller la santé et le bien-être des animaux, comprenant des signes au niveau du comportement, de la mobilité, de la perte de poids, et de l’apparition de symptômes cliniques. Les souris pathologiques seront étudiées jusqu’à ce que leurs poids aient diminué de 15% ou que les autres points limites soient atteints. Si des signes de mal-être apparaissent, les animaux seront pris en charge par un analgésique et pourront être séparés et placés dans des cages individuelles. Des points limites ont aussi été instaurés, induisant une euthanasie immédiate. L’état de santé des animaux sera suivie quotidiennement.

Choix des espèces

Les souris C57Bl/6N sont des souris sans modification génétique, représentant des animaux d’étude de l’anatomie du cerveau sain, et de l’efficacité de régénération tissulaire suite à l’implantation d’un biomatériau. De même, des rats Wistar seront utilisés du fait de leur taille importante comparée à la souris permettant de faciliter l’implantation de biomatériaux. Les souris BalbC et Swiss Nude permettront d'obtenir des modèles de tumeurs d'origine murine ou humaines. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte.

3 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis des chimiothérapies, immunothérapies et molécules par voie orale ou intrapéritonéale, la tumeur au flanc pouvant gêner leurs déplacements et déclencher la mise à mort au-delà d'un volume limite. L'objectif est de tester des molécules censées lever la résistance à la chimio-immunothérapie dans des cancers du côlon, du poumon et du pancréas, les bénéfices pour les patients restant hypothétiques. Le porteur affirme que l'efficacité des combinaisons en oncologie doit être évaluée sur des "organismes vivants" et conclut au recours à la souris.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer l’efficacité antitumorale d’une association immunothérapie (anti-PD-1) et chimiothérapies utilisées en clinique en association avec des inhibiteurs de certaines voies de résistance aux traitements, dans trois modèles de cancers chez la souris, un pour le côlon, un pour le poumon et un pour le pancréas.

Bénéfices attendus

Les cancers du côlon et du poumon font partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Actuellement, leur traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies, d’immunothérapies ou une combinaison des deux. Bien qu’ayant montré des effets bénéfiques chez certains patients, ces traitements restent inefficaces pour un grand nombre d’entre eux. Il serait donc intéressant de trouver des molécules capables de lever la résistance à la chimio-immunothérapie. La découverte de tels agents permettrait de rendre la chimio-immunothérapie efficace pour un plus grand nombre de patients. Nous proposons ici de tester des inhibiteurs de deux voies majeures connues pour réguler la réponse immunitaire et l’évolution du cancer. Le but du projet est d’évaluer l’efficacité antitumorale d’une association immunothérapie et chimiothérapies utilisées en clinique en association avec des inhibiteurs de certaines voies de résistance dans trois modèles de cancers chez la souris, un pour le côlon, un pour le poumon et un pour le pancréas. Dans ce projet, nous évaluerons : - l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale chez des souris standards. Ceci permettra d’évaluer l’efficacité d’une combinaison chimio-immunothérapie + composés testés par rapport à une chimio-immunothérapie seule. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur état d’activation chez les souris traitées par la chimio-immunothérapie seule ou en association avec les composés testés, par rapport aux souris non traitées (immunomonitoring, Nanostring). - la nécessité du système immunitaire, en réalisant les mêmes expériences chez des souris génétiquement modifiées, comme par exemple la souris de type Balb/nude (dépourvue de lymphocytes T et ayant un système immunitaire affaibli). L’importance de certains régulateurs de l’inflammation ou de l’autophagie sera également évaluée. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser l’immunothérapie, la chimiothérapie et/ou la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer.

Procédures

- Injection de cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée 5 minutes - Nombre de souris : 3500 souris. - Traitements par chimiothérapie: - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée 1 minute - Nombre de souris : 1960 souris. - Traitements par immunothérapie: - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée 1 minute Nombre de souris : 1540 souris . - Traitements par trametinib par voie orale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une administration par jour pendant 10 jours par animal - Durée 1 minute Nombre de souris : 630 souris. - Traitements par anakinra par voie intrapéritonéale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée 1 minute Nombre de souris : 630 souris.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Lorsque le volume tumoral est trop important, ou que la tumeur parait gêner le déplacement de la souris celle-ci sera mise à mort. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. Donc surveillance régulière du poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage. Si un point limite est atteint, la souris sera mise à mort. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont possibles : les chimiothérapies, immunothérapies et thérapies spécifiques utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. Surveillance régulière de l’état général et des points limites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Les souris utilisées pour les expériences de croissances tumorales seront mises à mort lorsque la taille des tumeurs sera trop importante. Les souris utilisées pour les expériences d’analyse du système immunitaire seront mises à mort afin de prélever la tumeur.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Si l’un des modèles ne donne pas les résultats escomptés ou s’il s’avère que les points limites sont atteints prématurément, celui-ci sera abandonné. Si aucun effet bénéfique de certains composés seuls ou en association avec la chimio-immunothérapie sur la réponse anti-tumorale (croissance et infiltrats immunitaires) n’est observé au début du projet, alors ces composés ne seront pas testés sur les souris immunodéficientes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe. L’utilisation d’un arbre décisionnel selon les points limites adaptés (poids, posture, expression de la douleur, absence de toilettage, léthargie, immobilité, tumeurs, …) et leur comptabilisation dans une grille de scores permettra de stopper la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

220 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une craniectomie pour l'implantation de cellules de glioblastome dans le cerveau, puis des séances répétées d'imagerie cérébrale sous anesthésie, avant la mise à mort vingt jours après la greffe. L'objectif est d'étudier le rôle de la sécrétion des cellules tumorales dans le développement du gliome et d'identifier des cibles thérapeutiques. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne démontre la pertinence in vivo et qu'une étude préclinique chez l'animal est requise.

Objectifs

Le gliome est un cancer du cerveau agressif au pronostic sombre et aux options thérapeutiques limitées. Le gliome est la forme maligne la plus courante de tumeur cérébrale primaire avec le taux de mortalité le plus élevé. Le glioblastome est considéré comme la forme de gliome la plus agressive, invasive et mortelle, et il représente 50% de tous les cas de gliome. Le glioblastome est considéré comme presque incurable et la survie des patients après le diagnostic est de 15 à 18 mois malgré des paradigmes de traitement agressifs tels que la résection chirurgicale combinée, la radiothérapie et la chimiothérapie. Ces tumeurs malignes très agressives sont extrêmement invasives et prolifératives. Combinés, ces facteurs contribuent à la résistance thérapeutique et à des taux de récidive de près de 100%. Pour mieux étudier la progression naturelle de cette maladie dévastatrice et pour une meilleure évaluation des nouveaux schémas thérapeutiques, des moyens de caractériser de manière non invasive et longitudinale les tumeurs dans les modèles précliniques sont très recherchés. Les modèles précliniques de gliome sont d'une valeur inestimable pour comprendre la progression du glioblastome chez les patients, pour évaluer des stratégies thérapeutiques prometteuses. Le glioblastome se caractérise notamment par une communication intense entre les cellules tumorales et leur microenvironnement, principalement par la sécrétion de protéines et d'autres facteurs par les cellules du glioblastome. Comme pour d'autres tumeurs solides, l'une des principales caractéristiques du glioblastome est l'intensité des interactions réciproques avec son microenvironnement - en particulier les neurones. Par conséquent, les mécanismes cellulaires qui contrôlent la sécrétion des cellules du glioblastome sont particulièrement importants dans le cancer et dans le fonctionnement des cellules cérébrales.

Bénéfices attendus

La greffe des cellules de glioblastomes modifiées génétiquement permettra de connaître le rôle de la sécrétion dans le développement tumoral. La co-injection de modificateurs de l'expression des gènes permettra de déterminer des potentielles nouvelles cibles thérapeutiques envisageables chez l’homme. Ces molécules pourraient le cas échéant être utilisés comme adjuvants d’une résection chirurgicale de tumeurs chez l’homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale visant à implanter des cellules tumorales dans le cerveau et la visualisation de la croissance tumorale par imagerie cérébrale sous anesthésie gazeuse d'une heure. Cette greffe sera réalisée en une seule fois par animal. cette procédure prend 1h maximum par rat. Pour les chacune des 4 séances d'imagerie, chaque rat subira une anesthésie gazeuses de 40 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des expérimentations sont liés aux anesthésies répétées, aux douleurs associées aux injections, au stress au réveil des anesthésies, aux douleurs liés au craniectomies et à un effet général altéré suite à la présence d'une tumeur cérébrale.

Devenir

La procédure vise à l'implantation des cellules tumorales dans le cerveau, et à réaliser un suivi longitudinal tous les 5 jours par imagerie cérébrale. Elle termine 20 jours après par la mise à mort des animaux.

Remplacement

Ce projet vise à obtenir une preuve de concept in vivo. Les expériences in vitro, y compris de co-culture glioblastome-neurones indiquent un rôle de la sécrétion dans l’état souche des cellules cancéreuses. Aucune méthode in vitro ne permet de démontrer la pertinence in vivo pour établir le rôle de la sécrétion dans le développement tumoral dans un environnement pertinent pour la pathologie humaine. De plus, l’utilisation potentielle d’oligos anti-sens pour contrôler la sécrétion dans le cadre du glioblastome chez l’homme nécessite une étude pré-clinique chez l’animal.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une évaluation statistique appropriée et prend en compte les échecs dus à une mortalité en cours de procédure. Le suivi longitudinal par imagerie de type Doppler permet de restreindre le nombre d’animaux utilisés mais nous procéderons à une analyse finale par histologie ainsi que par le suivi de marqueurs moléculaires. Pour ces raisons, des groupes de 25 rats par condition (8 au total) seront nécessaire. La procédure n'ayant pas été encore utilisée par l'équipe, une phase de mise au point et formation au geste avec 20 rats injectés avec des cellules de glioblastome contrôle sera nécessaire. Le projet utilisera un total de 220 rats.

Raffinement

Les rats, non isolés, ont dans leur cage un environnement enrichi. Les soins sont toujours effectués par les mêmes expérimentateurs et animaliers afin de réduire le stress des animaux. Les signes de douleur éventuels amèneront aux traitements appropriés avec des analgésiques. Nous avons défini des points limites.

Choix des espèces

Nous utiliserons un modèle des rats Fischer 344, un modèle pertinent pour l'implantation de cellules de gliomes. L’utilisation de ces modèles va nous aider à mieux appréhender la croissance tumorale et surtout avoir un modèle animale très proche des procédures effectuées chez les patients. Les cellules utilisées nous permettent de contrôler la croissance tumorale par imagerie cérébrale. Nous utiliserons des jeunes rats adultes de 6 à 8 semaines, ~200g, pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences s’étaleront sur 3 semaines donc l’implantation sur des jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.

614 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines par voie rétro-orbitale sous anesthésie, puis une chimiothérapie ou un placebo, avant d'être tuées pour prélever moelle osseuse, rate et thymus. L'objectif déclaré est de comprendre les mécanismes de rechute et de chimiorésistance des leucémies aiguës lymphoblastiques T, dont les bénéfices pour les patients restent renvoyés au long terme. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" d'évaluer ces mécanismes dans des modèles vivants et que les cellules leucémiques ne survivent pas assez longtemps in vitro.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes agressives au pronostic réservé, notamment en cas de rechute. Elles représentent 15 à 30% des leucémies aiguës de l'enfant et de l'adulte. Les polychimiothérapies récentes ont permis d'améliorer le pronostic des leucémies aiguës, cependant 20 à 30% des patients atteints de LAL-T présentent une rechute le plus souvent réfractaire aux thérapeutiques conventionnelles et conduisent au décès des patients dans 60% des cas. Le statut mutationnel de certains gènes semble être un facteur important de ces rechutes résistantes aux thérapies. Les cellules souches leucémiques jouent également un rôle essentiel dans la progression et la rechute des leucémies. Par leur propriété d'auto-renouvellement et de quiescence, les LSC sont capables d'échapper à la chimiothérapie de 1è ligne et de régénérer le contingent leucémique, faisant le lit de la rechute. L'étude de ce compartiment cellulaire s'inscrit donc dans la continuité de ce projet, et fait l'objet ici de cet amendement. Identifier les mécanismes à l'origine de la rechute et l'acquisition d'une chimiorésistance est essentiel pour améliorer le pronostic de ces patients. Pour mener à bien ces objectifs il est dès lors indispensable d'évaluer leur impact dans des modèles vivants, seuls garants d'une reproductibilité dans ce contexte de pathologie maligne ou le micro environnement joue un rôle décisif. Dans cette perpsective, la souris immunodéprimée constitue le modèle animal le plus adapté. Par ailleurs, les cellules leucémiques de patients sont fragiles et ne peuvent être maintenues suffisamment longtemps in vitro pour y mener des tests thérapeutiques. Il est en revanche largement décrit dans la littérature scientifique que la souris est un bon modèle d'expansion des cellules leucémiques humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'étendre nos connaissances sur les mécanismes à l'origine de la rechute de LAL-T et comprendre les altérations moléculaires responsables de l'acquisition d'une chimiorésistance. A terme, ce projet contribuera à la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer les chances de guérison des patients atteints de LAL-T.

Procédures

1/ Injection de cellules leucémiques ou pré-leucémiques par voie rétro-orbitale après anesthésie générale (temps estimé < 10min par souris). Surveillance clinique et/ou biologique au moins bi-hebdomadaire et adaptée à l'état clinique des souris. 2/ Traitement des souris immunodéprimées après prise de greffe par de la chimiothérapie conventionnelle classiquement utilisée dans le cadre du traitement des leucémies aiguës humaines et comparaison avec un groupe recevant un placebo (La durée et fréquence du traitement dépendra de la molécule utilisée : quotidien à hebdomadaire pendant une durée inférieure à 6 semaines).

Impact sur les animaux

Le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet est évalué à 450 souris sur 5 ans. Pour réduire ce nombre, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique des résultats grâce aux données collectées au cours d'expériences précédentes. Un nombre de 64 souris supplémentaires seront nécessaires pour l'amendement de ce projet, sans extension de sa durée (soit 2 années restantes). Nous serons particulièrement attentifs au bien être des animaux. Afin de réduire au maximum le risque de souffrance, les souris seont traitées dès que le taux d'infiltration sanguin leucémique sera compris entre 2 et 20% (évaluation en cytométrie en flux de façon hebdomataire via un prélèvement mandibulaire). Un tel taux d'infiltration est habituellement atteint entre 4 et 12 semaines post-greffe. Durant les protocoles expérimentaux, un suivi quotidien la première semaine, puis bi-hebdomadaire des animaux sera mis en place afin de surveiller les signes évocateurs d'une douleur. Afin de préserver le bien-être animal, nous détecterons les points limites qui conduiront à leur mise à mort (CF Points limites adaptés détaillés dans les procédures expérimentales). Concernant l'amendement, le temps de prise de greffe attendu dans les souris syngéniques est similaire au modèle de xénogreffe faisant l'objet du projet initial. En revanche, les souris utilisées pour cet amendement sont moins immunodéprimées que les souris initiales et la greffe étant syngénique, le risque potentiel pour l'animal est moins élevé pour les procédures relatives à cet amendement. Par ailleurs, aucune prédisposition à une toxicité particulière de ce modèle pré leucémique pour l'animal n'est attendue dans des conditions d'hébergement. Nous serons particulièrement attentifs au bien-être des animaux et appliqueront les mêmes règles de surveillance et d'éthique que précédemment, avec une surveillance interne quotidienne du personnel de l'animalerie.

Devenir

Mise à mort de l'animal à l'issue de chaque procédure pour récupération des tissus biologiques (moelle osseuse, rate, thymus)

Remplacement

Les expérimentations ayant pour objectifs de déterminer les mécanismes de résistance à la chimiothérapie ne peuvent pas être réalisées in vitro du fait de la forte mortalité des cellules leucémiques et doivent nécessairement être conduits in vivo dans des leucémies xénogreffées et amplifiées chez l'animal. Par ailleurs le modèle des lignées cellulaires n'est pas un reflet exact de la biologie des leucémies aiguës et ne peut donc pas être considéré comme un équivalent moléculaire fiable dans ce contexte. Pour la même raison, dans cet amendement, l'étude de la transformation leucémique de cellules immatures transduites avec un oncogène humain (ici TLX3) ne peut être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de ce projet est évalué à 450 souris sur 5 ans. Pour réduire ce nombre, nous avons estimé (par test paramétrique) la taille des échantillons permettant une analyse statistique des résultats grâce aux données collectées au cours d'expériences précédentes. Concernant l'amendement, un nombre de 64 souris RAG2-/-gc-/- supplémentaires seront nécessaires à ce projet, sans extension de sa durée (2 années restantes). Ce nombre a été calculé en prenant en compte une probabilité proche de 100% de prise de greffe (modèle syngénique), afin d'élaborer un nombre suffisant de tumeurs et 1è et 3è génération (8 souris d'une première génération puis 4 souris de seconde génération (par première génération) puis 2 souris de 3è génération (par seconde génération)).

Raffinement

Nous serons particulièrement attentifs au bienêtre des animaux. Les souris immunodéprimées seront élevées dans un environnement répondant à un statut sanitaire de type EOPS ou SOPF et ne présenteront donc pas de phénotype dommageable dans ces conditions. Les cages sont ventilées et enrichies à l'aide de cotons, bout de bois et tunnels, afin de répondre aux besoins des souris (nidification, entretien des dents, jeux). Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Nous avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille de score que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi visuel quotidien des animaux sera mis en place par un personnel qualifié de l'animalerie. La manifestation de tout signe évoquant une douleur définie par les points limites préalablement évoqués sera particulièrement surveillée. Le volume des injections et des prélèvements sera réduit au minimum possible. Afin de limiter la douleur, l'injection des cellules leucémiques se fera sous anesthésie gazeuse par isoflurane (induction 4,5%, entretien 2,5-3%, durée totale d'environ 2 minutes). Le suivi de la leucémie sera réalisé à partir de la 3ème semaine suivant l'injection des cellules leucémiques humaines par des prélèvements sanguins (

Choix des espèces

Les modèles de xénogreffe de leucémies chez la souris sont connus et bien décrits dans la littérature scientifique, ce qui permet de nous assurer une efficacité maximale dans la réalisation de ce projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes, âgées entre 7 et 15 semaines. C'est la fenêtre d'injection qui premet d'avoir un taux idéal de greffe d'après les données de la littérature, en permettant de réaliser la procédure d'injection dans de bonnes conditions. Ce modèle de xénogreffe est particulièrement applicable à notre étude, car il permet de récapituler l'éventail des signes cliniques de la maladie et de modéliser sa progression.

700 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modifiés génétiquement dès l'embryon pour exprimer des mutations cancéreuses, ils sont suivis jusqu'à douze mois et anesthésiés chaque mois pour détecter des tumeurs internes par fluorescence, afin d'étudier l'origine cellulaire de cancers du muscle de l'enfant. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer des troubles de la nage, une léthargie, des œdèmes et une incapacité à se nourrir, déclenchant la mise à mort. Il affirme que les cellules en culture ne modélisent pas l'apparition des tumeurs et que le poisson zèbre partage 80 % de ces programmes génétiques avec l'humain.

Objectifs

Les cancers touchent chaque année plus de 2500 enfants en France. On estime qu’un enfant sur 440 sera atteint par un cancer avant 15 ans. Malgré des essais cliniques, leur taux de survie ne s’améliore plus depuis 20 ans. Il est donc indispensable de développer des traitements plus efficaces et moins toxiques. Ce projet vise à déterminer si les cancers du muscle fréquemment observés chez les enfants et les adolescents peuvent dériver non pas seulement de la transformation de cellules du muscle mais aussi d’une autre population de cellules. Cette question est importante, car on sait que la réponse aux chimiothérapies peut varier en fonction de la cellule à l’origine des tumeurs. In vitro, il a été montré que lorsqu’on exprime des gènes mutés, fréquemment retrouvés chez les patients atteints par ces cancers, dans les cellules neuronales, celles-ci prolifèrent et expriment des marqueurs de ces cancers. Il est maintenant nécessaire de vérifier à l’aide du modèle de poisson que lorsque ces mutations sont introduites dans ces cellules neuronales, elles conduisent bien à la formation de tumeurs. L’objectif de ce projet est de pouvoir déterminer si des cellules neuronales constituent l’une des cellules d’origine des cancers du muscle chez l’enfant lorsqu’elles expriment des mutations fréquemment retrouvées dans ces pathologies. Or, on sait que la réponse aux traitements peut varier en fonction de la cellule d’origine du cancer. Le poisson est un modèle de vertébré particulièrement utile pour l’étude de la génétique du cancer. Les gènes et programmes génétiques impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'Homme et le poisson et de très bons outils sont disponibles pour reproduire les altérations génétiques trouvées des patients dans les cellules de poissons. Pour tester l’hypothèse d’une origine neuronale de certains cancers du muscle chez l’enfant, ces mutations seront introduites dans des embryons de poissons. Ensuite, un suivi attentif de la formation de tumeurs sera réalisé sur une durée 12 mois maximum. Le nombre de poisson a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique des résultats.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’origine des cancers des muscles chez les enfants. Cette étape est indispensable pour adapter la prise en charge thérapeutique des jeunes patients, car la cellule d’origine des cancers impacte la réponse aux traitements.

Procédures

Pour les poissons zèbres de 5 jours à 3 mois : Les poissons seront transférés provisoirement de leur aquarium à un autre plus petit (1 litre), par groupe de 3, 2 fois par semaine, pour réaliser l’observation attentive de l’apparition des tumeurs et d'éventuels signes de mal-être. Durée maximale de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 24. Les poissons sont également suceptibles d'etre anesthésiés et observé sous une loupe 1 fois par mois pour évaluer la présence de tumeur interne (fluorescence). Durée de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 3. Pour les poissons zèbres de plus de 3 mois : Les poissons seront transférés provisoirement de leur aquarium à un autre plus petit (1 litre), par groupe de 5 poissons, 1 fois par semaine, pour réaliser l’observation attentive de l’apparition des tumeurs et d'éventuels signes de mal-être. Durée maximale de l'intervention : 15 minutes. Nombre maximal : 36. Les poissons sont également suceptibles d'etre anesthésiés et observé sous une loupe 1 fois par mois pour évaluer la présence de tumeur interne (fluorescence). Durée de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 9.

Impact sur les animaux

La fréquence d'observation a été définie de manière à anticiper la détection des tumeurs tout en réduisant le malêtre animal associé à leur manipulation répétée. L'observation attentive des poissons nécessite leur transfert transitoire dans un autre bac (par groupe de 3 ou 5 poissons suivant leur âge). Les poissons seront également légèrement anesthésiés (Tricaïne methasulfonate tamponnée à pH7, 100mg/L) une fois par mois pour permettre d'observer par fluorescence, d'eventuelles tumeurs interne aux poissons. Chez les patients, aucun symptôme majeur n'est observé dans les premiers stades de la maladie en dehors de l'apparition d'une masse préférentiellement proche des muscles. De fait, certains animaux peuvent présenter des signes de malêtre dus au développement de ces tumeurs. Les signes les plus précoces comprennent des modifications de la nage, une incapacité à maintenir sa position dans la colonne d'eau, une respiration accélérée passagère ou une apathie. Les animaux qui présentent un ou plusieurs de ces signes cliniques seront identifiés et observés pendant une durée maximale de 48h. En absence d’amélioration des signes mal-être listés ci-dessus, les poissons seront mis à mort. La présence de tumeur, le hérissement des écailles, la présence d’oedèmes, une léthargie (immobilité au fond de l’aquarium) prolongée ou une incapacité à se nourrir constituent des points limites nécessitant une mise à mort immédiate.

Devenir

En cas de mal-être, les poissons zèbres seront mis à mort. Dans le cas d'apparition de tumeurs, afin de récupérer les tumeurs, et permettre leur analyse, les poissons seront mis à mort. A la fin de la procédure (soit à 1 an maximum), les poissons seront mis à mort pour prévenir la survenu d'éventuelle altération tardive du à la procédure.

Remplacement

Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer expérimentalement les conséquences des modifications génétiques impliqués dans les maladies humaines telles que le cancer. Les cellules cancéreuses humaines en culture sont très utiles pour comprendre les mécanismes moléculaires en place lorsque le cancer est déjà établi. En revanche, elles ne représentent pas la complexité des comportements cellulaires là où la tumeur est établie, l’interaction avec les tissus sains et le reste de l’organisme. Les cellules cancéreuses en culture ne peuvent pas modéliser les étapes permettant l’apparition et l’évolution temporelle des tumeurs.

Réduction

Dans un but de réduction et en accord avec la littérature scientifique, la taille de chaque groupe a été calculée pour obtenir des résultats significtifs tout en incluant le minimum d'individus dans cette étude. Des tests statistiques seront utilisés pour s'assurer de la significativité des résultas. De plus, l’analyse des caractéristiques biologiques des tumeurs sera réalisée sur le même groupe que la mesure du taux d’incidence des tumeurs. Dans la mesure du possible, nous essaierons de grouper au maximum les manipulations génétiques de manière à mettre en commun les groupes témoins et réduire ainsi le nombre total d’animaux utilisés. Nous réaliserons en priorité le modèle transitoire (350 poissons) puis nous développerons le système constitutif (350 poissons) si besoin, et en cas d’échec du premier modèle (soit un maximum de 700 poissons).

Raffinement

Tout signe de mal-être des animaux potentiellement dus au développement de tumeurs pourront être prévenus par une surveillance attentive des poissons à la recherche de signes ou de changements de comportement généralement associés à une maladie par l’application de critères d’arrêt définis.

Choix des espèces

Le poisson zèbre représente un bon organisme modèle pour l'étude de la génétique du cancer. Les gènes et programmes génétiques impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'Homme et le poisson et nous disposons de très bons outils pour reproduire les altérations génétiques trouvées dans les tumeurs humaines spécifiquement dans certains types de cellules dans les poissons adultes. D'autres espèces d'animaux pourraient être envisagées comme alternative au poisson zèbre, tels que Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster, mais ce sont des invertébrés dont de nombreux organes diffèrent considérablement de l’Homme, ce qui limite leur utilité pour l’étude du cancer. Le poisson représente une bonne alternative à la souris à la fois parce qu'il est un vertébré moins évolué et parce qu'il offre d'excellentes possibilités de manipulation génétique pour tester l'influence de gènes particuliers sur le développement tumoral. Les micro-injections de vecteurs ADN seront réalisées dans des embryons au stade d’une cellule. L’étude de la survenue des tumeurs primaires sera faite dans des poissons juvéniles ou adultes (âge compris entre 4 et 52 semaines) en fonction de la vitesse d’apparition des tumeurs.