Oncologie

744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans les coussinets des pattes des injections de cellules dendritiques activées, puis une seconde injection dans le flanc, pour mesurer une réponse immunitaire contre des peptides issus du génome silencieux. Le porteur indique que les injections dans les coussinets peuvent provoquer une douleur de plusieurs jours empêchant l'animal de marcher, de boire et de manger normalement. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les flux de cellules entre organes et juge cette étape "indispensable" pour tester le pouvoir immunisant des peptides.

Objectifs

Le système immunitaire dispose de plusieurs possibilités pour identifier et cibler les cellules tumorales. Parmi les cellules du système immunitaire, les lymphocytes T constituent un mécanisme clef pour cibler les cellules tumorales, mais c’est aussi un des mécanismes responsables des dommages dans les maladies auto-immunes. Cette reconnaissance de ses propres cellules (tumorales ou pas) s’effectue par le biais de molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). En effet, ces molécules, exprimées par la plupart des cellules, ont la capacité de capturer et d’exposer des peptides (fragments de protéines), reflétant la composition protéique de la cellule à un moment donné. Dans une situation normale, lorsqu’il s’agit de protéines du « soi », présentes normalement dans la cellule, le système immunitaire les ignore. En revanche, lorsqu’il s’agit de peptides dérivés de virus ou des bactéries (« non-soi »), le système immunitaire est activé, et est alors capable d’éliminer les cellules qui expriment ces peptides du non-soi. L’activation des lymphocytes T est faite par les cellules dendritiques. Ces cellules forment un réseau de cellules « sentinelles » capables de détecter des menaces. Après reconnaissance des menaces pour l’organisme, qu’il s’agisse de pathogènes ou de cellules tumorales, ces cellules peuvent capturer des peptides dérivés de pathogènes ; elles migrent ensuite dans les organes lymphoïdes secondaires où elles initient la réponse immunitaire en présentant ces peptides aux lymphocytes T. Une question majeure restant ouverte est celle de la nature des peptides exprimés par les cellules du « soi » visibles par le système immunitaire pendant les réponses auto-immunitaires ou dans le cadre de la tumeur. L’identification de ces peptides permettrait le développement des thérapies ciblés. Ce que nous voulons tester dans ce projet, c’est l’hypothèse selon laquelle les cellules du « soi » pourraient être vues par le système immunitaire par le biais de peptides dérivés de rétroéléments endogènes, éléments de la partie silencieuse du génome ayant la capacité de se répliquer et de se déplacer au sein du génome entier. L’expression de ces éléments est normalement inhibée, mais dans certaines situations, notamment dans des cellules cancéreuses, ils peuvent être réactivés.

Bénéfices attendus

Il est essentiel de noter que la très grande majorité des cancers développent des mécanismes très efficaces qui inhibent la réponse immunitaire. Les dernières années ont vu l’entrée en clinique des inhibiteurs de checkpoint, molécules utilisées dans le traitement de plusieurs cancers chez l’homme dans le cadre d’une approche appelée immunothérapie. Le développement de ces molécules constitue une avancée majeure dans le traitement de cancers chez l’homme. En effet, elles démontrent une efficacité chez des patients résistants à d’autres types de traitement. Cependant, les inhibiteurs de checkpoint ne fonctionnent que chez 20 à 25% des patients qui sont traités de cette manière. La compréhension des mécanismes expliquant cette efficacité variable fait actuellement l’objet d’efforts considérables de la communauté scientifique. Tout comme l’identification de molécules avec lesquelles les inhibiteurs de checkpoint pourraient être combinés pour augmenter leur efficacité. D’autre part, les traitements pour les maladies auto-immunes sont en général très peu spécifiques et impliquent la suppression plus ou moins généralisée du système immunitaire, ce qui entraîne plusieurs effets indésirables. Tant dans le cas des réponses immunitaires contre le cancer que dans celui des réponses auto-immunes, une question majeure restant ouverte est celle de la nature des peptides exprimés par les cellules du soi (tumoraux ou pas) visibles par le système immunitaire. L’identification de ces peptides permettra le développement des thérapies ciblés, soit contre les cellules cancéreuses, soit pour éviter les réponses auto-immunitaires. Ce projet permettra d’ouvrir de nouvelles pistes pour améliorer l’efficacité des thérapeutiques contre ces deux types de maladies.

Procédures

Pour ce projet, nous injecterons des cellules dendritiques, préalablement activées par une molécule dérivée de la paroi des certaines bactéries : le LipoPolySaccharide ou LPS (qui augmente la capacité des cellules dendritiques à activer les lymphocytes T) et incubées en présence des peptides candidats, dans la plante de pied de souris afin d’étudier leur capacité d’induction des réponses immunitaires in vivo. Les cellules dendritiques activées seront injectées dans chacun des coussinets des pattes arrière (1 ou 2 fois au cours de l’expérience) chez des souris anesthésiées (durée de l’anesthésie : 5 minutes). Les antigènes de soi, comme les peptides que nous allons tester dans ce projet, induisent des réponses immunitaires très faibles. Ces réponses ne sont pas détectables dans le sang de la souris, cependant, les cellules spécifiques seront concentrées dans les ganglions des pattes. Pour obtenir ces ganglions, certaines souris seront mises à mort 7-10 jours après ces injections. Les autres souris seront gardées et injectées 15-20 jours après la première injection avec une solution de peptides ou avec des cellules dendritiques activées par du LPS dans le flanc de la souris vigile (durée du geste inférieure à 10 secondes). 2-3 jours après la deuxième injection, les souris seront mises à mort pour évaluer l’ampleur de la réponse immunitaire contre les peptides après une deuxième immunisation.

Impact sur les animaux

Les injections dans les coussinets plantaires de la souris peuvent induire la douleur pour un temps limité après l’injection. Nous n’attendons pas une induction de l’inflammation dans les coussinets après l’injection des cellules dendritiques activées. Néanmoins, il est possible que les souris aient un peu de douleur pendant quelques jours dans les coussinets, ce qui pourrait les empêcher de marcher et de boire et manger normalement. Les injections dans le flanc de la souris peuvent induire un stress lié à la manipulation et une légère douleur pendant l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet découle de résultats obtenus in vitro et in silico où on a constaté l’expression et la présentation des peptides dérivés de rétroélements endogènes dans des molécules MHC de cellules dendritiques lors de leur activation par LPS. Cependant, le fonctionnement du système immunitaire repose sur des interactions tridimensionnelles et des flux de cellules finement régulés entre organes. De plus, la réponse immunitaire anti-tumorale ainsi que les réponses auto-immunitaires, entraînent la réaction de différentes sous-populations cellulaires qui interagissent entre elles dans des localisations tissulaires spécifiques. C’est pourquoi ces phénomènes ne peuvent être encore aujourd’hui reproduits in vitro. Cette étape est indispensable pour tester la capacité des peptides trouvés à induire des réponses immunitaires aussi bien antitumorales qu’auto-immunes.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est de 4 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. D’après notre expertise, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans des modèles expérimentaux semblables. Un minimum de 2 expériences indépendantes sur des groupes de 4 animaux est réalisé afin d'assurer la robustesse des résultats.

Raffinement

Les injections de cellules dendritiques dans les coussinets de la souris seront réalisées par du personnel entrainé sous anesthésie gazeuse afin de minimiser le stress causé à l’animal. Le volume injecté correspond à un volume réduit (par rapport au volume maximal de recommandations internationales ) afin de diminuer l’inconfort causé à l’animal. Les injections dans les coussinets plantaires de la souris peuvent induire la douleur pour un temps limité après l’injection. Nous examinerons les pattes et la démarche de la souris pour évaluer une possible gêne à la locomotion. En cas de douleur, celle-ci sera prise en charge par des anesthésiques locaux et des aliments gélifiés seront mis à disposition en cas de difficulté de locomotion. Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte des points-limite, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. D’autre part, la connaissance complète du génome murin nous a permis d’identifier des peptides derivés de rétroélements endogènes par séquençage à haut débit. Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin qu’elles aient fini leur croissance et que les résultats ne soient pas affectés par des modifications dues à un âge trop avancé des animaux. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris dont le gène ARNTL2 est inactivé, elles passent jusqu'à onze tests comportementaux répartis sur cinq semaines, évaluant mémoire, motricité, sociabilité, anxiété, dépression et sensibilité à la douleur, avec un jeûne de vingt-quatre heures pour l'un des tests. Le porteur indique que ces tests peuvent induire un stress léger à modéré et révéler de l'anxiété ou de la dépression, et prévoit la mort de toutes les souris pour analyser leurs tissus cérébraux. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne convient, l'évaluation comportementale exigeant l'animal vigile.

Objectifs

Le gène Arntl2 a été montré dans une précédente étude comme impliqué dans la régulation des rythmes biologiques circadiens. Dans ce projet, nous voulons voir si ce gène a aussi un impact sur les fonctions cérébrales, et notamment sur les capacités mnésiques. C’est pourquoi nous testerons des souris transgéniques pour lesquelles ce gène a été inactivé dans un large éventail de tests comportementaux. En comparant ces souris transgéniques à des souris contrôles, nous évaluerons les performances motrices, mnésiques, cognitives, émotionnelles, mais aussi de sociabilité, ou l’état de bien-être, d’anxiété ou à d’état dépressif et de susceptibilité à la douleur. Les souris adultes mâles et les femelles seront utilisées pour éventuellement mettre en évidence des effets dépendants du sexe.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’implication des horloges cérébrales dans les processus de mémoire mais également dans d’autres fonctions telles que la nociception, la coordination motrice ou les troubles de l’humeur. Il pourrait aussi permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques (chronothérapeutiques en se basant sur les rythmes circadiens) dans la prévention et le traitement des troubles de la mémoire et/ou de l’humeur chez l’humain, voir dans les processus douloureux.

Procédures

Les animaux sont soumis à des tests comportementaux servant à évaluer les performances mnésiques, motrices, senosrielles, sociales et émotionnelles. Chaque test dure durant de 3 à 10 minutes par jour répartis sur 1 à 4 jours. 24h au minimum sépareront ces tests. Certaines cohortes d' animaux réaliseront aux maximum 11 tests répartis sur 5 semaines alors que d'autres effectueront 6 tests répartis sur 4 semaines.

Impact sur les animaux

D’après les premières études préliminaires, l’inhibition génétique du gène ARNTL2 ne semble pas induire d’effet délétère. Les tests comportementaux peuvent induire des stress légers à modérés et de l’anxiété ou de la dépression pourraient être révélées potentiellement. Pour l’un des tests, les animaux réaliseront un jeûne préalable de 24h.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des analyses post-mortem des tissus cérébraux.

Remplacement

Nous ne pouvons pas avoir recours à des méthodes alternatives pour réaliser un tel projet. Il est nécessaire d’évaluer les différents paramètres comportementaux sur l’animal vigile. En effet la plupart des tests comportementaux réalisés dans le cadre d'un criblage comportemental impliquent une réponse motrice et mais également intégrée de l’animal. Il nous est donc impossible pour cette étape de travailler sur un modèle autre que l’animal.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats fiables et robustes tenant compte de la variabilité interindividuelle, de l'inactivation ou non du gène ARTNL2 et du sexe. Un maximum de test est réalisé sur un même groupe d'animaux tant que cela n'entrave pas la fiabilité des résultats expérimentaux et le bien-être animal.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées groupées. Elles font l’objet d’observations régulières tout au long de l'expérience. De l'enrichissement (carrés de coton pour favoriser la nidation, barreaux de bois à ronger et tunnel) est systématiquement disposé dans toutes les cages. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux entreront en procédure doucement après habituation à l'expérimentateur et à la manipulation. Des points limites ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance. En cas de signe de mal- être, des décisions seront prises en accord avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique.

Choix des espèces

Nous ne pouvons pas utiliser un autre modèle que la souris car le gène d’intérêt ARTNL2 dont nous voulons connaître les caractéristiques comportementales physiologiques et/ou éventuellement physiopathologiques n’est inhibé actuellement que chez la souris. Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte (âge au moins 8 semaines) avec un système nerveux ayant atteint sa pleine maturité fonctionnelle.

346 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 336 tuées à l'issue et 10 réutilisées comme femelles-stimulus. Elles sont soumises à un régime obésogène et à un mélange de phtalates, à des suivis de glycémie, à une ablation des ovaires puis à des tests comportementaux de cycle œstral, de lordose, de locomotion et de préférence olfactive. Le porteur indique que l'ablation des ovaires entraîne des douleurs post-opératoires et que gavages et injections provoquent un inconfort. Il précise que des mâles intacts sont utilisés pour les tests sans être comptés dans les effectifs, et conclut qu'aucune méthode alternative ne permet ces analyses comportementales et physiologiques.

Objectifs

Les facteurs externes ou environnementaux, tels que l'exposition à des perturbateurs endocriniens ou le régime alimentaire peuvent interférer avec les effets liés aux stéroïdes sexuels, issus des gonades, sur différents comportements et notamment avec les comportements de reproduction. Les phtalates, dont le principal est le DEHP (Di (2-éthylhexyl) phtalate), sont des perturbateurs endocriniens entrant dans la composition des plastiques et qui contaminent ainsi les aliments ou les produits d’hygiène et de cosmétique. L’exposition orale à l’âge adulte de souris femelles au DEHP, à des doses correspondant à une contamination environnementale, provoque une altération des comportements de reproduction. Ces effets sont associés à une modification des réseaux neuraux de l’hypothalamus impliqués dans le contrôle de ces comportements. Les données concernant l’influence du régime alimentaire, et plus particulièrement de l’obésité, sur les comportements de reproduction sont moins nombreuses bien que l’obésité soit souvent associée à un dysfonctionnement de l’axe hypothalamus-hypophyse-gonades. L’objectif de ce travail s’inscrit dans la perspective de créer un nouveau modèle de « malbouffe » des pays occidentaux en y intégrant les interactions entre le contenant (récipient plastique contenant des phtalates) et le contenu (alimentation riche en lipides et en sucres). Il s’agit d’explorer les effets comportementaux, moléculaires et cellulaires de l’association de ces deux types de perturbation environnementale : l’exposition à des perturbateurs endocriniens et le régime alimentaire obésogène/diabétogène.

Bénéfices attendus

Le projet se place dans la perspective d’étudier les conséquences d’une des caractéristiques du mode de vie occidental, les effets combinés de l'alimentation et des phtalates, sur la santé reproductive et son contrôle, dans un modèle murin adulte. Il permettra ainsi de faire émerger de nouvelles hypothèses concernant l’origine des altérations de la santé reproductive auxquelles sont confrontées les sociétés occidentales en combinant deux facteurs de l’exposome (régime alimentaire et exposition aux polluants chimiques).

Procédures

336 femelles seront soumises pendant 16 semaines à un régime obésogène/diabétogène et une exposition à un mélange environnementale de phtalates. Ce régime n’induit pas de nuisance particulière si l’accès à la nourriture et à la boisson n’est pas restreint. Ces souris seront soumises à des suivis de glycémie effectués par prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la queue (durée du suivi : 180 minutes maximum et 4 tests de tolérance au glucose et 4 tests de sensibilité à l’insuline répartis sur les 16 semaines de traitement). Parmi ces souris (240), ainsi que pour un groupe-stimulus (10), subiront une ovariectomie et une supplémentation en oestradiol et progestérone. La durée de la chirurgie est au maximum de 10 minutes et elle est pratiquée une seule fois. Les femelles d’étude sont soumises à différents tests comportementaux afin de suivre leur cycle oestral (1 frottis par jour de la semaine 12 à la semaine 16), et d’étudier les paramètres de leur comportement d’accouplement (2 tests de lordose de 30 minutes en semaines 12 et 14, 1 test de locomotion de 2h en semaine 13 et 1 test de préférence olfactive de 3 fois 10 minutes en semaine 15) avant d’examiner les modifications des structures cérébrales les contrôlant.

Impact sur les animaux

Lors des tests de tolérance au glucose le gavage oral peut engendrer un inconfort, tout comme l’administration d’insuline IP (douleur au point de piqure) lors des tests de sensibilité à l’insuline. Le suivi de la glycémie se fait par prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la queue qui peut engendrer une douleur légère et passagère au moment de l’incision. La procédure d’ovariectomie donne lieu à des douleurs post-opératoires. L’administration sous-cutanée de progestérone peut entrainer une légère douleur au point de piqure. Les souris-stimulus utilisées pour les expériences de comportement peuvent subir une légère douleur au point de piqure lors de l’anesthésie par voie IP.

Devenir

souris euthanasiées pour prélèvement de tissus et dosages biologiques (total : 336).

Remplacement

Il s'agit d'un projet comportant des analyses comportementales et des mesures de paramètres physiologiques : il n'est pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives.

Réduction

Les effectifs (total : 346 femelles) ont été calculés au plus juste afin de pouvoir obtenir une analyse statistique significative le cas échéant, compte tenu de la variabilité interindividuelle. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide de tests pertinents. Cohorte 1 : 4 groupes de 8 femelles, expériences répétées 3 fois soit un total de 96 femelles Cohorte 2 : 4 groupes de 10 femelles, expériences répétées 3 fois pour l’étude des modifications protéiques et 4 groupes de 10 femelles, expériences répétées 3 fois pour l’étude des modifications des acides nucléiques, soit un total de 240 femelles. A ces deux cohortes expérimentales, s’ajoute un groupe supplémentaire constitué de femelles-stimuli (femelles ovariectomisées et supplémentées en œstradiol et progestérone) nécessaires au test de préférence olfactive : 10 femelles. Les procédures de comportement sexuel et de préférence olfactive nécessitent d'utiliser des mâles intacts : ce sont des mâles qui ne subissent aucune contrainte ; ils n’ont donc pas été inclus dans le décompte des animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des locaux ad hoc, respectant la Directive 2010/63/UE. Les animaux sont surveillés quotidiennement et tout signe de mal-être est immédiatement signalé aux responsables du projet qui prennent la décision sur leur devenir, en accord avec le vétérinaire référent si nécessaire. Dès leur arrivée, les animaux sont manipulés régulièrement. La durée du jeûne lors des tests de glycémie a été réduite afin de limiter l’hypoglycémie. Pour les animaux subissant une procédure chirurgicale, des points limites adaptés permettent de gérer la douleur post-opératoire.

Choix des espèces

La souris est le modèle choisi pour ces études : c'est un des modèles les mieux caractérisés pour les études métaboliques et il existe de nombreux outils biotechniques disponibles pour ce modèle animal (anticorps, lignées transgéniques...). Cela permet ainsi de comparer les résultats obtenus avec la littérature et d'affiner nos hypothèses de travail. Il s’agit d’une étude chez l’adulte.

504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de sclérose latérale amyotrophique et de démence fronto-temporale par mutation de la protéine FUS, elles reçoivent des gavages et passent des tests moteurs et cognitifs répétés à quatre, huit, douze et seize mois, puis un examen des muscles sous anesthésie en fin de procédure. Le porteur indique que le gavage peut provoquer des fausses routes suivies d'une mise à mort immédiate, et prévoit la mort de toutes les souris pour analyser leurs tissus. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité comportementale et structurelle du système nerveux nécessaire à l'étude.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la démence fronto temporale (DFT) sont deux maladies neurodégénératives incurables encore mal comprises à ce jour. Nous avons dans notre laboratoire un modèle de souris qui mime ces maladies en reproduisant la mutation d’une protéine mutée (la protéine FUS) chez les patients. Après avoir valider notre nouveau modèle (objectif 1), nous voulons analyser l’effet de la mutation de FUS aussi bien sur la perte des neurones dans le temps (objectif 2) que son impact à l’échelle comportementale (objectif 3)..

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, un seul traitement est proposé aux patients atteints de SLA. Il s’agit du Riluzole, dont l’efficacité est très faible puisqu’il ne permet d’augmenter la durée de vie des patients que de quelques mois. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes en œuvre dans le développement et la progression de la SLA et de la DFT afin d’élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient aider à la mise en place de nouveaux traitements.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure d’administration par gavage à raison d’un gavage par jour, d’une durée maximale de 1 minute, durant une période de 5 jours. Les animaux suivront des tests moteurs (3 session de 3 minutes maximum, entrecoupées de phases de repos de 5 minutes) et des tests cognitifs. Le premier test dure 5 minutes, le second est composé de 4 sessions 5 minutes (entrecoupées de 8 minutes). Un troisième test est réalisé sur une période de 4 jours consécutifs, à raison de 4 essais par jour (durant maximum 1 minute chacun). Un quatrième sera réalisé sur une nuit et enfin le cinquième, sur une période de 5 jours, à raison d’un essai unique de 10 minutes par jour. Nous réaliserons ces différents tests de manière successive, en respectant des pauses d’un moins un jour entre chacun aux âges de 4 mois, 8 mois, 12 mois et 16 mois. L’examen du fonctionnement des muscles (EMG) durera environ 20 minutes et sera réalisée en fin de procédure, sur les souris endormies afin d’éviter toute souffrance.

Impact sur les animaux

Nous pourrions observer chez les souris traitées des fausses routes liées à l’administration du traitement par gavage mais aussi des signes de stress liés à la contention obligatoire pour réaliser ce geste de gavage. Nous pourrions également observer un léger stress causé par la passation des tests comportementaux. Nous avons mis en place des points précis et spécifique à chacun de ses risques pour sortir les animaux de la procédure en cas de besoin. Ainsi, après l’administration par gavage du traitement, nous réaliserons une évaluation scorée de l’état de la souris en remplissant la grille présentée en annexe 7. Nous évaluerons les items suivants (+ 1 point / - 1 point) : Prise/perte de poids, poils propres/sales, interaction/isolement, déplacement/prostration, respiration normale/sifflement. Si la somme des points est comprise entre 3 et 5, la souris sera replacée dans sa cage sans surveillance particulière, si la somme est comprise entre 1 et 3 points, nous demanderons un avis vétérinaire, si la somme est inférieure à 1, la souris sera mise à mort. En cas de fausse route, l’animal sera mis à mort immédiatement.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures car nous avons besoin d’étudier les tissus prélevés afin d’étudier les impacts au niveau microscopique (moléculaire, cellulaire et biologique) de notre intervention.

Remplacement

Ce projet a pour but de déterminer si le changement de la localisation de la protéine FUS dans la cellule (qui sort du noyau pour aller dans le cytoplasme chez les patients souffrant de SLA et de DFT) entraine 1) une perte des neurones dans le temps et 2) des troubles cognitifs et moteurs. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui récapitule à la fois la complexité comportementale (des comportementaux sociaux, des processus cognitifs) mais aussi celle structurelle du système nerveux (les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central) que l’on retrouve chez les patients atteints de ces maladies. Les modèles cellulaires ne nous permettraient de réaliser des études comportementales ni de reproduire cette complexité structurelle.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les études sur les muscles sur les mêmes animaux que ceux prévus pour réaliser les expériences histologiques et moléculaires. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude afin de valider les groupes expérimentaux et potentiellement réduite le nombre de groupes contrôles que nous utiliserons. Si cette étude pilote est validée sur ces deux aspects, nous pourrons réduire de plus de la moitié les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet.

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Les expérimentateurs en charge sont formés à chaque procédure et nous avons une très bonne connaissance du modèle utilisé. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal. Toutes les approches expérimentales que nous souhaitons utiliser dans ce projet sont couramment réalisées dans notre laboratoire, ce qui limite fortement les risques de perte de tissus pour des raisons purement techniques. Par ailleurs, la procédure d’étude du muscle sera réalisée sous anesthésie gazeuse afin de réduire toute souffrance de l’animal et de réduire le stress lié à la manipulation.

Choix des espèces

Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau et de la moelle épinière adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives et motrices qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes (début de l’expérience à 2 moi et fin prévue à 17 mois) car les patients souffrant de SLA liée à FUS présentent très rarement des formes juvéniles. Nous avons décidé d’étudier aussi bien les femelles que les mâles car les deux maladies qui nous intéressent touchent de la même manière les hommes et les femmes.

498 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris de deux, trois et quatre semaines reçoivent une greffe de cellules d'ostéosarcome dans l'os du tibia, puis une immunothérapie et un inhibiteur du métabolisme tumoral par injections répétées. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer un boitement et, en cas de métastases, une gêne respiratoire entraînant une mise à mort anticipée. Il présente ce modèle pédiatrique comme le plus proche de l'ostéosarcome de l'enfant et affirme qu'un essai clinique impose de justifier l'efficacité des molécules chez l'animal.

Objectifs

L’ostéosarcome est la tumeur osseuse la plus fréquente chez les enfants, les adolescents et jeunes adultes. Le traitement reste inchangé de plus de 50 ans avec un taux de survie plafonné à 70% en cas des tumeurs locales et 30% en cas des métastases. La base du traitement consiste en chirurgie combinée à la chimiothérapie pré- et post-opératoire. Ce traitement étant très agressifs avec des séquelles qui peuvent être très conséquentes pour des enfants, il y a un réel besoin de traitements mieux adaptés. Le but de ce projet est de valider de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de l’ostéosarcome. Les deux approches seront testées, un stimulant du système immunitaire et un agissant sur le métabolisme de la tumeur. Pour pouvoir réaliser un essai clinique de ces médicaments, il y a une exigence de justifier à la fois de leur efficacité et de leur sécurité d’emploi chez des animaux. Il est alors essentiel d’étudier ces candidats médicaments sur un modèle animal adapté tenant compte de la spécificité liée à l’âge de survenue parce qu’aucun autre modèle in vitro existant n’est aussi proche de la complexité d’un organisme humain.

Bénéfices attendus

Nous avons un modèle d’ostéosarcome inter-âge implanté dans l’os de la jambe postérieure chez des souris immunocompétentes âgées de 2, 3 et 4 semaines. Il existe des différences dans l’environnement proche de la tumeur correspondant au développement osseux au cours de la croissance. Ces données nous rendent confiants que l’efficacité de la réponse antitumorale à des âges différents sera modifiée. Ce projet montrera alors l’efficacité des thérapies innovantes par rapport à l’âge de survenue et permettra de mieux adapter des essais cliniques chez des enfants, adolescents et jeunes adultes.

Procédures

1 : implantation orthotopique des cellules tumorales en intratibiale dans toutes les procédures sous anesthésie de durée 5 min par animal 2 : administration des traitements par les voies intrapéritonéale (1x/jour) et intraveineuse (2x/semaine) sur animaux vigiles pendant 28 jours au maximum

Impact sur les animaux

Les animaux de 2 semaines étant plus sensibles à l’anesthésie par une baisse rapide de la température corporelle ils seront surveillés jusqu’au réveil sur le tapis chauffant et visités également à la fin de la journée. En cas d’apparition des métastases, une gêne respiratoire peut subvenir (fréquence respiratoire irrégulière ou accélérée) ainsi que la diminution du poids. Cette gêne est rapidement repérée grâce aux observations cliniques régulières d'un personnel expérimenté et l’animal sera mis à mort immédiatement pour éviter sa souffrance. On peut observer également le boîtement de l'animal dû au développement tumoral, pour cet effet les volumes tumoraux sont bien précisés en tant que les points limites. Utilisant que des doses non toxiques des traitements, on ne s’attend pas à des effets indésirables particuliers. On observera les sites d’injections et on change le côté d’injection à chaque administration. On fera également attention à la diminution du poids des animaux, le signe visible plus précoce d’un potentiel effet indésirable des traitements administrés ainsi qu'à d'autres potentiels effets indésirables (e.g. convulsions, cachexie, vomissement, diarrhée, apparition des plaques rouges sur la peau au site d'injection). Le stress de l'animal dû à la contention et l'injection des traitements sur animaux vigiles sera diminué par l'habituation des animaux avant le début des traitements par le personnel expérimenté.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par l’inhalation de CO2 à la fin des procédures afin de récolter les tumeurs et tissus avec des métastases pour les analyses approfondies ainsi que pour la création d'une banque des tissus sains en cas de la non prise tumorale.

Remplacement

L'environnement de l’ostéosarcome étant très complexe, il n’existe pas un autre moyen i.e. in vitro, pour reproduire sa complexité avec tous ses composants, notamment immunitaires afin d’étudier l’efficacité des médicaments agissant sur ce dernier. La première efficacité des traitements administrés a été évaluée au cours des études in vitro sur des cellules de l'ostéosarcome avant de passer chez l'animal. Leur toxicité chez la souris a été également évalué dans des études de toxicité in vivo par des entreprises développant ces molécules.

Réduction

Les procédures seront réalisées de façon séquentielle afin de réduire le nombre d'animaux. A la fin des procédures les animaux seront mis à mort et les tissus collectés afin de construire une banque tissulaire pour d’autres analyses histologiques et moléculaires. Pour toutes les procédures des tests paramétriques ou non-paramétriques, selon les règles de leur application, seront utilisés pour connaître l’efficacité des traitements au sein du même âge des souris ainsi que voir la différence de l’efficacité des traitements entre les âges différents. Le nombre des animaux a été calculé en se basant sur la proportion des animaux répondeurs au traitement vs des animaux contrôle.

Raffinement

Toute intervention d’injection dans l'os de la patte postérieur sera faite sous anesthésie générale administrée au maximum pendant 5 min. Les animaux seront manipulés sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale. Une définition précise des points limites conduisant à l'arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des animaux, une surveillance adaptée des animaux, au minimum une pesée et une observation bi-hebdomadaire permettront d’éviter toute douleur ou souffrance de l’animal. Dans le cas de la douleur de l'animal lié au développement tumoral, le plus souvent observée par le boitement de l'animal qui ne pose pas sa patte au sol, on administrera du paracétamol dans la boisson qui n'influence pas sur le système immunitaire. L'aménagment standard des cages par des cocons et papier craft peut être enrichi par des tunnels ou bouchettes pupliers en cas de l'observation du mal être des animau, notamment dû au stress post-injection des traitemens sur des animaux vigiles. Dans le cas des injections intrapéritonéales, le quadrant et le côté du ventre seront changés pour chaque injection. Dans le cas des injections intraveineuses, la même veine caudale latérale ne sera pas utilisée deux fois par la suite.

Choix des espèces

Nous disposons d’un modèle d’ostéosarcome établi par l’injection dans l'os dans les souris à des âges différents correspondant à des âges prépubère, pubère et post-pubère chez l'homme. Ce modèle est à notre connaissance le plus proche de l’ostéosarcome des enfants à différent âge de survenue (agressivité, pouvoir métastatique, environnement immunitaire) et un pic d'incidence à 15 ans hormis les cancers spontanés. Les cellules utilisées sont une lignée cellulaire d’ostéosarcome d’origine des souris de la même souche ; ce modèle peut donc être établi sur un animal avec un système immunitaire propre à souris, condition nécessaire pour étudier notamment l’environnement immunitaire de cette tumeur. A noter que l’âge plus jeunedes animaux n’influe pas le taux de prise tumorale.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris SAMP8 modèles de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent une supplémentation en butyrate, des gavages, des prélèvements de sang à la queue et des mesures du transit digestif, puis des tests comportementaux de mémoire visuelle et de motricité. Le porteur signale une perte de poids propre à cette lignée et indique que gavages, prises de sang et tests peuvent générer stress et douleur. Il affirme que l'étude du lien intestin-cerveau au cours du vieillissement ne peut aujourd'hui se faire que sur un modèle animal, faute de reproduire cette complexité in vitro.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) touche plus de 40 millions de personnes dans le monde. Il n’existe aucun traitement efficace pour prévenir, ralentir ou guérir la maladie. Elle est invalidante et mortelle, entraînant une perte progressive des neurones au niveau du cerveau, notamment des régions impliquées dans la mémoire. Un des signes majeurs de la maladie d'Alzheimer est l’accumulation dans le cerveau d’un bout de protéine appelé Abeta qui à la longue empêche une bonne communication entre les neurones. Plusieurs études montrent que les patients atteints de la MA ont également des altérations digestives (eg. constipation) pouvant se manifester de façon très précoce, longtemps avant qu’apparaissent les premiers signes affectant le cerveau. Ces défauts de transit gastro-intestinal suggèrent que la MA toucherait aussi bien le cerveau que l’intestin. L’intestin est composé de neurones régulant les fonctions digestives. Par ailleurs, il a également été montré que les atteintes intestinales augmentent le risque de développer une forme sévère de la maladie. Il a aussi été mis en évidence que les patients atteints de la MA souffrent de manière fréquente d’une altération du tapis microbien tapissant l’intestin et d’une baisse associée de métabolites provenant de ces microbes tel que le butyrate. De plus, le butyrate a été montré comme étant bénéfique au bon fonctionnement des neurones de l’intestin et du cerveau. Dans ce contexte, améliorer le fonctionnement des neurones de l’intestin pourrait améliorer la fonction de transit intestinal et ainsi prévenir des formes graves de MA. De nombreuses études ont mis en évidence le rôle important de la nutrition dans les processus de mémoire. Au vu de tous ces éléments, améliorer le tapis microbien de l’intestin ou des métabolites qu’il produit, tel que le butyrate, peux avoir un impact positif sur les fonctions de l’intestin et la mémoire dans la MA.

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif lié à l’âge représente un véritable enjeu pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes âgées. De plus, améliorer les capacités cognitives est reconnu comme une stratégie visant à réduire le risque de développer des pathologies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer. Favoriser la communication des neurones du cerveau par l’alimentation peut avoir des effets bénéfiques sur le vieillissement normal ou pathologique (Maladie d’Alzheimer) du cerveau. D’autre part, le vieillissement du cerveau est aussi associé à des altérations au niveau intestinal dont la cause pourrait être le vieillissement/ altération des neurones. Dans ce contexte, améliorer les mécanismes de communication neuronale dans le cerveau pourrait aussi impacter ceux de l’intestin et vice-versa. De plus, de nombreuses études ont mis en évidence le rôle important de la nutrition dans la régulation des performances cognitives (AGCCs : acides gras à courte chaine, acides aminés, vitamines). De manière intéressante, la flore intestinale et ses métabolites peuvent eux aussi impacter ces fonctions. Les AGCC sont naturellement synthétisés par le microbiote, principalement dans le colon et leur rôle central non seulement dans le métabolisme neuronal mais aussi la modulation de gènes impliqués dans la connectivité neuronale. De plus, d’autres études ont mis en évidence les effets bénéfiques du butyrate sur la communication des neurones du cerveau avec amélioration de la mémoire. Néanmoins, leur capacité à prévenir les altérations au niveau intestinal et leur mode d’action reste inconnu à ce jour et fait l’objet de cette étude.

Procédures

Après 4 mois et 6 mois de traitement, pour tous les animaux, nous effectuerons des études des fonctions digestives en évaluant le temps de transit colique (durée max 30 min) et total jusqu’à 6 heures avec addition d’eau (temps de transit total) , ainsi que la perméabilité intestinale in vivo et le nombre de fèces émises. L’objectif est de mesurer le temps de transit oro-anal et de calculer le nombre de fèces émises sur 2 heures. Ainsi les fèces émises seront collectées toutes les 15 minutes sur deux premières heures pour le temps de transit colique. Deux heures après gavage, un prélèvement d’un échantillon de sang à la queue (sur animal vigile) est réalisé (durée 30 sec). Après 6 mois, tous les animaux réaliseront des tests comportementaux (mémoire visuelle et motricité d’une durée de 10 à 30 min individuellement).

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effets indésirables n’est reporté dans la littérature concernant la supplémentation alimentaire en butyrate ou l’Inuline. Il est cependant important de noter une perte de poids des souris SAMP8 par rapport aux contrôles qui est indépendant de la supplémentation envisagée. Cette perte serait liée à une altération du métabolisme chez ces souris et qui est observable dès la naissance. Stress et douleur peuvent être générés par différentes expérimentations (gavage, prélèvements de sang ou tests comportementaux).

Devenir

Mise à mort de toutes les souris à l’issue des procédures. Des prélèvements terminaux seront réalisés pour des études sur des protéines, des ARN et des marquages sur des tissus.

Remplacement

L’étude du lien entre les systèmes nerveux central et entérique, dans un contexte de vieillissement physiopathologique, nécessite une étude comportementale qui ne peut, à ce jour, se réaliser que sur un modèle animal. De plus, le vieillissement et le développement de la maladie d’Alzheimer mettent en jeu différents systèmes cellulaires (neurones de l’intestin, neurones du cerveau, flore microbienne intestinal, système immunitaire ...) dont la complexité d’interaction ne peut être modélisée par une approche in vitro et justifie l’utilisation de modèles animaux afin de disséquer cette complexité d’interaction des acteurs impliqués et d’identifier les mécanismes sous-jacents associés.

Réduction

Les travaux réalisés in vitro sur des cultures de neurones de l’intestin nous ont permis d’identifier le butyrate comme métabolite d’intérêt et de réduire significativement le nombre d’animaux qu’il aurait fallu pour examiner les effets potentiellement bénéfiques de plusieurs métabolites bactériens. Parallèlement, des expérimentations similaires menés chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et ainsi de sélectionner le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir une significativité avec une erreur de 0,05 et une puissance de 80%.

Raffinement

Les animaux seront hébergés collectivement dans des cages avec frisottis et tunnels ou dômes plastiques transparents rouges. Ils seront observés quotidiennement. Le poids et l’état d’hydratation seront surveillés 3 fois par semaine si le score reste inférieur à 1 Si, selon les tables des points limites, le score venait à augmenter, la surveillance du poids et de l’hydratation seraient quotidienne voir 2 fois par jour pour des scores de 1 à 2. Si le score devait être de 3, les souris recevraient un analgésique par voie sous-cutanée, 1 fois par jour. Pour un score de 4 les souris seraient mises à mort

Choix des espèces

Les souris SAMP8 sont un bon modèle de la maladie d’Alzheimer car ne présentant aucune introduction de nouveaux gènes pour induire des signes de la maladie. De plus, étant un modèle naturel/spontané sans surexpression de gènes, il se prête mieux à des expériences de traitement à but thérapeutique comme la supplémentation avec du butyrate et/Inuline envisagé dans le projet. Les travaux menés au sein du laboratoire ont également montré qu’il est pertinent pour l’étude du rôle de l’intestin dans la MA. Les souris SAMP8 et leur modèles contrôles (SAMR1) seront utilisées dès l’âge de 3 semaines et supplémentées de façon quotidienne avec de l’eau sans supplémentation ou de l’eau contenant du butyrate (supplémentée ou non avec de l’Inuline) jusqu’à l’âge de 6 mois. Ces âges ont été retenus au vu de la littérature scientifique concernant la cinétique d’apparition des altérations au niveau de l’intestin ou du cerveau. Les souris SAMP8 et SAMR1 seront utilisées à l’âge de 3 semaines et hydratées de façon journalière avec de l’eau sans supplément (contrôle) ou de l’eau contenant du butyrate jusqu’à l’âge de 6 mois. Ces âges ont été retenus pour nos expériences car des études montrent que les symptômes intestinaux commencent vers 1-2 mois et les symptômes cérébraux vers l’âge de 6 mois. Etant donné que le projet vise à évaluer l’effet préventif du butyrate, les âges retenus permettent de baliser l’apparition de ces symptômes.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle de l'inflammation dans les réponses immunitaires contre les tumeurs. Chaque animal est irradié, reçoit une greffe de moelle osseuse puis des cellules tumorales, et une partie ingère un irritant intestinal par cycles de cinq jours. Le porteur indique que l'irradiation peut faire souffrir en cas de mauvaise reconstitution, que l'irritant colique provoque une perte de poids et une souffrance, et que tous les animaux sont tués pour prélever organes et tumeur. Il affirme que la complexité du micro-environnement tumoral "oblige" à recourir à l'expérimentation animale, les bénéfices restant formulés au conditionnel.

Objectifs

Chez l’homme, les réponses immunitaires anti-tumorales sont souvent inefficaces. Cela est notamment dû au développement d’un épuisement des réponses immunitaires (aussi appelé exhaustion). Il a été montré que certaines protéines sécrétées en contexte inflammatoire contribuaient au développement d’une exhaustion des globules blancs au cours du vieillissement. Au regard de ces résultats, nous souhaiterions déterminer le rôle de ces protéines sur l'exhaustion des réponses immunitaires dans le cadre du cancer.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de préciser le rôle de ces protéines inflammatoires sur les acteurs de la réponses anti-tumorale, notamment sur leur fonction. In fine, ce projet pourrait aboutir à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d'améliorer les réponses anti-tumorales et le traitement de certains cancers.

Procédures

Irradiation (4 minutes par souris), une injection intraveineuse rétro-orbitaire de cellules de moelle osseuse sous anesthésie générale (15 sec/souris). Pour certaines souris, une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par échographie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).

Impact sur les animaux

L'irradiation peut occasionner une souffrance en cas de mauvaise reconstitution des cellules de la moelle osseuse. L'injection intraveineuse, l'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever les organes et la tumeur pour analyser les cellules immunitaires et l'expression de plusieurs protéines d'intérêt.

Remplacement

La complexité inhérente au microenvironnement tumoral ne permet pas de récapituler les évènements immunologiques impliqués dans des systèmes in vitro, obligeant à utiliser l’expérimentation animale. Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et en se basant sur des données publiées de la littérature.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale au niveau du tube digestif en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux. Chaque animal chimère permet d'analyser les cellules de deux génotypes différents au sein d'un même animal.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Tous les gestes invasifs réalisés sur les animaux seront faits sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet (pesée et surveillance deux fois par semaine après l'irradiation, mesure de la croissance tumorale trois fois par semaine après l'injection de cellules tumorales, suivi régulier par échographie pour certains animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certaines voies de signalisation dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.