Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rôle du stroma dans les pathologies inflammatoires de la peau
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
2 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées, des prélèvements de sang à la queue et une biopsie de peau sous anesthésie, pour étudier le rôle des cellules du derme dans l'inflammation cutanée à l'aide de lignées transgéniques portant un gène "suicide". Le porteur décrit un inconfort léger et n'attend aucun effet indésirable majeur. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de ces interactions multicellulaires "nécessite" un modèle murin in vivo, dont le système immunitaire serait proche de celui de l'humain.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de caractériser le rôle du stroma dans les pathologies inflammatoires et allergiques de la peau. Les cellules stromales constituent une fraction importante du derme, et sont des producteurs majeurs de facteurs immunorégulateurs. Lors d’une inflammation, elles deviennent très pro-inflammatoires. Afin d’étudier le rôle de ces cellules stromales dans l’inflammation, et en particulier les interactions avec les celllules immunitaires, nous étudierons le rôle de différentes populations stromales inflammatoires grâce à l’utilisation de lignées de souris transgéniques qui expriment des gènes « rapporteur » ou « suicide» (le récepteur à la toxine diphtérique) sous contrôle de promoteur de facteurs stromaux.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes biologiques menant aux pathologies inflammatoires de la peau. Notre étude permettra de mettre en valeur le rôle des cellules stromales dans ces processus afin de pouvoir proposer des nouvelles cibles thérapeutiques visant à améliorer les traitements actuels des maladies chroniques inflammatoires ou allergiques de la peau, et blessures chroniques.
Procédures
- Un prélèvement sanguin a la veine caudale (durée : quelques secondes), 2x en 1 semaine, suivi d’une période de récupération de 1 semaine si besoin de refaire les prélèvements à l’identique. - Injection par voie intrapéritonéale quotidienne, ou tous les 3 jours. Durée : quelques secondes - Biopsie dermique localisée (1x par souris). Durée : 2 min sur souris anesthésiée
Impact sur les animaux
Inconfort léger dû aux injections ou prélèvement sanguin, rougeur peau. La biopsie dermique sera effectuée sur souris anesthésiée + analgésique local. Aucun effet indésirable majeur n’est attendu suite à ces procédures.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélever les organes pour analyse
Remplacement
Notre projet s’intéresse à l’interaction des cellules stromales avec leur microenvironnement à savoir les cellules endothéliales, les cellules épithéliales et les cellules immunitaires qui infiltrent le tissu. Comme l’étude de ces interactions cellulaires est donc multicellulaire et multi-organes (réponse immunitaire), elle ne peut pas être effectuée sur des cellules isolées in vitro et nécessite un modèle murin in vivo, qui ont un système immunitaire similaire à l’homme.
Réduction
Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible tout en assurant des résultats significatifs, qui seront confirmés par des analyses statistiques appropriées, par exemple le T Test ou le test Anova en fonction des questions posées. Ce nombre tient compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse et inclut pour chaque série d’expérience le nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi des erreurs d’interprétation.
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux dans les procédures expérimentales, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les traitements, et les biopsies de peau seront effectuées sur animaux anesthésiés, couchés sur un tapis chauffant et sur une peau traitée avec anesthésique local Si un comportement associé à de la douleur est détecté après les biopsies, des analgésiques seront administrés.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier les pathologies inflammatoires de la peau car des modèles sont bien établis et récapitulent la pathologie chez l’homme. De plus, la souris comporte tous les composants du système immunitaire inné et acquis, qui jouent un rôle essentiel dans l’inflammation chronique et sont semblables dans les pathologies inflammatoires humaines, de ce fait ce sont des bons modèles pour notre étude. Les conditions d’expérimentation proposées sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants en soumettant les animaux à moins de souffrance possible. Les souris seront âgées de 5 à 30 semaines car nous étudierons ces pathologies dans le jeune adulte (après sevrage) et l’adulte
Biodistribution et étude d’efficacité de nouveaux composés par imagerie chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Saines ou porteuses de tumeurs greffées, elles reçoivent des composés fournis par des clients extérieurs, des séances d'imagerie sous anesthésie et des prélèvements sanguins, avant que leurs organes soient envoyés aux commanditaires. Le porteur décrit une prestation de service visant à mesurer la biodistribution et l'efficacité de ces composés. Il affirme qu'aucune modélisation mathématique ni culture in vitro ne peut prédire ces résultats, ce qui rendrait l'animal vivant nécessaire.
Objectifs
Ce projet a pour but d'étudier, à la demande de chercheurs extérieurs à notre laboratoire, la biodistribution de nouveaux composés qu'ils nous fournissent chez des souris saines ou porteuses de tumeurs sous-cutanées et de suivre leur efficacité thérapeutique sur ces modèles de souris. Malgré des avancées significatives en termes de modélisations mathématiques, il n'est actuellement pas possible de prédire efficacement la biodistribution ou l’efficacité thérapeutique sur des modèles tumoraux, nous devons donc utiliser des animaux vivants. L’intérêt de ce projet est de pouvoir proposer à nos clients chercheurs des études sur des modèles de cancer simple à mettre en œuvre afin de vérifier la biodistribution/ciblage et l’efficacité des composés qu’ils mettent au point. Cela constitue une étape préliminaire avant de passer sur des modèles orthotopiques par exemple (faisant l’objet d’autres autorisations de projet). Les tumeurs sous cutanées pourront être issues de notre banque de cellules tumorales (cellules tumorales mammaire, pulmonaire, colorectal, pancréatique, ovarienne, prostatique…) ou fournies par nos clients. Nous ne pouvons pas précisément indiquer les composés (molécule, anticorps, hormone, peptide, protéine…) à tester car ils nous sont fournis par les clients (recherche fondamentale, privé…). Nous utiliserons uniquement des composés qui auront préalablement été testés et tolérés par les souris, cette étape est effectuée dans le cadre d’une autorisation de projet séparée ou chez le client.
Bénéfices attendus
Selon les études clients, les bénéfices attendus sont une bonne connaissance de la biodistribution des composés des clients sur souris saines puis sur souris avec tumeurs sous-cutanées avant utilisation de ces composés à visée thérapeutique sur souris avec tumeurs sous-cutanées. Ce projet pourra être suivi par un projet différent avec étude de l’efficacité thérapeutique de ces composés sur des animaux portant des tumeurs orthotopiques avec de plus grands effectifs.
Procédures
Des administrations de composés seront effectuées sur ces animaux par du personnel formé et entraîné : - Administration unique pour les procédures avec biodistribution - Administration répétée pouvant aller jusqu’à 7 fois par semaine sur 4 semaines maximum pour la procédure d’efficacité Pour les points d’imagerie, les animaux seront anesthésiés : - 4 examens maximum par jour sur 7 jours pour les procédures avec biodistribution - 2 examens d’imagerie par semaine sur 12 semaines maximum pour la procédure d’efficacité Dans le cas des souris induites en sous-cutanée (procédures 2 et 3), les animaux seront anesthésiés lors de l’induction qui se fait par piqure d’aiguille Nous pouvons être amenés à prélever du sang sur animal vigile au niveau submandibulaire (3 fois en 24h maximum).
Impact sur les animaux
Les possibles complications peuvent être liées au développement tumoral (perte de poids de l’animal, taille et aspect de la tumeur).
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque étude pour prélèvements post-mortem. Les organes prélevés sont ensuite envoyés aux clients pour de plus amples analyses.
Remplacement
Malgré des avancées significatives en termes de modélisations mathématiques, il n'est actuellement pas possible de prédire efficacement la biodistribution des composés. De plus, l'étude de tumeurs résulte de l’interaction de nombreux types cellulaires et ne peut pas être modélisée in vitro. Aucune autre méthode expérimentale ne serait en mesure d’apporter un niveau équivalent d’information que la procédure expérimentale impliquant l’utilisation d’animaux vivants.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en œuvre des techniques d’imagerie (bioluminescence, échographie, scanner, photoacoustique, imagerie radioisotopique, imagerie de fluorescence) qui permettent de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques sont effectués par les clients, ils utilisent en général des test ANOVA et test de comparaison multiple pour des études avec au minium 6 souris par lot. Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet est réduit au minimum sans toutefois compromettre les objectifs : sur 5 ans nous prévoyons jusqu’à 80 études qui seront réparties ainsi : - Pour la biodistribution sur souris saine (procédure 1), 40 études : 4 lots de 10 animaux = 1600 souris. - Pour la biodistribution sur souris avec tumeur sous-cutanée (procédure 2) : 20 études : 4 lots de 10 animaux = 800 souris. - Pour l’efficacité sur tumeur sous-cutanée (procédure 3) : 20 études : 4 lots de 10 animaux = 800 souris. Soit un total de 3200 animaux pour ce projet sur 5 ans. Les études étant faites sur demande des clients, nous ne serons pas amenés à utiliser systématiquement le maximum de souris par étude, le nombre d'animaux sera alors réduit en conséquence.
Raffinement
Les modalités d'imagerie mises en œuvre sont non invasives et les actes sont le plus souvent réalisés sous anesthésie, ce qui limite le stress infligé au cours de l'expérimentation. Par ailleurs, les souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des cages disposant d'un environnement enrichi et en accord avec les directives européennes. Les souris immunodéficientes présentent un phénotype dommageable mais seront hébergés en portoir ventilé et ne développeront donc pas ce phénotype. En portoir ventilé, les filtres HEPA des unités de ventilation procurent une très haute protection contre les bactéries, virus ... ainsi les souris immunodéficientes (sensibles aux infections) ne sont pas contaminées par des bactéries et virus qui entraineraient leurs décès. Les souris immunocompétentes seront également hébergées en portoir ventilé. Des grilles de scoring avec des points limites prédictifs seront mis en place et le personnel assurera l’observation des animaux quotidiennement afin d'anticiper leur souffrance.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d'utiliser des techniques d'imagerie in vivo. C'est ainsi le modèle animal de choix. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (5 à 10 semaines) car à ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. L’âge des animaux sera défini en fonction du modèle orthotopique qui sera étudié par la suite (6 semaines pour certains modèles de tumeur mammaire, 8-9 semaines sur les modèles de tumeur pulmonaire) correspondant qui sera utilisé lors d’une demande d’autorisation de projet séparée. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 659 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Une tumeur, mélanome ou cancer du côlon, leur est induite, puis elles reçoivent cinq injections d'une immunothérapie, avec suivi de la tumeur trois fois par semaine et prélèvements sanguins. Le porteur indique mettre les souris à mort quand la tumeur atteint 2 cm ou dès un point limite, parmi lesquels l'ulcération, une distension abdominale gênant les déplacements et la prostration. Il présente le recours aux modèles tumoraux murins comme "essentiel" pour reproduire un microenvironnement proche de celui de l'humain.
Objectifs
Dans notre projet, nous souhaitons éprouver l’hypothèse selon laquelle la combinaison entre un messager spécifique du système immunitaire (l’interleukine 2) et des inhibiteurs de point de contrôle (point de contrôle qui peuvent permettre à la tumeur de se protéger contre les attaques du système immunitaire) peut augmenter la formation de lymphocytes T mémoires. Afin de tester cette hypothèse, nous allons utiliser deux modèles de cancer ayant déjà prouvé leur sensibilité aux immunothérapies grâce à la stimulation de la réponse immunitaire médiée par les cellules T : le mélanome et le cancer du côlon. Ces modèles nous permettront notamment d’évaluer l’efficacité de la thérapie dans le contexte de tumeurs plus ou moins immunogéniques (cancer du côlon et mélanome respectivement). Ce programme de recherche, qui pourra s’appliquer à d’autres cytokines, permettra de mieux comprendre le rôle et le sort des lymphocytes dans l'immunité antitumorale. Enfin, il offre de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet aura un impact sur la santé humaine sur le long terme. Une meilleure compréhension des mécanismes à la base d’une réponse antitumorale durable vont permettre de développer de nouvelles stratégies immunothérapeutiques.
Procédures
Les souris recevront une injection de cellules tumorales correspondant au type de cancer étudié avec, dans le cas du modèle de mélanome une injection supplémentaire de cellules immunitaires d’intérêt. L’ensemble des souris recevra un traitement par injection (5 injections au total - une injection tous les jours pendant 5 jours, maximum 5min/intervention). L’évolution du volume tumoral sera mesuré par bioluminescence (sous anesthésie générale, 3 fois par semaine, 10min/intervention) dans le cas du mélanome ou par l’utilisation d’un pied à coulisse (sur animaux vigiles, 3 fois par semaine, 5min/intervention) dans le cas du modèle de mélanome et du cancer du côlon. Des prélèvements sanguins seront réalisés soit une fois par semaine jusqu’à la mise à mort (modèle de mélanome) ou une fois juste avant la mise à mort (modèle de cancer du côlon)(3min/intervention). La durée maximale des procédures est de 45 jours.
Impact sur les animaux
Les deux modèles utilisés peuvent entrainer des nuisances ou effets indésirables tels que l’ulcération ou l’infection de la tumeur, une distension abdominale empêchant la mobilité, une souffrance de l’animal qui se traduira notamment par une position prostrée, un manque de tonicité lors de la prise de l’animal, des yeux quasiment fermés, une perte de poil, une piloéréction ou encore une perte de poids.
Devenir
Les souris seront mises à mort lorsque la tumeur atteindra un diamètre de 2 cm ou dès l'atteinte d'un des points limites décrits pour chaque procédure.
Remplacement
L'utilisation des animaux dans cette étude est essentielle afin d'étudier le mécanisme de l'épuisement des lymphocytes T et de mieux comprendre comment la thérapie à l'interleukine-2 combinée au blocage de la protéine 1 de la mort cellulaire programmée (Programmed cell death protein 1, PD-1) permet la reprogrammation des cellules T épuisées (Tex) en cellules "memory"-like. Les modèles tumoraux murins vont nous permettre de recréer le microenvironnement tumoral complexe et ainsi d'étudier les effets de cette thérapie combinée dans des conditions semblables à celles de l'Homme.
Réduction
Afin de respecter le principe de réduction, les expériences ont été conçues afin de coordonner plusieurs paramètres d'analyse à partir d'expériences individuelles et permettent une analyse longitudinale. Cela a réduit le nombre total d'animaux requis. De plus, si les premiers résultats obtenus sont statistiquement significatifs et suffisamment homogènes, le nombre d'animaux et de répétitions d'expérimentations sera diminué. Quand cela est possible, des expériences in vitro seront réalisées afin de reproduire les données pertinentes du phénomène in vivo afin de réduire l'utilisation des animaux. Par exemple, nous n'utiliserons que quelques animaux afin de générer un grand nombre de cellules T par culture in vitro. De cette manière, l'expansion de cellules permet de disposer de suffisamment de matériel pour une analyse génomique biochimique et fonctionnelle en aval, sans avoir à utiliser un grand nombre de souris.
Raffinement
Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage dans un environnement enrichi (cocoon) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin réduire leurs stress et angoisse. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant toute procédure pouvant provoquer un stress, une angoisse ou une souffrance. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. Des points limites ont été définis avant l’expérimentation et dans le cas où ceux-ci seraient atteints, les animaux seront mis à mort selon la méthode définie. La mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.
Choix des espèces
Les cellules tumorales avec lesquelles nous travaillons sont issues de souris femelles justifiant donc l’utilisation de cette espèce et de ce sexe dans notre projet. De plus, le choix de l’âge des souris utilisées est justifié par les données déjà existantes dans la littérature relative aux modèles sur lesquels nous souhaitons travailler où les souris sont injectées entre 6 et 8 semaines d'âge avec des nombres de cellules variable des lignées correspondantes.
Etude de la régénération tissulaire chez la souris : modèle du tissu adipeux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
1 890 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'ablation chirurgicale de 40 % d'un tissu adipeux sous-cutané, suivie d'injections d'une molécule orientant la cicatrisation ou la régénération, avant prélèvement d'organes. Le porteur décrit un suivi du bien-être adapté à l'inflammation provoquée par la chirurgie. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la régénération d'un organe ne peut se faire que sur des animaux vivants, les hypothèses étant d'abord testées in vitro et in silico.
Objectifs
La réparation tissulaire d’une lésion peut conduire à l’activation de deux processus : la régénération qui correspond à la restauration de la structure du tissu et de sa fonction, ou la cicatrisation qui est caractérisée par un dépôt excessif de matrice extracellulaire(MEC) affectant l’architecture globale du tissu et sa fonction. La faculté de régénérer certains membres ou organes est retrouvée chez les vertébrés non mammifères ou chez des organismes inférieurs tels que la salamandre, le poisson zèbre ou encore le planaire. En revanche, chez les mammifères, les capacités régénératrices sont restreintes à une courte période périnatale. Cette perte de capacités régénératrices post-natales chez les mammifères adultes suggère la mise en place de mécanismes inhibant la régénération au profit des processus cicatriciels. Notre projet consiste désormais à explorer comment les propriétés mécaniques de la matrice extracellulaire contrôlent les processus de régénération chez les mammifères. Ce projet sera développé sur un modèle de lésion du tissu adipeux (lipectomie) chez la souris, puisque notre équipe a déja démontré la capacité de ce tissu à régénérer, sous certaines conditions bien maîtrisées.
Bénéfices attendus
La compréhension du mécanisme de régénération, en particulier la maîtrise de la production de MEC, pourrait permettre d’améliorer la réparation tissulaire chez le mammifère adulte, y compris l'homme, afin de rétablir les fonctions tissulaires après lésion.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une seule intervention chirurgicale permettant d'initier le modèle lésionnel. Il s'agit d'une lipectomie : résection partielle (40%) d'un seul tisu adipeux sous-cutané, réalisée en 10 minutes. Puis tous les animaux seront injectés (maximum 1 minute) avec une molécule pharmalogique afin d'orienter l'issue du modèle vers la régénération ou la cicatrisation et d'en étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires. Celles ci n’excèderont pas 200 μL par voie sous-cutanée ou par voir intra-péritonéale, et leur fréquence (1seule par jour) pourra varier selon les molécules, de J0 à J4, ou bien tous les 3 jours pendant la durée du protocole.
Impact sur les animaux
L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux sur l’état global de santé des animaux, et sera adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures, tels que l'inflammation générée par la chirurgie. Les protocoles sont réfléchis afin d’être le moins douloureux possible pour l’animal (mode et volume d’injection, durée du traitement…) et les études antérieures nous ont permis de mieux appréhender les points limites pour le bien-être des animaux.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour prélevements d'organes.
Remplacement
Même si l’étude de la régénération d’un organe ne peut se faire qu’’en utilisant des animaux vivants, de nombreuses hypothèses sont au préalable testées in vitro et in silico. Le recours à l’animal est donc restreint uniquement aux expériences indispensables.
Réduction
Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience et d’établir un protocole d’étude adapté à l’obtention de résultats fiables permettant d’atteindre l’objectif, et en évitant la répétition des groupes contrôles indispensable à la validation des résultats. D'après notre expertise le nombre minimum d'animaux pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement interprétables est de 5 animaux par groupe, et doit être répété 3 fois pour obtenir une significativité des résultats. Ce sont également les résultats des simulations dans notre modèle in silico qui nous permet de ne réaliser que les expérimentations les plus pertinentes.
Raffinement
Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un travail de raffinement continu dans le but d’aboutir à des procédures de travail définies, et avec une procédure de suivi du bien-être animal adaptée aux expériences. En effet, les animaux ne seront jamais seuls en cage afin de respecter le caractère grégaire de la souris. Nous proposons aussi d’enrichir l’environnement des souris, favorisant le bien-être de l’animal. L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux, adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures, sur l’état global de santé des animaux. Les protocoles sont réfléchis afin d’être le moins douloureux possible pour l’animal (anesthésie gazeuse, mode et volume d’injection, durée du traitement…) et les études antérieures nous ont permis de mieux appréhender les points limites pour le bien-être des animaux. La surveillance des souris sera réalisée tous les jours. Ceci permettra de proposer des soins adaptés, de sortir de l’étude, ou bien d’euthanasier les animaux en cas de comportements anormaux ou de souffrance (points limite : perte de poids, prostration, poil hirsute).
Choix des espèces
Afin d’étudier les processus de régénération, il est indispensable d’étudier les mécanismes mis en place au cours du temps, après lésion tissulaire. Notre laboratoire a montré que le fond génétique, ou bien les récepteurs aux opioïdes jouaient un rôle majeur dans la balance régénération/cicatrisation. Afin d’en étudier les effets de ces paramètres, nous disposons au laboratoire ou par l’intermédiaire de collaborations plusieurs lignées transgéniques de souris tout à fait pertinentes pour mener à bien notre étude. C’est pourquoi l’ensemble de ce projet nécessite l’utilisation de l’espèce mus musculus. Les animaux seront utilisés à l’âge de jeune adulte (de 6 à 8 semaines) afin d’utiliser des animaux à maturité sexuelle. Les procédures décrites dans ce protocole ont déjà été validées sur des animaux de cet âge et les résultats ont été publiés.
Rôle et mécanismes d’action des neurones à 26RFa dans la régulation hypothalamique de l’homéostasie glucidique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 696 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de l'absence de réveil au modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale pour injecter des vecteurs viraux ou implanter une canule, des jeûnes répétés de 6 à 16 heures et des prélèvements sanguins à la queue répétés 6 à 10 fois, pour étudier des neurones impliqués dans la régulation du sucre. Le porteur relie ces travaux au diabète et à l'obésité, dont les retombées thérapeutiques restent au conditionnel. Sur le remplacement, il indique avoir utilisé des cultures cellulaires mais affirme qu'il n'existe "pas d'alternative non-animale" pour l'étude intégrée.
Objectifs
Au cours de la dernière décennie, il a été montré que le cerveau participe à l’équilibre métabolique et au maintien de la quantité de sucre circulant dans le sang (la glycémie), de façon importante. Un défaut dans ces processus de régulation assurés par le cerveau pourrait donc jouer un rôle majeur dans l'apparition de maladies ayant un grave impact sur nos sociétés occidentales telles que l'obésité et le diabète. En effet, l'obésité est fréquemment associée au diabète de type II et leur progression significative et synchrone depuis 30 ans fait de la pandémie mondiale de "diabesity" actuellement observée, un véritable enjeu de santé publique. Néanmoins, les mécanismes de contrôle du métabolisme et de la glycémie par le cerveau sont encore très mal connus. Nous savons que certaines molécules de l’organisme permettent aux neurones du cerveau de communiquer entre eux afin d’assurer ces fonctions de contrôle. Parmi ces molécules, certaines semblent être importantes car elles sont capables de modifier la sensation de faim, notamment chez les animaux obèses, et de modifier la quantité de sucre en circulation dans le sang. Le projet décrit ici, cherche à comprendre comment les neurones du cerveau communiquent entre eux pour réguler le métabolisme et la glycémie de l’organisme.
Bénéfices attendus
Si l’on parvient à comprendre la façon dont les neurones du cerveau communiquent entre eux et régulent le métabolisme et la quantité de sucre en circulation dans l’organisme, cela permettra d’identifier les mécanismes qui ne sont plus correctement régulés chez les personnes atteintes de diabète de type 2 et d’obésité. Des pistes seront alors ouvertes pour la prise en charge thérapeutique de ces maladies et l’identification de nouveaux médicaments.
Procédures
Les animaux seront soumis à divers type d'expérimentations et de prélèvements soit en conditions vigile, soit sous anesthésie. - Afin d'activer ou d'inhiber les neurones à 26RFa ou bien administrer des composés pharmacologiques dans le Système nerveux central, les animaux subiront une chrirugie visant à injecter des vecteurs viraux dans l'hypothalamus ou à implanter une canule d'injection dans les ventricules cérébraux. - Afin de suivre la glycémie, les animaux subiront des prélèvements sanguins à l'extrémité de la queue d'un volume total de l'ordre de 40 μL par expérimentation. Les expérimentations sont répétées 6 à 10 fois avec une semaine de repos minimum entre chacune d'entre elles. Certains prélèvements sanguins sont réalisés sous anethésie. - Afin de prélever des tissus à l'issue des tests physiologiques, les animaux seront profondément anesthésiés afin de réaliser une perfusion intracardiaque de PFA 4%, fixer les tissus et prélever le cerveaux. - Pour le suivi métabolique, les animaux seont hebergés en cage de calorimétrie indirecte afin d'évaluer les paramètres métaboliques.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à divers type d'expérimentations et de prélèvements soit en conditions vigile, soit sous anesthésie. - Chirurgie stéréotaxique visant à injecter des vecteurs viraux dans hypothalamus ou à implanter une canule d'injection dans les ventricules cérébraux. Nuisances prévues : douleurs post opératoires minorées par des antalgiques. - Mise à jeun de 6 à 16h avant chaque test physiologique. Nuisances prévues : Perte de poids consécutive à la mise à jeun dont le retour à la normale sera surveillé après chaque test, une semaine de repos minimum entre chacun d'entre eux. - Incision à l’extrémité de la queue. Nuisance prévue : douleur à l’incision couverte par l’application locale d’analgésique. - Cage de calorimétrie indirecte afin d'évaluer les paramètres métaboliques. Nuisance prévue : isolement des animaux à 1 animal/cage inhérent à ce suivi, minoré par un temps de test le plus court possible et une mise à mort qui suit immédiatement le test.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèver les organes.
Remplacement
Afin de comprendre la fonction du système peptidergique 26RFa, nous avons entrepris de caractériser l’effet de ce neuropeptide sur des lignées de cellules beta-pancréatiques et neuronales en culture. Cependant, la compréhension globale du rôle physiologique de ce neuropeptide dans la communication existant entre les différents systèmes de l’organisme (i.e. communication via le système nerveux et le système hormonal dans ce cas), n’est possible que in vivo. Il n’existe pas d’alternative non-animale. Dans ce contexte, la grenouille a été précédemment utilisée afin d’identifier le 26RFa. Par la suite, les études chez les mammifères ont révélé un rôle majeur du 26RFa dans la régulation du métabolisme énergétique. Ceci en fait une piste du choix en vue d'un développement thérapeutique dans le cadre du traitement de maladies métaboliques telles que le diabète de type 2. Une telle approche physiologique n’est rendue possible que par les études, sur des organismes modèles mammifères afin de s'approcher le plus possible de la physiologie humaine.
Réduction
Compte tenu de l'approche chémogénétique innovante utilisée dans ce projet, nous ne pouvons pas, a priori, modéliser la puissance statistique des tests que nous prévoyons de mener. Aussi, nous menerons nos procédures en subdivisant les effectifs des groupes prévus par lot de 3 animaux par condition et par test. Nous incrémenterons les résultats obtenus jusqu'à un maximum par avance fixé de 12 souris par condition de traitement. Cet effectif est en effet justifié par les données disponibles dans la litterature (dont nos propres expérimentations) indiquant que la variabilité inter-individuelle des processus physiologiques étudiés est prise en compte dans des groupes de 12 souris, dans le fond C57Bl6/J. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables (test ANOVA à un ou deux facteurs selon les conditions d’expérimentation réalisées, suivis d’un test post-hoc tel que Tukey ou Bonferroni). De plus, une partie des tests physiologiques prévus pour évaluer l’homéostasie glucidique sera réalisée successivement sur une même souris et chaque souris sera son propre contrôle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d’une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précédent et de stabiliser leur poids corporel. Pour les groupes dédiés au prélèvement des explants hypothalamiques ou cérébraux, les groupes de souris pourront être réduits à 10 animaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux seront maintenus à minimum trois par cage pour éviter tout isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. La animaux devant subir plusieurs tests au cours d'une même procédure, chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d’une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précédent et de stabiliser leur poids corporel.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre de façon globale, le rôle des neurones à 26RFa/orexines dans la régulation hypothalamique de l’homéostasie glucidique et de comprendre les mécanismes d’actions de ces deux neuropeptides. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coût d’entretien réduits, fortes performances reproductives. Il s’agit d’un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques et chémogénétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude, la physiologie adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.
Validation de l’efficacité anti-tumorale de AJO14 et ses derivées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
142 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur pancréatique leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent chaque jour pendant cinq semaines une injection d'une molécule candidate, la taille de la tumeur étant mesurée deux fois par semaine. Le porteur cite parmi les signes possibles la prostration, l'ulcération de la tumeur, l'automutilation et des vocalises. Il présente le recours à la souris comme "indispensable" et justifie le choix de souris immunodéficientes par un coût réduit et des autorisations moins contraignantes que pour des espèces qu'il dit "plus évoluées".
Objectifs
Le cancer du pancréas est une tumeur maligne très grave. Asymptomatique et métastatique, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement efficace. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amené à développer de nouveaux agents pour combattre ces cancers. Dans ce contexte, des inhibiteurs contre des protéines essentielles dans les tumeurs ont été développé et se sont avérés très efficace sur plusieurs lignées cellulaires dérives des patients. Des résultats prometteurs obtenus, montrent une réduction significative du taux de prolifération cellulaire. L'efficacité de cette famille des molécules est justifiée par son affinité pour une protéine clef dans le processus de carcinogenèse pancréatique. Dans ce contexte, ce projet a l'objectifs d'évaluer si ces molécules ont un effet curatif et sont efficaces pour réduire la tumeur dans ce modèle animal en ciblant ce proteine.
Bénéfices attendus
Notre objectif est de présélectionner la meilleure molécule candidate pour poursuivre nos essais précliniques.
Procédures
Une injection de cellules tumorales (par voie sous-cutanée) sera effectuée. Lorsque le volume de la tumeur est suffisant, les animaux seront traités quotidiennement par une injection d’une solution par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 0.5 mL, aiguille de 27G pendant 5 semaines. L’intervention dure 20-30 secondes. 2 fois par semaine, la taille des tumeurs seront mesurés avec un pied à coulisse. L’intervention dure 20-30 secondes.
Impact sur les animaux
Des signes de maladie peuvent être : cyphose dorsale, prostration, diminution du poids de l’animal, volume tumoral >1,5 cm3, ulcération de la tumeur, automutilation, vocalises. Bien que nous n'avons jamais observé de lésions chez les souris dues à cette procédure, les injections répétées quotidiennenment pourraient générer des lésions cutanées. Nous tenons à souligner que ces inhibiteurs n'ont montré aucune toxicité lors d'expériences précédentes aux doses qui seront utilisées dans ce projet, en traitements quotidiens pendant un mois.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour prélever les tissus pour différents analyses.
Remplacement
Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. De nombreuses données antérieures ont été réalisées sur des cellules en culture, y compris celles provenant de patients humains. Cependant, nous avons besoin d'un modèle animal pour prouver que le composé et ses dérivés induisent un effet antitumoral dans un modèle beaucoup plus complexe proche de l'être humain. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.
Réduction
Toutefois, nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 142 individus (4 groupes de 8 souris pour chaque somposé, 8 souris control pour touts les composés, et 6 souris de plus au cas où certaines souris ne les développeraient pas) conformément à la règle de réduction.
Raffinement
Concernant le raffinement, les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage de 530cm 2 ) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation : en alternance tiges de papier, abris en carton, pelotes de lanières de papier. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. En ce qui concerne le protocole d'injection, la solution sera chauffée avant l'injection. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal: un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux (tableau de score fourni en annexe). Tout animal obtenant un score total supérieur ou égal à 7 ou un score de 3 dans une des catégories sera mis à mort.
Choix des espèces
Les souris immunodéficiences sont des modèles très répandus dans la littérature et établis depuis longtemps. Leur utilisation est simple, peu coûteuse, rapide et permet de s’affranchir d’autorisations plus complexes et restrictives concernant des espèces animales plus évoluées Les animaux seront âgées de 4 semaines au moment de leur réception afin d’obtenir des souris adultes et en pleine forme (poids supérieur à 20g) au moment de commencer l’expérimentation. En effet, nous prévoyons une période d’acclimatation de 7 jours minimum après réception avant d’inoculer les cellules en sous-cutanées puis encore 2 à 3 semaines d’attente pour obtenir une tumeur d’un volume satisfaisant. Le traitement commencera alors sur des souris âgées entre 7 et 9 semaines selon la vitesse de développement de la tumeur.
Suivi des progéniteurs cardiaques à l’aide d’outils génétiques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
536 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 508 d'entre elles tuées à l'issue et 28 mâles réutilisés pour maintenir les lignées. Les femelles gravides reçoivent une injection intrapéritonéale de doxycycline, puis sont tuées entre cinq heures et six jours après pour prélever leurs embryons. Le porteur décrit un travail sur des lignées génétiquement modifiées visant à suivre les progéniteurs cardiaques au début du développement. Il indique disposer d'un modèle in vitro de type gastruloïde mais affirme qu'il ne reproduit pas l'embryon entier, ce qui rendrait la souris "indispensable".
Objectifs
Le coeur est le premier organe à fonctionner dans l’embryon, ce qui implique la mise en place de processus développementaux complexes très tôt lors de l’embryogénèse afin de permettent la formation correcte du coeur. Les étapes précoces de l’embryogénèse sont critiques dans l’apparition des pathologies cardiaques. Les défauts de développement cardiaque suite à des anomalies congénitales touchent 1% des naissances viables. Certaines de ces anomalies sont associées à d’autres malformations qui touchent d'autres organes. Les stratégies thérapeutiques actuelles restent inefficaces face aux maladies cardiovasculaires, qui sont les premières causes de mortalité. Afin de mettre en place de nouvelles stratégies de thérapie cellulaire, il est nécessaire d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant les premières étapes du développement cardiaque, plus particulièrement le destin des progéniteurs cardiaques précoces. Le projet de recherche consiste ainsi à étudier la spécification des progéniteurs cardiaques précoces lors des étapes précoces du développement de l'embryon, à la fois in vivo en utilisant comme modèle la souris, et in vitro en utilisant des cellules souches embryonnaires comme modèle alternatif. Pour cela, le projet fera appel à des lignées de souris génétiques permettant de suivre les progéniteurs cardiaques et tous leurs descendants (cellules filles). Le but du projet, est d’étudier ainsi la contribution de sous-populations de progéniteurs cardiovasculaires vers un lignage ou des régions cardiaques particulieres.
Bénéfices attendus
Ces travaux dans leur globalité permettront d’identifier les mécanismes essentiels pour la programmation du développement cardiaque et ainsi contribueront à améliorer les techniques de thérapie cellulaire dans le cadre des pathologies cardiovasculaires.
Procédures
Le projet repose sur le suivi d'animaux de lignées nouvellement créées (sans phénotype dommageable attendu à l'état hétérozygote). Il repose également sur des procédures d'injections uniques par voie intra-péritonéale (d'un antibiotique sans conséquence pour l'animal) au cours de la gestation chez des femelles gravides. Les animaux sont ensuite mis à mort entre 5h et 6 jours après injection pour prélèvement d'embryons.
Impact sur les animaux
L’impact de l’expérimentation sur les animaux repose sur l’acte d’injection par voie intra-péritonéale de Doxycycline (antibiotique) pouvant induire stress, douleur et inconfort le temps de l’injection. Aucun effet du traitement sur le comportement ou la santé de l’animal n’a été reporté.
Devenir
A l'issu du suivi de la création de nouvelles lignées, les mâles si aucun phénotype n'est détecté seront réutilsés pour croisement avec des femelles C57Bl6 pour maintient des lignées. A l'issu de la procédure d'injection de doxycycline, les souris seront mise à mort pour prélévement.
Remplacement
Pour mimer les premières étapes du développement cardiovasculaire, nous utilisons un modèle de remplacement in vitro de type embryoïde (gastruloïde). Cependant, la morphogénèse du cœur y est incomplète et les chambres cardiaques ne sont pas établies. Ces modèles ne peuvent donc pas remplacer l'embryon entier en raison de la complexité de l’organe. Ainsi, l’expérimentation animale utilisant des souris génétiquement modifiées est indispensable pour une partie du projet dédiée à l’étude intégrée des phénomènes physiopathologiques.
Réduction
Afin de limiter ou éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal, tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions reliées à l'étude, des stratégies ont été mises en place. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal/embryon et analyserons les lignages cardiques mais également extra-cardiaques. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques couplée à notre expérience (nos investigations passées montrent que certains effets varient selon les mesures de 30 à 70%) permettent d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Des stratégies d’optimisation sont mises en place au cours du projet afin de réduire voire de supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse chez l’animal. - Modifications apportées à l'élevage afin d'améliorer le bien-être des animaux : enrichissement des cages notament lorsque les males reproducteurs sont isolés (kraft, dôme, bâtonnets à mâcher). Chaque souris injectée verra également son environnement enrichi (kraft, dôme, bâtonnets à mâcher). - La planification des procédures expérimentales (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation) diminue le stress des animaux et favorise la validité de l'expérience. - Etablir des points limites les plus précoces possibles en fonction de l'objectif de l'expérimentation.
Choix des espèces
Chez la souris, le développement et le fonctionnement physiologique du coeur sont similaires à ceux décrits chez l’Homme. Par ailleurs, les souris génétiquement modifiées représentent le modèle le plus pertinent en ce qui concerne la compréhension des maladies congénitales cardiaques. Les lignées nouvellement crées seront suivies à partir de la naissance (nouveaux nés) et après le sevrage (21 jours). Les souris gravides injectées par de la doxycycline (entre E6.5 et E7.5), seront mises à mort 5h à 6 jours après injection pour prélèvement d'embryons.
Test d’un supplément alimentaire riche en acides gras polyinsaturés oméga 3 pour prévenir les cycles courts induits par effet mâle, comme alternative à l’utilisation de progestatifs chez la chèvre : Etude d’un effet dose
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système urogénital
90 chèvres vont être utilisées, gardées vivantes et destinées à être réutilisées dans d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit une prise de sang à la jugulaire et reçoit un supplément alimentaire enrichi en oméga-3, testé à deux doses, pour induire l'ovulation sans hormones en vue de l'insémination. Le porteur indique que le supplément peut réduire l'appétit et provoquer des diarrhées, et retire l'animal de l'essai en cas de troubles. Il affirme qu'aucune alternative n'existe et situe le projet dans une stratégie d'insémination sans hormones pour l'élevage caprin.
Objectifs
L’Insémination animale (IA) a un rôle central dans le cadre de la sélection génétique. L’IA est pratiquée en élevages de petits ruminants quasi exclusivement après synchronisation hormonale des chaleurs et des ovulations. Ce traitement hormonal a également l’avantage de rendre possible la reproduction hors saison sexuelle pour pouvoir étaler la production tout au long de l’année. Or, le contexte sociétal et réglementaire de l'élevage incite fortement à la recherche de traitements alternatifs excluant l’utilisation d’hormones. Le projet vise à developper une stratégie alimentaire pour induire et synchroniser les ovulations chez les caprins en vue de la pratique de l'IA sans utilisation d'hormones.
Bénéfices attendus
Validation de la preuve de concept sur l’utilisation d’une supplémentation alimentaire avec des acides gras oméga-3 pour prévenir les cycles courts infertiles induits par effet mâle chez les caprins. Ces résultats préliminaires attendus permettront ensuite de construire un projet de plus grande envergure autour de cette stratégie alimentaire dans l’objectif de developper un protocole de supplémentation efficace et réalisable en élevages caprins. Il s’agit d’une stratégie qui permettra de remplacer le traitement progestatif associé à l’effet bouc pour la pratique de l’insémination animale sans utilisation d’hormones.
Procédures
1 seul prélèvement sanguin par individu sur animal vigile . Le prélèvement sera réalisé par ponction à la veine jugulaire . Cet acte ne dure que quelques secondes.
Impact sur les animaux
La supplémentation alimentaire, étant basée sur un apport lipidique, peut entrainer une diminution de l’apetit qui se retablira à l’arret de la supplémentation. Cet effet sera surveillé par la mesure journalière de la quantité de fourrage et du concentré non consommé par les chèvres. Le supplément lipidique de la ration pourrait eventuellement entrainer des troubles digestifs (i.e diarrhées). Le cas écheant, l’animal sortira de l’expérimentation dès l’apparition des symptômes. Si les troubles digestifs sont généralisés dans un lot, l’expérimentation sera arreté pour le lot concerné. Néanmoins, les doses du supplément alimentaire seront choisies parmi celles n’ayant pas entrainé une perte d’apétit ni des signes digestifs indésirables lors des essaies preliminaires réalisés chez la brebis, et d’après la bibliographie. Lors de la prise de sang (par ponction à la veine jugulaire), les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée, mais pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité. Cette intervention n’entraine pas d’altération de l’état général. Le poil court des chèvres permet une visualisation aisée des veines. La contention des animaux pour la prise de sang par les expérimentateurs animaliers (en binôme) est faite dans un espace réduit (entre des claies ou au parc de tri) pour faciliter la contention et en présence de congénères pour limiter le stress dû à l’isolement. La présence répétée des expérimentateurs en interaction positive en dehors des procédures (alimentation, traite, soins aux animaux) est associée à une diminution du comportement de fuite de l’animal et donc de son stress face à la contention. Une surveillance de l’état général des animaux et du site de prélèvement sera réalisée afin de traiter l’apparition éventuelle d’une inflammation (phlébite), d’un hématome voire d’une infection. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera aussi réalisée afin de detecter tous signe de dégradation.
Devenir
Les animaux expérimentaux pourront être réutilisés dans d'autres projets sous réserve d'un avis favorable du vétérinaire sanitaire de l'EU.
Remplacement
L’étude de l’effet d’une supplémentation alimentaire avec des acides gras oméga-3 sur la durée du 1er cycle ovulatoire induit par effet mâle ne peut être réalisée qu’avec l’utilisation d’animaux vivants. Aucune alternative n’existe.
Réduction
Le projet utilisera 90 chèvres au repos sexuel réparties en 3 lots de 30 individus (1 lot non-supplémenté et 2 lots supplémentés avec la dose 1 et 2). La variable à étudier sera la proportion de chèvres developpant un cycle court lors de la 1ère ovulation induite par l’effet bouc. Un calcul de puissance a été réalisé sur cette variable afin de déterminer le nombre de chèvres par lot. La fréquence de cycles courts attendue dans le lot témoin non supplémenté est de 85 % au minimum. Pour valider la preuve de concept, notre objectif est de diminuer cette fréquence à 50% (effet notable), au moins dans l’un des lots supplémentés. Avec 30 chèvres par groupe nous pourrons montrer une difference de 35% (85% vs 50%).
Raffinement
Les chèvres seront dans leurs conditions d’élevage habituelles (en groupe) dans un bâtiment d’élevage conventionnel sur litière paillé (surface de 2m carrés par tête) et feront l’objet d’une surveillance journalière pendant toute la durée du protocole. Le milieu est enrichi avec une brosse rotative par lot, des tapis (grato gratte) positionnées sur les claies pour se gratter les flancs et des disques suspendus à mordiller. Les prelevements de lait se feront manuellement sur leur poste à la salle de traite, ne nécessitant pas de contention supplémentaire. Les prélèvements de sang seront réalisés par ponction veineuse à la veine jugulaire par du personnel qualifié. La contention des chèvres pour les prélèvements sanguins se fera dans un espace réduit (entre des claies ou au parc de tri) en présence de congénères pour limiter le stress dû à l’isolement. La présence répétée des expérimentateurs en interaction positive en dehors des procédures (alimentation, soins aux animaux) est associée à une diminution du comportement de fuite de l’animal et donc de son stress face à la contention. Lors des prises de sang, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée n’entrainant pas de trouble de l’état général (pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité). Le poil court des chèvres permet une visualisation aisée des veines. Une surveillance du site de prélèvement sera réalisée afin de traiter l’apparition éventuelle d’une inflammation (phlébite), d’un hématome voire d’une infection. Le cas échéant, un baume antiseptique et cicatrisant pourra être appliqué en massage sur les veines. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera aussi réalisée. En cas de signes de maladie, un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire conseil de l’installation expérimentale ou avec son intervention si nécessaire.
Choix des espèces
La chèvre est l’espèce cible sur laquelle nous voulons valider la preuve de concept. L’étude sera réalisée avec des chèvres adultes primipares et multipares, en lactation, étant traites 2 fois par jour (matin et soir). Il s’agit du profil de chèvres adultes mises à la reproduction chaque année dans l’élevage.
Impact d’un régime hypoprotéique sur le métabolisme protéino-énergétique en cas de déficience en OTC
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales destinées à inactiver un gène intestinal, puis 48 d'entre elles subissent trois semaines de régime pauvre en protéines et un isolement de 48 heures sans enrichissement, pour étudier le rôle de la citrulline dans le métabolisme. Le porteur assume une perte de poids importante comme donnée centrale et fixe la mise à mort à -15 % en une semaine ou -40 % en trois semaines. Sur le remplacement, il affirme qu'un modèle in vivo est "indispensable" et que la souris est la seule espèce disposant du système génétique utilisé.
Objectifs
Depuis plusieurs années, l’intérêt s’est porté sur les propriétés régulatrices des acides aminés. Plus particulièrement, différents travaux ont montré que la citrulline, un acide aminé n’entrant pas dans la production des protéines, était un puissant activateur de la production des protéines musculaires. De telles propriétés pourraient être mises à profit dans la prise en charge de pathologies atteignant la fonction musculaire. En parallèle, une étude réalisée chez des rats âgés dénutris et confirmée chez l’Homme sain soumis à un régime hypoprotéique, a montré que la citrulline était capable de stimuler la synthèse protéique musculaire et d’augmenter le contenu protéique musculaire. En effet, il a été mis en évidence que l’absence de citrulline plasmatique (via l’extinction du gène de l’OTC, enzyme responsable de la production intestinale de citrulline), lors d’un régime standard, n’avait pas d’effet sur les animaux. En revanche, sous régime faible en protéines, l’absence de citrulline plasmatique entrainait une importante perte de poids chez les animaux (masse maigre et masse grasse). Ces effets n’étaient pas retrouvés chez les animaux recevant de la citrulline par voie orale. Nous cherchons donc maintenant à expliquer pourquoi la citrulline joue un rôle majeur en cas de régime hypoprotéique, et non sous régime standard, sur le métabolisme protéino-énergétique. Le but de ce projet-ci est donc de comprendre les mécanismes par lesquels la citrulline joue un rôle fondamental dans la régulation du métabolisme protéino-énergétique, sous régime hypoprotéique. De ce fait, nous avons choisi de travailler sur une lignée de souris génétiquement modifiée nous permettant d’inactiver spécifiquement la production intestinale de citrulline et d’en évaluer les conséquences sur le métabolisme protéino-énergétique. Nous évaluerons donc le métabolisme protéino-énergétique des souris sans production de citrulline intestinale sous un régime alimentaire hypoprotéique, ainsi que l’intérêt d’une supplémentation exogène en citrulline dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension du rôle de la citrulline intestinale dans le contrôle du métabolisme protéino-énergétique. Une perte de poids importante des animaux (procédure sévère) est fondamentale car elle est une indication du rôle de la citrulline endogène pour maintenir une synthèse protéique physiologique (comparable à la perte musculaire observée lors d’alitement prolongé). Il nous est donc primordial d’avoir assez de temps (3 semaines) pour étudier ce phénomène et donc de tolérer une perte de poids assez importante.
Procédures
Une partie des souris (n=16) recevra de la citrulline par voie orale (administrée dans les croquettes) pendant 7 semaines. Tous les animaux (n=80) seront injectés avec l'agent chimique inducteur de l'inactivation en intrapéritonéal (durée : 30 secondes) pendant 5 jours. Une partie des animaux (n=48) sera soumise à un régime légèrement hypoprotéique (75% des besoins) pendant 3 semaines. Tous les animaux (n=80) : hébergement isolé et sans enrichissement pendant 48h, de façon à suivre leur activité physique spontannée. Tous les animaux (n=80) : Anesthésie et analgésie par injection unique (30 secondes) suivi du prélèvement du cœur.
Impact sur les animaux
Les nuisances sur les animaux sont les suivantes : stress lié à la contrainte légère et très brève liée à la préhension des animaux pour leur pesée quotidienne, stress lié aux injections intrapéritonéales de l'agent chimique inducteur de l'inactivation (5 fois) et du mélange chimique analgésique/anesthésiant (1 fois) et stress lié à l'isolement et à l'absence d’enrichissement pendant 48h lors des mesures de l’activité locomotrice, d’où le classement en procédure modérée.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés. Le muscle et le coeur ainsi que divers tissus d'intérêt sont prélevés sur l'animal pour être conservés en vue d'analyses futures.
Remplacement
Ce projet étudie les conséquences d’une diminution de la concentration en citrulline plasmatique (via une suppression de l’OTC intestinale) sur le métabolisme protéino-énergétique. Le recours à des modèles alternatifs comme des cellules en culture n’est, dans l’état actuel des connaissances, pas possible parce que nous nous situons dans le domaine de la physiologie intégrée. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment la citrulline produite par l’intestin module l’équilibre protéino-énergétique au niveau corps entier. Dans le but d’observer des modulations phénotypiques, un modèle in vivo est indispensable. Le choix de la souris se justifie car c’est la seule espèce pour laquelle le système de recombinaison CreLox existe.
Réduction
Dans ce modèle, seuls 50% des animaux ont leur concentration plasmatique de citrulline diminuée. De façon à ne pas euthanasier les 50% de souris restantes, nous avons décidé de les utiliser comme groupe contrôle. De plus, un groupe Ctrl-HP+Cit n’a pas été ajouté car, il a été démontré que le métabolisme protéino-énergétique des souris ctrl sous régime hypoprotéique (Ctrl-HP) n’était pas modifié. Il n’y a donc pas d’intérêt à apporter de la citrulline à ce groupe d’animaux. En outre, nous prendrons le soin d’utiliser le nombre minimal d’animaux mais qui permette cependant de tirer des conclusions statistiques (utilisation de tests statistiques adaptés au plan expérimental) avec une puissance de test suffisante. Le nombre d’animaux par groupe (16 dont 8 mâles et 8 femelles) a été estimé sur la base d’études publiées et des résultats précédents obtenus dans cette étude. En effet, il a été utilisé 12 animaux/groupe pour le dosage du rapport ATP/ADP, mais, compte-tenu de la possible mise à mort des animaux avant la fin du protocole due à une perte de poids trop importante (15% en 1 semaine ou 40% en 3 semaines), 16 animaux minimum par condition expérimentale sont nécessaires pour mettre en évidence des modifications significatives du rapport ATP/ADP induites par l’invalidation du gène OTC. Enfin, les expériences ont été soigneusement planifiées (par rapport aux données bibliographiques et à nos résultats préalables) pour permettre la collecte d’un maximum d’informations à partir des individus étudiés. De plus, les organes non utilisés seront congelés pour des études complémentaires éventuelles ou des mises au point de protocoles d'analyses.
Raffinement
Ce protocole fait appel à des procédures expérimentales sévères qui n’engendrent pas de douleur chez nos animaux, mais un stress/une angoisse liée à une perte potentielle d’activité locomotrice nuisant à l’expression de leur comportement fondamental. Pour s’assurer de l’état de santé de nos animaux, nous suivrons très précisément l’état général des animaux ainsi que leur poids à raison de 2 fois par semaine tout au long du protocole, puis tous les jours à partir de la mise sous régime hypoprotéique. Ce suivi entraînera une contrainte légère et très brève liée à la préhension. S’il s’avère que l’un d’entre eux perde du poids de façon importante (-15% au cours d'une semaine ou -40% sur 3 semaines), ou soit blessé ou souffrant, il sera exclu du projet et mis à mort. Une autopsie sera réalisée pour identifier plus précisément les causes de cet état ayant justifié la mise à mort le cas échéant, de façon à optimiser nos procédures pour d'éventuelles études futures. La décision de mise à mort sera prise par un des responsables du projet et/ou la SBEA si le porteur de projet n’est pas disponible rapidement/réactif. Pendant toute la durée de l'étude, à l'exception des 48h nécessaires à la mesure de l'activité locomotrice spontanée, les animaux seront en collectivité, en cages ouvertes, permettant aux individus de sentir la présence de leurs congénères, avec un milieu enrichi par l'ajout d'objets dans les cages (tunnels, abris en carton...). Au moment de la mise à mort, les animaux seront anesthésiés et sous analgésie de façon à ne pas souffrir.
Choix des espèces
La citrulline plasmatique est exclusivement produite via l’Ornithine Transcarbamylase (OTC) au niveau de l’intestin. Afin de pouvoir moduler l’action de cette enzyme et donc la production de citrulline et son impact niveau corps entier, l’utilisation d’animaux transgéniques est indispensable. Les animaux seront injectés avec l'agent chimique inducteur de l'inactivation à l’âge de 10 semaines pour être sûr que le gène de l’OTC soit bien mis en place (inactif avant le sevrage). L’étude à proprement parler (début du régime hypoprotéique) commencera lorsqu’ils seront âgés de 14 semaines, soit 4 semaines après l’injection de tamoxifène de façon à s’assurer que l’OTC est bien inactivée.
Dynamiques cortico-ganglions de la base sous-tendant l’apprentissage de séquences
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
150 canaris vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Les mâles subissent des chirurgies intracérébrales de trois à sept heures pour y injecter des traceurs, poser des électrodes d'enregistrement ou provoquer des lésions, et sont tués pour prélèvement du cerveau, tandis que les femelles sont maintenues en vie et rendues à la colonie. Le porteur décrit un projet de recherche fondamentale sur les mécanismes cérébraux du chant, dont il rapproche l'organisation de celle du langage humain. Il affirme que l'imagerie ne permet pas la résolution nécessaire et que les enregistrements neuronaux sont impossibles chez l'humain.
Objectifs
L’organisation des signaux acoustiques (la syntaxe) est un aspect essentiel de la communication vocale animale. Les oiseaux chanteurs en particulier produisent des chants composés de suites d’éléments sonores appelés syllabes. Si chez certaines espèces, comme le diamant mandarin, les chants ont une organisation simple (linéaire) des syllabes, chez d’autres, telles le canari domestique, l’organisation des syllabes repose sur des règles complexes et notamment des dépendances à long terme (la probabilité de produire une syllabe précise peut dépendre de celles produites plusieurs secondes auparavant). Ces règles syntaxiques sont semblables à celles décrites chez les humains. Les canaris présentent par ailleurs une plasticité annuelle de leurs chants. Les canaris constituent donc un modèle idéal pour déterminer les mécanismes neuronaux de la production et de la variabilité de la syntaxe vocale. Le comportement de chant résulte d’un apprentissage sensorimoteur et met en jeu un réseau de structures cérébrales dédiées. Le contrôle neuronal de la production du chant est assuré par un ensemble de zones cérébrales "corticales" hiérarchiquement organisées et spécialisées dans le chant. Si des études ont mis en avant les mécanismes sous-tendant la variabilité acoustique des chants, ceux mis en jeu dans le contrôle de l'organisation des éléments constitutifs des chants restent méconnus. Notre objectif ici est de déterminer le réseau neuroanatomique impliqué dans le contrôle de la variabilité d'organisation des éléments du chant et d'en caractériser les propriétés neurophysiologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamentale bénéficera en premier à la communauté spécialisée dans le domaine de recherche de la neuroéthologie du chant des oiseaux. Il apportera aussi des connaissances essentielles pour mieux comprendre les potentiels déficits observés dans la parole humaine. En effet, de nombreusess études ont mis en avant les analogies du comportement de chant des oiseaux chanteurs et du langage humain. Ces analogies ont été identifiées d'un point de vue comportemental (l'acquisition du chant et du langage mettant en jeu les mêmes étapes) et neurobiologiques (analogies moléculaires et cellulaires). Par ailleurs, des lésions ou perturbations des structures cérébrales dédiées au comportement de chant induisent des déficits comportementaux semblables à ceux observés chez les humains, tels que des bégaiements ou des retards d'apprentissage. Nombre de ces déficits chez les oiseaux chanteurs rappellent les troubles de la parole observés chez les humains atteints de pathologies neurodégénératives touchant les ganglions de la base (maladie de Parkinson ou de Huntington par exemple). Enfin, les méthodologies d'étude et d'analyse déployées permettront des avancées technologiques en lien avec le traitement de grand jeu de données (big data) et pourront nourrir des projets de recherche computationnelle et de modélisation future.
Procédures
Un prélèvement sanguin (une à deux gouttes de sang) sera effectué sur tous les oiseaux, une seule fois par oiseau. Cette procédure ne dure que quelques minutes et ne nécessite pas l'anesthésie de l'oiseau. Les oiseaux seront soumis à diverses procédures chirurgicales intracérébrales. Chaque oiseau ne subira qu'un seul type d'intervention chirurgicale et qu'une seule fois. Suivant l'opération chirurgicale, effectuée sous anesthésie générale, la durée varie de 3 à 7h.
Impact sur les animaux
Ce projet impliquera de placer une partie des oiseaux utilisés pour les expériences dans des caissons d'isolation acoustique individuels afin d'enregistrer leurs vocalisations. Cette méthode est la seule permettant d'enregistrer les vocalisations des oiseaux avec la meilleure qualité possible pour mener nos études. Certains oiseaux subiront par ailleurs des chirurgies intracérébrales afin d'injecter des agents chimiques (traceurs neuronaux pour identifier les projections neuronales ou acide pour réaliser des lésions cérébrales), des électrodes d'enregistrement (pour enregistrer les activités des neurones) ou des électrodes de stimulation électrique (pour procéder à des stimulations électriques intracérébrales localisées).
Devenir
Pour l'ensemble des procédures de ce projet, tous les animaux identifiés comme femelles seront maintenus en vie et retourneront dans la colonie, ce projet ne portant que sur les mâles canaris. A l'issue des différentes procédures, tous les mâles seront euthanasiés. La collecte du cerveau à la fin de chacune de ces procédures est essentielle afin de 1/pouvoir identifier les projections entre les structures cérébrales d'intérêt, 2/ pouvoir identifier les points d'insertion des électrodes d'enregistrement ou de stimulation électrique, 3/pour caractériser l'étendue de la lésion cérébrale.
Remplacement
Le but de nos recherches est de déterminer les mécanismes neurobiologiques mis en jeu dans l’apprentissage, la production et la perception de vocalisations. Pour cela, les oiseaux constituent un remarquable modèle d’étude, leurs vocalisations présentant des points communs avec la parole humaine et un ensemble de structures cérébrales étant dédié à la perception, la production et au contrôle des vocalisations. Les technologies actuelles (IRM) ne permettent pas d'avoir un niveau de résolution suffisamment fin pour analyser l'activité de neurones à des échelles temporelles de l'ordre de la milliseconde. Mener ces expériences reposant notamment sur des enregistrements électrophysiologiques de l’activité neuronale et des stimulations intracérébrales, qui ne sont pas possibles chez le sujet humain (sauf dans certaines conditions particulières), permet d’avancer dans la compréhension des processus neurobiologiques en général et dans le comportement vocal des oiseaux en particulier.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux à utiliser et d’adapter le protocole expérimental, nous conduirons les expériences sur un seul oiseau à la fois. Cela nous permettra de traiter les éventuelles difficultés les unes après les autres. Par ailleurs, cela nous permettra de ne collecter que le nombre de données nécessaires pour obtenir suffisamment de puissance statistique. Lorsqu’un oiseau aura subi une opération chirurgicale, celui-ci sera maintenu seul dans une cage jusqu’à récupération (que nous estimons à 48h) mais de façon à ce qu’il puisse voir et entendre ses congénères. Des oiseaux stressés ou en souffrance ne vocalisant pas, ils seront contrôlés au quotidien. Un antalgique sera administré lors de l’opération chirurgicale et tant que l’oiseau montre des signes de douleur (inactivité, absence de vocalisations, posture prostrée).
Raffinement
Avant toute procédure chirugicale, les oiseaux reçoivent une administration d'un analgésique. La chirurgie s'opère sous anesthésie générale. Lorsqu’un oiseau aura subi une opération chirurgicale, celui-ci sera maintenu seul dans une cage jusqu’à récupération (que nous estimons à 48h) mais de façon à ce qu’il puisse voir et entendre ses congénères. Des oiseaux stressés ou en souffrance ne vocalisant pas, ils seront contrôlés au quotidien. Un antalgique sera administré lors de l’opération chirurgicale et tant que l’oiseau montre des signes de douleur (inactivité, absence de vocalisations, posture prostrée). Le point limite est atteint lorsqu’un oiseau montre une absence de réaction (absence d'envol lorsque l'oiseau est touché par l'expérimentateur) ou une réaction faible à l'expérimentateur (envol au touché de l’oiseau) sur 2 jours consécutifs.
Choix des espèces
Pour comprendre les processus sous-tendant le contrôle vocal, les oiseaux chanteurs constituent un modèle de choix. Ils présentent des capacités remarquables de modulation et de contrôle de leurs vocalisations. Ils possèdent un ensemble de structures cérébrales spécialisées dans ce comportement. Plusieurs parallèles avec l'apprentissage vocal chez l’humain existent (période sensible pour l'apprentissage, répertoire de gestes moteurs vocaux). Notons que si cette capacité d'apprentissage vocal est fréquente chez les oiseaux, elle est beaucoup plus rare chez les mammifères, et, en l'état actuel des connaissances, absente chez les invertébrés. Nous nous proposons d’étudier en particulier les canaris domestiques (Serinus canaria). Ces oiseaux produisent des chants variables constitués d'éléments acoustiques organisés suivant des règles de dépendance aussi identifiée dans le langage humain. Ils s’adaptent parfaitement à la vie en captivité. Enfin, le réseau de structures cérébrales mis en jeu dans leur comportement vocal est très précisément connu et décrit dans la littérature, permettant une comparaison fiable des données et une mise en perspective des résultats obtenus. Tous les animaux utilisés dans cette étude seront âgés d'au moins 100 jours. A cet âge, les canaris sont depuis longtemps sortis de leur nid et indépendant. Ils commencent à pratiquer leur chant à cet âge là, ce qui nous intéresse tout particulièrement dans cette étude.
Analyse des anomalies de cellules du cerveau dans un modèle de lésions cérébrales induites par la naissance prématurée chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Pour reproduire chez la souris les lésions cérébrales liées à la prématurité, 2 452 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à 42 ou 60 jours de vie pour le prélèvement du cerveau. Pendant leurs cinq premiers jours, des souriceaux séparés de leur mère le temps des gestes reçoivent des injections d'interleukine-1 bêta, une molécule inflammatoire qui peut entraîner déshydratation, retard de croissance, hémorragie interne et la mort dans 5 à 10 % des cas. Viennent ensuite au sevrage un traitement censé éliminer certaines cellules du cerveau, puis à 2 mois un test de mémoire par trois chocs électriques précédés d'une sonnerie, un test de choix entre un congénère inconnu et un objet, et une chirurgie sous anesthésie pour mesurer l'activité des neurones. Les souris dont le poids varie fortement ou qui montrent isolement ou agressivité sont tuées avant terme, et le porteur ajoute 10 % de souriceaux aux groupes injectés pour compenser la mortalité qu'il anticipe.
Objectifs
La prématurité est la première cause de mortalité et de handicap chez les enfants de moins de 5 ans. Un lien causal entre infection maternelle et naissance prématurée a été mis en évidence. En effet, l’inflammation systémique chez le fœtus peut entrainer une neuroinflammation et par conséquent, des lésions cérébrales connues sous le nom d’encéphalopathie du prématuré qui favorisent ensuite l’apparition de troubles du développement neurologique, en particulier les troubles du spectre autistique. Parmi les acteurs clés de la neuroinflammation, on retrouve les cellules microgliales (MG), cellules immunitaires résidentes du cerveau. La morphologie et les fonctions des MG sont altérées lors d’un stimuli inflammatoire précoce, conduisant notamment à des altérations moléculaires et comportementales (diminution du comportement social) caractéristiques des troubles du développement neurologique. Le remplacement spontané de ces cellules microgliales, après leur élimination par un traitement médicamenteux, pourrait contribuer à la correction de certaines de ces anomalies dont le rétablissement de la maturité des neurones et du comportement social. Les objectifs de cette étude sont donc d’abord de préciser les conséquences de cette inflammation précoce sur la mise en place des structures cérébrales et le comportement chez les adultes des deux sexes, et ensuite de déterminer le potentiel de ce traitement quant à la correction de ces troubles neurologiques.
Bénéfices attendus
Grâce à ce modèle souris d’inflammation précoce, nous déterminerons pour la première fois l'efficacité de l’élimination de cellules cérébrales altérées et leur remplacement pour traiter les troubles du développement neurologique. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la capacité de cette approche à être appliquée dans une stratégie médicale précise.
Procédures
Les injections réalisées sur les souriceaux d’une molécule inflammatoire connue sous interleukine-1beta (IL-1β) durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation de leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Le traitement testé sera ensuite administré dans l’alimentation au sevrage des animaux à la troisième semaine de vie et pendant 3 semaines. Les animaux seront soumis à deux tests afin d’évaluer leur mémoire et leur comportement social à 2 mois. Pour la mémoire, les animaux recevront un léger choc électrique suite à une sonnerie à 3 reprises. Deux jours plus tard, ils seront placés dans cet environnement et leur comportement de peur lors du retentissement de cette sonnerie, se traduisant par une immobilisation de l’animal, sera évalué. En termes de comportement social, les souris auront le choix d’interagir avec un nouvel animal ou avec un objet, une préférence pour l’interaction avec l’animal est attendue. L’interaction avec le nouvel animal devrait susciter l’intérêt et constituera le critère d’évaluation (reniflements, etc.). Enfin, les animaux subiront une chirurgie à 60 jours afin de mesurer l’activité neuronale dans différentes zones cerveau. Pour cela, les animaux seront endormis et un antidouleur leur sera administré. L’imagerie est ensuite effectuée. L’animal est ensuite euthanasié.
Impact sur les animaux
Pour les souriceaux durant la première semaine de vie, les injections peuvent causer une douleur transitoire et locale. Les injections induisent une inflammation, par conséquent les souriceaux peuvent présenter des signes de déshydratation, ont un retard de croissance, et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris contrôles. Ces effets perdurent environ 2 semaines. Les injections peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie interne dans l’abdomen, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Pour cette raison, l'apparition d'hémorragie sera particulièrement surveillée entre le premier et le 5e jour de vie. Bien que les injections durant les premiers jours de vie soient des gestes très rapides, ils peuvent induire un stress lié à la séparation avec la mère pendant ce laps de temps. Concernant le traitement médicamenteux pour éliminer les cellules microgliales, il sera administré pendant 3 semaines dans le régime alimentaire ou par injection pendant 5 jours selon les résultats d’une étude préliminaire. Les effets indésirables qui pourraient survenir incluent un changement de la structure du visage et du crâne. Les tests comportementaux peuvent également induire un stress chez l’animal, en particulier le test comprenant un choc à la patte. Pour cela, nous avons déterminé les durées minimales nécessaire afin d’étudier ces comportements pour minimiser la présence de nos animaux dans des environnements qui pourraient impacter leur bien-être. La chirurgie n’induira pas de nuisances, l’animal étant endormi par anesthésie et sa douleur contrôlée par un antidouleur, il est ensuite euthanasié.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt (Jour 42 et 60 après leur naissance) pour les analyses. Les prélèvements de cerveaux permettront d'étudier de manière approfondie l’inflammation cérébrale et l’efficacité du traitement pour la protection du cerveau en développement.
Remplacement
L’étude de la complexité de la réponse inflammatoire au niveau cérébral, ses conséquences et son traitement requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet avec une maintenance du milieu physiologique et des interactions entre les différentes cellules et organes à plusieurs stades de développement. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux est utilisé pour traiter des données statistiquement exploitables. De ce fait, il est nécessaire d’avoir n=10 animaux par groupe expérimental, avec 10% d’animaux supplémentaires dans les groupes recevant la molécule inflammatoire, compte-tenu de la mortalité probable due à l’inflammation. Une seule et même analyse sera dupliquée seulement en cas de variabilité. Les études de mises au point de nos techniques sont également indispensables et comptent le nombre minimum d'animaux. Les analyses requièrent des processus de préparation différentes, un seul et même prélèvement ne peut donc pas servir pour plusieurs analyses.
Raffinement
Les mères et les souriceaux sont hébergés dans des cages enrichies en essuie-tout pour qu’elles puissent y faire leur nid. Les femelles souris blanches ont d’excellentes qualités maternelles, ce qui constitue un bon choix pour minimiser le stress des souriceaux qui subiront la procédure d’injection, même si c’est un acte peu douloureux, réalisé sur animal sans nécessité d’anesthésie. Après le sevrage les animaux seront hébergés avec un maximum de 6 animaux par cage. Pendant les 5 jours d’injection, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités, et le tonus ; à distance de l’inflammation on réalisera une surveillance régulière pour détecter une fluctuation importante du poids ou des troubles du comportement (isolement, agressivité). Si l’un de ces points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. À la fin de l’étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. L’administration de l’interleukine-1β permettra d’étudier les voies impliquées dans la neuroinflammation et établir des stratégies neuroprotectrices. Cette inflammation au niveau du cerveau pendant les 5 premiers jours de vie permet de simuler une inflammation pendant la grossesse chez l’Homme. Suite à l’inflammation, les cellules altérées dans le cerveau seront éliminées par un traitement chez les souris avant l’adolescence et remplacées spontanément par des nouvelles cellules. La correction des troubles structuraux et comportementaux sera ensuite étudiée à l’âge adulte (2 mois). En plus d’une connaissance bien établie sur le développement neurologique chez la souris, les souris blanches présentent de nombreux avantages pour une étude développementale tels que le nombre de souriceaux par portée, qui permet de réduire le nombre de femelles gestantes, ainsi que les qualités maternelles de la mère.
Etude des cibles du facteur de transcription NFAT5 impliquées dans le développement métastatique des mélanomes.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent une injection de cellules de mélanome dans l'oreille, un suivi par imagerie sous anesthésie une à deux fois par semaine pendant au moins six semaines, et parfois l'ablation chirurgicale de la tumeur, pour étudier la formation des métastases. Le porteur indique que la tumeur de l'oreille occasionne une gêne et que l'apparition de métastases est invalidante. Il affirme que le comportement tumoral ne peut être appréhendé que sur un animal vivant "entier" et que seule la souris immunodéprimée permet l'implantation de cellules humaines.
Objectifs
Le mélanome cutané est une tumeur maligne issue de la transformation des cellules responsables de la couleur de la peau appelées mélanocytes. Ces dix dernières années, le développement de nouvelles thérapies a permis d’augmenter la survie des patients. Cependant, ce cancer est parmi les plus agressifs du fait de sa forte capacité à produire des métastases (cellules disséminées formant des tumeurs secondaires dans d’autres organes) qui sont responsables de la majorité des échecs thérapeutiques et de la mort des patients. Nous avons pu identifier une liste de 21 gènes cibles potentiels pouvant jouer un rôle dans l’émergence des métastases. Nous avons ensuite confirmé et validé 10 cibles grâce à des expériences in vitro et des études sur des prélèvements de patients atteints de mélanomes. Nous souhaitons maintenant confirmer nos résultats en étudiant les effets des modifications d’expression de ces cibles validées sur la formation des métastases in vivo chez la souris. Nous avons choisi le modèle souris pour ce projet car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de valider de nouvelle cible thérapeutique. Cela permet donc d’envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques pour limiter la progression tumorale chez les patients ayant un mélanome avancé (stade 2 à 4) mais n’ayant pas de métastases détectables au moment de l’exérèse de la tumeur primaire. En effet, chez la plupart de ces patients, les métastases ne sont détectables que plusieurs années après la chirurgie. Outre les retombées médicales envisageables, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de la progression tumorale des mélanomes cutanés.
Procédures
Injection en sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie locale, au niveau de l'oreille: une injection, durée 30 secondes. Séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse, durée maximale 20 min, 1 à deux fois par semaine pendant au moins 6 semaines. Procédure chirurgicale d'ablation de la tumeur au niveau de l'oreille (si la tumeur atteint une taille trop importante avant l'appartion des métastases, qui sont l'objet d'étude du projet) sous anesthésie gazeuse, une seule fois, durée maximale 30 min.
Impact sur les animaux
La tumeur située dans l'oreille de la souris peut occasionner une gêne. L'apparition de métastases est invalidante et peut entrainer des contraintes
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car ils développeront tous potentiellement des tumeurs et des métastases.
Remplacement
Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome dans les organes distants. Nous avons cependant valider nos résultats par différentes techniques in vitro avant de passer à l'in vivo. Nous utiliserons des souris immunodéficientes qui permettent l'implantation de cellules humaines.
Réduction
Nous avons pu identifier une liste de 21 cibles potentielles d'un gène pouvant jouer un rôle dans l’émergence de métastases dans le mélanome (tumeur dermatologique très agressive et très courante), grâce à des expériences in vitro et des études sur des prélèvements de patients atteints de mélanomes, nous avons reduit ce nombre à 10 . Enfin, le nombre d'animaux a été réduit au minimum et déterminé grâce à une étude statistique permettant une interprétation précise et significative des résultats obtenu ainsi qu'en regroupant les expériences: un groupe témoins pour au moins 2 groupes d'intérêt. Les techniques d'injection des cellules ont été très standardisées pour assurer la reproductivité des résultats.
Raffinement
Pour respecter les exigences de raffinement, les animaux sont observés tous les jours par les membres responsables du projet, tout comportement anormal sera évalué selon la grille de score de douleur établie et les points limites seront strictement appliqués. De plus, les animaux sont observés et pesés deux à trois fois par semaine par les expérimentateurs confirmés responsables du projet. Si une perte de poids d'environ 10% par rapport au poids initial est observé, un aliment complémentaire riche et appétent sera ajouté dans la cage. Les souris seront anesthésiées (anesthésie locale ou générale, suivant les gestes)lors des différentes procédures.. Si un signe de douleur est observé (prostration, agressivité), un analgésique sera administré et un enrichissement supplémentaire ou différent sera ajouté dans la cage.
Choix des espèces
La souris immunodéficiente sélectionnée est la seule qui permet l'implantation de tumeurs humaines de mélanome avec une efficacité de prise de 70%. Vu la population de patients, les souris seront utilisées à maturité sexuelle, adultes.