Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
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- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Evaluation de l’effet d’une supplémentation alimentaire en poudre de tomate sur le métabolisme, l’inflammation et la résistance à l’insuline dans le modèle d’obésité induite par l’alimentation chez la souris mâle et femelle.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime riche en graisse, elles reçoivent huit poudres de tomate différentes pendant douze semaines, avec prélèvements sanguins sur animal éveillé, tests de tolérance au glucose et à l'insuline, perçage des oreilles et isolements répétés. Le porteur décrit un objectif appliqué, améliorer les effets santé de la tomate en combinant choix de variétés, pratiques de culture et technologie alimentaire. Il affirme que l'étude d'une supplémentation alimentaire ne peut s'envisager que sur un modèle vivant.
Objectifs
La tomate est une des productions agricoles les plus importantes en termes de volume de production et de portée économique. Sa consommation, notamment sous forme de poudre de tomate, est associée à des effets bénéfiques pour la santé métabolique, mais son profil nutritionnel et sa teneur en micronutriments dépend du génotype et des conditions de production. L’objectif du projet est de mieux comprendre l’impact du génotype de tomate et du déficit d’irrigation sur la qualité nutritionnelle des poudres de fruit et les conséquences que cela va engendrer en terme de santé métabolique chez la souris. Pour ce faire, 4 génotypes de tomate ayant subit 2 niveaux d'irrigation et présentant des profils contrastés en phytomicronutriments seront lyophilisés (8 poudres différentes en tout) puis administrés à 180 souris C57Bl/6J (8 groupes de 9 souris mâles et 9 souris femelles supplémentés et 2 groupes de 18 souris contrôles) durant 12 semaines, dans le cadre d'un régime riche en graisse. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9eme semaine et un test de tolérance au glucose ainsi qu'un test de perméabilité intestinale à la 10eme semaine. Les fèces seront également récoltés et le microbiote des animaux sera analysé.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux évaluer l’impact du génotype et des conditions de culture de poudre de tomate sur les effets sur la santé métabolique. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les effets santé de la tomate avec une combinaison innovante du choix de génotypes, de pratiques culturales et de technologie alimentaire.
Procédures
Des prélèvements de sang sur un animal vigile seront réalisés. Pour ce faire, les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués. Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en isolement des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur glycémie. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé. Lors de la procédure, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.
Impact sur les animaux
Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères. Douleurs possibles lors des interventions de prélèvements sanguins, de perçage des oreilles pour l'identification des animaux lors des injections d'insuline. Ces nuisances ou effets indésirables toutes temporaires et réversibles sont associés à des mesures de raffinement (enrichissement de la cage, manipulation régulière des animaux, soins apportés si nécessité).
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de tomate.
Remplacement
L’étude d’une supplémentation en poudre de tomate sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.
Réduction
Le nombre d'animaux (18 par groupe, soit 9 par sexe) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes de manière sexe-dépendante, notamment en ce qui concerne la prise de poids. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé sur la base d’une étude similaire sexe-dépendante et déterminée avec la variation du poids (variable quantitative) comme résultat principal de l’étude.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt.
Choix des espèces
Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.
Comprendre et cibler l’épitranscriptome de l’îlot pancréatique pour restaurer la sécrétion d’insuline dans le diabète de type 2.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Elles subissent des injections intrapéritonéales de glucose et d'insuline, des gavages, un séjour en cage métabolique et des injections répétées de deux inhibiteurs, le brequinar et le bisantrène, pour étudier une enzyme liée à la sécrétion d'insuline dans le diabète de type 2. Le porteur indique que ces molécules sont cytotoxiques in vitro et qu'elles ont provoqué chez l'humain des effets toxiques sur le sang et le foie, les souris étant surveillées et euthanasiées si elles perdent 20 % de leur poids. Il conclut que les lignées cellulaires ne permettent pas d'étudier la communication entre organes, ce qui justifierait le modèle in vivo.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer, in vivo, le rôle de la déméthylase FTO dans la fonction et l’identité des cellules bêta au sein des îlots pancréatiques mais égalment dans d'autres organes métaboliques. Pour cela nous injecterons dans différents modèles de souris des inhibiteurs pharmacologiques de cette enzyme, le bisantrene et le brequinar puis nous étudierons leurs différents effets au niveau transcriptionnel et métabolique. Des modèles génétiques d'invalidation du gène codant l'enzyme seront également utilisés pour les différents tissus (cellules bêta et alpha pancréatiques, foie, tissus adipeux)
Bénéfices attendus
Des données préliminaires réalisées au sein du laboratoire sur des lignées cellulaires bêta pancréatiques montrent que l’inhibition de la déméthylase FTO (par siRNA ou inhibiteurs pharmacologiques) améliore l’expression des gènes de l’identité et de la fonction de la cellule bêta pancréatique, associé à une augmentation de la sécrétion d’insuline. Ainsi les résultats obtenus au cours du projet pourraient nous permettre d’identifier in vivo de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de conserver la masse des cellules bêta pancréatiques et/ou d'améliorer la sécrétion d’insuline au cours du diabète de type 2.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - une prise de poids régulière 2 fois par semaines au maximum. - suivi en cage métabolique (durée 1 semaine) - des injections intrapéritonéales de glucose, pyruvate ou insuline (6 fois pour chaque individu, en cours et fin de protocoles, chaque expérimentations étant espacées d'une semaine minimum, durée 4 heures) - des gavages de glucose (3 fois pour chaque individu, en cours et fin de protocoles, durée 4 heures) - des injections intrapéritonéales de molécule pharmacologiques (1 fois par jour pour chaque individu, pendant 5 à 20 jours, durée 1 heures), avec changement de site d'injection entre chaque injection
Impact sur les animaux
Les différents protocole pourront engendrer un stress chez les animaux suite aux diverses manipulations ainsi que des douleurs légères. Seuls l'effet du brequinar et du bisantrene, encore peu connu chez la souris, est susceptible d'induire des douleurs modérée chez les animaux et/ou des variations de comportements. Toutefois des études in vitro montrent que ces inhibiteurs peuvent être cytotoxiques. Chez l’Homme des essais cliniques pour le traitement de la leucémie ont également montré des effets hématotoxiques et hépatoxiques temporaires. Pour pallier à toutes ces nuisances, les animaux seront manipulés dans des pièces dédiées et calmes, avec une surveillance quotidienne pour détecter le moindre signe de souffrance (blessure, posture ou comportements anormaux, perte de poids importante, etc).
Devenir
Les animaux utilisés étant génétiquement modifiés, aucun des animaux utilisés en fin de protocoles sera maintenu en vie. Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude.
Remplacement
Des expérimentations in vitro, réalisées sur des lignées cellulaires de cellules bêta pancréatiques murines, montrent des résultats très encourageants quand au rôle de la déméthylase FTO et de ses inhibiteurs dans la régulation de l'homéostasie du glucose. Toutefois les modèles de lignées cellulaires sont limités et ne permettent pas d'étudier la communication inter-organe qui peut avoir lieu au cours de la régulation de l'homéostasie du glucose et du diabète de type 2. Ainsi l'utilisation de modèles in vivo, par l'utilisation de souris génétiquement modifiées, et/ou soumises à un régime riche en graisse, permet de reproduire les conditions physiologiques et physiopathologiques afin de mieux comprendre le rôle de la déméthylase FTO dans le développement du diabète de type 2 ou d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Pour définir statistiquement le nombre d'animaux nécessaires, nous avons utilisé une méthode statistique pour réduire au minimum le nombre d'animaux, permettant ainsi de déterminer le nombre exact d'animaux par expérimentation en fonction des paramètres recherchés.
Raffinement
Un suivi quotidien et une observation des animaux sont réalisés par les membres de l'équipe de l'animalerie dans laquelle les animaux sont hébergés. Les membres de l'équipe travaillant sur ce projet suivent également les animaux afin de garantir leur bien-être et minimiser au maximum leurs éventuelles souffrances. L'état général des animaux est évalué tous les jours par des observations quotidennes et pesées hebdomadaires. L’état général des animaux sera évalué par les utilisateurs ainsi le personnel animalier. Les points limites déterminés pour nos protocoles sont : le dos vouté, le poil hérissé, une perte de poids de 20% et la prostration ou l’absence de réaction des animaux. Dans ce cas l’animal sera enregistré au SBEA. Un traitement visant à soulager l’animal pourra être mis en place, le cas échant sans amélioration, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris reste le meilleur modèle permettant d’étudier l’importance d’un gène dans le développement de maladies et d’identifier de nouveaux traitements potentiels. Pour ce projet, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement déficientes pour le récepteur de la leptine (souris Db/Db), qui reproduisent la physiopathologie du diabète de type 2 ainsi que les souris contrôles correspondantes. Des souris C57Bl6J soumises à un régime standard ou riche en graisse seront également utilisées dans ce même but. Des souris invalidées dans les cellules alpha ou bêta pancréatiques et dans d'autres tissus pour le gène codant la déméthylase FTO pourront également être utilisées au cours du projet afin de mieux comprendre le rôle de Fto dans les différents organes métaboliques (MipCre Fto-Flox, RipCre Fto-Flox ; GcgCre Fto-Flox ; AdipoQCre Fto-Flox ; AlbCre Fto-Flox). Ces modèles de souris seront associés aux souris contrôles respectives. Les souris C57Bl6/J ou invalidées pour FTO seront utilisées à partir de 5 semaines de développement afin de mettre en place un régime alimentaire riche en graisse de 12 à 24 semaines et induire un phénotype diabétique. Des souris Db/Db de 8 et 16 semaines seront également utilisés pour les injections d'inhibiteurs de FTO (bisantrene ou brequinar). Les souris de 8 semaines permettront d'étudier les effets de l'inhibition de FTO dans des cellules bêta fonctionnelles. Les souris de 16 semaines permettront également d'étudier les effets de l'inhibition de FTO mais dans des cellules bêta ayant une fonction altérée.
Etude du rôle de deux gènes dans le développement du mélanome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales et développent une tumeur au flanc, pour étudier le rôle de deux gènes dans le mélanome. Le porteur indique une mise à mort au plus tard 28 jours après l'injection, ou avant si un point limite est atteint. Il n'utilise que des mâles, ses lignées de mélanome ne se développant pas chez les femelles, et présente la souris comme le modèle le plus proche de la maladie humaine.
Objectifs
Le mélanome malin cutané est la forme la plus agressive des cancers de la peau. Aujourd'hui, le seul traitement efficace reste la chirurgie pratiquée à un stade précoce car une fois disséminées, les cellules de mélanome deviennent résistantes aux chimiothérapies conventionnelles. Les espoirs apportés par l'essor des thérapies ciblées et de l’immunothérapies ont été fortement nuancés par des cas de non-réponse ou rechutes rapides. Il est donc aujourd'hui crucial de comprendre les mécanismes de résistance mis en place par ces cellules cancéreuses. La capacité des cellules tumorales à s’adapter aux traitements anti-cancéreux, est régulée par un ensemble de gènes. Nous avons identifié deux gènes fréquemment altérés dans le mélanome et impliqués dans la capacité d’adaptation de ces cellules. Ce projet a pour but de décrypter l'impact de ces 2 gènes sur le développement des cellules de mélanome chez la souris.
Bénéfices attendus
Malgré l’essor récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie dans le traitement du mélanome, la plupart des patients rechutent avec un mélanome résistant. Identifier de nouveaux acteurs impliqués dans la résistance permettra de mieux comprendre la capacité d’adaptation des cellules de mélanome et de développer de nouvelles approches de combinaison thérapeutique
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection unique en sous-cutanée de cellules tumorales. Ils seront aussi soumis à de la contention.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont l'apparition de tumeur localisée sur le flanc arrière droit. La contention va également leur générer du stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car les souris ne rentreront pas dans un nouveau protocole. Les animaux ayant reçu une injection de lignées tumorales en procédure 2 seront mises à mort au maximum 28 jours après injection, si aucun point limite n'est atteint avant cette date.
Remplacement
Nous avons étudié les effets de la dérégulation de 2 gènes in vitro dans des lignées cellulaires de mélanome. Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier le développement tumoral dans un environnement complexe. En parallèle des analyses complémentaires seront réalisées in vitro dans des lignées de mélanome, et sur des prélèvements tumoraux de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Réduction
Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet (n=272) a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Pour chacune des procédures expérimentales présentées, le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats adaptée selon le cas. De plus, un animal permettra d’obtenir des résultats dans plusieurs expériences (pousse tumorale, analyse histologique de la tumeur). Aussi, en accord avec une autre équipe utilisant la souris génétiquement modifiée étudiée, nous récupèrerons des mâles qui seront déduits du nombre total déclarés dans cette DAP. En échange, nous donnerons des femelles qui permettront également de réduire le nombre de souris de la DAP de l'autre équipe.
Raffinement
Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine. L'environnement sera enrichi avec du coton cardé et des maisonettes. Aussi, le phénotype dommageable des souris ne s'exprime pas dans les conditions ventilées de l'animalerie dans laquelle elles sont hébergées
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études du mélanome car c'est un modèle proche de la pathologie humaine reproduisant les caractéristiques histologiques. Nous disposons également d'outils, d'expériences et de compétences solides pour réaliser cette étude dans les meilleures conditions chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, âge standard pour l'étude du système immunitaire. Nous utiliserons également que des souris mâles, car nous avons remarqué dans des précédentes études que nos lignées de mélanome ne poussaient pas toutes chez des souris femelles. A l'inverse, aucun problème n'était observé chez les mâles.
Caractérisation des rôles d’une famille de protéines membranaires dans la fonctionnalité du système immunitaire et dans le cancer chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Selon les groupes, elles reçoivent des injections, une infection par deux virus ou une greffe de cellules tumorales, avant un prélèvement d'organes. Le porteur indique que l'infection virale peut entraîner fièvre, forte perte de poids et mortalité accrue, et que les tumeurs pulmonaires peuvent provoquer des difficultés respiratoires. Il conclut qu'aucune alternative n'existe pour étudier le rôle de ces protéines membranaires dans le système immunitaire et le cancer, et compare souris sauvages et souris génétiquement modifiées.
Objectifs
Certaines protéines cellulaires sont capables de se lier aux membranes cellulaires et de modifier leur comportement, influençant ainsi un large nombre de fonctions de la cellule. Parmi elles, certaines protéines lient les membranes et interfèrent avec la fusion entre membranes cellulaires et virales. Si cette action protège la cellule de l’infection virale, elle l’expose potentiellement à des disfonctionnements, car la façon dont les membranes se comportent en demeure changée. En utilisant un modèle souris dans lequel les gènes codants pour ces protéines membranaires sont non fonctionnels et qui présente un phénotype non-dommageable pour l’animal, le but du projet est de déterminer si des tels protéines membranaires peuvent modifier le développement du système immunitaire après infection virale ou en réponse à des immunogènes modèles (protéines qui stimulent le système immunitaire), et si elles peuvent influencer le développement des tumeurs chez la souris.
Bénéfices attendus
L’identification de mécanismes d’action des protéines membranaires permettra dans le court terme d’avancer dans les connaissances sur les fonctions de ces protéines et dans le long terme, de les transposer à l’homme pour une meilleur compréhension du système immunitaire, ainsi que du processus de développement du cancer.
Procédures
Procédure 1. Les animaux seront soumis à une seule injection sur animal vigile (1 fois, 20 secondes, 60 souris). Procédure 2. Les animaux seront soumis à une injection sur animal vigile. Dans le groupe A, les animaux recevront 1 seule injection (20 secondes, 90 souris). Dans le groupe B, les animaux recevront 2 injections (à J0 et J28 ; de 20 secondes chacune, 90 souris). Procédure 3. Les animaux seront soumis à une infection sous anesthésie générale par deux virus donnant lieu à une infection aigue ou chronique (1 fois, 1 minute, 300 souris au total). Procédure 4. Les animaux seront soumis à une injection sous anesthésie générale de cellules tumorales (1 fois, 1 minute, 240 au total).
Impact sur les animaux
Procédures 1 et 2. L’acte d’injection peut provoquer une gêne potentielle au site d’injection, mais pas d’autres effets indésirables prévus. Procédure 3. L’infection virale peut conduire à une mortalité accrue, à de la fièvre, à une perte de poids importante ainsi qu’à modifications d’activité/comportement. Procédure 4. La croissance des cellules tumorales dans les poumons peut provoquer difficultés respiratoires et mortalité accrue.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement d’organes afin d’analyser de manière exhaustive le développement du système immunitaire et de la tumeur chez l’animal
Remplacement
A ce jour, le seul modèle alternatif à l’utilisation d’animaux pour l’étude des protéines membranaires est représenté par de modèles de culture cellulaire in vitro. Si ce modèle a permis d’affiner un certain nombre de questions sur les fonctions de ces protéines dans la cellule (et de ce fait de restreindre le nombre d’animaux pour répondre à une série bien plus ciblée de questions biologiques), l’approche ex vivo ne permet pas de comprendre le rôle de ces protéines dans le fonctionnement du système immunitaire et dans le cancer. Pour répondre à ce type de question biologique le nombre d'acteurs cellulaires et moléculaires mis en jeu est trop important et leurs interactions trop complexes pour pouvoir être modélisés par des approches ex vivo. Aucune alternative existe donc à l’utilisation d’animaux pour atteindre les objectifs spécifiques de ce projet et de ce fait le projet n’envisage pas l’usage d’alternatives animales en remplacement partiel et/ou complet. Ainsi, la comparaison entre modèles de souris sauvages et souris dont les protéines membranaires sont non fonctionnelles constitue le modèle biologique plus pertinent pour explorer leurs fonctions.
Réduction
Une étude bibliographique approfondi a permit d’identifier les doses optimales de produits et de virus, ainsi que les points d’analyses plus pertinents pour répondre aux questions scientifiques de chaque partie du projet. Cela a permis de réduire le nombre d’animaux à utiliser au maximum.
Raffinement
Les animaux resteront en groupes sociaux afin de limiter le stress lié à l'isolement et des points limites prédictifs et précoces seront mis en place pour préserver le bien-être animal. Afin de réduire le stress et la douleur de l’animal, les gestes d’injection plus invasifs seront faits après anesthésie général. Après chaque intervention sur l’animal, son état général, son poids, sa température et son comportement seront surveillé le lendemain de l’intervention et puis de façon régulière.
Choix des espèces
Malgré l'existence de différences entre les souris et les hommes, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. De plus, la richesse des outils et des réactifs disponibles chez la souris permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant pour le projet. Des souris âgées de 8-12 semaines seront utilisées pour les expérimentations. A cet âge, les souris ont un système immunitaire mature.
Création d’une lignée de hamsters Syriens (Mesocricetus auratus) génétiquement modifiés par électroporation in vivo du système CRISPRCas9
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
7 750 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, la quasi-totalité tuée à l'issue et 21 femelles réutilisées. Jusqu'à 950 femelles subissent une superovulation par injections hormonales, un accouplement puis une chirurgie de 30 minutes pour modifier génétiquement les embryons par CRISPR-Cas9, et les petits nés reçoivent une biopsie de l'oreille et un tatouage. Le porteur indique que les petits ne portant pas la modification ciblée sont tués, faute de pouvoir vérifier l'ensemble de leur génome. Il présente ce nouveau modèle comme un moyen d'étudier la reproduction saisonnière et rattache les bénéfices humains, sur la fertilité, à une perspective lointaine.
Objectifs
Le hamster Syrien est un modèle de rongeur saisonnier très bien caractérisé avec une activité de reproduction contrôlée par la photopériode (durée du jour sur 24h). Nous souhaitons développer des modèles de hamster génétiquement modifiés permettant une étude approfondie de la fonction de certains peptides impliqués dans la régulation saisonnière de la reproduction. Depuis longtemps on sait que les variations annuelles de la sécrétion nocturne de mélatonine permettent une représentation centrale des saisons. Au cours des dernières années plusieurs équipes ont montré que la mélatonine, via des récepteurs spécifiques exprimés dans le cerveau contrôle la production de thyréostimuline (TSH) qui régule la production d’hormones thyroïdiennes dans le cerveau. Ces hormones thyroïdiennes agiraient ensuite notamment sur l’expression d'un peptide spécifique pour moduler l’activité de l’axe reproducteur. Cette voie moléculaire sous le contrôle de la mélatonine reste néanmoins hypothétique. Les études de cette voie se limitent à des études uniquement pharmacologiques par manque de modèles de rongeurs saisonniers génétiquement modifiés. Nous souhaitons donc développer ces modèles de hamster génétiquement modifiés permettant une étude approfondie de la fonction de ce peptide régulateur dans la régulation saisonnière de la reproduction.
Bénéfices attendus
Le premier bénéfice de ce projet est de faire avancer les connaissances sur l'implication des peptides RFAmides dans la régulation saisonnière de la reproduction sur un modèle pertinent. Par ailleurs, de plus en plus d’études montrent l’importance des variations saisonnières sur la régulation des fonctions physiologiques et notamment de la fonction de reproduction chez l’humain avec notamment des variations saisonnières de fertilité, de l'activité gonadique et de l'hypophyse qui contrôle l'activité des gonades (Meyer, 2016 ; Castro Dopico, 2015 ; Rojansky, 1992). Ces variations saisonnières seraient tout comme chez le hamster doré sous contrôle de la mélatonine, dont la durée de sécrétion nocturne varie en fonction des saisons qui sont elles-mêmes encodées notamment par une variation de la durée de la phase lumineuse/24j. L’étude de l’intégration de ces facteurs saisonniers dans le système nerveux constitue donc un premier pas vers une meilleure connaissance des mécanismes par lesquels l’humain est affecté par les variations annuelles de la lumière.
Procédures
950 femelles au maximum subiront un protocole de superovulation par injection de deux hormones à 3 jours d'intervalles. Chaque injection dure 30 secondes. Chaque femelle superovulée sera accouplée une nuit avec un mâle reproducteur. Chaque femelle sera le lendemain soumise à une contention (animal vigile) pour vérifier la présence d'un bouchon vaginal signe de copulation et donc de fécondation. Les femelles bouchonnées seront soumises à une chirurgie sous anesthésie/analgésie d'une durée égale à 30 minutes. Les petits génétiquement modifiés seront soumis à une biopsie d'oreille et un tatouage des doigts (durée 5 minutes).
Impact sur les animaux
Chirurgie : perte de masse moyenne de 8 à 10% maximum , douleur modérée, inflammation, agrafes arrachées. On ne peut totalement exclure un risque infectieux et inflammatoire. Piqure ip superovulation : 2 à 3j d’intervalle alternance coté injection : saignement si piqure dans un organe, risque d’inflammation. Accouplement : agressivité de la part de la femelle envers le mâle conduisant à des blessures si pas dans la bonne phase du cycle (oestrus) Electroporation : réduction possible du nombre de petits par résorption fœtale ou par mort in utéro des embryons . Identification tatouage et biopsie d'oreille : douleur aigue transitoire. On ne peut exclure une inflammation et un saignement consécutifs à la piqûre du doigt et au prélèvement du fragment d'oreille. Stress transitoire lié à l'isolement des femelles suite à la chirurgie.
Devenir
Les femelles superovulées non accouplées seront réutilisées dans d'autres projets chaque fois que cela sera possible. Les femelles gestantes seront gardées en vie pour suivre la gestation et la mise bas. Néanmoins nous ne pouvons en estimer à priori le nombre car cela dépendra du fait qu'elles soient ou non en pleine ovulation lors de la mise en accouplement avec le mâle. Les petits présentant la modification ciblée seront quant à eux conservés pour être utilisés dans des projets. Les autres seront mis à mort car il est impossible de vérifier tout le génome de ces animaux pour vérifier si la procédure a pu induire une modification génétique ailleurs que sur le gène cible.
Remplacement
Nous travaillons à la génération d’un nouveau modèle animal adapté à la recherche sur la régulation saisonnière de l’activité de reproduction qui est un mécanisme complexe faisant intervenir plusieurs structures nerveuses et endocrines (hypothalamus, hypophyse, gonades); aussi est-il impossible de réaliser une telle étude sur des organes isolés ou de reproduire l’axe gonadotrope dans sa complexité dans un modèle in silico.
Réduction
Ce projet a pour objectif la mise au point et la validation d’une nouvelle approche de transgénèse sur une nouvelle espèce : le hamster doré.Le nombre d'animaux néc essaires aux mises au point de la méthode et ensuite à la production d'animaux nécessaires à l'établissement d'une colonie ont été estimé empiriquement sur la base des connaissances que nous avons du modèle animal , de la littérature disponible sur le rat et la souris et d'échanges avec des scientifiques qui utilisent la méthode du I-GONAD . Avec cette aproche il n'est actuellement pas possible d’estimer le nombre d’animaux qui seront génétiquement modifiés sur l'ensemble des petits nés ni s'ils seront aptes à se reproduire. En fonction du sexe et de l’espèce le peptide cible influe différemment sur la reproduction des animaux. Néanmoins, pour la durée du projet, nous estimons donc que nous aurons au maximum à utiliser 750 femelles pour la production d’animaux génétiquement modifiés et 100 femelles maximum pour la mise au point complète de l'approche méthodologique sur l'espèce. Dès validation de la méthode et dès que nous aurons le nombre d’animaux des deux sexes suffisant pour lancer une colonie, les expériences seront interrompues. Aucune analyse statistique ne sera réalisée au cours de ce projet. L’approche choisie diminue drastiquement le nombre d’animaux utilisés puisqu'il ne sera plus nécessaire de produire des mâles vasectomisés pour obtenir ensuite les femelles pseudo-gestantes indispensables au transfert d’embryons en transgénèse classique. Chaque fois que cela sera possible nous proposerons à la réutilisation dans d'autres projets les femelles superovulées mais non accouplées que nous ne pourront donc pas utiliser.
Raffinement
Hébergement: 1 animal/cage après chirurgie pour suivi et traçabilité des mises-bas et suivi des petits. Cage enrichie avec un barreau à ronger et matériel de nidation. Contact maintenu entres congénères grâce aux cages transparentes ouvertes. La chirurgie nécessaire pour l’électroporation in oviducte sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie profonde. La température corporelle des animaux est maintenue pendant toute la durée de la chirurgie par un tapis chauffant thermostaté couplé à une sonde rectale puis les animaux sont replacés dans leur cage respective qui sont également maintenues sur tapis chauffants thermostatés ou lampe chauffante jusqu’à leur complet réveil. Les animaux recevront un traitement analgésique post-opératoire pendant 3 jours et seront suivis quotidiennement pendant la semaine suivant la chirurgie et leur état de santé sera évalué grâce à une grille de score avec examen de la locomotion spontanée, provoquée, poids, état général, état de la plaie). Si une souffrance est détectée chez l'animal, l’avis du vétérinaire de l’EU sera demandé et le traitement requis mis en place ou mise à mort (analgésie ou mise à mort). De plus, des poinst limites ont été préalablement établis permettant de limiter la souffrance animale en interrompant chaque fois que nécessaire la procédure.
Choix des espèces
Le rat et la souris ne sont pas des modèles adaptés à l’étude des rythmes saisonnier pour laquelle le hamster est le modèle de rongeur le plus utilisé. De plus, la technique de transgénèse par CRISPR Cas9 a déjà été réalisée avec succès sur le hamster Syrien et le génome est entièrement séquencé ce qui donne accès à la séquence du gène cible Nous utiliserons des animaux adultes pleinement sexuellement mâtures donc à partir de 10 semaines.
Etude du rôle d’une protéine dans la progression de l’ostéosarcome et la restauration du sytème immunitaire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales à la patte, jusqu'à treize séances d'imagerie sous anesthésie et des injections répétées de molécules, pour tester des candidats médicaments contre l'ostéosarcome de l'enfant. Le porteur affirme que le développement tumoral ne génère pas de douleur apparente, tout en prévoyant une surveillance trois fois par semaine et des points limites précoces. Les retombées cliniques annoncées restent renvoyées à un futur transfert vers la clinique, l'objectif immédiat étant de valider l'effet antitumoral chez la souris.
Objectifs
Dans les cancers pédiatriques, l’ostéosarcome (OS) est un cancer rare qui touche 3.4 cas par million d’habitants/an. Ces tumeurs d’origine osseuse se développent dans diverses localisations comme au niveau des os long (tibia, fémur), épaule ou encore au niveau de la mâchoire. La survie à 5 ans des patients est d’environ 75% alors qu’elle est inférieure à 27% chez les patients dont la maladie s’est propagée à d’autres parties du corps (métastases). Malgré les avancées de la médecine personnalisée, il n’y a eu que de faibles progrès dans le traitement de cette maladie. De nouvelles molécules ciblant les cellules immunitaires ont été identifiées, dont leur rôle va être de rétablir le système immunitaire afin de combattre la tumeur. Il faut donc démontrer que ces molécules possèdent des caractéristiques de candidats médicaments antitumoraux et anti-métastatiques. Ceci permettrait d’améliorer la prise en charge médicale de l’ostéosarcome chez l’enfant, les adolescents et jeunes adultes. L’objectif de ce projet est de confirmer chez la souris l’efficacité antitumorale de ces molécules c’est-à-dire que le traitement induit une diminution du volume de ces tumeurs primaires et de l’étendue des métastases.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules candidats médicaments dans le traitement d’un type de cancers pédiatriques (ostéosarcome) en vue d’un transfert technologique vers la clinique.
Procédures
Analgésique pré implantation : 1x lors de la greffe au niveau de la patte gauche avant l'anesthésie. Anesthésie : 1x au moment de la greffe au niveau de la patte (Durée : 5 min maxi) 13x max (entre 5 et 13 selon la procédure) pour l'imagerie lumineuse (Durée : 8 min maxi par point d’acquisition soit 1x/semaine). Traitement : 2 jours/7 pendant 5 semaines maximum ou 3jours/7 injection des molécules pendant 3 semaines maximum. Évaluation de l’efficacité des composés et prise de greffe par imagerie lumineuse sous anesthésie (1x/semaine) et par mesure au pied à coulisse de l’épaisseur des pattes (2x/semaine) pendant 90 jours maximum (de 35 à 90 jours selon les procédures)
Impact sur les animaux
La toxicité des molécules a été évaluée précédemment et n’a pas montré de toxicité aux doses que nous allons utiliser. La greffe de cellules tumorales ne génère pas de douleur, de plus quand cela est compatible l'animal est anesthésié et reçoit un antalgique. Le développement tumoral ne génère pas de signes de douleur apparente, ni de problème de locomotion. Par conséquent, les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux. Toutefois les animaux sont surveillés 3x/semaine pour prévenir et détecter tout mal être animal. Lors du traitement pharmacologique, un cadran sera défini et les zones d'injection seront alternées (gauche-droite-haut-bas) pour le bien-être animal. Ce protocole d'administration a déjà été mis en œuvre et il n'a pas été observé de souffrance particulière. Le développement de métastases pourrait entrainer une difficulté respiratoire, des douleurs abdominales à la palpation (foie), un envahissement de plusieurs organes altérant leur fonction qui seront détectés par imagerie (1x/semaine).
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort.
Remplacement
Pour le remplacement, les traitements à évaluer ont déjà démontré des résultats prometteurs in vitro sur de nombreux tests comme des évaluations à partir de cellules de sang humain frais ou de tumeurs isolées de patients. Les modèles tumoraux chez la souris nous permettent de valider l’effet thérapeutique de nos traitements à l’échelle d’un organisme, ainsi que d’évaluer leur potentiel effet toxique avant d’envisager un essai clinique.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les composés d'intérêts et de déterminer les doses maximales tolérées. De plus, pour chaque modèle tumoral orthotopique, la progression de la tumeur sera suivie par imagerie par bioluminescence. Cette approche non invasive et quantitative nous permet de suivre la progression de la maladie et de décider de la mise à mort des souris avant même l’apparition de symptôme critique. D’après les données de la littérature, on estime que le taux de prise de greffe sera de 90%. Cette donnée a été prise en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet.
Raffinement
Nous avons généré une lignée cellulaire qui émet de la lumière afin de pouvoir suivre la progression tumorale et/ou la dissémination métastatique au cours du temps sur le même animal sans avoir recours à sa mise à mort dans un but de raffinement. Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupe de 5 souris par cage. Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures présentées ci-après. L'administration d'analgésique/anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe au niveau de la patte, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. De plus, post-mortem différents organes seront prélevés pour des analyses complémentaires.
Choix des espèces
L’utilisation des souris a un âge un peu plus précoce, nous permettra d’avoir une meilleure reproduction du système immunitaire et des hormones retrouvés chez les patients pédiatriques. Nous avons déjà démontré qu’à des âges plus précoce la prise de greffe reste fiable et donne de résultats clairs afin d’analyser l’efficacité de nouveaux traitements. De plus l’utilisation de souris nous permettra de réellement étudier le rôle de notre protéine d’intérêt dans le développement tumoral. Nous avons également l’avantage de posséder des souris génétiquement modifiées rendant possible l’utilisation d’un anticorps humain permettant alors un rapprochement entre le pré-clinique et clinique plus robuste.
Régulation de l’évitement comportemental dans l’hippocampe
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
704 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont quatre cents dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et trois cents en gravité modérée. Génétiquement modifiées, elles reçoivent des injections, une à deux chirurgies stéréotaxiques du cerveau et un test d'évitement de place répété cinq jours, avant mise à mort pour analyse des organes. L'objet est fondamental, identifier les circuits de l'hippocampe qui commandent l'évitement, le porteur reliant ce comportement au stress post-traumatique et espérant à terme des cibles thérapeutiques. Il affirme qu'il est "impossible de remplacer l'animal vivant" pour étudier ce comportement.
Objectifs
Ce projet a pour objectif général d’identifier les circuits neuronaux impliqués dans l’évitement de place chez la souris. Ce projet se focalisera sur les neurones de l’hippocampe qui jouent un rôle clef dans la navigation spatiale et les comportements de défense. Or, aucune étude à ce jour n’a cherché à comprendre comment l’hippocampe contrôle l’évitement de place chez la souris. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ce circuit.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier comment les souris apprennent à éviter un lieu dangereux et à cesser d’éviter un lieu qui ne l’est plus. Ce phénomène, autrement appelé persistance d’évitement est couramment observé dans le syndrôme de stress post traumatique. Cet évitement comportemental et cognitif excessif limite l’efficacité de la thérapie comportementale. Comprendre son corrélat neuronal pourrait donc permettre d’identifier des cibles thérapeutiques pour le traitement de l’évitement persistant chez les patients atteints de stress post-traumatique.
Procédures
Ce projet s’étalera sur 5 ans et impliquera 6 procédures expérimentales. Les procédures comprennent toutes les injections intra-péritonéales (3 injections sur la vie de l'animal, quelques secondes), la chirurgie stéréotaxique (1 à 2 chirurgies d'une heure chacune), le comportement (5 jours, 30 min par jour) et la mise à mort (quelques secondes) pour collecter les organes pour analyse ultérieure.
Impact sur les animaux
Le comportement d’évitement de place, les injections intrapéritonéales, les approches de chirurgie stéréotaxique, et la mise a mort engendrent des douleurs et stress modéré. L'isolement engendre de l'inconfort modéré.
Devenir
Notre étude nécessite de mettre à mort les animaux pour récupérer les organes que nous étudierons notamment par histologie.
Remplacement
Il est impossible de remplacer l’animal vivant pour l’étude du comportement d’évitement. La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 704 souris adultes (mâles et femelles) sur un période de 5 ans. Nous avons optimisé les protocoles afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera avec des analyses statistiques en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra d'utiliser toutes les souris générées.
Raffinement
Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences ou les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes, sont proches les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri- opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être et des points limites adaptés. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.
Choix des espèces
L’évitement est un comportement extrêmement important pour la survie et est donc conservé chez les mammifères. Par ailleurs, ce projet requiert l’étude fine de populations de neurones accessibles uniquement via des modèles murins transgéniques. Les souris se reproduisent rapidement (une portée par mois) et leur système nerveux atteint son développement adulte en 12 semaines. Ainsi, la souris adulte représente un modèle de choix pour étudier les mécanismes neuronaux qui contrôlent le comportement d’évitement.
Mise en place et description de 3 modèles de cancers étendus au péritoine pour évaluer l’intéret de traitements immunomodulateurs : étude expérimentale chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent, éveillées, une injection de cellules tumorales dans l'abdomen, puis on laisse la carcinose péritonéale se développer, ce qui peut provoquer douleurs, ascite et cachexie, jusqu'à la mise à mort. L'objet du projet est de créer trois modèles de cancer du péritoine destinés à tester ensuite des traitements, le bénéfice pour la médecine humaine restant à ce stade la seule production de ces modèles. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre la tumeur et son environnement et retient la souris qui "mime la clinique humaine".
Objectifs
Mettre en place, chez la souris, des modèles de cancer envahissant l'abdomen (carcinose péritonéale, venant d'un cancer du colon ou cancer de l'estomac) pour permettre dans un second temps de tester l'intéret de potentiels traitements ayant la possibilité d’être utilisés rapidement chez l’homme pour une transition clinique. Le projet vise aussi à une meilleure compréhension du mécanisme d’action et de l’effet du traitement sur la tumeur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont l’obtention de données permettant de développer de nouvelles thérapies pour la médecine humaine et vétérinaire. Plus précisément, les questions explorées et les apports pour la connaissance scientifique sont les suivantes : Création de nouveaux modèles animaux pour tester des médicaments dans le traitement des cancers du péritoine (carcinose)
Procédures
Les gestes techniques sont seulement l’injection dans l’abdomen de cellules tumorales sur animal éveillé, qui aura lieu une fois, avec des aiguilles de petite taille, durant au maximum 30 secondes. les souris seront manipulées pour effectuer les pesées 2 fois par semaine, geste durant environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour l’animal sont en lien avec : - L’injection dans l’abdomen de cellules tumorales sur animal éveillé, qui aura lieu une fois. - la croissance de la tumeur dans le peritoine, qui peut provoquer des douleurs, qui seront calmées par des antalgiques si ce sont des douleurs aigues, et amenant à la mise à mort de l’animal si elles ne sont pas calmées par les antidouleurs ou si elles deviennent chroniques. - la croissance de la tumeur dans le peritoine peut provoquer de l’ascite (eau dans le ventre), qui peut être inconfortable et cacher une perte de poids. En cas de douleur non calmée par les antidouleurs, de prise de poids importante ou de poids stable mais avec des signes de perte de muscle (cachexie), les souris seront mises à mort.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour permettre d’observer la progression de la tumeur dans l’abdomen/péritoine. Les tumeurs seront aussi analysées au microscope (histologie) et avec d’autres méthodes d’analyses du système immunitaire
Remplacement
A ce jour, il n'existe aucun modèle de carcinose péritonéale mimant correctement l’intéraction entre la tumeur et son environement (très variable dans la carcinose, en contact avec de nombreux organes, avec intéraction avec les système immunitaire mature), in vitro ou de modélisations informatiques ou autres modèles alternatifs susceptibles de répondre à notre objectif de travail. C'est pourquoi, nous utiliserons, comme modèle animal, la souris qui mime la clinique humaine.
Réduction
Le modèle choisi a une variabilité relativement faible par rapport aux autres modèles existants. Cela permet de limiter le nombre d'animaux par groupe. Les expériences seront accomplies dans un ordre et regroupées pour permettre de limiter la nécessité de réaliser des groupes contrôles pour chaque question scientifique. Tous les animaux seront utilisés à la fois pour une analyse des paramètres cliniques mais aussi pour les analyses biologiques/histologiques, permettant de ne pas avoir à reproduire les expériences pour le simple fait de récupérer des résultats biologiques/histologiques. Il n’est pas attendu de décès pendant l’injection des cellules tumorales ni pendant le suivi qui nécessiterait d’augmenter ce nombre. Si un modèle n’a finalement pas des caractéristiques satisfaisantes (pas de prise des cellules, progression trop rapide ne permettant pas de commencer les traitements, etc), il ne sera pas utilisé par la suite pour tester l’intérêt des traitements.
Raffinement
Le milieu est enrichi avec des lanières de papier, morceau de bois, maison. Les animaux sont surveillés 3 fois par semaine par les expérimentateurs (puis tous les jours quand la maladie sera avancée) afin d’évaluer la non atteinte des points limites et la recherche de signes de douleur. Dans le cas où un de ces points limites est atteint, nous agirons en première intention pour mettre un terme à cette gène (par exemple antidouleur). Si cela ne suffisait pas nous mettrons à mort la souris afin de réduire la souffrance. Des croquettes mouillées et de l’eau gélifiée seront utilisés en cas de difficultés à se déplacer de la part d’une des souris de la cage ou en cas suspicion de début de cachexie. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine pour le suivi et la détection de l’ascite.
Choix des espèces
Les modèles de carcinose péritonéale chez la souris miment bien la clinique humaine. Nous utiliserons des souris adultes de plus de 8 semaines afin de mimer une pathologie qui touche plutôt l’adulte chez l’homme. Les souris auront environ 8-9 semaines (stade adulte) au début des expériences et au plus environ 15 semaines à la fin des expériences.
Modèle murin pour identifier le mécanisme d’action du vaccin anti-tumoral APAVAC®
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe sous la peau des cellules de lymphome ou de cancer du côlon, laissées croître jusqu'à un volume de deux mille millimètres cubes, avec des prélèvements sanguins par la queue, pour identifier le mécanisme d'un vaccin antitumoral déjà commercialisé en médecine vétérinaire. Le porteur écrit qu'un anti-inflammatoire "introduirait des biais" en défaveur de l'étude et ne sera donc pas administré, et annonce une efficacité qui "devrait" reproduire celle observée chez le chien. Sur le remplacement, il indique avoir mené des travaux in vitro et ex vivo mais juge la vérification in vivo "primordiale".
Objectifs
Le lymphome B diffus à grandes cellules est le lymphome le plus fréquent. La prise en charge thérapeutique est basée sur une immunochimiothérapie couplant le rituximab à la polychimiothérapie. Pour le patient âgé, cette thérapie n’est pas toujours applicable en particulier en raison de comorbidités notamment cardiaque. Pour pallier ce problème et envisager des traitements pouvant stimuler le système immunitaire, nous avons développé une thérapeutique basée sur l’utilisation de protéines autologues actives sur le système immunitaire. La procédure de préparation de ce vaccin est basée sur la purification de protéines tumorales sur des particules de phosphate de calcium d’hydroxyapatite. Ces particules devront être réinjectés au patient pour une réactivation spécifique de son système immunitaire contre les cellules tumorales. Cette préparation vaccinale est utilisée depuis 2013 en médecine vétérinaire dans le modèle canin. Une étude récente a mis en évidence un doublement de la survie des chiens après traitement par le vaccin. Etant donné Les résultats spectaculaires ont, la mise en place d’un essai clinique est envisagée chez l’homme. Cependant les équipes cliniques requièrent une analyse mécanistique de l’efficacité vaccinale dans un modèle pré-clinique murin. Il est envisagé d’inclure dans le protocole clinique d’autres types de cancers qui font également face à des obstacles thérapeutiques, tel que le cancer colorectal dans le projet. Enfin nos données préliminaires sur la composition du vaccin indiquent la présence de différentes protéines de choc thermique. Il est donc pertinent d’étudier leurs effets dans l’efficacité du vaccin. Nos objectifs sont donc dans ce projet, (1) de mettre au point la préparation vaccinale à partir de tumeur de lymphome B murin et de côlon, (2) de mettre au point la condition de traitement la plus efficace dans le modèle murin, (3) d’identifier les cellules immunitaires anti-tumorale et les protéines de choc thermique impliquées. L’utilisation de ce modèle dans des souris possédant un système immunitaire fonctionnel (Balb/c) a montré, dans plusieurs études, une pertinence pour identifier les cellules contrôlant le développement du lymphome et du cancer du côlon.
Bénéfices attendus
La vaccination des animaux devrait permettre une réduction tumorale significative comme celle observée chez le chien. L’identification des mécanismes antitumoraux de la vaccination nous permettra de valider les prérequis nécessaires à la mise en place d’un essai clinique de Phase I/II dans le lymphome B et le cancer du côlon.
Procédures
Il s’agira de prélever une goutte de sang pour déterminer la composition sanguine de l’animal en réponses aux vaccins. Pour dilater la veine de la queue, les souris sont placées sous une lampe d’animalerie chauffante pendant 10 minutes. Elles sont ensuite glissées dans un tube de contention adapté aux souris et acheté chez un fournisseur spécialisé. Le placement des souris ne durera qu’une dizaine de secondes par souris. Le prélèvement de sang est ensuite effectué avec une aiguille (26 Gauge) ou une lame tranchante stérile. Cette opération durera en moyenne 10 secondes par souris. Cette méthode est recommandée pour des prélèvements répétés de moins de 0,1 mL de sang. Les animaux sont maintenus dans le tube de contention pendant toute la durée du prélèvement. Le volume prélevé est au maximum de 100 microlitres (2 à 3 gouttes). Après la prise de sang un point de compression sera réalisé afin d’éviter tout saignement à l’endroit de l’incision. Une prise de sang (100uL) à J-1 avant l’injection des cellules tumorales et le jour de la mise à mort à la fin de la procédure expérimentale seront réalisés. Total de 2 prises de sang par souris. Le nombre de souris concerné par ces prises de sang sera de 532. Les 36 autres souris qui seront employées à la génération des tumeurs nécessaires à la fabrication des vaccins ne seront pas concernées par ces prises de sang. Les injections de cellules tumorales A20 (2x106 cellules) et CT26 (5x105 cellules) seront réalisées en sous-cutanée à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de 26 Gauge et concerneront les 568 souris du projet expérimentale. Un maximum de 100 µL de suspension cellulaire seront injectés. Chaque injection de cellules tumorales durera en moyenne une dizaine de seconde. Les injections de préparation vaccinale concerneront ¬532 souris à hauteur de 4 injections vaccinales par souris et seront réalisées à J5, J7, J9 et J14 en post-injection des cellules tumorales. Chaque vaccination durera en moyenne une dizaine de seconde. Au total, pour une souris, deux prises de sang auront lieu, (à J-1 avant injection des cellules tumorales et avant la mise à mort), 5 injections (1 de cellules tumorales A20 ou CT26 et 4 injections de solution vaccinale).
Impact sur les animaux
L’utilisation du vaccin chez le chien depuis 2013 n’a pas montré d’effets indésirables. L’injection des inhibiteurs d’HSP chez la souris n’a pas montré d’effets indésirables. L’injection du vaccin peut engendrer de la souffrance et du stress au souris, c’est pour cela que l’injection se fera sous anesthésie à l’isoflurane. Également, l’injection des cellules cancéreuses A20 et CT26 par voie sous-cutanée se fera sous anesthésie à l’isoflurane et la croissance tumorale ne dépassera jamais les 2000 mm2.
Devenir
L’analyse de la réponse des souris à la vaccination nécessite une étude approfondie des tumeurs et des cellules du système immunitaires. Le prélèvement de la tumeur ainsi que des organes lymphoïdes (rate et ganglions) contenant les cellules immunitaires nécessite la mise à mort des animaux.
Remplacement
Les résultats préliminaires obtenus à partir des nombreuses expériences in-vitro et ex-vivo ont été très encourageants et ont permis de réduire le nombre de souris au regard des différents axes restant à être investigués. Des marqueurs phénotypiques ont été découvert via ces expériences ex-vivo. Toutefois, ce modèle ne nous permet pas de tester notre hypothèse d’une stimulation de certaine populations anti-tumorales du système immunitaire. C’est la raison pour laquelle il est primordial de pouvoir vérifier ces résultats dans un modèle in-vivo. Ces expériences constituent des tests pré-cliniques et ont pour but d’observer l’immunogénicité de notre traitement dans un organisme vivant immuno-compétent. Ces expériences in-vivo sont donc nécessaires afin de mettre en valeur les aspects physiologique résultants de notre thérapie. Mais également de retrouver les marqueurs phénotypiques vérifiés par les expériences ex-vivo.
Réduction
Pour chacune des combinaisons thérapeutiques (vaccination préventive ou curative, effets des inhibiteurs de HSP, ou déplétion des HSP) réalisées lors de nos expérimentations in vivo, nous utiliserons des groupes de 7 souris maximum, ce qui correspond à la taille d’échantillon minimum nécessaires à nos tests statistiques et valable avec le test non paramétrique adapté aux petits échantillons (< à 10) de Mann-Whitney. De plus, nous étudierons plusieurs éléments sur un même groupe de souris dès que cela est possible (réduction) et nous réaliserons seulement les expériences les plus indispensables sur les modèles murins.
Raffinement
Dans le but de préserver le bien-être animal et pour anticiper l’arrivée des signes de souffrance liés à la maladie, nous suivrons l’évolution de la croissance tumorale en mesurant tous les 2 jours par un pied à coulisse le volume des tumeurs, puis tous les jours lorsque la tumeur atteindra un volume égal ou supérieur à 1500 mm3. Dans le but de réduire, supprimer/soulager la douleur/détresse pour l’ensemble de nos animaux (vaccinés ou non), ces derniers seront minutieusement observés lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Les injections des cellules cancéreuses A20 et CT26 pourraient engendrer de la souffrance et du stress au souris, ainsi l’injection se fera sous anesthésie à l’isoflurane. La croissance tumorale sera monitorée et ne dépassera jamais les 2000 mm2. L’injection du vaccin par voie sous-cutanée sera réalisée sous anesthésie à l’isoflurane. Un suivi (réveil et post anesthésique) sera mis en place après injection des cellules tumorales en sous-cutané (s.c.), et des vaccins (s.c.), pour nous assurer que les souris retournent à une activité normale (confort, vivacité, état sanitaire). L’utilisation d’un anti-inflammatoire introduirait des biais en notre défaveur, car cela irait à l’encontre de l’intérêt de l’étude (l’immunisation via l’utilisation d’un biomédicament). Pour pallier à cela, les animaux seront quotidiennement suivis par l’expérimentateur et en cas de signes de souffrance un analgésique sera administré. Si la souffrance persiste, l’expérience sera stoppée. De plus, des mesures seront prises pour améliorer le bien-être des animaux. L’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Un enrichissement structural du milieu sera également mis en place. Un contenant sera placé dans chaque cage permettant aux souris de se cacher et de développer leur répertoire comportemental (exploration, enfouissement…). Les animaux seront mis à mort par les personnes formées. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale à l’isoflurane. Après la mise à mort, la mort des animaux est constatée par l’absence des signes vitaux : respiration, battements cardiaque, absence des mouvements volontaires et des réflexes.
Choix des espèces
Les souris BALB/c seront utilisées afin de se rapprocher au maximum des conditions de développement tumorale en présence d’un système immunitaire compétent. Cette condition est nécessaire pour tester les effets d’une vaccination anti-tumorale sur le système immunitaire. La souris a pour intérêt d’avoir un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Le modèle de lymphome B murin A20 et le modèle CT26 de cancer du côlon ont été montré comme pertinent comme modèles pré-cliniques or ces modèles se développent dans des souris BALB/c. Nous utiliserons des souris femelles et mâles de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adulte. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte et, en ce qui concerne les modèles de souris immunocompétentes, soient dotées d’un système immunitaire fonctionnel.
Suivi longitudinal de deux populations de chevreuils étudiées à différents niveaux d’organisation biologique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
3 500 chevreuils vont être capturés puis relâchés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal capturé au filet reçoit des boucles auriculaires, un transpondeur sous-cutané et subit des prélèvements de sang, de poils, de fèces et de parasites, pour un suivi démographique et physiologique de deux populations closes. Le porteur indique que la capture provoque un stress et une mobilité réduite, parfois une myopathie de capture ou des fractures, et chiffre à 3,5 % la part des animaux morts ou mis à mort lors des captures hivernales entre 1993 et 2022. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne se substitue au suivi longitudinal d'individus marqués, qu'il juge "indispensable".
Objectifs
De par leur rôle dans la dynamique de la biodiversité, leur valeur patrimoniale et leurs interactions croissantes avec les activités humaines, il est de plus en plus nécessaire de bien comprendre la dynamique des populations, l'utilisation de l'espace, l'éco-épidémiologie et l'éco-physiologie des grands mammifères herbivores. C'est dans cette optique que notre laboratoire pilote des programmes de recherche intégratifs sur l'ensemble des espèces de grands mammifères herbivores, en collaboration étroite avec la Direction de la Recherche et de l’Appui Scientifique de l'Office Français de la Biodiversité (OFB). L’objectif du présent programme de recherche est la perpétuation d’un suivi démographique, phénotypique, génétique, physiologique et épidémiologique de deux populations de chevreuils (Capreolus capreolus), une peuplant un territoire d'études dans le nord-est de la France et l’autre une réserve biologique dans l’ouest de la France. Ces deux populations sont encloses et très faiblement chassées. Depuis 1975 (pour la première population) et 1977 (pour la seconde), et le début du programme de Capture-Marquage-Recapture, la collecte des données s’est enrichie pour répondre aux questions posées dans des projets scientifiques aux thématiques diverses (ex : démographie, communautés de parasites, horloges moléculaires, interaction entre stress et immunité). Les suivis individuels de ces populations constituent aujourd’hui deux des suivis longitudinaux de populations sauvages les plus longs et complets au monde, fait d’autant plus exceptionnel qu’il concerne deux populations contrastées en termes de conditions environnementales, permettant ainsi d’étudier le rôle de l'environnement sur les processus éco-évolutifs et éco-épidémiologiques. Les suivis à long-termes de populations naturelles constituent aujourd’hui une ressource scientifique précieuse à préserver. Notre objectif est donc de mettre notre programme de recherche sur le suivi du chevreuil (et la collecte de données associée) en adéquation et au service de projets scientifiques ambitieux et multi-disciplinaires, tout en respectant la sécurité et le bien-être des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet à long terme est fondé sur le suivi détaillé des trajectoires individuelles de chevreuils faisant face à des contextes environnementaux très variés aussi bien au sein (variation entre cohortes, variation spatiale de la qualité d’habitat) qu’entre (productivité de l’habitat et conditions climatiques très contrastées) populations. Ce cadre unique permettra (1) de quantifier l’importance des différences individuelles de trajectoires démographiques, comportementales, et physiologiques, (2) d’identifier les facteurs responsables de cette hétérogénéité, (3) d’appréhender la covariation entre ces trajectoires pour établir une typologie, et (4) de mesurer la performance de chaque type de trajectoires et de prédire leur fréquence relative suivant le contexte environnemental. Ces tâches permettront de tester empiriquement de nombreuses théories actuelles de la biologie évolutive qui restent difficiles à appréhender en milieu naturel, et plus généralement de quantifier le rôle respectif des contraintes, du hasard et de l’évolution adaptative dans la réponse des traits constitutifs des trajectoires individuelles aux changement de conditions environnementales. En plus de ces bénéfices en termes d’une meilleure compréhension des processus biologiques agissant dans la nature, ce projet a clairement une forte valeur sociétale. Ciblant une espèce « ingénieure des écosystèmes » qui est actuellement l’espèce de grand mammifère la plus abondante et l’une des plus intensivement chassée en France (avec près de 500 000 individus tirés chaque année) et dans toute l’Europe, ce projet apportera les connaissances nécessaires à une gestion plus raisonnée du chevreuil afin de limiter les conflits avec les activités humaines tels que l’augmentation des collisions automobiles, la prévalence de la maladie de Lyme, ou les dégâts à la régénération forestière.
Procédures
Dans le cadre des captures hivernales, les animaux d’âge connu (c’est-à-dire capturés pour la première fois alors qu’ils étaient faons ou chevrillards) seront soumis aux interventions suivantes : une pose de boucles auriculaires à la première capture (si non marqué - durée 1 min), une pose de transpondeur sous-cutané (si non marqué - durée 1 min), un prélèvement de sang par an maximum (durée 1 min), un prélèvement de poils par an maximum (durée 1 min), un prélèvement de fèces par an maximum (durée 2 min), et un prélèvement de parasites externes (durée 1 min). Les animaux d’âge non connu (c’est-à-dire capturés pour la première fois alors qu’ils étaient déjà adultes) ne seront soumis qu’au prélèvement de fèces. Dans le cadre de la recherche et du marquage des faons nouveau-nés, les interventions sur animaux vigiles correspondront à la pose de boucles auriculaires (durée 1 min) et à un prélèvement de sang (durée 1 min).
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue est le stress causé par la capture (phase de course avant la capture au filet puis phase de manipulation pour la mise en sabot) et par la manipulation sur la table. La conséquence la plus fréquente de ce stress est une mobilité réduite dans les jours suivant la capture, dont la durée a été évaluée à 14 jours chez le cerf de Virginie. Plus rarement, peut survenir une myopathie de capture (fréquence évaluée à moins de 2% des cas lorsque des bonnes pratiques sont respectées), s’exprimant essentiellement soit sous la forme d’un choc post-capture (dans les 6 heures suivant la capture, avec risque mortel) soit sous la forme d’un syndrome d’ataxie-myoglobinurie (dans les heures ou jours suivant la capture). Une douleur pourrait être liée à une manipulation maladroite, à la prise de sang, à la pose de boucles auriculaires et du transpondeur. La douleur associée au protocole est donc modérée et de courte durée et ne persiste pas au-delà de la manipulation. Les réactions de fuite ou de lutte peuvent avoir pour conséquences des traumatismes physiques: occasionnellement des plaies sans conséquences majeures, ou rarement des fractures ou des atteintes articulaires, ces dernières pouvant entraîner un risque mortel. Au total, pour les années 1993-2022, le pourcentage d’animaux morts ou mis à mort au cours des captures hivernales était de 3,5% dans la population de l’ouest de la France (de 1,2% à 8,3%) et de 2,7% dans celle du nord-est (de 0,8% à 5,7%). Il était stable au fil du temps dans la première et a eu tendance à diminuer à dans la seconde. La différence entre les deux populations et les variations interannuelles semblent liées à la condition physique des animaux, généralement meilleure dans la population du nord-est que dans celle de l’ouest. Ainsi, dans cette population, l’année de plus forte mortalité associée aux captures était l’hiver 2003-2004 faisant suite à la sécheresse de l’été 2003 (8,3%), et était due en partie à la présence exceptionnelle de faons de très petite masse (
Devenir
Remis en liberté.
Remplacement
Notre programme de recherche sur le chevreuil repose en grande partie sur l’étude des réponses individuelles et populationnelles aux variations des conditions environnementales d’origines diverses (e.g. conditions climatiques, ressources, pollution, agents pathogènes). Ces réponses sont étudiées aux niveaux comportemental, physiologique et démographique. Le suivi longitudinal d’individus marqués, permettant de quantifier les trajectoires individuelles est donc indispensable, tout comme le prélèvement de tissus biologiques sur ces mêmes individus. Il n’existe donc, par essence, aucune méthode substitutive à notre protocole de recherche. Les approches in vitro ou in silico ne permettent pas d’étudier simultanément (i) les réponses aux variations des conditions environnementales d’origines diverses (climat, pollution, pathogène) de manière intégrée (des réponses physiologiques complexes jusqu’à leurs conséquences sur la valeur sélective) au niveau individuel, et (ii) les conséquences démographiques au niveau populationnel. Notre protocole a été réfléchi de sorte à ce que toutes les quantités de tissus prélevées soient en adéquation avec des objectifs pré-définis précis. Toutefois, si certains échantillons s’avéraient non utilisés ou si une amélioration des protocoles de biologie moléculaire permettait de réduire la quantité de tissus à utiliser pour la quantification d’un paramètre donné, les échantillons supplémentaires et restants seraient mis à disposition de notre réseau de collaborations (et participeraient ainsi à du remplacement pour des projets futurs).
Réduction
Chaque année, un total de 350 à 500 animaux sont capturés sur les deux sites (entre 150 et 250 dans la population du nord-est et entre 200 et 250 dans la population de l’ouest sur les 10 dernières années). Environ 50% de ces animaux sont capturés pour la première fois (et donc marqués à cette occasion) ; 50% sont des animaux qui ont déjà été capturés et marqués une année précédente. Ce nombre permet de maintenir une proportion importante d’animaux marqués dans la population (> 50%) et d'obtenir des estimations précises des paramètres démographiques. Comme il n'est pas possible de prendre en compte les effets de l'âge sur les paramètres démographiques et physiologiques à partir des animaux d'âge non connu, ces derniers ne font pas l'objet de prélèvements biologiques (hormis un morceau de cartilage auriculaire pour la reconstitution du pédigrée) mais sont examinés, pesés et mesurés. En effet, l'âge et le sexe des animaux ont des effets marqués sur les traits d'histoire de vie et les mesures physiologiques, et un effectif minimum situé entre 80 et 100 prélèvements par an et par population est nécessaire pour appréhender la forte hétérogénéité entre individus et obtenir des mesures précises des marqueurs physiologiques étudiés. En outre, le chevreuil est une espèce avec une forte espérance de vie, ce qui nous permet d’étudier et de contrôler l’importance des conditions environnementales rencontrées dans l’environnement natal, et ainsi de prendre en compte les effets de l’année de naissance (appelés ‘effet cohorte’). La fourchette de 80-100 prélèvements annuels (en fonction de la réussite des captures) par site sur des animaux d’âge connu nous permet d’assurer la capture d’individus de chaque cohorte non éteinte, même pour les cohortes de plus mauvaise qualité. En termes de réduction de l'inconfort et des prélèvements, les manipulations qui peuvent être stressantes ou douloureuses pour l’animal (pose de boucle auriculaire et transpondeur) sont réalisées une seule fois dans sa vie (excepté les cas rares où l'individu a perdu une de ses marques). Les autres prélèvements réalisés sur les adultes (captures hivernales) ou les faons (au printemps) ne sont réalisés qu’une seule fois dans l’année. Si un animal d’âge connu venait à être capturé une seconde fois dans la même saison, aucun prélèvement ne serait pris et l’animal serait relâché le plus rapidement possible.
Raffinement
Afin de minimiser le stress, les manipulations sont effectuées dans un local réservé à cet effet par du personnel formé et qualifié. Les animaux ont les yeux couverts d’un tissu le temps que les prélèvements soient réalisés et sont manipulés le plus silencieusement possible. Ils sont ensuite transférés dans une autre pièce au calme en attendant d'être relâchés. La durée totale entre la capture et le relâcher est de 2 à 6 heures incluant 10 (mâles) à 20 (femelles) minutes de contention et de manipulation en dehors du sabot (boite de contention). La survie des animaux est tout à fait conforme à ce que l'on observe chez les autres espèces de mammifères terrestres de taille similaire (sauf Primates). La survie annuelle des jeunes (jusqu'à 1 an) est très variable en fonction des conditions environnementales (
Choix des espèces
Le chevreuil est un ongulé forestier commun, pour lequel les techniques de capture et de contention sont éprouvées et qui présentent des enjeux importants en termes de gestion cynégétique (actions de gestion de la faune sauvage par la chasse), forestière et sanitaire. C’est un mammifère au cycle de vie lent, plus proche de l’homme que les modèles murins, ce qui multiplie les implications et la portée scientifique de nos travaux situés à l’interface de l’écologie et des sciences de la santé. Le chevreuil est aussi la seule espèce de mammifère au monde pour laquelle deux populations vivant en milieux contrastés sont suivies intensivement depuis des décennies. Cet atout permet de capitaliser sur les données démographiques et environnementales (qualité de l’habitat, conditions climatiques) collectées sur plus de 2000 individus dans le cadre de nos projets (maximisant ainsi le remplacement), mais également de profiter de l’expérience passée pour raffiner nos protocoles. Tous les stades de développement seront utilisés. L’âge des chevreuils ne pouvant être déterminé avec exactitude que durant leur première année de vie (grâce à l’analyse de la dentition et l’éruption des incisives), il est nécessaire de capturer les nouveaux individus (pas encore marqués) avant un an pour suivre ensuite des animaux d’âge connu. De plus, l’un des objectifs du projet étant d’estimer la survie des jeunes individus (notamment la phase de vie précoce entre la naissance et l’entrée de l’hiver, cruciale dans la dynamique des populations chez cette espèce), les chevreuils sont capturés à 2 périodes distinctes dans l’année: au printemps au moment de leur naissance (faons nouveau-nés) et pendant leur premier hiver lorsqu’ils sont âgés de 7 à 9 mois (chevrillards). Les captures hivernales sont aussi l’occasion de capturer des animaux adultes d’âge connu (s’ils ont été marqués faons et/ou chevrillards) et des animaux adultes d’âge non connu (pas marqués faons ni chevrillards).
Production d’anticorps de souris spécifiques de protéines recombinantes et essai de candidats vaccins à ARNm de Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum et Plasmodium knowlesi
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Des injections de protéines avec adjuvant de Freund, complet la première fois puis incomplet, précèdent une exsanguination par ponction intracardiaque sous anesthésie pour les souris immunisées : 600 souris âgées de 6 semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet doit produire des anticorps polyclonaux contre des protéines de Plasmodium, le parasite du paludisme, et cribler des candidats vaccins à ARNm injectés dans le muscle. Le porteur prévient que les souris "peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d'angoisse". Celles dont le titre d'anticorps suffit sont mises à mort pour leur sérum, et les autres doivent l'être à la fin de chaque procédure, même si le porteur ajoute qu'elles "peuvent être réutilisées dans d'autre projets dans la mesure du possible".
Objectifs
Le paludisme est un problème de santé publique, majeur qui sévit dans plus de 100 pays et fait plus de 627 000 morts par an surtout chez les jeunes enfants. Chez les femmes enceintes, l’infection par Plasmodium peut causer leur mort et celle de leur enfant ainsi qu’un poids de naissance inférieur à la normale entraînant une mortalité très fréquente après la naissance. Depuis 2021, un vaccin est disponible sur le marché. La prise d’antipaludiques et l’utilisation de moustiquaires imprégnées augmentent la résistance du parasite aux antipaludiques. La maladie est causée par le parasite du genre Plasmodium, un protozoaire appartenant au phylum des Apicomplexes. Parmi les 5 espèces qui infectent l’Homme, deux sont les plus répandues : Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Le cycle de vie du parasite, entre un hôte mammifère et un moustique du genre Anopheles, est complexe. La partie la mieux connue de ce cycle est la phase érythrocytaire se déroulant chez le mammifère, durant laquelle les parasites se multiplient dans les érythrocytes de l’hôte. Notre laboratoire étudie les mécanismes d’invasion des globules rouges humains par Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Nous nous intéressons, en particulier, au stade sanguin du cycle du parasite. Nous étudions les mécanismes mis en jeu par le parasite pour s’attacher au globule rouge, y pénétrer et s’y développer. Cette phase érythrocytaire pour P. falciparum et P. knowlesi, peut être reproduite in vitro dans des systèmes de culture de globules rouges humains. Nous avons identifié plusieurs protéines d’intérêt exprimées par le parasite lors de son cycle de vie dans le globule rouge. Afin de les étudier, nous allons produire, chez la souris, des anticorps polyclonaux (AcP) dirigés contre ces protéines. Ces anticorps nous permettrons d’inhiber ces protéines à la surface du merozoïte (forme du parasite permettant d’infecter un nouveau globule rouge) ainsi que de déterminer la réponse immunitaire des candidats vaccins.
Bénéfices attendus
Notre compréhension du paludisme est limitée par des outils de recherche tels que les anticorps. Il existe en effet peu d’anticorps spécifiques contre les différentes espèces de Plasmodium disponibles. Ce projet a pour but de produire un outil qui sera indispensable dans la lutte contre cette maladie. Les anticorps sont essentiels pour faire progresser notre connaissance sur le fonctionnement du parasite. Nous pouvons étudier l’expression de ces molécules dans les différents stades du parasite en utilisant les techniques suivantes : ELISA, Western Blot, l’inhibition de la croissance parasitaire, les procédures d’immunoprécipitation, l’immunofluoromicroscopie. Avec des anticorps spécifiques nous sommes en mesure de mieux comprendre l’implication des protéines responsables de l’invasion chez P. falciparum, P. vivax et P. knowlesi. De plus, les infections de souris par des candidats vaccins permettront un criblage des préparations vaccinales.
Procédures
1) Une prise de sang (une minute). 2) Une injection (une minute). 3) L'exsanguination par ponction intra-cardiaque (5 minutes) à la fin de l’expérience, préalablement anesthésiées par injection par voie intrapéritonéale (une minute).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés à l’injection des protéines avec adjuvant et des candidats vaccins. Dans des très rares cas les souris peuvent mal supporter les protéines recombinantes et les candidats vaccins à ARNm. Elles peuvent montrer une réaction inflammatoire. Les souris recevront les protéines recombinantes en présence d’adjuvant Complet de Freund (CFA) pour la première injection et l'adjuvant Incomplète de Freund (IFA) pour les autres injections. L’utilisation de l’adjuvant CFA par voie sous-cutanée peut induire des effets indésirables. Les injections des candidats vaccins à ARNm se feront par la voie intra-musculaire sans adjuvant. Les souris peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d’angoisse.
Devenir
Toutes les souris ayant un titre d’anticorps satisfaisant seront mises à mort afin d’obtenir une quantité de sérum suffisant pour l’études des protéines d’invasion ou déterminer les candidats vaccins permettant la meilleure immunisation possible contre P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi. Toutes les souris n’ayant de titre d’anticorps satisfaisant lors de prélèvements intermédiaires seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car elles ont reçu au moins une injection de protéines recombinantes ou une dose de candidats vaccins à ARNm. Elles ne peuvent donc pas être réutilisés dans notre projet. Cependant, elles peuvent être réutilisées dans d’autre projets dans la mesure du possible.
Remplacement
L’alternative possible à l’emploi de sérums serait d’employer les sérums prélevés chez des personnes vivant en zone d’endémie, porteuses d’anticorps contre les antigènes d’intérêt et d’immuno-purifier les immunoglobulines spécifiques par affinité sur les antigènes recombinants. Les expériences d’autre groupes de recherche ont montré que les anticorps ainsi obtenus sont de faible affinité pour des protéines spécifiques, avec un titre très faible et ne fonctionnent pas pour les protéines intracellulaires qui ne sont pas exposée à la réponse immunitaire de l'hôte. Il existe aujourd'hui des alternatives non animales pour produire les anticorps telles que les anticorps recombinants et les aptamères (courts fragments d'ADN ou d'ARN qui peuvent se lier à des cibles telles que des protéines). Cependant, une bibliothèque de gènes d'anticorps de Plasmodium n'a pas encore été constituée, ce qui rend cette technique hors de portée pour le moment. Le recours à l’animal est nécessaire car ces anticorps ne peuvent être obtenus qu’après immunisation d’une espèce animale. Cependant, pour chaque protéine identifiée avec certitude dans l’invasion du globule rouge par P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi, nous ferons des hybridomes permettant d’obtenir des anticorps monoclonaux. Ce qui nous permettra de bénéficier d’une banque d’anticorps pour l’étude des mécanismes d’invasion du globule rouge par les Plasmodium.
Réduction
Le nombre de souris pour chaque expérimentation a été calculé au plus juste pour permettre un nombre minimum des animaux. Cette estimation a été réalisée en concertation avec un biostatisticien. Ainsi, nous avons choisi des groupes de 5 souris dont les sérums seront poolés afin d’avoir une quantité de sérums suffisante pour une étude approfondie et répétée.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse de nos souris, nous mettrons en œuvre un enrichissement de l’environnement avec par exemple des abris et des bâtons de coton pour la nidification. Si les souris montrent des signes de détresse ou de souffrance pendant les prélèvements nous pouvons utiliser une anesthésie gazeuse sous isoflurane. Une surveillance accrue pendant 3 jours suivant les injections et puis 2 fois par semaine entre les injections et les prélèvements ainsi que des soins post manipulation (injections et prélèvements) seront pratiqués.
Choix des espèces
Nous avons choisi de produire nos anticorps chez la souris car nous savons par des expériences antérieures que les protéines recombinantes de Plasmodium sont très immunogènes chez la souris. De plus il est indispensable de tester des candidats vaccins sur des souris avant de continuer leur développement. Les souris utilisées pour les immunisations seront âgées de 6 semaines, âge auquel on obtient une bonne réponse immune et une préhension correcte pour l’immunisation et le prélèvement sanguin.
Effet chronique de la kisspeptine et test d’expression et de sécrétion de la protéine dans le tissu musculaire de souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
779 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des pompes osmotiques renouvelées deux fois, des injections dans la veine saphène, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline et des tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour tenter de faire produire un peptide de la reproduction par leurs cellules musculaires. Le porteur signale des douleurs, une perte de poids et une perte de mobilité liées aux pompes et aux injections, tous les animaux étant mis à mort pour prélèvement d'organes. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'est envisageable pour cette approche encore jamais testée.
Objectifs
La kisspeptine (Kp), produite dans le cerveau, est un puissant stimulateur de la sécrétion de gonadolibérine (GnRH) qui, à son tour, induit la libération de l’hormone lutéinisante (LH) dans la circulation sanguine chez les mammifères. A ce jour, de très nombreuses études ont évalué l’effet d’une injection aigüe de kisspeptine pour tenter de comprendre et de maitriser la reproduction de plusieurs mammifères (notamment la souris, l’Homme, mais aussi les animaux de rente pour lesquels le système reproducteur n’est pas actif tout au long de l’année). De ce fait, les mécanismes impliquant le contrôle de la sécrétion de LH et l'action de la Kp sont alors très bien connus et documentés. Cependant, une faiblesse majeure de la kisspeptine, utilisée en tant que telle pour maitriser la reproduction, est le délai d’action de la protéine qui est relativement vite dégradée. Des études ont alors tenté de mettre au point une forme modifiée de la kisspeptine afin de la rendre plus résistante aux processus de dégradation. A ce jour, aucune forme modifiée du peptide n’a cependant été assez performante pour être utilisée comme outils de maitrise de la reproduction. Le présent projet vise alors à adopter une approche totalement innovante à la lumière de ce qui est en cours de développement dans le domaine des biomédicaments : faire produire la kisspeptine directement par les cellules musculaires qui sont des cellules définitivement différenciées, qui ne se divisent pas, et sont capables de fortement exprimer une protéine puis de l'excréter dans le système circulatoire. Concrètement, l’idée est d’injecter dans le muscle un complexe ADN pour faire produire de la Kp qui sera excrété du muscle vers le système sanguin. Comme ils n’impliquent pas d’agents viraux, ces complexes sont plus faciles d’utilisation et n’ont pas d’effet inflammatoire. Nous souhaitons donc tester si l’injection de ces complexes dans le muscle peut être une technique efficace pour, à terme, faire produire de façon stable la Kp dans l’optique de stimuler ou inhiber la reproduction de l’organisme cible qui, dans ce projet, est la souris.
Bénéfices attendus
Le présent projet vise à mettre au point une méthode permettant de sécréter de la kisspeptine de façon continue par les cellules musculaires de l’organisme cible. Les bénéfices sont donc multiples 1) étudier l’effet d’une diffusion continue de kisspeptine sur la physiologie de l’organisme, 2) mettre au point une technique de production de peptides par les cellules musculaires et 3) développer un outil permettant de maitriser la reproduction.
Procédures
- Pose de mini pompes osmotiques sur 96 animaux : les mini pompes diffusent la solution qu'ils contiennent pendant 28 jours maximum, le protocole étant prévu pour 3 mois, les mini pompes seront remplacées 2 fois. - Test de tolérance au glucose (GTT) et à l'insuline (ITT) sur 56 animaux avec des prélèvements de sang. L'ITT sera toujours réalisé 1 semaine avant le GTT et ceux ci seront réalisés 3 fois avec 28 jours d'intervalle. - Frottis vaginaux réalisés sur 28 femelles sur une période de 8 jours tout les 28 jours. - Tests de comportements sur 80 animaux - Prises de sang sur 96 animaux tout les 28 jours. L'intervention sera réalisée 4 fois. - Injection d'un solution et 16 prélèvements de 4ul de sang de façon sériée, une seule fois au 84ème jour du protocole. - Mise à mort après anesthésie - Injection hydrodynamique d'un vecteur plasmidique via la veine saphène réalisé sur 637 animaux au total sur les deux procédure (630 + 7). Prises de sang tout les 10 jours pendant 3 mois, soit 9 fois. - Mise à mort après anesthésie - Electroporation ou injection hydrodynamique sur 14 animaux
Impact sur les animaux
Le peptide et ses effets sont très bien décrits chez les mammifères, et notamment chez les rongeurs. En termes de manipulation des animaux, les tests comportementaux, chirurgies, injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets secondaires peuvent être observés, notamment suite à la pose des mini pompes ou l'injection hydrodynamique : des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent apparaître mais sont anticipés par l'injection d'antidouleurs au moment des procédures. De plus un suivi journalier sera mis en place pour prévenir ce genre d'effets et pouvoir traiter les animaux en conséquence. L’objectif de ce projet est d’induire une production continue de kisspeptine par l’organisme, ce qui n’a encore jamais été testé jusqu’à présent.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes pour des études post mortem
Remplacement
Une grande partie du travail de sélection des meilleurs vecteurs ADN a été réalisé en amont sur des modèles de cultures cellulaire, mais l'étude de l'effet de la Kp sur la fonction de reproduction et sur la physiologie globale de l’organisme nécessite un système complexe et vivant tel que le modèle murin afin d'avoir une compréhension complète des mécanismes mis en jeu, aucune méthode de remplacement n'est donc envisageable dans ce contexte.
Réduction
Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 7 animaux par traitement.
Raffinement
Les animaux impliqués dans cette étude sont élevés dans les conditions d'élevage classique dans des cages en présence d'enrichissement (de type carton pour la mise en place d'un nid, petite cabane en carton...). De plus, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l’expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Aussi une attention toute particulière sera portée aux points limites. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement et l'apparence des souris sera suivi avec attention et les animaux seront pesés tous les jours pendant 3 jours après les prises de sangs puis tous les 2 jours jusqu'aux prochains prélèvements. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites. Afin de de réduire le stress lié aux prélèvements de sang et permettre l'habituation des animaux à cette procédure, un morceau de cookie sera apporté aux animaux après chaque prélèvement sanguin. De plus, lors des chirurgies (implantation de mini pompes et injections hydrodynamique, des traitements anesthésiques et analgésiques seront apportés aux animaux pour réduire leur douleurs au maximum.
Choix des espèces
Les mécanismes d’action de la kisspeptine, de façon aigüe chez la souris sont très bien documentés au niveau de la physiologie de la reproduction. De plus les mécanismes sous-jacents sont bien décrits et conservés chez les mammifères. Cependant, l’effet de la kisspeptine sur le long terme sur la physiologie globale de l’organisme reste assez peu étudiée, or, ce peptide est de plus en plus présenté comme étant un outil prometteur pour la maitrise de la reproduction et le traitement de pathologies associées à la fertilité. La souris est alors un très bon modèle pour analyser les effets de composés sur la physiologie et le comportement tout en offrant la possibilité de réaliser des parallèles avec d’autres espèces qui permettront d’avoir un bon aperçu de l’effet de la kisspeptine sur le long terme. Enfin, ces études font suite à des manipulations in vitro et permettront de poursuivre avec des expérimentations sur les espèces de rente telles que les ovins et constituent alors un chainon essentiel au développement de notre approche de façon optimale et rigoureuse.