Oncologie

910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les protocoles, on leur greffe des cellules tumorales sous la peau ou dans la prostate par chirurgie, ou on déclenche des tumeurs par injections de tamoxifène, avant des séries d'injections répétées et des séances d'imagerie sous anesthésie s'étalant jusqu'à dix-huit mois. Le porteur indique que les souris développent des tumeurs et une dégradation progressive de leur état général, encadrées par des points limites. Le projet vise à confirmer chez la souris le rôle de la signalisation calcique dans le cancer de la prostate et à tester un anticorps, l'application chez l'humain restant présentée comme une perspective.

Objectifs

L’objectif du projet consistera à permettre une validation in vivo de nos résultats obtenus in vitro à savoir : -la signalisation calcique est impliquée dans la croissance tumorale en réponse à une stimulation du système nerveux parasympathique -la signalisation calcique est impliquée dans la résistance aux traitements chimiothérapeutiques -la signalisation calcique est impliquée dans la formation des métastases osseuses du cancer de la prostate -la signalisation calcique est une cible thérapeutique potentielle in vivo.

Bénéfices attendus

Les enjeux en matière de cancérologie sont importants car nous avons identifié in vitro que la signalisation calcique un rôle central dans plusieurs mécanismes clés de la cancérogenèse (prolifération, angiogenèse, métastase, apoptose, résistance aux chimiothérapies…). Nous devons confirmer ces données obtenues in vitro par des études chez la souris. Une autre application importante de ce projet sera l’étude de l'efficacité d'un anticorps monoclonal ciblant spécifiquement la signalisation calcique des cellules tumorales afin de stopper la progression tumorale. L’anticorps testé pourra être modifié et utilisé chez l’homme comme thérapie seule ou en combinaison contre les cancers prostatiques avancés aujourd’hui incurables.

Procédures

Procédures 1,2 et 5: 1 Anesthésie à l'isoflurane (10 min) suivie d'1 injection sous-cutanée de cellules tumorales. Une fois par semaine (pendant 9 semaines): traitements avec les chimiothérapies ou solvant seul (1 injection intra péritonéale/sem soit 9 IP) et/ou 1 administration per os/sem de Rucaparib (ou solvant seul) (soit 9 PO) et/ou 1 injection IP de l'anticorps monoclonal ou son peptide contrôle (à renouveler tous les 3 jours) (soit 21 IP). Procédure 3 : 1 Anesthésie par isoflurane avant la procédure chirurgicale (implantations dans la prostate de cellules cancéreuses humaines à l'aide de seringues à insuline). Puis, chaque semaine (durée étude 25 semaines), la progression de la maladie sera surveillée par imagerie petit animal à bioluminescence : 1 injection (100 µL) IP de luciférine (25 IP au total) puis 1 Anesthésie à l’isoflurane (25 AG au total) puis imagerie. A partir de la semaine 4 et pendant 21 semaines, traitements appropriés comme indiqué (anticorps ou anticorps-CTL ; à renouveler tous les 3 jours soit 49 IP; docetaxel 1 IP/sem soit 21 IP; inhibiteur de PARP 1 IP/sem soit 21 IP ; docetaxel+PARP 1 IP/sem soit 21 IP). L’influence du système nerveux périphérique sera également évaluée avec un antagoniste des voies cholinergiques/muscariniques (darifenacin (Chrm3)). A partir de la semaine 4, les souris concernées recevront une IP journalière de darifenacin à 2.5 mg/kg dans du PBS ou du PBS seul (soit 147 IP). Procédure 4: durée de 18 mois. 5 IP intrapéritonéales consécutives à la semaine 2 (souris âgées de 15 jrs) pour l'administration du tamoxifène ou du solvant seul (huile de maïs). A partir de la semaine 4, les souris concernées recevront une IP journalière de darifenacin à 2.5 mg/kg dans du PBS ou du PBS seul (476 IP au total). Pour toutes les souris de la procédure 4: 36 anesthésies par isoflurane (pour chaque souris tous les 15 jours) afin de réaliser un suivie par imagerie petit animal à rayon X de l'apparition des métastases osseuses.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les souris concerneront la douleur et la maladie puisque les souris vont développer des tumeurs selon trois approches : xénogreffes sous cutanées, xénogreffes orthotopiques protatiques ou tumeurs spontanées. Pour les xénogreffes sous cutanées (Procédures 1, 2 et 5), une injection souscutanée de cellules tumorales sera réalisée au niveau du dos sous anesthésie générale. Il n’y aura pas d’autres nuisances causées par d’autres actes expérimentaux par la suite hormis les différents traitements (chimiothérapies, anticorps) que subiront les différents groupes de souris et qui seront injectés en intra-péritonéal. Pour les xénogreffes orthotopiques protatiques (Procédure 3), une injection intra-prostatique de cellules tumorales sera réalisée également sous anesthésie générale. Un acte chirurgical sera nécessaire. Il n’y aura pas d’autres nuisances causées par d’autres actes expérimentaux par la suite hormis les différents traitements que subiront les différents groupes de souris et qui seront injectés en intra-péritonéal. Cependant, chaque semaine, la progression de la maladie sera surveillée par imagerie petit animal à bioluminescence (non invasif) et une anesthésie générale à l’isoflurane sera nécessaire. Enfin, en ce qui concerne les tumeurs spontanées (Procédure 4), les souris recevront une administration de tamoxifène par injection intrapéritonéale une fois toutes les 24 heures pendant 5 jours consécutifs afin d’induire la délétion d’ORAI3 spécifiquement dans la prostate. Il n’y aura pas d’autres nuisances causées par d’autres actes expérimentaux par la suite hormis les différents traitements que subiront les différents groupes de souris et qui seront injectés en intra-péritonéal. Cependant, chaque semaine, la progression de la maladie sera surveillée par imagerie petit animal à rayon X (non invasif) et une anesthésie générale à l’isoflurane sera nécessaire. En ce qui concerne les nuisances ou effets indésirables attendus et engendrés par suite des expérimentations (conséquences, phénotype), les souris vont développer des tumeurs et donc des douleurs pourront apparaître avec une détérioration progressive de l’état générale. Ainsi, pour chaque procédure des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum, sans remettre en cause les résultats du projet sont présentés.

Devenir

Tous les animaux des différents protocoles seront euthanasiés sans douleur à la fin de chaque procédure expérimentale afin de récupérer les tumeur pour réaliser des analyses omics.

Remplacement

Les caractéristiques morphologiques, physiologiques et immunologiques de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. De même, l’influence de l’innervation qui est un paramètre que nous souhaitons examiner n’est pas reproductible in vitro. La délétion de manière inductible et spécifique dans les cellules épithéliales de la prostate permettra d’évaluer précisément le rôle de la protéine ORAI3 au sein d’un microenvironnement composé de différents type cellulaires (cellules nerveuses, stromales, immunes) dans différents contextes physiologiques et physiopathologiques. De plus, l’utilisation d’animaux d‘expérimentation comme la souris est particulièrement pertinente dans le cadre de la recherche en cancérologie afin de confirmer in vivo l’intérêt de nouvelles associations de chimiothérapies ou l’utilisation d’un anticorps monoclonal thérapeutique dont nous avons montré in vitro l'efficacité

Réduction

Afin de réduire la variabilité des résultats, l'environnement des souris et leur statut sanitaire seront contrôlés. Des tests statistiques appropriés ont été utilisés afin de déterminer le nombre nécessaire et suffisant de souris par lot. La randomisation sera également appliquée afin de supprimer certains risque de biais. Au total, ces mesures permettent de réduire au maximum le nombre des animaux utilisés pour les procédures expérimentales.

Raffinement

Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans des cages adaptées en termes de surface et 3 enrichissements seront prévus (tunnel, coton, igloo rouge) pour réduire le stress des animaux. Aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. L'environnement des animaux, l'équipement, système d’abreuvoir, la qualité de l’eau, la nourriture et la litière seront contrôlés régulièrement. L’état de bien être des souris sera également évalué quotidiennement par l’observation des signes physiques, physiologiques et comportementaux (perte de poids, aspects du pelage, morsures...). Lors de chaque anesthésie, la température des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de coussins chauffants. De plus, un gel oculaire (à base de vaseline) est appliqué au niveau des yeux des animaux pour éviter tout dessèchement de la cornée à chaque anesthésie. Nous allons utiliser des analgésiques et/ou des anesthésiques locaux adaptés afin de prévenir et/ou réduire au maximum la douleur chez les animaux.

Choix des espèces

L’innervation du cancer de la prostate est un paramètre que nous souhaitons examiner et n’est pas reproductible in vitro. Le modèle murin est aujourd’hui validé pour l’étude de l’innervation du cancer de la prostate. Les protocoles seront réalisés avec des souris mâles âgées de 5 semaines. En effet, pour les expériences utilisant des souris immunodéprimées (nude) il est connu que les souris d'un âge plus avancé peuvent récupérer des lymphocyte T par rapport aux souris jeunes. Dès lors, pour les autres souris du projet et afin de pouvoir comparer les différents groupes nous utiliserons pour tout le projet des souris âgées de 5 semaines. Pour la procédure3: des souris plus âgées seront utilisées (8 semaines car il nous faut attendre la maturité sexuelle des mâles soit 8 semaines pour réaliser les injections intra-prostatiques). Pour la procédure 4: le développement tumorale sera induit par injections de tamoxifène sur des souris âgées de 15 jours et l'étude de survie durera 18 mois.

90 bars vont être utilisés, tous gardés en vie et susceptibles d'être réutilisés dans un autre projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en trois classes d'âge, ils sont exposés à des lumières de couleurs différentes puis filmés pour mesurer leurs réactions, afin d'améliorer la sélectivité des engins de pêche commerciale. Le porteur indique que l'acclimatation est volontairement écourtée à cinq minutes et le transfert mené sans anesthésie, pour maintenir un stress reproduisant l'entrée d'un poisson dans un chalut. Les retombées annoncées, des dispositifs lumineux laissant échapper les juvéniles, sont renvoyées au moyen et au long terme, l'étape immédiate restant la caractérisation du comportement des bars en bassin.

Objectifs

Les pêcheurs des eaux européennes sont obligés de ramener toutes leurs captures à terre suite à la mise en œuvre de l'obligation de débarquement de la politique commune de la pêche. Les captures comprennent les espèces qui ont une faible valeur commerciale, les petits poissons dont la taille est inférieure à la taille minimale autorisée et les espèces vulnérables qui sont habituellement rejetées en mer. L'objectif de l'obligation de débarquement est de réduire les prises accessoires et d'inciter à une pêche plus sélective. Le bar européen (Dicentrarchus labrax) fait partie des espèces capturées pour lesquelles il est nécessaire de trouver des techniques de pêche afin d’améliorer sa sélectivité. Par exemple, pour ne capturer que les adultes et laisser s’échapper les petits individus sous taille. Une des pistes pour améliorer la sélectivité est d’utiliser les réponses des espèces face à des stimuli lumineux. Des lumières sont régulièrement utilisées à l'intérieur des engins de pêche pour guider les petits individus vers les dispositifs d’échappement. Cependant, les réponses de chaque espèce, notamment du bar européen, ne sont pas connues et il est donc important de mener des expériences en milieu contrôlé sur cette espèce d’intérêt. En effet, il a été observé que les espèces se comportent différemment en fonction des couleurs utilisées. La réponse à la lumière d'un poisson peut être affectée par des facteurs biologiques, sociaux et environnementaux, tels que la sensibilité visuelle au cours du développement (i.e. juvéniles vs adultes), la présence de congénères ou les conditions de turbidité. Afin de caractériser la réponse à différents types de lumière chez le bar européen, nous allons utiliser des caméras sans lumière visible (caméras infrarouges et hydroacoustiques) afin de caractériser le comportement des individus dans le noir et lors de stimulations lumineuses. Les expériences seront réalisées individuellement et en groupe pour voir s'il existe une influence sociale dans la façon dont le bar européen réagit face à la lumière. Ce projet aura trois objectifs : 1, Observer comment le bar européen réagit à différents types de lumière. 2, Voir s'il y a une différence dans les réponses face à la lumière entre les adultes et les juvéniles. 3, Voir s'il y a une différence dans les réponses face à la lumière d’individus isolés et en groupe.

Bénéfices attendus

Le projet vise à quantifier les réponses du bar face à différentes lumières. A court terme, ces données fondamentales permettront de fournir de nouvelles informations sur les capacités visuelles de l'espèce. À moyen terme, elles permettront de déterminer quels types de lumière peuvent être installés sur les engins de pêche (par exemple, dans le chalut pélagique) pour être testé en mer sur le bar sauvage. À long terme, il s'agira d’équiper les engins de pêche de dispositifs sélectifs tels que des lumières pour sélectionner les bars adultes et guider les juvéniles pour qu'ils puissent s'échapper.

Procédures

Ils seront soumis à des tests lumineux qui les exposeront à des lumières de longueur d'ondes différentes. Seuls les bars adultes seront exposés deux fois à la lumière infrarouge pendant 45 minutes par individu. Les trois lots de bars seront exposés à la lumière rouge, bleue, verte et blanche deux fois pendant 90 minutes chacun.

Impact sur les animaux

Les nuisances seront liées à la pêche, au transfert entre bassin d'élevage et bassin expérimental, à l'isolement pendant les tests individuels et à l'exposition à des stimuli lumineux d'intensité moyenne. • Pêche et Transfert : stress léger d'environ 3 minutes pour pêche et transfert. Pour chaque bar adulte du groupe 1, il y a un total de 36 minutes de ce stress sur la totalité de la procédure. Par ailleurs, pour chaque juvénile du groupe 2 (> 1 an) et du groupe 3 (< 1 an), il y a un total de 24 minutes. • Isolement social : stress léger d’environ 15-30 minutes. Pour chaque bar adulte du groupe 1, il sera isolé 6 fois (2 fois x 3 tests) pendant 2 heures et 17 minutes dans la totalité de la procédure. Pour chaque bar juvénile des groupes 2 et 3, ils seront isolés 4 fois (2 fois x 2 tests) pour un total de 1 heure et demie. • L'habituation à un environnement nouveau : stress léger pour un total de 4 à 6 tests d'une durée de 1h30 à 2 h maximum. • L'exposition à stimuli lumineux de longueur d'ondes différentes : un stress léger pendant 45 à 90 minutes maximum.

Devenir

Tous les poissons seront gardés en vie à la fin de la procédure. Ils peuvent etre réétudiés dans le cadre d'un nouveau projet.

Remplacement

Les réponses comportementales et les trajectoires de nage doivent être observées chez des individus vivants et en bonne santé. En effet, la modélisation de comportements face à la lumière ne pourrait être pertinente en l’absence d’observations empiriques sur l’espèce considérée. L'observation préalable des bars dans un environnement contrôlé permettra ainsi d'identifier les changements de comportement de nage face à la lumière exclusivement. Cela n’est pas réalisable en conditions de pêche commerciale à cause des nombreux autres facteurs entrant en jeu.

Réduction

Trois différents stades de développement du bar sont pris en compte pour observer les différences dans les réponses à la lumière à mesure que la capacité visuelle et comportementale du bar se développe avec l'âge. Pour chaque stade, 30 individus sont considérés. Les juvéniles du groupe 2 (> 1 an) et du groupe 3 (< 1 an) subiront 2 tests tandis que les adultes du groupe 1 (4 ans) subiront chacun 3 tests. Cela permettra d’obtenir 10 réplicats de groupes tout en maintenant un nombre d’individus total réduit. Par ailleurs, seuls les adultes seront utilisés pour confirmer leur incapacité à voir dans le spectre infrarouge. Des tests statistiques ont été utilisés pour déterminer le nombre de poissons qui seront étudiés et qui ont été précisés pour le comité d'éthique. Les précisions techniques ne sont pas ajoutées pour la version publique.

Raffinement

Les tests seront effectués après un jeûne de 24h pour éviter les régurgitations pendant les pêches et transferts et ainsi éviter le mal-être des poissons. Les bars ne subiront pas d'anesthésie lors du transfert dans les bassins (réduction de leur espace disponible) et les temps d’acclimatation seront courts (5 min) afin de créer et maintenir un stress lié à la réduction de leur espace qui se rapprocherait de la compartimentation subie lors de l’entrée d’un bar dans un chalut de pêche. En cas de difficulté à capturer les individus pour leur transfert, le niveau de l’eau du bassin d’élevage sera abaissé. Le transfert des poissons d'un bassin à l'autre se fera individuellement à l'aide d'un seau opaque avec couvercle d’un diamètre 50 cm pour les adultes (taille totale ≤ 40 cm) et 30 cm pour les juvéniles (taille totale ≤ 25 cm). Le transfert se fera à pied sur une distance de 10 m et durera moins d’une minute. La présence humaine sera réduite au maximum en installant une caméra optique suspendue et une caméra hydroacoustique sous-marine. Les matériaux qui seront immergés dans le bassin expérimental avec les poissons seront inertes et sans partie pointue afin d’éviter de blesser les bars s'ils entrent en contact avec les équipements.

Choix des espèces

Le bar est une espèce d’intérêt halieutique, écologique (top prédateur et espèce migratrice avec présence saisonnière) et commercial (forte valeur économique et importante pression de pêche sur l’espèce) qui pose plusieurs problématiques de sélectivité dans le cadre de la Politique Commune de la Pêche et l’interdiction des rejets. Trois stades de développement du bars seront utilisés (adultes, juvéniles > 1.5 ans et juvéniles < 1 an). Les adultes et les juvéniles sont généralement ceux qui sont pris dans les engins de pêche, mais seuls les adultes sont ciblés par les pêcheurs. Ici, nous visons à déterminer les différences de réponses face à des stimuli lumineux selon leur âge/développement, en partant du postulat que les réponses phototactiques et capacités visuelles peuvent varier entre les stades de développement. Ces différences pourraient aider à la création de dispositifs sélectifs pour réduire la capture des juvéniles tout en conservant les adultes.

610 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par gavage d'un ver intestinal puis par un parasite de la malaria, subissent des prélèvements sanguins trois fois par semaine, puis une ponction cardiaque suivie de la mort par dislocation cervicale. Le porteur décrit une infection le plus souvent asymptomatique et une anémie transitoire liée à une souche de plasmodium "non létale", et tue toute souris dont l'état se dégrade. Il présente la souris comme le "modèle de choix", ces interactions à trois partenaires ne pouvant selon lui être reproduites in vitro, l'étude portant d'abord sur la capacité d'adaptation du ver.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’adaptation à la coïnfection entre un nématode intestinal et un des agents de la malaria murine, en termes de la capacité à réguler la réponse immunitaire de l’hôte. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et en effet on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection peut entrainer des dynamiques très différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela peut également avoir des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, un des paramètres clé déterminant la dynamique de la coïnfection est la capacité des nématodes intestinaux à moduler la réponse immunitaire de l’hôte. Cette capacité d’immunomodulation a pour objectif de favoriser la persistance des vers au sein de l’hôte. Cependant, un hôte dont la réponse immunitaire est sous exprimée devient également plus susceptible à l’infection par d’autres pathogènes. La question que nous souhaitons aborder ici est donc la suivante : Y a-t-il un potentiel d’adaptation du nématode aux conditions de coïnfection qui limite le niveau d’immunosuppression de l’hôte ?

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier le potentiel d’adaptation d’un nématode intestinal à la coïnfection avec plasmodium en termes de sa capacité à immunomoduler l’hôte. Ces deux parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Notre projet vise donc à contribuer à élucider le rôle que la manipulation de la réponse immunitaire par le nématode pourrait jouer dans le risque encouru par ces populations où helminthes et paludisme sont endémiques.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : gavage (200 µl d’eau de boisson à l’aide d’une sonde souris, une seule fois, durée

Impact sur les animaux

Nous attendons peu d’effets indésirables sur les animaux. Le nématode intestinal produit des infections asymptomatiques dans le sens qu’aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté et ceci basé sur de centaines de souris infectées au cours de ces 10 dernières années. Dans des très rares cas, l’émergence des vers adultes dans la lumière intestinale peut provoquer une augmentation de la perméabilité intestinale et un passage de LPS dans le sang. Etant donné que les animaux sont surveillés quotidiennement et deux fois par jours pendant la période d’émergence des vers, si on constate une détérioration de l’état de santé des souris (p.ex. état de prostration) elles sont immédiatement retirées de l’expérience et euthanasiées par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane. La souche de Plasmodium yoelii que nous allons utiliser s’appelle 17X NL où l’acronyme NL signifie « non létal ». Nous avons déjà effectué des infections de C57BL/6JRj avec cette souche de plasmodium et avons pu constater qu’aucune mortalité n’intervient. Le seul symptôme observable associé à l’infection par Plasmodium yoelii 17X NL est une diminution du nombre de globules rouges (anémie). Cette diminution est cependant transitoire (elle se produit entre les jours 14 et 22 post-infection) et après J26 les valeurs reviennent à la normale. Le gavage est réalisé en quelques secondes, à l’aide s’une sonde souris, et ne comporte de nuisances particulières si ce n’est le stress lié à la contention de l’animal. Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois avec un petit volume d’eau (200 µl). Les injections i.p. sont réalisées après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). Comme pour le gavage, chaque individu ne reçoit qu’une seule injection. Les micro prélèvements de sang à l'extrémité de la queue sont aussi réalisés après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). Les prélèvements de fèces sont effectués en isolant les souris (afin de pouvoir identifier l’appartenance de l’échantillon à chaque individu). Cependant, les souris ne sont isolées que pendant 1 heures, étant pour le reste hébergées en groupe (5 souris par cage). Etant donné que deux prélèvements sont effectués par semaine, le temps passé en isolement ne constitue que 1% du budget temps hebdomadaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés dans d’autres expériences, n’ayant plus une réponse immunitaire naïve par rapport aux parasites utilisés.

Remplacement

L’objectif de notre étude est d’évaluer l’adaptation d’une espèce de nématode intestinal à la coïnfection par plasmodium en termes d’immunosuppression de l’hôte. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

L’effectif de souris utilisé dans cette expérience a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 5 souris par passage pour chaque groupe expérimental, et 15 souris tests dont l’objectif est de vérifier si les paramètres mesurés ont dévié par rapport à la génération initiale. Le nombre de 15 souris est le plus petit possible car 5 souris sont mises à mort pour chaque jour de prélèvement. Afin de réduire ultérieurement le nombre total de souris, nous avons décidé de ne répéter l’expérience qu’une fois. Par ailleurs cette répétition ne concerne que les souris tests et non pas les souris utilisées pour les passages. Au total, avec les répétitions, 610 souris seront nécessaire sur une période de 3 ans.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans cette expérience. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (minimum 5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Lors des prélèvements de fèces, les animaux ne sont isolés que pendant 1 heure, ce qui représente 1% du temps hebdomadaire passé en isolement. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Les injections et prélèvements de sang sont effectués après application d’un anesthésiant local pour éviter toute douleur. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.

679 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de lymphome humain, sous la peau ou dans le tibia, puis des traitements répétés par gavage, injection ou voie intraveineuse et une imagerie hebdomadaire pendant trois à six mois. Le porteur décrit une douleur aux sites d'injection, une perte de poids et une mobilité réduite à mesure que la tumeur grossit, et programme la mise à mort dès l'atteinte de points limites. Il reconnaît utiliser des lignées cellulaires in vitro mais juge le modèle murin "indispensable", les retombées pour les patients atteints de lymphome restant renvoyées "à terme".

Objectifs

Les lymphomes NK/T extraganglionnaires de type nasal sont des entités rares de lymphomes T périphériques associés au virus Epstein Barr. Ils se localisent le plus souvent au niveau de la sphère ORL mais peuvent également atteindre d’autres organes dans le cadre de formes disséminées extranasales. La survie globale à 5 ans des formes localisées est actuellement de l’ordre de 70%, alors que celle des formes disséminées ne dépasse pas les 40%. Ceci justifie le développement de nouvelles approches thérapeutiques basées sur des thérapies plus ciblées incluant des approches d’immunothérapie. Les thérapies ciblées permettent en effet une meilleure tolérance au traitement par la réduction des effets indésirables toxiques mais également une meilleure éradication de la tumeur. Elles peuvent s'utiliser seules ou en association avec la chimiothérapie conventionnelle. La compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des lymphomes NK/T est essentielle pour identifier et tester de nouvelles cibles pharmacologiques afin de compléter l’arsenal thérapeutique du clinicien et améliorer significativement les chances de guérison et de survie des patients. Plusieurs molécules candidates ont été identifiées grâce à des données préliminaires obtenues dans des modèles in vitro. Pour certaines d’entre elles, leur efficacité semble être modulée par la présence d’une mutation dans un gène d’intérêt. Ce projet a donc pour objectif de valider l’efficacité de ces molécules dans des modèles murins in vivo. Certaines molécules ont une action cytotoxique directe sur les cellules tumorales et peuvent donc être testées dans des modèles murins immunodéficients alors que d’autres ont pour mécanisme d’action une modulation de l’immunité anti-tumorale et doivent donc nécessairement être évaluées dans des modèles immunocompétents. Le projet se déroulera en deux étapes : -1ère étape : générer les modèles murins appropriés, qu’ils soient immunodéficients ou immunocompétents -2ème étape : tester l’efficacité des thérapies candidates dans ces modèles en évaluant l’impact du statut mutationnel pour notre gène d’intérêt.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’efficacité d'inhibiteurs pharmacologiques et d’immunothérapies déjà disponibles dans un modèle préclinique. L’objectif à terme sera de proposer un rationnel d’utilisation de ces médicaments dans les futurs protocoles cliniques de prise en charge des lymphomes NK/T.

Procédures

>Injection des cellules tumorales humaines (lignées) en sous-cutané : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • 1 seule fois par animal au cours de la procédure • durée : 1 min • 640 animaux >Injection des cellules tumorales humaines (cellules primaires) par voie intratibiale : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • 1 seule fois par animal au cours de la procédure • durée : 1 min • 39 souris >Prélèvement sanguin jugal : • souris vigile • bimensuelle puis hebdomadaire si présence de cellules tumorales circulantes, pendant 3 à 6 mois • durée : 1 min • 49 souris >Imagerie in vivo par bioluminescence : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • hebdomadaire pendant 3 à 6 mois • durée : 30 min • 679 souris >Administration de molécules thérapeutiques par gavage oral : • souris vigile • quotidien, à partir de J7-J10 post-injection, une fois par jour pendant 14 jours • durée : 30 secondes • 60 souris >Administration de molécules thérapeutiques par injection intrapéritonéale : • souris vigile • quotidien, à partir de J7-J10 post-injection, une fois par jour (ou tous les deux jours) pendant 14 jours (5 jours / semaine) • durée : 30 secondes • 450 souris >Administration de molécules thérapeutiques par voie intraveineuse caudale : • souris vigile • quotidien, à partir de J7-J10 post-injection, une fois par jour pendant 14 jours (5 jours / semaine) • durée : 30 secondes • 180 souris >Transfert adoptif de lymphocytes T OT-1 par voie rétroorbitaire : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • 1 seule fois par animal au cours de la procédure • durée : 1 min • 120 souris

Impact sur les animaux

Douleur aux sites d’injection des cellules tumorales (maxi : 3 jours) / Perte de poids / Mobilité réduite à cause de la croissance tumorale (1 semaine) / Stress lié à l’administration par gavage oral (14 jours)

Devenir

Mise à mort pour tous les animaux de toutes les procédures lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : • Atteinte des points limites (cf grille de score établie pour chaque procédure) • Indication à une greffe dans des receveurs secondaires • Absence de prise de greffe au-delà de 3 ou 6 mois (selon les procédures)

Remplacement

Compte tenu du coût des études cliniques chez l’homme et de la réglementation actuellement en vigueur, une étape intermédiaire de vérification des hypothèses dans un modèle préclinique est indispensable. Dans le cadre de notre projet : •Les cellules tumorales de patients (dites cellules primaires) ne peuvent pas être obtenues en quantité suffisante pour tester in vitro l’efficacité des molécules d’intérêt. De plus, ces cellules sont fragiles et ne peuvent être maintenues en culture suffisamment longtemps pour pouvoir mener des expériences pharmacologiques in vitro. •Les lignées cellulaires n’étant pas le reflet exact de la biologie des hémopathies, il est indispensable de tenter d’amplifier les cellules primaires via un modèle murin afin d’objectiver la pertinence thérapeutique d’une drogue en tenant compte de sa pharmacodynamie et pharmacocinétique. •Pour évaluer la réponse immune anti-tumorale et de sa modulation par les immunothérapies, le rôle du micro-environnement tumoral est absolument majeur dans la réponse au traitement, une dimension qui ne peut naturellement pas être appréciée dans les études in vitro / ex vivo. Pour toutes ces raisons, la souris reste le modèle préclinique indispensable pour l’étude des lymphomes NK/T et pour tester l’efficacité in vivo de nouvelles thérapeutiques, et ce, avant de pouvoir les proposer aux humains dans le cadre d’essais cliniques.

Réduction

Méthologie de réduction du nombre des animaux nécessaires à l’expérimentation : •Evaluation pharmacologique in vitro approfondie sur lignées cellulaires pour optimiser les concentrations de drogues et pour sélectionner un nombre restreint de drogues d’intérêt (déjà réalisé) •Quantification de la viabilité cellulaire avant toute injection dans les souris •Optimisation du matériel issu de xénogreffe par productions multiples •Réduction du nombre d’animaux au minimum, après estimation des effectifs afin de garantir l’obtention de résultats statistiquement recevables. •Utilisation d’un même groupe de souris contrôles traitées par placebo pour évaluer l’efficacité de plusieurs drogues administrées selon la même voie •Utilisation de l’imagerie par bioluminescence : ce système d'imagerie optique préclinique permet d’évaluer la croissance tumorale. Des signaux de bioluminescence et/ou de fluorescence peuvent être suivis de manière longitudinale ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux. Un suivi quotidien des souris sera effectué dans les 3 jours suivant l’injection des cellules tumorales. En cas de signes évocateurs d’infection ou de douleurs au site d’injection, du meloxicam sera administré. Nous avons également défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi bihebdomadaire de ces points limites permettra de minimiser la douleur des animaux en programmant leur mise à mort si nécessaire. Les procédures seront par ailleurs raffinées par un enrichissement des cages d'animaux. Les cages seront enrichies à l’aide de coton et de cabanes, pour répondre aux besoins de nidification et ludiques des souris. Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Les souris NSG seront hébergées dans une zone SOPF, en portoirs ventilés et manipulées sous hotte ou PSM, leur permettant ainsi de ne pas exprimer de phénotype dommageable. Les injections de cellules en sous-cutané, rétroorbitaire ou intratibiale, les prélèvements sanguins et l’imagerie par bioluminescence nécessaires au suivi seront réalisés sous anesthésie. Concernant les traitements nécessitant un gavage oral, les souris seront habituées progressivement aux procédures de gavage avant la phase de traitement.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes ont été décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour greffer les cellules hématopoïétiques humaines, étudier le développement des hémopathies humaines et servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouvelles thérapies. Concernant l’évaluation de la réponse immune anti-tumorale, le modèle de greffe dans des souris contrôles a déjà été validé dans la littérature. Pour les souris immunodéficientes : souris adultes entre 8 et 12 semaines, âge durant lequel la probabilité de prise de greffe est maximale selon les données de la littérature et l’expérience du laboratoire. Pour les souris contrôles : souris adultes entres 6 et 8 semaines, âge conforme aux données de la littérature