Oncologie

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection dans le sinus veineux situé derrière l'œil sous anesthésie, puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang par la joue sur deux à trois semaines, pour comparer des anticorps produits à partir de microalgues à des anticorps classiques. Le porteur présente l'enjeu comme économique, réduire le coût de production des anticorps, et annonce le bénéfice pour les patients à terme. Il affirme qu'après vérification in vitro il était "nécessaire" d'étudier ces anticorps dans un organisme au système immunitaire mature.

Objectifs

L’industrie pharmaceutique mise de plus en plus sur les anticorps thérapeutiques pour satisfaire les besoins de santé, encore nombreux. Cependant, l’industrie française a pris du retard dans ce domaine. Malgré une consommation importante de médicaments par la population française, seuls trois anticorps thérapeutiques sont produits en France (omalizumab, canakinumab, sécukinumab). Avec la prévalence croissante des maladies chroniques comme les cancers, les maladies autoimmunes et infectieuses telles que la COVID-19, le besoin en médicaments de type anticorps s’accroit considérablement. Ces médicaments sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Le coût de production de ces anticorps est très élevé. En conséquence, il devient indispensable de développer des systèmes alternatifs de production d’anticorps qui permettent de décroître leurs coûts de production et ainsi de les rendre plus accessibles. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels dirigés contre des virus comme le virus de l’Hépatite B ou le virus de Marburg. Nous produisons actuellement des bio-similaires d’anticorps anti-cancéreux. L'objectif du projet est donc de comparer la pharmacocinétique de ces anticorps produits à partir de microalgues par rapport aux anticorps génériques.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude, si ils valident le système alternatif de production d'Ac à partir de microalgues va permettre de diminuer considérablement leur coût de production et ainsi les rendre plus accessibles.

Procédures

Chaque souris recevra à J0 une injection intraveineuse unique via le sinus rétro-orbitale de 5 mg/kg d’anticorps dans un volume total de 200µl de PBS. Cette injection sera pratiquée sous anesthésie générale. Chaque souris aura des prélèvements sanguins, un total de 9 sur 2 à 3 semaines. Prélèvements de sang via les veines submandibulaires. L’ensemble des prélèvements sera effectué sous anesthésie générale à l’isoflurane 2.5% après une induction à l’isoflurane 5% dans l’air. Le volume de chaque prélèvement sera de 50µl récupéré dans des capillaires calibrés. Après chaque ponction une pommade antiseptique cicatrisante sera appliquée (Biseptine Cica gel).

Impact sur les animaux

Les gestes expérimentaux sur les animaux se limitent à une injection intraveineuse et des prélèvements sanguins qui ne devraient pas induire de nuisances ou effets indésirables particuliers compte tenu des mesures préventives prises et des précautions apportées à leur mise en oeuvre.

Devenir

Tous les animaux de l'étude seront mis à mort.

Remplacement

Les anticorps sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels, malgré une structure protéique identique certaines modifications post-traductionnelles peuvent intervenir et par conséquent modifier l'affinité des parties constantes pour les différents récepteurs aux FcGamma ou son immunogénicité. Après vérification in-vitro de ces différentes interactions anticorps récepteurs il était nécessaire d’étudier leur comportement dans un organisme vivant avec un système immunitaire mature et fonctionnel.

Réduction

Au-delà de l’utilisation du nombre minimum d’animaux pour obtenir une modélisation correcte de la pharmacocinétique de chaque anticorps, cette étude à terme permettra de remplacer les milieux de culture riches en sérum de veaux foetal par de l’eau de mer pour la production de ces anticorps. Le problème éthique majeur du sérum de veau foetal vient du fait qu’il provient du sang de foetus de vache, prélevé au moment de l'abattage de vaches gestantes. Le foetus est retiré du ventre de sa mère, et la totalité de son sang est prélevé par ponction cardiaque, le plus souvent sans anesthésie afin de garantir la qualité de l’échantillon. Ce nouveau mode de production permettra donc à court et à long terme moins d’utilisation de sérum de veaux foetal et donc d’animaux donneurs.

Raffinement

L’injection intraveineuse ainsi que les différents prélèvements seront pratiqués sous anesthésie générale à l’isoflurane. Afin de limiter le nombre de prélèvement sur chaque souris tout en garantissant un suivi sérologique optimal pour l’étude pharmacocinétique, les 16 souris seront divisées en 4 groupe de 4. De cette façon le nombre de prélèvements par individu sera divisé par 4, de plus les prélèvements seront alternés coté droit et gauche de la mandibule. L’innocuité de ces anticorps devant être totale, des points limites extrêmement précoces basés sur le mouse grimace scale et le poids seront appliqués :

Choix des espèces

La souris est un très bon modèle qui permet d'évaluer après modélisation le profil pharmacocinétique d'un anticorps monoclonal. La demi vie d'un anticorps et sa bio distribution au sein des différents tissus d'un organisme vivant sont dûs à un récepteur aux Fc des immunoglobulines G, le FcRn. Chez la souris il est totalement fonctionnel pour les IgG humaines ce qui permet d'évaluer la demi vie et la courbe de distribution par dosage cinétique des concentrations résiduelles dans le sang (volume périphérique) d'un anticorps choisi. Ces anticorps sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels, malgré une structure protéique identique certaines modifications post-traductionnelles peuvent intervenir et par conséquent modifier l'affinité des parties constantes pour les différents récepteurs aux FcGamma. Cette étude chez la souris permettra donc d'évaluer ces modifications potentielles. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 semaines pour que leur système immunitaire soit mature. Elles arriveront dans notre animalerie à l’âge de 6 semaines et seront acclimatées pendant 7 jours période nécessaire au développement d'un microbiote dépendant de notre animalerie.

980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un régime gras et sucré, une chirurgie du cerveau sous anesthésie, des injections sous-cutanées, dans le ventre et directement dans le cerveau, des prélèvements sanguins sur animal éveillé et des jeûnes de 6 à 16 heures, pour étudier le rôle d'un récepteur dans la régulation du poids. Le porteur renvoie au long terme les retombées annoncées, de nouveaux traitements contre l'obésité et le diabète. Il affirme qu'il est "nécessaire" d'étudier un "organisme vivant intègre" que ni les cultures cellulaires ni aucun modèle informatique ne pourraient remplacer.

Objectifs

Le système endocannabinoïde représente une cible thérapeutique potentielle pour combattre l’obésité et le diabète de par sa capacité à réguler la balance énergétique et le métabolisme glucidique. Le récepteur aux cannabinoïdes CB1, qui fait partie de ce système, est présent dans plusieurs organes impliqués dans le métabolisme énergétique et glucidique. Il est notamment présent dans certains neurones du cerveau et dans certaines cellules pancréatiques. Ce récepteur a différentes localisations subcellulaires (à la surface ou à l'intérieur de la cellule). Ces cellules sont aussi très sensibles aux changements d’alimentation et participent activement à la régulation du métabolisme pour maintenir à terme un poids et une glycémie stable. Une étude récente suggère un rôle d'un sous-type de récepteur CB1 dans la modulation de la fonction des neurones et des cellules pancréatiques. Notre objectif général est de comprendre le rôle de ce récepteur CB1 dans la balance énergétique et le métabolisme glucidique. Nous combinerons des approches pharmacologiques, comportementales, métaboliques, moléculaires et neuro-anatomiques.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir des informations sur comment l'organisme répond à la surcharge calorique, ainsi que de trouver de potentielles cibles thérapeutiques. Les bénéfices attendus à long-terme sont de permettre l'élaboration de nouveaux traitements pour l’obésité et le diabète.

Procédures

- Changement de régime alimentaire : le nouveau régime est plus gras et plus sucré. Il est palatable pour les animaux mais induit une obésité à long-terme. La consommation de ce régime durera entre une et 12 semaines. - Tests métaboliques avec prélèvements sanguins sur animaux vigiles : le suivi de la glycémie implique que les animaux soient non anesthésiés. - Chirurgie stéréotaxique (= cérébrale) et vasculaire, sous anesthésie générale, avec protocole d'analgésie post-chirurgicale. - Injections sous-cutanées, intra-péritonéales et intra-cérébro-ventriculaires : cela nécessite de prendre les animaux en contention pendant quelques secondes. - Jeune de 6h ou 16h

Impact sur les animaux

1. Stress induit par l’isolement en cage individuelle : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la prise alimentaire individuelle est nécessaire. 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce test nécessite de placer l’animal dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeun (6h ou 16h). La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10 à 15% du poids mesuré le jour précédent. 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. La peau du scalp et le périoste devant être incisés, une douleur post-opératoire est attendue. La perte de poids ne devrait pas durer plus de 3 jours (basée sur nos études antérieures).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour faire des analyses moléculaires.

Remplacement

Le but de notre activité de recherche est de comprendre les bases biologiques de la régulation de la balance énergétique et les mécanismes physiopathologiques menant à l’obésité. Lors d’un déséquilibre énergétique, plusieurs structures cérébrales entrent en jeu et communiquent, non seulement entre elles, mais aussi avec les organes périphériques. Il est donc nécessaire d’étudier un organisme vivant intègre, qui ne peut être remplacé par des techniques in vitro. Toutefois, nous réaliserons des tests pharmacologiques in vitro sur îlots pancréatiques en culture, ce qui limitera le nombre d’animaux. Cependant, le niveau de complexité dans une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que de nombreux mécanismes biologiques contrôlant la balance énergétique restent inconnus. Enfin, les modèles génétiques dont nous avons besoin pour tester notre hypothèse sont largement développés chez la souris.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement (le calcul est détaillé en 3.4.10). Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil à résonnance magnétique nucléaire, qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide d’un test t de Student (2 groupes) ou par analyse de variance (ANOVA) à 2 facteurs, suivie si nécessaire d’un test post-hoc de Tukey (plus de 2 groupes). Dans le cas des mesures répétées (évaluation de la prise alimentaire, du poids corporel dans le temps), des ANOVAs à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats seront utilisés

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 ou 7 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, un tunnel en carton pour se cacher et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

Le comportement alimentaire, la balance énergétique et les métabolismes glucidique et lipidique sont depuis longtemps évalués chez la souris, qui représente donc une espèce adéquate pour ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités sont développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité du génome murin et humain fait de la souris un bon modèle prédictif lors d’études d’inactivation de gènes. Toutes les souris arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 3 semaines. Les procédures expérimentales débuteront après au minimum 1 semaine d’habituation. Etant donné l’impact significatif de l’âge sur le métabolisme énergétique et glucidique, ces expériences seront réalisées sur des souris jeunes (4 semaines) ou plus âgées (24 semaines).

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une fibrose et des tumeurs du foie par injections répétées de deux produits chimiques, le DEN dès l'âge de quinze jours et le tétrachlorure de carbone deux fois par semaine pendant dix-huit semaines, avant d'administrer des inhibiteurs de l'inflammation seuls ou combinés à un anticancéreux. Le porteur affirme que l'évolution du cancer reste silencieuse et sans effet indésirable notable pour les souris, et qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer cette étude jugée trop complexe. Toutes les souris sont tuées pour prélever le sang et le foie.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique de molécules dans le cancer du foie. Pour cela, nous induirons chez la souris une fibrose et des tumeurs dans le foie pour reproduire la maladie humaine en leur administrant deux produits chimiques, le N-nitrosodiéthylamine (DEN, administré aux souris âgées de 15 jours), et le tétrachlorure de carbone (CCl4, administré aux souris 2 fois par semaine à partir de l’âge de 8 semaines pendant 18 semaines). A partir de la semaine 15 et pendant 4 semaines, les souris seront traitées avec deux molécules capables de soit diminuer les effets (antagoniste IL-1b) ou la production (un inhibiteur de l'inflammasomme NLRP3) d’une molécule de l’inflammation (IL-1b) pour étudier si elles sont capables de réduire le cancer du foie. Ces molécules ont donné des résultats prometteurs dans des modèles cellulaires au laboratoire. Elles seront administrées seule ou en combinaison avec le Sorafenib qui est médicament administré chez les patients atteints de cancer du foie à un stade tardif.

Bénéfices attendus

Les études proposées dans ce projet permettront de déterminer si des molécules permettant de diminuer les effets ou la production d’une molécule de l’inflammation (IL-1b) ont la capacité de réduire la progression du cancer du foie.

Procédures

Les souris seront soumises à : une injection d’un génotoxique ou son diluant en injection intrapéritonéale 15 jours après la naissance pour induire le développement de tumeurs ; deux injections par semaine d’une molécule favorisant le développement de la fibrose hépatique ou son diluant en injection intrapéritonéale à partir de l'âge de 8 semaines pour une durée de 18 semaines ; une administration de molécules ciblant une voie de l’inflammation ou leurs diluants en injection intrapéritonéale 2 fois par semaine les 4 dernières semaines (elles seront combinés pour réduire la fréquence des injections) ; une administration d’un traitement antitumoral ou son diluant en injection intrapéritonéale cinq fois par semaine. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 15 secondes par souris. Au moment du sacrifice, il sera réalisé un prélèvement de sang à la veine cave inférieure.

Impact sur les animaux

Ce modèle favorise le développement de tumeurs hépatiques (induites par le DEN) sur un foie avec une fibrose (induite par le CCl4) ce qui permet de se rapprocher de la physiopathologie du carcinome hépatocellulaire chez l’homme car la cirrhose représente un stade de la maladie qui précède l'apparition d'un cancer du foie. A ce stade, l'évolution du cancer est silencieuse (comme chez l'homme), les souris n'ont pas d'effets indésirables notables.

Devenir

Les animaix seront euthanasiés à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie.

Remplacement

Les méthodes alternatives consisteraient à réaliser des études in vitro. Cependant, celles-ci ne permettraient pas de répondre à la question posée. En effet, ce projet vise à étudier l'effet de deux molécules pharmacologiques ciblant la réponse inflammatoire seul ou en combinaison avec une molécule pharmacologique ciblant les cellules tumorales. Les effets des molécules ciblant la réponse inflammatoire vont avoir des répercussions sur de nombreux types cellulaires immunitaires et tumorales. Il n’est donc pas possible de trouver un modèle in vitro permettant de remplacer une telle étude dans laquelle la réponse physiopathologique étudiée est très complexe car elle met en jeu plusieurs types cellulaires (cellules tumorales et plusieurs types de cellules immunitaires). Nous avons recours à des animaux car il n’y a pas de méthodes alternatives.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats.

Raffinement

Nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait son euthanasie anticipée. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrées de coton pour faire le nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose.

Choix des espèces

La souris est le modèle couramment utilisé pour étudier les effets de molécules pharmacologiques dans la progression du carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, ce modèle permettant le développement de tumeurs hépatiques sur un foie avec une fibrose, et qui permet de se rapprocher de la physiopathologie du carcinome hépatocellulaire chez l’homme a été développé en 2014 chez la souris et est bien caractérisé dans cette espèce (Uehara T et al.Curr Protoc Pharmacol 2014). Le N-nitrosodiéthylamine (DEN) est un produit chimique qui induit des cancers du foie s’il est administré chez le souriceau de 15 jours car à ce stade les cellules hépatiques sont en forte prolifération ce qui rend plus facile l’induction d’un cancer du foie.

3 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont colonisées par gavage avec des souches d'Escherichia coli, soumises à un régime gras pendant plusieurs semaines à plusieurs mois et à des tests répétés de tolérance au glucose, certaines souches pathogènes pouvant entraîner une perte de poids déclenchant leur mise à mort. Le porteur qualifie le recours à l'animal d'"irremplaçable" pour ces bactéries et reconnaît ne pas avoir prévu d'analyse statistique préalable du nombre d'animaux. Toutes les souris sont tuées pour disséquer leurs tissus, un effectif de 3 360 justifié par la recherche d'un "seuil statistiquement valable".

Objectifs

Comprendre : i) les altérations du métabolisme du glucose et du microbiote intestinal induites par les infections à E. coli; ii) le rôle de l'inflammation intestinale dans les phénomene du point i); iii) comoprendre les mécanismes moléculaires selon lesquels les maladies métaboliques type obésité et diabète de type 2 predisposent aux infections.

Bénéfices attendus

Amélioration de la prise en charge des patients métaboliques et qui souffrent des maladies infectieuses à E. coli

Procédures

9 procédures : voir point 4. Durée de la procédure 1 de colonisation ~5 seconds, le temps du gavage; pour la procédure 2 high-fat diet courte durée, 4 semaines; pour la procédure 3 high-fat diet longue durée, ~3 mois; pour la procédure 4 IPITT 1 heure; pour la procédure 5 IPGTT 2 heures; pour la procédure 6 OGTT 2 heures; pour la procédure 7 IPPTT 2 heures; pour la procédure 8 injection de MCC950, ~5 seconds, le temps de l'injection; pour la procédure 9 de la NFS, durée de ~15 seconds, le temps du prélevement du sang.

Impact sur les animaux

Les expérimentations décrites ne sont pas censées induire de douleur et sont bien tolérées par les souris adultes. Pour les souches pathogènes, une perte de poids supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Eventuels états de prostration (pas prévus) et/ou isolement et poil hérissé seront aussi considérés comme points limites.

Devenir

Les souris resterons en vie à la fin de chaque procédure. Les souris seront mises à mort à la fin de chaque protocole complet indiqué en 3.4.10. La mise a mort est nécessaire afin de permettre la dissection des tissus pour réaliser les analyses moléculaires et identifier les facteurs moléculaires à la base des phénotypes observés.

Remplacement

Pas adaptable dans ce cas car si les études avec des cellules ont permis d’identifier et caractériser les dommages à l'ADN provoqués par les génotoxines, le recours à l’animal est irremplaçable pour ce type d'étude avec des souches bactériennnes. En effet, aucun modèle cellulaire ne permet de récapituler les processus de la colonisation intestinale bactérienne, de la translocation, c’est-à-dire la diffusion des bactéries vers les autres organes, ni d’évaluer, au niveau de l’individu, le rôle de la colonisation par des bactéries produisant des génotoxines sur la santé.

Réduction

Le chiffre de 3360 souris nous permettra d’atteindre un seuil statistiquement valable et donc de pouvoir interpréter les résultats obtenus. Cela permettra donc de ne pas répéter les expérimentations tout en respectant la réduction du nombre d’animaux employés (règle de 3 R). En ce qui concerne les points limites (critères d'interruption) pour le raffinement des protocoles, l’inhibition pharmacologique de l’inflammasome intestinal NLRP3 et les procédures de colonisation n’ont pas été rapportées pour induire de douleur chez l’animal et sont bien tolérées sauf avec certaines souches pathogènes. Pour ces souches spécifiquement, le temps d’expérimentation sera réduit afin de minimiser la mortalité. Une perte (non attendue) du poids initial supérieure à 20% ainsi que des éventuels états de prostration ou isolement nous conduiront à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Nous envisageons d’utiliser de souris mâles, dont la littérature montre une vaste gamme de données sur le microbiote intestinal.

Raffinement

Les expérimentations décrites ne sont pas censées induire de douleur et sont bien tolérées par les souris adultes. Pour les souches pathogènes, une perte de poids supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Eventuels états de prostration (pas prévus) et/ou isolement et poil hérissé seront aussi considérés comme points limites. Nous ne prévoyons pas une étude statistique à l’avance (analyse de puissance) car nous n’avons pas un pourcentage précis de modulation de variables que l’on va analyser.

Choix des espèces

Le microbiote intestinal chez la souris est désormais bien connu et sa structure ressemble à celle du microbiote intestinal chez l’homme. Pour cela, la translation des résultats obtenus chez la souris vers l’homme pourrait être faite rapidement (Serino et al., Acta Diabetol. 2013). Nous utiliserons des souris de 12 semaines d’âge au moment de la colonisation avec les souches bactériennes d’intérêt. Cette âge tient compte du temps d’acclimatation des souris en zootechnie (2 semaines), de l’éventuel protocole antibiotique (2 semaines) avant colonisation et du traitement par régime gras 60%HFD (4 semaines ou 3 mois, selon le protocole). Dans ce dernier cas les souris arriveront à l’âge de 6 semaines. Cette âge permet une réponse optimale des souris au régime gras diabétogène/obésogène pour l’induction des maladies métaboliques. Dans les autres cas sans régime gras les souris arriveront en zootechnie à l’âge de 10 semaines.

900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 720 tuées à l'issue et 180 expédiées vers des laboratoires clients. Ce prestataire induit à la demande des tumeurs mammaires par injection de cellules cancéreuses, avec un suivi par imagerie, des traitements répétés et des prélèvements sanguins, puis la mise à mort pour analyses. Le porteur décrit une offre de modèles tumoraux facturée à des chercheurs extérieurs, justifiée par 400 animaux déjà utilisés lors d'une autorisation précédente. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace "l'animal entier" pour étudier la biodistribution d'un composé.

Objectifs

Ce projet a pour but de mettre en œuvre, à la demande de chercheur extérieurs à notre laboratoire, des modèles de cancer mammaire et de les étudier par imagerie in vivo, à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments.

Bénéfices attendus

Le projet représente un ensemble d’études types qui pourront viser à comprendre des mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou à évaluer l'efficacité thérapeutique de nouveaux traitements.

Procédures

Induction de cancer mammaire : 1 seule injection par animal, cellules injectées sous anesthésie gazeuse dans le coussinet mammaire des souris. Cette procédure dure moins de 5 minutes. Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 9 semaines sous anesthésie générale soit 18 examens d’imagerie au maximum par animal dans une étude. Pour les techniques d’imagerie les plus longues, le temps est de 20 minutes maximum par examen. Traitements : au maximum 5 traitements par semaine pendant 6 semaines par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse sur animal vigile. Il faut 30 secondes au maximum pour administrer un traitement. Au cours d’une étude, un animal recevra au maximum 30 traitements. Prélèvement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire volume maximal de 130μL(en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours) pour une souris de 25g en alternant les joues gauche et droite .Il faut environs 30 secondes pour effectuer ce type de prélèvement et appliqué un point de pression avec un crayon hémostatique au point de collecte pour arrêter le saignement. On estime qu’un animal aura au maximum 9 prélèvements de sang sur 9 semaines d’étude.

Impact sur les animaux

Les dommages attendus sont liés au développement d'une tumeur mammaire et éventuellement à l'apparition de foyers tumoraux secondaires (dans les ganglions lymphatiques, le sang, le foie, les poumons, le cerveau, et les os). Néanmoins, ces foyers, qui peuvent être détecé par imagerie de bioluminescence.apparaissent lorsque la tumeur primaire est déjà proche de l’atteinte d’un point limite (>2cm3 ou apparition de nécrose). Les dommages attendus sont donc essentiellement liés à la tumeur primaire. Nous mettrons en place un suivi ainsi que des points limites pertinents permettant d’anticiper toute douleur ou stress qui pourrait être provoqué chez l’animal. La douleur infligée par l’injection des cellules et réactifs pour l'imagerie et les traitements, correspond à celle d’une piqûre d’aiguille. On s’assurera auprès du client que les molécules sont déjà connues pour leur non toxicité. Les molécules nouvelles seront testées au préalable selon un projet spécifique pour vérifier la tolérance avant de débuter ce type d’études en modèle cancéreux. De plus, les souris seront suivies grâce à nos grilles de scoring pour surveiller l’apparition d’effet secondaire tels que la perte de poids, modification de la physiologie ou du comportement.

Devenir

Les animaux de 3 études (180 animaux) seront uniquement induits pour des tumeurs, hébergés dans nos locaux pendant 1 semaine minimum, le temps de leur récupération complète. Il n'y aura aucun acte d'imagerie. Ils pourront ensuite être fournis à des clients demandeurs de ce modèle pour des travaux expérimentaux réalisés dans leurs locaux. Nous leur fournirons la grille de scoring des animaux de la semaine précédent l'envoi dans leurs EU. Les animaux de 12 études ( 60 x 12 =720 animaux) seront mis à mort à l'issue de la procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour une autre étude.

Remplacement

Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable. Avant de débuter les études chez l’animal, des tests d’efficacité in vitro seront effectués par nos clients sur des cellules de cancer mammaires en culture. Ainsi, les molécules qui ne présentent pas d’effet in vitro ne seront pas testées in vivo. De plus nous justifions l’utilisation de 900 animaux sur 5 ans puisque lors des 3 dernières années dans une DAP similaire à présent expirée, nous avons utilisé 400 animaux pour des études clients qui ont d’ores et déjà prévu de tester des candidats médicaments très prochainement.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en œuvre des techniques d’imagerie (bioluminescence, échographie, scanner, photoacoustique, imagerie radioisotopique, imagerie par résonnance magnétique, imagerie de fluorescence) qui permettent de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris.

Raffinement

Les animaux seront observés scrupuleusement et des points limites prédictifs (perte de poids >20%, nécrose de la tumeur, volume tumoral >2cm3, aspect général, physiologie clinique, locomotion) nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance au cours de l’expérimentation. De plus, durant les examens d'imagerie et l'induction du modèle tumoral dont la douleur est similaire a une piqure d’aiguille, les souris seront anesthésiées. Les symptômes potentiels liés au traitements sont principalement une légère perte de poids. Enfin, les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes, enrichies avec du celluron (Les souris utilisent chaque semaine ce petit cylindre de coton pour la fabrication d’un nid). Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

Certains types de tumeurs mammaires utilisées sont injectés à des modèles immunodéficients ce que l’on ne retrouve pas chez toutes les espèces mais quasiment uniquement chez la souris. Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses humaines et murines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 - 6 semaines, stade où les bourgeons mammaires ne sont pas complètement développés et où les conditions hormonales de la souris sont adéquates pour la croissance tumorale.