Oncologie

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont surveillées et pesées pour suivre l'apparition de tumeurs spontanées de l'endomètre, de la peau, des poumons ou du foie, avant des analyses post-mortem. Le porteur indique que la souffrance modérée découle de l'apparition des tumeurs et non des manipulations, limitées à la contention. Il présente un modèle vivant comme "indispensable" pour confirmer qu'un variant génétique identifié chez des patientes prédispose au cancer, et prévoit de tuer les mâles reproducteurs pour stocker leur sperme.

Objectifs

Chez des patientes présentant des caractéristiques évoquant un syndrome de prédisposition au cancer de l’endomètre, un variant spécifique d’un gène, a été identifié. Ce gène n’a jamais été précédemment impliqué dans la prédisposition au cancer chez l’Homme. Ce variant est absent dans la population générale. La surexpression du gène étudié est un facteur de mauvais pronostic dans plusieurs types de cancers (cancers du sein, de l’endomètre, du poumon et du foie). Par ailleurs, une étude a montré un effet tumorigène spontané au sein d’un modèle murin sur-exprimant le gène d’intérêt. Le variant identifié est situé dans un domaine de la protéine qui pourrait diminuer sa dégradation. Par conséquent ce dérèglement pourrait jouer un rôle dans la formation des tumeurs. Notre hypothèse est que le variant de ce gène conduit à une stabilisation de la protéine qui a un rôle essentiel dans le la machinerie de division des cellules. Ainsi, ce variant pourrait prédisposer à la survenue de cancers. L’objectif de ce projet est de confirmer le caractère pathogène du variant identifié chez des patientes, c’est-à-dire montrer qu’il est causal d’un nouveau syndrome de prédisposition tumorale. Un modèle murin porteur de ce variant est utilisé pour démontrer une prédisposition au développement de tumeurs. Par ailleurs, la compréhension du mécanisme de tumorigenèse associé à cette variation de gène, jamais décrite, présente un intérêt scientifique majeur.

Bénéfices attendus

Le variant et le gène impliqué n’ont jamais été décrits comme pouvant conduire à une prédisposition au développement de tumeurs ou de cancers chez l’Homme. Il y a donc un bénéfice direct pour les patients porteurs à confirmer le caractère délétère du variant pour permettre un diagnostic adapté. A plus long terme, l’analyse des tumeurs permettra sur le plan scientifique de mieux comprendre les mécanismes de la tumorigenèse associés à l’hyperactivation de cet oncogène, voire à tester des approches thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront uniquement observés et pesés pour vérifier le développement de tumeurs potentielles.

Impact sur les animaux

Des tumeurs sont susceptibles de survenir au niveau de l’endomètre ou bien la peau, les poumons ou le foie. Des méthodes non invasives seront utilisées pour évaluer l’apparition de ces tumeurs. Les nuisances expérimentales se limiteront aux stress de la contention et de la manipulation des animaux et les nuisances modérées sur les animaux seront donc la conséquence de l’apparition des tumeurs

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses post-mortem

Remplacement

La variation génétique identifiée a été caractérisée in vitro. Après confirmation du phénotype tumoral associé à la modification génétique testée, l’analyse des tumeurs développées sera une étape importante dans la compréhension du mécanisme de développement tumoral associé. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement auquel est soumis la cellule contenant la mutation. Un modèle vivant intégré est donc indispensable pour étudier les interactions entre la tumeur et ses organes cibles mais également avec l’organisme dans sa totalité. Ces modèles vont nous permettre d'étudier le développement de la maladie en essayant de mimer et comprendre leur mécanisme oncogénique.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé grâce à des outils statistiques. Par ailleurs, les mâles reproducteurs seront mis à mort afin de récupérer leur sperme en vue du stockage long terme de cette lignée et réduire ainsi le nombre d’animaux.

Raffinement

Le présent projet inclut uniquement une surveillance des animaux avec un suivi de croissance tumorale (si développement de tumeurs) par observation et pesée des souris. Aucune manipulation invasive n’est prévue. Nous n’anticipons pas de phénotype dommageable pour les souris sauvages mais pour les souris mutées on attend un développement de tumeurs spontanées. Si l’animal montre des signes de douleur des antalgiques lui seront administrés. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de définir les points-limite.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce souris a été fait pour plusieurs raisons : La souris est un mammifère comme l’Homme et sa physiologie est proche de celle de l'Homme, Le gène étudié est présent dans les deux espèces et l’acide aminé muté est également identique entre les 2 espèces, La souris est un modèle classique pour les modifications génétiques et est pertinent pour l’étude de la prédisposition génétique au cancer. Jeunes souris sevrées puis adultes

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un test de tolérance au glucose et un test à l'insuline avec prélèvements sanguins répétés, deux isolements de 48 heures et deux échographies sous anesthésie, sous régime enrichi en lipides, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur décrit un stress d'isolement et des lésions cutanées possibles liées au sur-toilettage, et présente ces tests comme "incontournables". Il indique combiner modèles cellulaires et animaux pour étudier une protéine impliquée dans une maladie mitochondriale.

Objectifs

Dans le cadre de ce projet nous nous intéressons à une famille d’enzymes, dont un membre de la famille est responsable d’une maladie mitochondriale caractérisée par des atteintes neuromusculaires sévères. A ce jour, les causes de cette pathologie sont inconnues. Récemment, en utilisant des cellules en culture, une sous-famille unique de ces enzymes dont les membres sont très similaires à l’enzyme responsable de la pathologie mitochondriale a été mise en évidence. Cette sous famille de protéines est également impliquée dans l’activité énergétique de la mitochondrie. Dans des modèles in vitro, un mécanisme pouvant expliquer l’atteinte mitochondriale observée chez les patients a été récemment décrit. Afin de confirmer que ce mécanisme est bien à la base de la pathologie et de la régulation du métabolisme énergétique mitochondrial, nous voulons étudier le rôle d’une protéine appartenant à cette sous famille. Pour cela un modèle de souris avec cette protéine désactivée a été généré. Nous voulons ainsi étudier les effets de la suppression de cette protéine en particulier sur les fonctions physiologiques en condition normale et sous régime riche en lipides. Nos objectifs spécifiques sont donc chez 36 souris : D’analyser les effets cardiaques et métaboliques en condition normale et en condition de régime riche en lipides. De mesurer les variations de la biochimie du sang en condition normale et en condition de régime riche en lipides. De réaliser une étude tissulaire en condition normale et en condition de régime riche en lipides.

Bénéfices attendus

La mitochondrie est un élément présent dans les cellules et jouant un rôle central dans plusieurs fonctions. Elles produisent l’essentiel de l’énergie nécessaire au bon fonctionnement des différents organes chez l’homme. Cette activité énergétique mitochondriale est donc cruciale et son altération entraine des maladies rares et sévères. A l’heure actuelle, plus de 120 syndromes mitochondriaux ont été décrits pour lesquels aucun traitement n’existe. Aussi, la compréhension des mécanismes régulant ces activités énergétiques mitochondriales représente une étape essentielle vers le développement d’approches thérapeutiques contre ces pathologies. Dans ce projet, nous souhaitons comprendre le rôle important joué par une protéine dans la régulation du métabolisme énergétique mitochondriale. Celle-ci fait partie d’une famille de protéines dont certains membres sont responsables de syndromes mitochondriaux et dont la fonction reste inconnue. A court terme, en comprenant le mode d’action et l’impact de notre protéine sur la mitochondrie, notre projet permettra d’établir les causes des pathologies mitochondriales associées à cette famille. A long terme, notre projet permettra d'identifier les cibles sur lesquelles agir afin d'améliorer les fonctions mitochondriales. Ainsi, une fois que nous aurons détaillé le mode d’action de cette protéine, nous souhaitons identifier des molécules actives sur celle-ci et utiliser ces molécules pour restaurer les fonctions mitochondriales dans des pathologies.

Procédures

Durant ce protocole, une cohorte de 36 animaux suivra une série de tests qui viseront à déterminer l'effet d'un régime enrichi en lipides sur les fonctions métaboliques. Pour cela, nous effectuerons un seul test de tolérance au glucose par souris, dans lequel l'animal reçoit une injection intrapéritonéale de glucose suivi de 5 prélèvements d'une goutte de sang à la queue afin de suivre sa glycémie ; tout comme peut le faire l'homme en cas de diabète. Un seul test de sensibilité à l'insuline par souris sera aussi effectué, assez similaire au précédent mais avec une injection intrapéritonéale d'insuline entrainant une réduction de la glycémie. Ce test permet de vérifier si un diabète de type I ou type II est installé chez l'animal. Ces deux tests durent environ 3 heures durant lesquelles l'animal est placé dans un tube de contention afin de prélever des gouttes de sang à plusieurs temps (5 gouttes sur la durée du test). Un test de calorimétrie permet de vérifier la consommation en oxygène des animaux et nécessite d'isoler les souris durant 48h, ce qui peut être un stress d'isolement. Ce test sera répété deux fois par souris. Néanmoins, elles retrouvent ensuite leurs groupes sociaux. L'échographie sera réalisée deux fois par souris, elle nécessite que l’animal soit sous anesthésie. La procédure dure environ 20 min par souris. Enfin, des prélèvements sanguins seront effectués en fin d’étude pour analyser des paramètres biochimiques. Ces prélèvements, un par souris, se font en quelques minutes.

Impact sur les animaux

Durant le projet, les animaux subiront un prélèvement sanguin, qui dure quelques minutes. Nous étudierons les mécanismes de régulation du glucose et la sensibilité à l'insuline. Dans ce protocole, les animaux recevront une injection d'insuline et de glucose, et subiront des prélèvements de gouttes de sang à intervalle réguliers sur une période de 3 heures, afin de suivre leur glycémie. Pour connaitre leur métabolisme énergétique, ils seront isolés pour une période de 48h. Ce test sera répété deux fois par souris. Cet isolement permet de connaitre la valeur de chaque individu et est indispensable pour pouvoir conclure sur ce paramètre. Les deux échographies se déroulent quant à elles sous anesthésie à l'isoflurane pendant toute la durée du test. Les animaux seront rasés et une crème dépilatoire hypoallergénique sera appliquée. Enfin, le régime enrichi en lipides peut entrainer la présence de lésions cutanées dues à un hyper-toilettage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour collecter des tissus qui seront analysés afin de déterminer l'impact de ce régime et de la mutation génétique sur les organes.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet, nous combinons l’utilisation de modèles in vitro et d'animaux. L’utilisation des modèles animaux est limitée aux études qui ne peuvent être conduites sur les modèles in vitro. Ainsi, les tests en conditions de régime riche en lipides et les analyses biochimiques, morphologiques et structurelles des tissus sont des impératifs incontournables de notre projet qui, en l'état des connaissances et des méthodes disponibles, ne peuvent pas s'affranchir de l'utilisation d'un modèle animal. En revanche, les investigations des mécanismes cellulaires et moléculaires sont développées sur des modèles cellulaires in vitro.

Réduction

D'un point de vue général, nous réalisons une grande partie de notre projet sur des modèles cellulaires in vitro et limitons autant que possible les approches expérimentales réalisées sur l'animal. Ces dernières sont uniquement destinées à valider/confirmer l'implication des processus révélés in vitro dans le domaine physiopathologique. Pour notre projet, nous avons procédé à une réflexion pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Nous avons établi strictement le nombre d’animaux nécessaire incluant mâles et femelles porteurs des génotypes KO et wild-type. de plus, les groupes contrôles et expérimentaux ont un fond génétique identique. Afin de limiter l'utilisation d'animaux, nous avons opter pour une approche intégrative où les animaux sont utilisés pour différents tests et analyses. Tous les types de tissus que nous souhaitons étudiés seront prélevés sur chacun des animaux utilisés. Pris dans son ensemble, le design de notre projet permet d'optimiser au maximum la quantité d’animaux nécessaire à sa réalisation.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Ainsi, durant le prélèvement sanguin, nous réaliserons des injections de sérum physiologique tiède afin de compenser la perte hydrique. Une surveillance accrue et quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux sera mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure, si ces derniers sont atteints nous procéderons à l'arrêt de l'expérience.

Choix des espèces

Le modèle expérimental utilisé dans ce projet et le modèle murin, largement utilisé dans le contexte de modifications génétiques. La souris est un modèle établit et solide concernant l’étude des pathologies mitochondriales. En effet, ce modèle permet d'exprimer fortement les syndromes mitochondriaux incluant les atteintes de différents systèmes, l’intolérance à l’effort et les déficits neurologiques. Les animaux seront utilisés à 8 semaines, soit le début de l’âge adulte.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intraveineuses de cellules qui induisent des tumeurs pulmonaires, puis des chimiothérapies, avant d'être tuées à J13 ou J17 pour prélever leurs poumons. Le porteur indique que l'injection provoque un stress lié à la contention et une douleur de faible intensité, et affirme s'appuyer sur plus de dix ans d'expérience du modèle. Il conclut que le recrutement des globules blancs au site tumoral ne peut s'appréhender in vitro et doit être confirmé dans un "organisme entier".

Objectifs

NLRP3 est une protéine largement décrite pour ses fonctions dans l’inflammation, dans des globules blancs appelés myéloïdes. Nos données préliminaires obtenues d’autres globules blancs appelés lymphocytes, isolés de souris montrent que NLRP3 est présent dans ces cellules. En l’absence de NLRP3 ces globules blancs ont une activité anti-tumorale marquée contre différents types de tumeurs. L’absence de NLRP3 dans ces globules blancs semble impacter le recrutement de ces cellules au site tumoral. Grâce à des cellules isolées des tumeurs de souris déficientes pour NLRP3 nous avons pu observer une différence dans l’expression de certains récepteurs membranaires suspecter d’être impliqué dans le recrutement des globules blancs déficients pour NLRP3. Le récepteur appelé CXCR3 interagit avec 3 molécules ayant des effets différents. Différentes lignées tumorales sont capables de les produire. Nous avons validé in vitro la différence de recrutement. Au regard de ces résultats, nous souhaitons aujourd’hui valider ces observations in vivo. En effet, la complexité de la réponse immunitaire anti-tumorale est telle que les résultats obtenus in vitro ne sont pas suffisants pour affirmer que les mécanismes de recrutement des globules blancs identifiés in vitro sont transposables à un organisme entier et qu’ils pourraient servir de cible thérapeutique. Pour confirmer nos hypothèses in vivo, nous utiliserons des souris contrôles ou déficientes pour NLRP3 comme donneurs de globules blancs. Ces globules blancs seront injectés à des souris ayant de tumeurs au niveau pulmonaire. Ainsi, nous pourrons comparer le recrutement des globules blancs contrôles ou déficients pour NLRP3 dans des tumeurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : - apporter des connaissances nouvelles concernant NLRP3. - évaluer si NLRP3 pourrait être une cible thérapeutique ou un complément à l’immunothérapie

Procédures

Les injections de cellules seront réalisées en iv sur souris vigiles (2 par souris, chaque injection dure quelques secondes). Les traitements par chimiothérapies seront réalisés en ip sur souris vigiles (4 par souris, chaque injection dure quelques secondes). La mise à mort sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane.

Impact sur les animaux

Les tumeurs seront induites dans les poumons suite à une injection intra veineuse dans la veine caudale. Cet acte peut engendrer du stress chez l’animal car il doit être maintenu dans un système de contention. L’injection induit une douleur de faible intensité au site de l’injection. Les foyers tumoraux au niveau des poumons permettent d’obtenir des résultats plus clairs et de meilleure qualité. Les animaux seront mis à mort à J13 ou J17 post-injection des cellules tumorales. A ce stade, il y a entre 100 et 200 foyers tumoraux sur les poumons (d’environ 1mm de diamètre) et cela n’impacte pas la vie des animaux (nous avons plus de 10 ans d’expérience sur ces modèles).

Devenir

Les 260 souris seront toutes euthanasiées afin de prélever les poumons

Remplacement

Nous avons déjà réalisé un certain nombre d’expériences in vitro pour caractériser les différences entre les CD8 issus de souris C57Bl6 et les CD8 déficients pour NLRP3. Ceci nous a permis d’identifier des marqueurs d’intérêt et des phénomènes à explorer in vivo. Malheureusement, le recrutement au site tumoral et l’implication dans la réponse immunitaire antitumorale ne peuvent pas être appréhendés in vitro à l’heure actuelle car ce sont des mécanismes trop complexes qui font intervenir plusieurs acteurs cellulaires et moléculaires.

Réduction

Dans un souci de réduction et étant donné que nous voulons confirmer des résultats obtenus in vitro, les expériences ne seront réalisées que 2 fois avec 5 souris par groupes et par des personnes parfaitement formées aux gestes permettant d’optimiser la reproductibilité. De plus, chaque expérience sera accompagnée d’une analyse complète de l’infiltrat immunitaire afin de récolter un maximum d’informations sur les mêmes souris sans avoir besoin de recommencer les expériences (1 lobe pour l’analyse de l’infiltrat et 1 lobe pour les marquages). Enfin, un « go-no go » est appliqué à la fin de chaque phase du projet. En d’autre terme si les résultats de la phase n ne confirment pas l’hypothèse, la phase n+1 ne sera pas réalisée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Ils seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (la fréquence de surveillance sera bien entendu augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux). Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.

24 poissons sauvages de quatre espèces (chevaines, brèmes, perches, gardons) vont être utilisés, relâchés vivants dans leur rivière plutôt que tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont capturés par pêche électrique, anesthésiés, puis reçoivent par chirurgie un émetteur acoustique implanté dans l'abdomen et une injection d'antibiotique. Le porteur suit leurs déplacements entre un affluent-refuge et le cours principal pour comprendre l'effet du changement climatique sur ces regroupements hivernaux. Il affirme que le comportement en milieu naturel ne peut s'étudier ni en conditions contrôlées ni par modélisation.

Objectifs

Évaluer l’impact du changement climatique sur les écosystèmes aquatiques continentaux passe par la connaissance des stratégies de sélection de l'habitat des espèces et de l’accessibilité des habitats. Ces stratégies sont dépendantes des espèces et du stade de développement des individus. La dimension thermique de ces habitats a été peu étudiée jusque là. Si la notion de refuge thermique froid estival a rapidement été identifiée, notamment dans le cadre de la gestion des espèces d’eau froide, des études récentes ont pu mettre en évidence l’importance de refuges chauds hivernaux, en particulier pour la croissance individuelle. Par ailleurs, des observations de terrain récentes ont mis en évidence la présence de "hot spots" plurispécifiques saisonniers de forte densité de poissons. Ces regroupements massifs pourraient jouer un rôle majeur dans la dynamique des populations et méritent à ce titre d’être étudiés précisément. Le projet testera l'hypothèse que les regroupements hivernaux de poissons sont déterminés par des discontinuités thermiques entre les affluent et la rivière principale lors des pics de froid hivernaux. Le objectifs seront (i) de renseigner les mouvements des poissons entre le cours principal et les affluents refuges en période hivernale, (ii) de mettre en évidence les déterminismes environnementaux de ces mouvements (température, débit) et (iii) d'évaluer l’impact d’obstacles à la migration sur ces mouvements. La réalisation du projet nécessite la capture de poissons lors du regroupement dans l'affluent, leur marquage par implantation chirurgicale d’un émetteur acoustique et le suivi de leurs déplacements par télémétrie active (recherche mobile-active sur le secteur d’étude). Quatre espèces de poissons seront ciblées du fait de leur présence avérée dans le regroupement et du fait de la diversité des stratégies d'utilisation de l'habitat qu'elles représentent.

Bénéfices attendus

L’hypothèse principale du projet est que les regroupements hivernaux de poissons constatés dans des affluents sont déterminés par des discontinuités thermiques entre ces affluents et le cours principal durant les pics de froid hivernaux. L’expérimentation de suivi par télémétrie acoustique active permettra de mieux comprendre l’arrivée des poissons dans un affluent et la destination (dispersion du banc) de ces poissons dans le cours principal. Ce projet apportera des connaissances essentielles à propos de la répartition spatiale et temporelle des poissons, notamment en cas de stress thermique. Une meilleure compréhension des besoins de connectivité entre tous les habitats fonctionnels (refuge, alimentation, reproduction) pour les poissons permettra de (i) mieux définir et gérer la continuité piscicole et (ii) protéger les zones refuges (refuges thermiques par exemple). Dans un contexte de changement climatique, la présence de refuges thermiques pourrait s’avérer déterminante pour la résilience de certaines populations. L’étude se focalise sur quatre espèces de poissons dont les exigences écologiques sont différentes, afin de suivre les déplacements des poissons après le regroupement dans le refuge thermique.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés individuellement et un acte chirurgical simple d'environ 5 min permettra d’implanter un émetteur acoustique dans la cavité générale. Le poids de l’émetteur est très faible par rapport à la masse du poisson marqué. Le poisson anesthésié est maintenu en immersion, de manière à ce que ses branchies soient constamment irriguées par la solution d’anesthésie, lui permettant de continuer à respirer. Enfin, une injection intramusculaire d’antibiotique à large spectre et longue action est réalisée pour limiter le risque d’infection.

Impact sur les animaux

Les poissons subiront un premier stress lors de leur capture, inhérent à la pêche électrique. Cette technique est réputée pour engendrer peu de mortalité. Ensuite le stress peut être généré par la manipulation des individus et par l’acte chirurgical réalisés par les expérimentateurs. Les conditions de stabulation et balnéation-sédation et une surveillance continue des poissons permettront de limiter au maximum le stress des individus manipulés. En cas de blessure ou de stress manifestes, les poissons seront mis à mort par immersion dans un bac avec un sur-dosage d'anesthésique.

Devenir

Tous les animaux capturés et tous les animaux opérés seront rapidement relâchés vivant dans leur milieu d’origine.

Remplacement

Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné qu’il s’agit d’étudier le comportement des individus en milieu naturel. De ce fait il n’est pas envisageable de réaliser cette expérimentation sur d’autres individus ni de réaliser ces expérimentations en conditions contrôlées. L’absence de connaissances quantitatives sur les déplacements annule également toute possibilité de modélisation. Le modèle poisson issu du milieu naturel est pertinent pour cette étude et ne peut donc pas être remplacé pour répondre à la problématique posée.

Réduction

Il s’agit d’une étude préliminaire et le nombre de poissons étudié est minimisé tout en assurant l’observation d’un nombre suffisant d’individus pour émettre des premières hypothèses à propos de leurs comportements. De ce fait, les analyses sont souvent descriptives et réalisées à l’échelle individuelle, tant la variabilité inter-individuelle des comportements est forte. Un petit nombre d’individus n’est donc pas un problème pour ce genre d’étude. Pour cette expérience, n=24 individus seront utilisés au total et relâchés vivants dans leur milieu d’origine. Ce total, qui correspond à un effectif de six individus prélevés (idéalement trois juvéniles et trois adultes) pour chacune des quatre espèces cibles sera suffisant pour effectuer des analyses biologiques classiques en télémétrie (comportement de déplacement) en limitant au maximum le nombre d’individus manipulés, permettant ainsi de respecter la règle réduction des 3 R.

Raffinement

Les poissons seront capturés et placés en stabulation le plus rapidement possible, dans des bacs de 80 L remplis d’eau de la rivière d’origine, renouvelée toutes les heures. L’expérimentation étant prévue en période froide (décembre – février), la température et l’oxygène dissous seront peu limitants. Un bulleur permettra d’assurer une parfaite oxygénation de l’eau des bacs. Le remplacement fréquent de l’eau des bacs empêchera le risque de choc thermique entre bacs ou entre milieu naturel et bacs. D’autre part les poissons ciblés resteront peu de temps dans ces bacs. Les autres poissons capturés (espèces non ciblées ou de masse trop faible) seront remis dans leur milieu d’origine directement. Les bacs seront munis de couvercles diminuant lumière, stress et tentative de fuite. L'anesthésie permettra de limiter la souffrance de l'animal lors de la mise en place de la marque. Cette marque ne dépassera jamais 2% de la masse du poisson dans l'air. Ces marques permettent de localiser individuellement les poissons sans obligation de les recapturer pour récupérer des données. Enfin une antibiothérapie préventive en intramusculaire permettra pour chaque individu marqué d'éviter les risques d'infection.

Choix des espèces

L’objectif est de caractériser le comportement de déplacement de poissons sauvages en milieu naturel entre le cours principal d’un fleuve et son affluent, où s’opèrent des regroupements hivernaux. Ainsi, seules les principales espèces déjà observées dans l'affluent sont pertinentes pour l’expérimentation. Les quatre espèces ciblées et les stades de développement retenus pour chaque espèce (juvénile et adulte) représentent différentes stratégies d’utilisation de l’habitat.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou par chirurgie dans le cerveau, puis des traitements, un suivi par imagerie et des prélèvements sanguins, avant une mise à mort pour prélever organes et fluides. Le porteur évalue de nouveaux médicaments contre les tumeurs cérébrales, des bénéfices situés à court terme mais "avant passage chez l'homme". Il affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution et que la souris est l'espèce la plus adaptée.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments dans des modèles pertinents de tumeurs cérébrales chez la souris. A noter, les tumeurs cérébrales touche plus de 360 000 personnes par an en France.

Bénéfices attendus

A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que les nouveaux traitements testées sont efficace et également d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage chez l'homme.

Procédures

Les animaux recevront 1 greffe de cellules tumorales soit par voie peu invasive (sous cutané) soit par chirurgie (injection dans le cerveau - durée de la chirurgie estimé à 5-10 min). Dès lors, des essais de traitements seront menés. En cas de prélèvement de sang ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume inférieur à 10 %. Une suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne < 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min).

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur chez la souris pourra à terme être associé à des effets secondaires. Dans ce contexte, la mise en place de points limites adaptés permettra de détecter ces signes au plus tôt. De même, l’utilisation de traitement novateur pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Encore une fois, la mise en place de points limites adaptés permettra d'agir rapidement. Les procédures chirurgicales intracérébrale repose sur la mise en place de protocoles chirurgicaux incluant une analgésie maitrisée ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies. L'ensemble des mesures décrites ci-dessus permet donc de réduire les contraintes potentielles pour l’animal à leur minimum.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le cancer du cerveau. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques (test de comparaison entre groupe véhicule et groupes traités.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.