Oncologie

40 souris diabétiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réutilisées d'un précédent projet, elles sont mises à jeun quelques heures puis placées de façon répétée en cage individuelle, pour les habituer à consommer des matrices alimentaires devant recevoir un actif régulant la glycémie. Le porteur indique que le jeûne et l'isolement répété peuvent générer un stress, et que ces souris sont mises à mort faute d'autre projet prévu. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut mimer le choix et l'intégration de la nourriture par un être vivant.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’habituer des souris diabétiques à la consommation de différentes matrices alimentaires dans lesquelles il est envisagé d’incorporer un actif breveté et commercialisé, un dérivé de lait, permettant de réguler la glycémie en réduisant de manière significative la glycémie postprandiale (après un repas) pour les personnes en pré-diabète. Il faut cependant s’assurer au préalable que les souris consomment ces matrices alimentaires sans présence de l’actif, le plus rapidement possible, nécessitant une habituation à cette consommation d’un aliment différent de leur régime habituel pour lever la réticence et/ou le rejet à manger un aliment nouveau (néophobie alimentaire). Cette habituation sera effectuée en 2 phases successives : au cours de la 1ère phase d’habituation, les matrices alimentaires seront placées directement dans la cage des souris pendant plusieurs jours, en leur laissant accès à leur régime habituel et sans mise à jeun préalable, puis au cours de la 2ème phase d’habituation, les matrices alimentaires seront placées dans une cage d’isolement dans laquelle les souris seront mises individuellement après une période de mise à jeun préalable pour qu’elles s’habituent à consommer les matrices alimentaires qui leur seront proposées, le plus rapidement possible, pendant également plusieurs jours. Pour réaliser ce projet, nous réutiliserons des souris diabétiques issues d’un autre projet autorisé (validité toujours en cours) au cours duquel les souris auront été soumises à une procédure expérimentale de classe modérée, et après une parenthèse thérapeutique ou "wash out" d’une semaine entre les 2 projets.

Bénéfices attendus

Le diabète correspond à une élévation prolongée de la concentration de glucose dans le sang (hyperglycémie). Dans le cas du diabète de type 2 (90% des cas de diabète), ce phénomène provoqué par une perturbation du métabolisme glucidique apparaît progressivement et insidieusement. En France, en 2019, près de 4 millions de personnes étaient identifiées diabétiques par l'assurance maladie et prenaient un traitement médicamenteux pour leur diabète (soit 5,3% de la population). A cela, s’ajoutent les personnes diabétiques qui s’ignorent. Cette prévalence ne cesse d’augmenter en France, particulièrement chez les hommes, les jeunes (80 ans). Les personnes diabétiques doivent s’astreindre à un régime spécial, avec notamment un contrôle voire la limitation très stricte de la prise d’aliments sucrés, ce qui peut impacter leur moral. Elles vivent parfois des problèmes de santé mentale comme la dépression, l’anxiété et les troubles de l’alimentation, voire ce qui est maintenant appelé l’épuisement diabétique qui est une des complications psychologiques les plus graves de la maladie. Les personnes qui en sont atteintes ressentent une profonde impuissance et un désespoir intense. Les industriels des secteurs pharmaceutiques et agroalimentaires cherchent donc des molécules et ingrédients pouvant agir sur la limitation du passage dans le sang des sucres ingérés lors des repas. Cette étude préliminaire est donc la base d’un projet consistant à développer des aliments fonctionnels pouvant être consommés par toutes les personnes y compris et surtout les personnes diabétiques. Permettre en effet aux personnes diabétiques de consommer à nouveau yaourts, céréales, chocolat ou barres nutritionnelles lors d’activités physiques leur redonnerait un confort de vie plus important et limiterait la survenue de pathologies associées telles que celles décrites précédemment.

Procédures

Aucun prélèvement et aucune procédure chirurgicale ne sera réalisé sur les 40 souris diabétiques nécessaires à la réalisation de ce projet. Elles seront mises à jeun pendant quelques heures puis placées en cage individuelle sur des temps très courts mais de façon répétée, ce qui pourra engendrer un stress. La période de mise à jeun correspondra cependant à la phase diurne au cours de laquelle la prise alimentaire est très faible chez la souris. Quant au placement en cage individuelle, il sera nécessaire pour contrôler que chaque souris consomme ou non la matrice alimentaire qui lui a été proposée.

Impact sur les animaux

La mise à jeun des souris pendant quelques heures ainsi que le placement en cage individuelle sur des temps très courts mais de façon répétée, pourra engendrer un stress pour les souris. La période de mise à jeun correspondra cependant à la phase diurne au cours de laquelle la prise alimentaire est très faible chez la souris. Quant au placement en cage individuelle, il sera nécessaire pour contrôler que chaque souris consomme ou non la matrice alimentaire qui lui a été proposée.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 40 souris diabétiques db/db nécessaires à la réalisation de ce projet, réutilisées d’un autre projet autorisé, seront mises à mort à l’issue des expérimentations, aucun autre projet n’étant envisagé sur ce lot de souris.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo mimant l’alimentation, c’est à dire le choix et l’intégration de la nourriture par un être vivant. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre de souris diabétiques minimum nécessaire et suffisant issues d’une expérimentation précédente, après une parenthèse thérapeutique ou "wash out" d’une semaine entre les 2 études, afin d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base d’études précédentes réalisées chez le rat suivant le même protocole expérimental d’habituation qui sera suivi.

Raffinement

Les souris seront observées quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré 2 fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal est observée ou si des modifications du comportement des animaux sont observées (cachexie, vocalises, convulsions…), celles-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des feuilles de papier absorbant seront placées dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être.

Choix des espèces

La souris diabétique est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser cette étude dans le cadre d’un projet visant à développer des aliments fonctionnels pour les personnes diabétiques. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour évaluer l’effet de composés pharmaceutiques et alimentaires sur cette pathologie Les animaux seront des souris diabétiques âgées de 9 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour évaluer l’effet de composés pharmaceutiques et alimentaires sur le diabète

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime riche en graisses et en sucres, elles subissent sept prélèvements sanguins à la queue, un test de tolérance à l'insuline et des mesures répétées en tube de contention, pour évaluer l'effet de lipides bioactifs sur l'obésité. Le porteur indique que les tests peuvent stresser les animaux et qu'un isolement de quarante-huit heures est imposé pour l'analyse du métabolisme. Il justifie l'usage de la souris par le fait que ces lipides sont destinés à l'alimentation humaine et qu'il est donc "judicieux" de les tester dans l'alimentation d'un modèle animal.

Objectifs

Les lipides bioactifs sont présents en faible quantité dans les plantes, chez certains microorganismes et chez les animaux, en particulier le poisson. Les trois effets biologiques majeurs des lipides bioactifs sont : antioxydant, antimicrobien et anti-inflammatoire. Des études plus spécifiques sur les effets santé ont été menées ces dernières années et montrent qu'ils pourraient aussi impacter le métabolisme des lipides, l’insulinorésistance et le diabète, les maladies cardiovasculaires, voire certaines maladies neurodégénératives. Ces composés bioactifs de notre alimentation pourraient donc avoir des effets bénéfiques potentiels contre les problèmes métaboliques associés à une alimentation de type occidental. Ce projet concerne l'étude des effets curatifs d'une forme particulière de lipides bioactifs sur des souris obèses et fait suite à notre projet précédent qui a permis de mettre en évidence des effets bénéfiques lors d'un traitement préventif.

Bénéfices attendus

Les travaux de la littérature suggèrent que les lipides bioactifs possèdent un fort potentiel pour la santé dans le domaine de l’obésité et des désordres métaboliques associés. La forme que nous allons utiliser n'a pas encore été testée en dehors de notre laboratoire. Nous avons déjà pu mettre en évidence des effets bénéfiques dans le cadre d'un traitement préventif de l'obésité et nous souhaitons vérifier ces effets dans le cadre d'un traitement curatif. Notre hypothèse est que ces lipides bioactifs peuvent réduire l’obésité des souris sous régime enrichie en gras et en sucres et peuvent réduire la résistance à l’insuline et améliorer les troubles métaboliques associés. Ils pourraient être utilisés en alimentation humaine.

Procédures

Nous pratiquerons au total 7 prélèvements sanguins sur animaux vigiles par ponction à la queue (30 secondes par prélèvement). Nous respecterons les recommandations en terme de volumes et de temps de récupération car nous prélèverons moins de 7.5% du volume sanguin total en une semaine. Les animaux recevront deux injections intrapéritonéales (5 secondes par injection), une de solution d’insuline pour le test de tolérance à l’insuline, l’autre d’anesthésique au moment de l’euthanasie. Pour la mesure de composition corporelle hebdomadaire par IRM, l’animal sera mis en tube de contention 2 min, en tout 5 fois. Pour la mesure de motricité, l’animal sera déposé sur un cylindre en rotation 3 fois 5 minutes avec 20 minutes de repos entre chaque séance.

Impact sur les animaux

Les souris obèses recevront un régime riche en graisse et en sucre (type fast-food). Cet état est comparable aux personnes souffrant d'obésité. Les animaux pourront être stressés pendant les différents test non invasifs. Ils seront isolés pendant 48 heures pour l'analyse du métabolisme respiratoire.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements de sang et de tissus qui nous permettront de caractériser les effets métabolique et musculaire de notre lipide bioactif.

Remplacement

Les lipides bioactifs que nous allons étudier sont destinés à devenir un complément ou additif alimentaire pour prévenir, ralentir ou soigner le développement de l'obésité et des dommages associés chez l'Homme. Il est donc judicieux de les tester dans l'alimentation plus particulièrement chez un modèle animal.

Réduction

Pour chacune des procédures, le nombre d’animaux par groupe a été estimé sur la base de résultats obtenus par notre laboratoire et d’analyses statistiques pour définir le nombre minimal nécessaire. L'objectif étant d'utiliser ces lipides bio-actifs en alimentation humaine, nous les allons tester chez des mâles et des femelles.

Raffinement

Les souris seront hébergées par 2 pour mieux contrôler tout comportement d’agressivité et de bagarres chez les mâles. La nourriture sera changée tous les 2 à 3 jours afin d'éviter une perte d'appétence (rance). Les animaux seront manipulés avec un tunnel afin d'éviter la préhension par la queue et pour les habituer au test de composition corporelle qui est aussi réalisé dans un tunnel de contention. Pour les différents tests les animaux seront habitués au prélable au nouvel environnement et nous aplliquerons des points limites préalablement définis pour chaque procédure.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère pertinent pour les études du métabolisme. Nous pouvons obtenir des animaux mimant le syndrome métabolique humain. Les animaux seront âgés de 21 semaines à réception et de 6 mois pour l'euthanasie. D'après les données de notre fournisseur, ces adultes seront "obèses". Nous pourrons ainsi vérifier un effet curatif de nos traitements.

210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection de cellules tumorales, des traitements répétés et un suivi de la tumeur par imagerie sous anesthésie, pour tester des chimiothérapies adaptées aux sous-types de cancer colorectal. Le porteur indique que les traitements peuvent provoquer perte d'appétit et de poids, et que toutes les souris ayant reçu des cellules cancéreuses sont tuées pour prélèvement d'organes. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'étudier l'évolution dynamique du cancer colorectal, les molécules ayant déjà été sélectionnées in vitro.

Objectifs

Les cancers colorectaux (CCR) font partis des cancers les plus fréquents en France avec 43336 nouveaux cas en 2018 et représentent la deuxième cause de mort par cancer avec 17117 décès. Ils peuvent être classés selon un consensus de quatre sous-types moléculaires. Un de ces sous-types est notoirement résistant aux interventions thérapeutiques, comme démontré par des études précliniques et des observations cliniques rétrospectives. En se basant sur ce constat, nous avons réalisé des criblages pour identifier les médicaments qui agissent sélectivement sur de telles cellules. Nous avons donc démontré dans des expériences in vitro que 2 molécules sont particulièrement efficaces contre une lignée cellulaire humaine du sous-type résistant mais pas contre une lignée cellulaire non résistante. Nous souhaitons donc confirmer ces résultats in vivo afin de pouvoir par la suite trouver les schémas de chimiothérapie les plus adaptés en fonction des CMS.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique des chimiothérapies adaptées aux différents sous-types moléculaires spécifiques du cancer colorectal. Les résultats ont donc le potentiel d'améliorer les méthodes de traitement de certains cancers colorectaux.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales par animal. Cette procédure durera en moyenne 5 min. Par la suite, les souris seront manipulées brièvement 1min 2-3 fois par semaine pour mesurer la croissance tumorale. Les traitements se font sous anesthésie local par injection. une fois tous les 2 jours. L’injection prend 1 min. Une fois par semaine,la croissance tumorale et l’apparition de métastases sera suivi avec la machine d'imagerie en bioluminsescence : sous anesthésie générale (durée maximum 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à : - Une injection de cellules tumorales sous anesthésie, avec croissance tumorale limitée - L’injection de traitements - Un suivi de la croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine Ces différentes manipulations pouvent entrainer du stress chez l’animal. Les traitements chimiotherapeutiques peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris.

Devenir

Toutes les souris auront reçu des cellules cancéreuses, il n’est donc pas possible de les garder en vie à la fin de la procédure. Des prélèvements post-mortem d'organes et de tumeurs pour analyse seront également effectués.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour étudier l’évolution dynamique du cancer colorectal et trouver des chimiothérapies adaptées. Les traitements ont déjà été testés et sélectionnés in vitro sur des lignées cellulaires cancéreuses caractéristiques dérivées de patients.

Réduction

Pour la réalisation de ce projet, nous utiliserons des groupes de 10 souris (avec un maximum de 210 animaux) pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous chercherons à regrouper les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux contrôles. Les échantillons obtenus seront partagés avec des collaborateurs.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, au moins une fois par semaine et avant euthanasie lors de l’expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un élevage social (mais maximum 5 par cage, exclusion des souris agressives), animaux hébergés au calme. Les manipulations, injections et l’euthanasie seront réalisées à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les procédures expérimentales seront effectuées sous anesthésie.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : De par sa petite taille, la souris est un animal facile à manipuler et il est possible d’en héberger un nombre relativement important. C’est aussi un animal suffisamment grand pour pouvoir recevoir des injections de cellules tumorales. La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en technique et de suivi microbiologique et vétérinaire. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une transplantation de microbiote de patients par gavages répétés ou une induction d'arthrite par injection d'anticorps, l'implantation chirurgicale d'un capteur de télémétrie, puis un test de sensibilité tactile de von Frey, pour étudier le rôle du microbiote intestinal dans la douleur de la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur indique que l'induction d'arthrite peut provoquer diarrhée et déshydratation et que les mesures cardiaques imposent un isolement en cage individuelle. Il affirme qu'aucun modèle de substitution ou in silico ne convient, la perception de la douleur étant selon lui propre à "l'organisme conscient".

Objectifs

Il existe actuellement de très nombreux traitements pour les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR). Bien que ces traitements soient très efficaces sur l’inflammation, on observe chez 20 à 30 % des patients la persistance de douleurs chroniques diminuant grandement leur qualité de vie au quotidien. Ces patients présentent une sensation douleureuse déclenchée plus facilement que ches des personnes non atteintes. C'est la sensibilisation des voies nerveuses de la douleur. Ce mécanisme pathologique est responsable de la douleur chronique. De plus en plus de travaux montrent que le microbiote intestinal agit sur le contrôle de la douleur. On parle de l’axe intestin-cerveau. Cet axe repose entre autres sur les voies d'entrée de la douleur via le nerf vague parasympathique. Nous émettons l’hypothèse que le microbiote intestinal des patients atteints de PR est à l’origine de la sensibilisation de la douleur en modulant les neurones parasympathiques. Une fois altérés, ces neurones vont entrainer des douleurs pathologiques chroniques, malgré le contrôle l’inflammation articulaire. Notre objectif est d'évaluer in vivo l’impact du microbiote intestinal sur la sensibilisation à la douleur et sur la fonction du système nerveux parasympathique dans un contexte de polyarthrite rhumatoide. Nous voulons identifier quels facteurs issus du microbiote intestinal est/sont impliqué(s).

Bénéfices attendus

Une fois la preuve de concept apportée, l'analyse et la comparaison des souches bactériennes et métabolites du microbiote des différentes conditions (polyarthrite douloureuse, non douloureuse et de différents groupes contrôles), en fonction du stade clinique et de la sensibilisation obtenue in vivo permettront d’identifier quels facteurs du microbiote pourraient être impliqués dans ce mécanisme allodynique. Ceci ouvrira de nouvelles voies de recherche sur ce phénomène pathologique. De plus, une fois le facteur identifié, nous pourrons continuer d'explorer ce mécanisme in cellulo (neurones de ganglions jugulaires et noueux murins contenant les corps neuronaux des afférences du parasympathiques).

Procédures

Selon le groupe de souris, les animaux auront soit un transfert de microbiote intestinal de patients (4 gavages (durée 2 à 4 minutes) sur 4 semaines, précédés d'une semaine d'antibiotique par voie orale), soit une induction de polyarthrite rhumatoïde (injection d'anticorps anti-collagènes). Tous les animaux auront une implantation de capteurs de télémétrie sous-cutanée pour enregistrement de l'électrocardiogramme (2 mesures). L'implantation chirurgicale en sous cutanée dure environ 20 minutes. D'une manière hebdomadaire, des recueils de selles seront effectués et une pesée sera réalisée. Un test de détermination de la sensibilité tactile sera effectué à 2 temps du protocole (avant/après). La durée du test de Von Frey est d'environ 20 minutes par animal. Plusieurs prélèvements seront effectués en post-mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés à des fins d'enregistrement de l'electrocardiogramme devront être mis en cage unique. Concernant l'execution du test de sensibilité tactile (Von Frey), ce dernier sera mené de manière éthique et consiste à ne pas faire durer l'inconfort/la douleur d'un animal au cours du test. L’étude de la douleur se fera donc dans la recherche des seuils de douleur avec un cut off pour ne pas faire souffrir en excès les animaux. Concernant l'induction d'arthrite, l’injection de LPS peut entraîner des diarrhées et une déshydratation.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour éffectuer des prélèvements, soit pour récupérer le télétransmettteur de télémétrie.

Remplacement

Ce projet s'interressant aux mécanismes de régulation de la douleur par le microbiote intestinal, il n'existe pas de modèle de substitution ou in silico permettant d'étudier les mécanismes mis en jeu. Par ailleurs, la perception de douleur est un phénomène appréhendé par l’organisme conscient, et lui seul. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.

Réduction

Pour réduire la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris nécessaires pour démontrer un effet, nous utiliserons des lots d’animaux du même âge et du même genre au moment de l’initiation du protocole. Nous avons fait le choix de méthodes (télémétrie, von Frey), permettant le suivi des animaux dans le temps pour réduire le nombre de groupes utilisés et obtenir le maximum d'information sur chaque animal. AInsi nous étudierons les paramètres avant/après intervention sur le même animal. De plus, nous effectuerons les mesures d'ECG, de pharmacologie, les tests d'allodynie, les analyses de microbiote chez le même animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et augmenter la puissance statistiques des tests (tests appariés). Les tissus d'intéret (tissu nerveux, cardiaque, digestif) seront prélevés sur tous les animaux en vue de leur étude ultérieure.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans l’EU, régulée à 22-24°C avec un cycle jour/nuit 12h/12h, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau de boisson et un bruit de fond d’ambiance. Les conditions de stabulation sont effectuées en ambiance EOPS (pas de pathogène, pas d'opportuniste, pas de parasite) avec maintien en groupe dans des cages de taille appropriée avant inclusion dans le protocole. Les animaux sont stabulés en condition d'enrichissement intermédiaire (copeaux de différentes origine et texture, cotons et substrat de nichage, aliment accessible sur le substrat au besoin). Une visite quotidienne par un zootechnicien ou investigateur principal des animaux pour le suivi journalier est effectuée. L'ensemble des procédures sera réalisé avec l'objectif de réduire /limiter l'angoisse tout au long du projet, de limiter la douleur au seul besoin du projet (test d'allodynie de von Frey) en utilisant les méthodes appropriées d'analgésie et d'anesthésie lors de l'implantation des capteurs de télémétrie., et dans le respect de l'animal. Une grille d'évaluation clinique et des actions à mener en conséquences est mise en annexe. En particulier, le jour de l’implantation ECG, les animaux sont surveillés une fois par heure. Puis, les animaux sont surveillés une fois par jour. En cas de présence de douleur (échelons décrits dans la grille), un renforcement des visites sera conduit : Echelons 1 & 2 : 2 à 3 visites/jour; Echelon 3 : 4 visites/jour et 1 visite/heure en échelon 4. Si l’animal est inactif, incapable de se déplacer, avec les poils très hérissés, le dos courbé (possibilité de décubitus latéral) et des difficultés respiratoires ou bien avec les yeux fermés, et une perte de poids (>15% du poids initial), la mise à mort de l’animal est décidée.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de transfert de microbiote chez l’animal in vivo, permettent d’évaluer les conséquences fonctionnelles intégrées d’un microbiote précis. La régulation autonomique (afférences/éfférences) est largement similaire entra l'Homme et la souris, tout comme les mécanismes de l'allodynie. L'expérience du laboratoire dans le transfert de microbiote chez la souris, dans les investigations cardiaques et autonomique (HRV) permet d'éviter une mise au point/validation du protocole et la consommation d'animaux pour cela. Par ailleurs, un projet connexe sur le modèle murin est déjà en cours sur cette thématique au laboratoire. L’arthrite sera induite chez des animaux de 10 à 12 semaines d'âge comme cela est conseillé dans la littérature. Le protocole d’humanisation nécessitera 4 semaines et donc l’utilisation de souris âgées de 8 semaines pour qu’elles atteignent les 12 semaines au moment de l’induction de l’arthrite.

4 776 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections quotidiennes de molécules anticancéreuses pendant trois semaines, avec un suivi de la tumeur trois fois par semaine. Le porteur indique que les traitements peuvent provoquer perte de poids, diarrhée et cachexie, et que la croissance tumorale peut entraîner des métastases. Il affirme que le recours à des animaux vivants est "indispensable" parce que la réponse immunitaire à la chimiothérapie ne serait pas reproductible in vitro.

Objectifs

Les lysosomes sont des compartiments cellulaires impliqués dans la dégradation et le recyclage du matériel de la cellule. Les lysosomes ont un rôle important dans le bon fonctionnement des cellules mais une fois endommagés ils peuvent déclencher la mort des cellules. Depuis quelques années, un intéret important est porte en médecine sur les composés qui ont la capacité d’endommager les lysosomes et provoquer la mort des cellules cancéreuses en induisant la perméabilisation de la membrane lysosomale. Nous avons sélectionné in vitro plusieurs nouveaux composés capables d’induire la mort des cellules cancéreuses via la perturbation des lysosomes. Ce projet vise a tester le potentiel anti-cancéreux de ces molécules dans des modèles murins de croissance et vaccination anti-tumorale. Nos objectifs sont : i) déterminer les molécules les plus efficaces dans les modèles tumoraux; ii) étudier la réponse de l’immunité tumorale; iii) explorer l’effet thérapeutique des molécules en monothérapie ou en combinaison avec d’autres thérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique des nouvelles molécules anti-tumorales efficaces dans plusieurs types de cancer en monothérapie et/ou en association avec d’autres thérapies.

Procédures

Toutes les souris de ce projet seront injectées via sous-cutanée (1 fois) avec des cellules tumorales afin d’induire la croissance d’une tumeur. Les injections s.c. seront effectuées sur l’animal anesthésié (via anesthésie gazeuse) pour une durée maximale de 2 minutes. Les traitements anti-tumoraux seront administrés (maximum 1 fois par jour sur 3 semaines) via des injections intra-péritonéales, qui ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectuées sur l’animal vigile pour une durée maximale de 30 secondes. La mesure des tumeurs s’effectuera sur souris vigiles au moins 3 fois par semaine avec une durée maximale d’une minute à l’aide d’un pied à coulisse.

Impact sur les animaux

Les traitement anti-tumoraux peuvent induire une perte de poids/d’appetit et de la diarrée. Le site des injections pourrait s’infecter. L’induction de la croissance tumorale peut conduire à des effets indésirables (apparition de métastases, cachexie).

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, la réponse du système immunitaire à la chimiothérapie vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 4776 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, tapis chauffants,). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Pour nos études, nous utilisons principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé́).

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime gras, à des mises à jeun de vingt-quatre heures avec suivi de la température rectale, à des tests de tolérance au glucose et à l'insuline et à des échographies sous anesthésie, avant d'être mises à mort pour prélever leurs tissus, pour étudier le rôle de la protéine PTPIP51 dans l'adipocyte au cours de l'obésité. Le porteur indique que le régime gras entraîne une prise de poids et une insulinorésistance, l'effet de la délétion du gène restant inconnu. Il affirme qu'une validation in vivo est "indispensable" après des tests menés sur lignées cellulaires.

Objectifs

L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que la dysfonction adipocytaire joue un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. Notre équipe s’intéresse à différents facteurs qui contrôlent l’homéostasie de l’adipocyte. Des travaux récents de notre équipe ont démontré que les points de contact entre deux structures cellulaires, le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries sont des éléments importants de la bonne santé de l'adipocyte. Ces points de contacts sont appelés les MAM. Dans le foie, il a été montré que ces MAM contrôlaient la santé métabolique. Dans le tissu adipeux, le rôle physiologique de ces MAM n’a pas été exploré. Les MAM correspondent à des rapprochements des membranes de du RE et de celles des mitochondries. Ces rapprochements sont notamment permis par la présence de protéines de rapprochement comme la protéine tyrosine phosphatase-interacting protein 51 (PTPIP51). Le but du présent projet est de supprimer la présence de cette protéine (PTPIP51) de rapprochement dans l'adipocyte, chez la souris, pour tester l'effet que celà aura sur la santé du tissu adipeux et sur la santé métabolique globale de l'animal.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de démontrer le rôle des MAMs dans le développement des complications métaboliques associées à l’obésité. Si ce travail s’avère concluant, les MAMs du tissu adipeux pourraient être considérées comme une cible thérapeutique contre les complications cardiométaboliques du surpoids.

Procédures

A l’âge de 8 semaines, les souris sont mises sous régime gras. La mesure de glycémie requiert 3 microlitres de sang par mois. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. La mise à jeun se traduit par une privation de nourriture pendant 24 heures et un suivi de la température (sonde rectale + vaseline), de la glycémie (5 prélèvements de 3 microlitres) et des corps cétoniques (5 prélèvements de 3 microlitres) Les analyses d’échographie se font sous anesthésie 1 fois par mois pendant 20 minutes

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les procédures expérimentales, les nuisances principales sont liées aux injections, aux gavages et aux prélèvements à la queue. La mise sous régimes gras entrainnera une prise de poids et le développement d'une insulinorésistance. L'effet de la délétion de PTPIP51 est inconnue. Nous émettons l'hypothèse qu'elle accélrera le développement d'une insulinorésistance.

Devenir

Les animaux sont mis à mort et les tissus d'intéret sont prélevés.

Remplacement

Le but de notre projet est de valider l’importance des MAMs dans l’homéostasie du tissu adipeux. La solidité de l’hypothèse du rôle des MAMs dans le tissu adipeux est actuellement testée dans des lignées cellulaires et nous avons démontré que la déficience en PTPIP51 réduisait drastiquement les MAMS. Dans la continuité, une validation in vivo est indispensable pour étudier les conséquences de l’altération des MAMs du tissu adipeux sur la santé cardiométabolique. Les expériences proposées ici interviennent à un moment ou le rationnel est solide et/ou nos expériences chez l’animal sont indispensables pour observer l’effet de nos interventions dans les adipocytes matures et les réponses physiologiques intégrées.

Réduction

Le projet préconise l’utilisation d’un nombre total de 720 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés

Raffinement

Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, qui réduise la douleur. Nous utilisons des sondes de gavages en polypropylène qui réduise la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en terme de points limites gradés et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne (week-end) compris permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.

Choix des espèces

Le modèle adipoPTPIP51 est spécifique de l’adipocyte et nous avons déjà la démonstration que la déficience en PTPIP51 altère les MAMs. La mise sous régime gras permet de reproduire les conditions de surnutrition relative à l’étude du surpoids et de l’obésité. Ce modèle permettra d’étudier si la dérégulation des MAMs entraîne une dysfonction adipocytaire et si la dysfonction adipocytaire altère d’autres paramètres généraux de santé comme la sensibilité à l’insuline et la fonction cardiaque. Un modèle animal intégré est le seul moyen de tester ces éléments. Nous utiliserons des souris de 8 semaines au moment de la mise sous régime gras et donc du démarrage de l’expérience.

5 568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales pour développer des tumeurs pédiatriques, puis des traitements par voie orale et par injection pendant une quinzaine de jours, avant d'être mises à mort pour prélever leurs organes et leurs tumeurs, dans une étude de molécules inhibitrices d'épissage contre les cancers de l'enfant. Le porteur limite la description des effets indésirables aux tumeurs sous-cutanées du flanc et aux traitements. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte du comportement tumoral dans toute sa complexité.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer l’impact de modificateurs de la traduction des protéines comme immunomodulateurs sur la réponse anticancéreuse dans les cancers pédiatriques. Après plusieurs tests in vitro, nous avons isolé huit molécules candidates et ce, sur plusieurs lignées de cellules murines à l’origine cancers très graves de l'enfant.

Bénéfices attendus

Ces résultats démontreront les composants biologiques importants dans la traduction des protéines ont un potentiel dans les cancers pédiatriques avec comme objectif final l’identification de potentielles combinaisons médicamenteuses capables d’augmenter ultérieurement la survie des patients.

Procédures

Une injection unique de cellules tumorales sera réalisée pour le developpement des tumeurs pédiatriques (durée 5 minutes). Dans le cas de la voie d'administration per os, les souris seront administrées 2 à 4 fois par semaine pendant 2 semaines (durée 30 secondes). Un prélevement de sang unique, sera réalisé sous anesthésie générale. Les traitements par injection seront faits toutes les 24h, 48h ou 72h et ce durant 15 jours (durée 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels seront ceux liés à la présence de tumeurs uniques sur le flanc, sous la peau, ainsi que ceux liés aux traitements par injection ou administration orale.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés pour prélèvements d'organes et de tumeurs post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’évaluer les interactions entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi, la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique a recours à un modèle animal. Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d'appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents système au sein de l'organisme (systeme vasculaire, immunitaire...), l'utilisation des modèles appliqués in vivo reste donc indispensable. Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l'efficacité de nos molécules et leurs liens avec les mécanismes oncogéniques et metastiques des cancers mais également explorer et valider l'efficacitté de thérapies susceptibles d'être utilisées chez les patients.

Réduction

Une étude approfondie de la littérature a été menée avant d’initier ce projet pour s’assurer de l’absence de résultats publiés s’approchant des objectifs de notre étude. Le nombre d’animaux utilisé lors des expériences sera établi de façon à obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux utilisé tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d'utiliser un nombre suffisant d'animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan statistique. Les analyses statistiques seront effectuées en utilisant des tests non-paramétriques dont l'application ne requiert pas la vérification préalable de la normalité incompatible avec les petits échantillons.

Raffinement

Les animaux sont surveillés chaque jour afin de détecter toute modification dans le comportement/déplacement de l'animal. Les zones implantées sont également observées quotidiennement afin de detecter précocement un developpement de la tumeur. Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée. Pour la limiter, nous avons établie une grille d’observation visant à définir des points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et cadrant les mesures prises à l’apparition des premiers signes de contrainte/ douleur. Si nous détectons des signes de stress ou de douleur anormaux, nous donnerions un antalgique morphinique pour soulager les animaux. Toutes les injections seront précédées d'une anesthésie locale. Les animaux seront stabulés en groupe, avec accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un enrichissement du milieu est également apporté par des sizzlenests et de maisons en cartons.

Choix des espèces

Les modèles murins sont les modèles les plus utilisés pour étudier l’effet des médicaments sur la croissance tumorale. Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunocompétentes ce qui nous permettra d’évaluer au mieux les coopérations entre les cellules immunitaires et les cellules tumorales. Nous utiliserons des souris jeunes (animaux âgés entre 4 et 6 semaines au début de protocole) au moment de l’injection des cellules tumorales. Nous utiliserons des souris jeunes afin de pouvoir etudier nos molécules sur des cancers pédiatriques.