Oncologie

804 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur cérébrale leur est implantée, suivie d'une irradiation cérébrale fractionnée de 20 Gy, de gavages, d'injections et de prélèvements sanguins répétés, puis d'imageries sous anesthésie avant la mise à mort par perfusion intracardiaque. Le projet compare protonthérapie et rayons X combinés à l'immunothérapie, l'adaptation clinique restant annoncée au conditionnel. Le porteur affirme que ces expériences sont "absolument nécessaires" et qu'"on ne peut pas utiliser d'espèces moins évoluées que la souris".

Objectifs

La radiothérapie (RT) fait partie des traitements les plus utilisés chez les patients atteints de cancer. A l’heure actuelle, en France, 60% des patients diagnostiqués pour un cancer sont traités par RT. Pour les tumeurs cérébrales, tels que les gliomes, la RT fait partie du traitement standardisé. Nous avons précédement montré que l’irradiation aux RX pouvait modifier l’inflammation des tumeurs cérébrales, notamment en augmentant la proportion de macrophages pro-tumoraux. D’autres études ont montré l’impact de l’irradiation cérébrale sur la lymphopénie (diminution des lymphocytes sanguins). Contrairement à la RT conventionnelle qui utilise des photons de basse énergie (rayons X et γ), la protonthérapie utilise des particules chargées plus lourdes et de haute énergie. Parce qu’elle peut déposer de façon précise des doses d’irradiation dans le tissu, la protonthérapie peut être utilisée pour : i) limiter les risques de radiotoxicité en réduisant l’exposition du tissu sain, et ii) augmenter la dose déposée à la cible pour accroître la probabilité du contrôle tumoral tout en maintenant les doses pour le tissu sain environnant sous la limite du seuil de tolérance. Le premier objectif est d’appréhender si au-delà des avantages balistique/dosimétrique/radiobiologique, la protonthérapie pourrait présenter des avantages par rapport aux RX en termes d’inflammation anti-tumorale dans le cas d’une irradiation cérébrale. Le second objectif est de déterminer si la combinaison de la protonthérapie et de l’immunothérapie serait bénéfique pour le traitement des tumeurs cérébrales.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’améliorer les connaissances scientifiques sur les effets de la protonthérapie sur l’inflammation. De plus, cela permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques combinant la protonthérapie et l’immunothérapie (dont les tumeurs cérébrales sont très résistantes). Le projet scientifique global présente également une partie clinique dont le CPP a été accepté en décembre 2021. Les résultats du projet ci présent pourront ainsi être comparés aux données cliniques. Ainsi, l’ensemble de ces résultats pourra rapidement être adapté à la clinique dans le but d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de tumeurs cérébrales. Plus généralement, ce projet permettra d’appréhender en détail les relations entre la protonthérapie et les immunothérapies.

Procédures

Les animaux subiront plusieurs types d’interventions (irradiations, prélèvements sanguins, …). -Implantation de cellules tumorales : Les souris sont induites à l’anesthésie et vont subir cette procédure une seule fois qui dure environ 15min. - L'irradiation cérébrale est réalisée après anesthésie des animaux. Les animaux sont anesthésiés et lors de l’irradiation cérébrale par RX ou protons, une dose totale de 20Gy sera délivrée de manière fractionnée comme en clinique : 2.5Gy/séance avec deux séances par jour (espacées de 6h) sur 4 jours consécutifs. Les souris vont subir cette procédure une fois qui dure environ 5 min. - Prélèvements sanguins sous-mandibulaires seront réalisés sur souris vigiles. Les souris vont subir cette procédure 6 fois, une fois par semaine qui dure environ 20 sec. -Administration par gavage sera réalisée sur souris vigiles. Les souris vont subir cette procédure tous les jours pendant deux semaines qui dure 10 secondes. -L’administration par injection ip sera réalisée sur souris vigile. Les souris vont subir cette procédure tous les 2-3 jours pendant un mois maximum qui dure environ 10sec. - Imagerie par IRM/TEP, les animaux sont anesthésiés et vont subir des IRM qui dure environ 15 min et les souris vont subir des TEP Fludarabine qui dure environ 20 min. -Mise à mort par perfusion intracardiaque. Après une injection de buprénorphine 15 min avant la procédure, les animaux seront profondément anésthésiés et maintenus pendant la chirurgie.

Impact sur les animaux

-Li'rradiation par elle-même n’induit pas de douleurs, les points limites pendant la procédure d’irradiation vont correspondre à une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations/min. - Les répétitions bijournalières et ce sur 4 jours consécutifs peuvent induire une perte de poids des animaux jusqu’à 10 jours après irradiation. Le poids de chaque animal sera mesuré avant, pendant et 15 jours après irradiation et si une perte de poids >10% est observée, la procédure sera arrêtée. Le prélèvement sanguin ou l’injection de traitements journalier et hebdomadaire en eux-même ne provoquent pas de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. - Les séances d’imageries (TEP et IRM) en elles-même n’induisent pas de douleurs, les points limites vont correspondre à une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations/min. Si tel est le cas, le pourcentage d’isoflurane sera légèrement diminué et si cette fréquence de réaugmente pas, la procédure sera arrêtée. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil et ensuite replacés dans leur cage et rentrés à l’animalerie tous les soirs. Ils sont ensuite surveillés quotidiennement. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale peut induire des douleurs.

Devenir

En fin de protocole, les animaux seront mis à mort. Les organes seron ensuite prélevés pour réaliser à postériori des marquages immunohistologiques sur coupes de 20µm d'épaisseur. Les marquages permettront de suivre la quantité de macrophages et leur état d'activation ainsi que la quantité de cellules lymphocytaires et myéloides. Concernant la cytométrie en flux, elle nous permet de quantifier l'ensemble des cellules circulantes lymphoides (LT / LB / NK + les sous populations LT H; LT M; LT Reg ) et myéloides (Cellules dendritiques / monocytes / Myeloid derived Suppressor cells)

Remplacement

L’évolution du système immunitaire et ce en lien avec la circulation sanguine cérébrale après un traitement ainsi que la formation et l’évolution de l’inflammation tumorale ne peuvent pas être évaluées in vitro. Les expériences in vivo sont absolument nécessaires pour étudier l’impact d’un traitement et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient être transposées à la clinique, on ne peut pas utiliser d’espèces moins évoluées que la souris. La souris présente un système immunitaire similaire à l’homme et nous disposons d’un modèle in vivo de tumeur cérébrale bien maitrisé dans le laboratoire qui récapitule plusieurs caractéristiques retrouvées chez les patients.

Réduction

Afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour les analyses de cytométrie en flux, il sera nécessaire d’utiliser 10 animaux par groupes et ceci en prenant en compte la variabilité inter-individuelle basée sur notre expérience antérieure et de nos expériences antérieures. Afin de réduire le nombre d’animaux au maximum, à chaque fin de protocole, les tissus (cerveaux, rates et ganglions lymphatiques) seront prélevés pour des études histologiques. Pour les analyses d’imagerie et d’histologie à court terme, basé sur notre expérience antérieure, 6 animaux par groupe sera suffisant. L’imagerie nous permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux en évitant des euthanasies à tous temps. Des tests statistiques adéquats seront utilisés.

Raffinement

Si chute de la respiration pendant l'irradiation : Si tel est le cas, le pourcentage d’isoflurane sera légèrement diminué et si cette fréquence ne réaugmente pas, la procédure sera arrêtée. Les animaux sont surveillés tous les jours pendant toute la durée du protocole, week-end compris. Le poids des souris est suivi tous les 2-3 jours avant, pendant et deux semaines après l’irradiation. Si perte de poids dues aux protocoles d'irradiation: Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil et ensuite replacés dans leur cage et rentrés à l’animalerie tous les soirs. Ils sont ensuite surveillés quotidiennement. Pour limiter cela, les souris disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que du complément alimentaire (DietGel Recovery) Pour le modèle de tumeur cérébrale, la procédure chirurgicale est détaillée en 4.2. Après la chirurgie, les animaux sont surveillés tous les jours pendant le protocol, week-end compris. Les souris sont hébergées dans des cages avec 5 souris/cage dans un environnement enrichi (roues/cartons). L'état général des animaux est utilisé comme reflet de son bien-être et des points spécifiques comme le poids ou une respiration anormale sont utilisés comme point limite. Pour toutes les procédures le nécessitant, une anesthésie générale volatile et une analgésie locale et générale sont appliquées.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux in vivo sont indispensables pour récapituler au mieux l’environnement inflammatoire des tumeurs qui se développent chez les patients. Nous utiliserons des souris immunocompétantes C57/Bl6 car ces souris présentent toutes les populations de cellules immunitaires et parce que le modèle de tumeur cérébral utilisé repose sur l’implantation de cellules de gliome GL261, cellules issues de souris femelles C57/Bl6, afin d’éviter toute inflammation abérante due au rejet de « greffe » par la souche de souris utilisée. De plus, pour cette espèce et pour les cellules étudiées, tous les outils de caractérisation en cytométrie en flux sont déjà validés dans la littérature et dans notre laboratoire. Animaux agés de 7 semaines. Ce stade correspond à de jeunes adultes et est parfaitement adapté en termes de physiologie aux pathologies ciblées. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expériementaux utilisés.

80 souris juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime pauvre en protéines qui restreint leur croissance, elles subissent une calorimétrie avec 72 heures d'isolement, un test de tolérance à l'insuline avec sept prélèvements sanguins à la queue, puis une laparotomie sous anesthésie pour prélèvement en veine porte avant la mise à mort. Le projet évalue les effets d'un probiotique dans un contexte de malnutrition, cibles thérapeutiques annoncées au conditionnel et à long terme. Le remplacement tient en une phrase, le porteur affirmant que la réponse "intégrée" de l'organisme "nécessite une étude chez l'animal".

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur dans les pays en développement, touchant environ 150 millions d'enfants dans le monde. Des études ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté. De plus, une intervention probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels) permet de compenser partiellement le retard de croissance observé dans le contexte de malnutrition chez un modèle préclinique de rongeur. En plus des retards de croissance classiquement décrits, un déficit en protéines pendant l'enfance entraîne des perturbations métaboliques qui persistent à l'âge adulte. Cependant, les altérations exactes se produisant en contexte de malnutrition protéique juvénile, ainsi que les éventuels bénéfices d’une intervention probiotique sont encore mal connus. De précédentes études portant sur les hormones de l'intestin ont permis d’identifier une population de cellules productrices d'hormones impactée par la malnutrition protéique juvénile. Dans ces conditions, une diminution du nombre de cellules produisant du Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1), une hormone contrôlant la sécrétion d’insuline par le pancréas et donc le métabolisme énergétique, a été observée. De plus, les fonctions du GLP-1 étaient également impactées. Il est donc intéressant d'explorer de façon détailléé le métabolisme énergétique dans ces conditions. En utilisant un modèle murin de malnutrition protéique juvénile, permettant une approche de physiologie intégrée, l'objectif de ce projet est de caractériser finement les altérations métaboliques induites par une carence protéique ainsi que le potentiels effets bénéfiques d'une bactérie probiotique.

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition protéique dans un contexte juvénile sont encore mal connues. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises du métabolisme qui surviennent en condition de malnutrition et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec une bactérie probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets bénéfiques pour la santé au-delà des effets nutritionnels classiques). De futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants soufrant de malnutrition protéique chronique au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté pourront ainsi être identifiées.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéine (qui entraîne un retard de croissance modélisant la malnutrition protéique juvénile) ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi qu’à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. Les animaux seront soumis une fois à une mesure de composition corporelle par Résonance Magnétique Nucléaire. La mesure s’effectue sous contention et dure quelques minutes. Les animaux seront soumis à une expérience de calorimétrie indirecte impliquant un isolement des animaux pendant 72h. Un test de tolérance à l’insuline sera réalisé sur les animaux vigiles (injection intra-péritonéale) et 7 prélèvements sanguins (2-3 μL) seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer la glycémie au cours du temps. Enfin, un prélèvement de sang dans la veine porte sera réalisé 15 minutes après un gavage au glucose. Pour cela, après une injection de buprénorphine, les animaux seront anesthésiés avec de la kétamine et de la lidocaïne et une laparotomie sera réalisée. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 80 animaux appartenant à 4 groupes expérimentaux (10 mâles et 10 femelles par groupe).

Impact sur les animaux

Cette procédure devrait entraîner des nuisances modérées sur les animaux. Le régime pauvre en protéine utilisé dans le cadre de cette procédure a déjà été utilisé et il n’engendre pas de sensation de faim, ni d’aggressivité chez les animaux juvéniles. Ce régime vise à modéliser le retard de croissance induit par la malnutrition protéique chronique, il entraîne donc une plus faible croissance en taille et en poids par rapport au régime contrôle pendant la durée de la procédure. Aucune modification de l’activité, ni de stress anormal n’a cependant été détecté chez les animaux nourris avec le régime pauvre en protéine. Pour limiter les effets délétères du régime pauvre en protéine sur les animaux, leur poid et leur taille seront mesurés chaque semaine et les animaux seront mis à mort si un des points limites est atteint. Leur comportement sera également surveillé de manière régulière. Les expériences de Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN) et de calorimétrie indirecte peuvent induire un stress chez les animaux en raison du bruit environnant et de l’isolement. La mesure de RMN s'effectue sous contention dans un tube adapté et dure 2 minutes maximum. Pour limiter ce stress, les expériences de calorimétrie indriecte sont réduites en temps au minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables. De plus, une période d’acclimatation est prévue avant l’expérience pour limiter le stress lors de l’expérience et l’enrichissement sera accru dans les cages suite à la période d’isolement pour limiter le stress post-expérience. Le test de tolérance à l’insuline implique une injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. L’injection intrapéritonéale peut entraîner un gonflement ou un œdème, dont l’apparition sera surveillée quotidiennement après la procédure. La cicatrisation du bout de la queue sera également surveillée.

Devenir

L'ensemble de animaux mis en procédure seront mis à mort après le prélèvement en veine porte en vue du prélèvement des organes d'intérêt. Les mères, qui n'auront pas subi de procédure expérimentale, seront réformées dans l'animalerie.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Le nombre de 10 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité, la différence de moyenne attendue entre les groupes ainsi l’écart-type attendu des données au vu de nos résultats précédents. Le test statistique réalisé sera une analyse de variance à trois voies. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Notre protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agrée. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur nous permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, les animaux seront surveillés de manière quotidienne. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés par tatouage (au début de la procédure, sous anesthésie légère à l'isoflurane 3%) afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Les animaux seront ensuite progressivement habitués à la nourriture en mangeoire en vue de la procédure de calorimétrie indirecte. Afin de limiter le stress lié au transport, une période d’acclimatation est prévue après le transport et avant le début des procédures expérimentales. Pour la procédure de calorimétrie indirecte, pendant laquelle les souris seront isolées pour une période de 72h, les animaux conserveront une partie de leur litière afin de limiter le stress. Lors du test de tolérance à l'insuline, l'état général des animaux sera surveillé et l'expérience sera stoppée s'il vient à se dégrader. De plus, si la glycémie des animaux descend sous un certain seuil au-delà duquel ils risquent une hypoglycémie, ils recevront une injection intrapéritonéale de glucose. A la suite du test de tolérance à l’insuline, l’apparition d’un oedème ou d’un gonflement au point d’injection intrapéritonéale ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés quotidiennement et pourront donner lieu à l’application locale d’antispetiques le cas échéant. Des points limites suffisament prédictifs pour pallier à tout stress et toute souffrance animale seront établis. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un probiotique dans un contexte malnutrition. Les animaux seront suivis à partir du 21ème jour post-natal (âge du sevrage et de l'identification par tatouage de la patte), et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage (traitement commencé à jour 21 (P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’à jour 56 (P56). Ce stade est choisi car l'objectif du projet est de connaître les effets d'une malnutrition juvénile sur le métabolisme.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies stéréotaxiques cérébrales, la pose de pompes osmotiques, des régimes hyperlipidiques provoquant obésité et résistance à l'insuline, et des tests métaboliques répétés avec prélèvements sanguins sur animaux vigiles. Le projet vise à comprendre le rôle des céramides dans le diabète de type 2, retombées thérapeutiques renvoyées au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il est "très difficile" de reproduire ces interactions entre organes in vitro et conclut que le modèle animal reste "nécessaire".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche sur le diabète, pathologie définie par une élévation anormale du taux de glucose dans le sang, et qui touche plus de 300 millions de personnes dans le monde. Le diabète de type 2 concerne plus de 90% des patients diabétiques et se caractérise par une résistance des tissus cibles à l'insuline, hormone clef dans la régulation de la glycémie, associée à un défaut de sécrétion de cette hormone par les cellules beta du pancréas. Il est maintenant bien établi qu'un régime riche en graisses peut induire la survenue d'un diabète de type 2, via un phénomène appelé la lipotoxicité. Ce dernier est défini par une accumulation délétère de lipides dans différents tissus. Parmi les différents lipides, les céramides apparaissent comme particulièrement délétères. Ainsi, il a été décrit qu'un excès de céramides perturbe la voie de signalisation insuline dans les tissus cibles de cette hormone. Les céramides peuvent également être à l'origine de l'inflammation des cellules B pancréatique, conduisant à une diminution de la sécrétion à l'insuline. Tous les mécanismes d'actions des céramides (qui diffère selon les types de tissus) ne sont cependant pas élucidés et davantage d'études doivent être menées afin d'évaluer la pertinence de l'inhibition de la synthèse des céramides comme cible thérapeutique dans le traitement du diabète. L'objectif de ce projet est donc de mieux comprendre, par des études in vivo, le rôle du métabolisme des céramides sur l'homéostasie glucidique et l'inflammation dans différents tissus cibles de l'insuline (foie et cerveau) ou dans les cellules beta chez la souris. Dans ce projet, nous allons particulièrement cibler la sérine palmitoyltransférase 2 (SPT2), une sous-unité de la SPT, enzyme clef de la voie de synthèse des céramides.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l'implication du métabolisme des céramides dans l'homéostasie glucidique, dans différents types cellulaires. Ces études permettront également d'élucider les mécanismes d'actions des céramides dans production hépatique de glucose, l'insulino-résistance ou dans la sécrétion de l'insuline. Ce projet vise aussi à comprendre l'implication des céramides dans l'inflammation et la mort des cellules beta. Enfin, une approche utilisant un inhibiteur d'une enzyme qui produit des céramides, la sphingomyélinase neutre 2, nous aidera à investiguer les mécanismes de régulation de la synthèse des céramides dans les cellules du foie. Les résultats attendus pourraient ouvrir de nouvelles perspectives pour la prévention et le traitement du diabète de type 2, à plus long terme.

Procédures

Prélèvements sur animaux vigiles : 312 souris; chirurgie stéréotaxique pour injection de la protéine Tat-Cre : 72 souris; chirurgie stéréotaxique pour injection de la protéine Tat-Cre + pose d'une canule et pompe Alzet pour perfusion icv de résistine : 96 souris. Détail par procédures : -Proc 1 : injection intrapéritonéale quotidienne pendant 15j puis réalisation de trois tests fin d 'évaluer l'homéostasie glucidique. Ces tests consistent à un suivi de la glycémie (prélèvements sur animaux vigiles) après soit une administration orale de glucose, soit une injection intrapéritonéale de pyruvate ou de glycérol, ces différents tests seront réalisés avec au minimum deux jours d'intervalles. - Procédure 2 : régime hyperlipidique puis tests de mesure de l'homéostasie glucidique espacés de 2 jours minimum avec prélèvements sur animaux vigiles, identiques à ceux de la procédure 1. - procédure 3 : injections stéréotaxiques et insertion d'une pompe osmotique, puis réalisation de tests espacés de 2 jours avec prélèvements sur animaux vigiles (idem procédure 1). - procédure 4 : injections stéréotaxiques et insertion d'une pompe osmotique, puis réalisation d'enregistrements nerveux sur animal anesthésié. - ¨Procédure 5 : injections stéréotaxiques, régime hyperlipidiques puis réalisation de tests espacés de 2 jours minimum avec prélèvements sur animaux vigiles (idem Procédure 1).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des régimes provoquant l'obésité et/ou des désordres métaboliques de type réistance à l'insuline. Le protocole sera arrêté si les animaux présentent différents signes de souffrance (infections suite aux chirurgies,œdème, absence de mobilité dans la cage, poils ébouriffés, mauvaise prise alimentaire, perte de poids). Ces paramètres seront évalués par le chercheur chaque jour dans la semaine suivant la mise sous régime, injections, tests métaboliques ou chirurgies.

Devenir

A l'issue des procédures les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus et du plasma en vue de mesures biochimiques.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux est encore nécessaire. Cependant, nous avons entamé une réflexion sur le développement d'approches in vitro du type organ on chips qui permettent de mimer quelques interactions entre organe. Certains des travaux réalisés in vitro auront pour but de remplacer, au moins en partie, les approches in vivo

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons effectué un travail en amont qui nous a permis d'identifier un gène cible particulièrement intéressant (SPT2). L'inhibition de son expression dans différents tissus a déjà montré des résultats très prometteurs. Le nombre d'animaux utilisé a été calculé pour que les tests statistiques puissent être fiable et robuste, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d'animaux le plus faible possible.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des milieux enrichis ce qui permettra d'améliorer leur bien-être. Ils seront également observés quotidiennement et un suivi du poids et de la prise alimentaire seront réalisés 2 fois par semaine. Cela nous permettra d'identifier rapidement les animaux en souffrance.

Choix des espèces

Les modèles précliniques de rats et de souris sont des outils complémentaires et essentiels, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. De plus, la souris est un modèle de choix pour les études génétiques car de nombreuses lignées de souris transgéniques sont disponibles. Ces souris seront utilisées à l'âge adulte, à partir de deux mois. Dans le cadre de l'utilisation du régime cétogène, une partie des souris seront mises sous régime cétogène dès le sevrage pour qu'elles n'aient pas accès à une alimentation riche en glucide.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sevrées, elles reçoivent un régime pauvre en protéines modélisant la malnutrition, un probiotique ou un placebo dans la joue, subissent une calorimétrie avec isolement de 72 heures et un test de tolérance à l'insuline avec prélèvements au bout de la queue, puis une laparotomie pour prélever le sang de la veine porte avant mise à mort. Le projet évalue l'effet d'un probiotique sur les troubles métaboliques de la malnutrition infantile, cibles thérapeutiques annoncées à long terme. Le porteur affirme que la réponse intégrée de l'organisme à l'alimentation impose l'étude chez l'animal.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur dans les pays en développement, touchant environ 150 millions d'enfants dans le monde. Des études ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté. De plus, une intervention probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels) permet de compenser partiellement le retard de croissance observé dans le contexte de malnutrition chez un modèle préclinique de rongeur. En plus des retards de croissance classiquement décrits, un déficit en protéines pendant l'enfance entraîne des perturbations métaboliques qui persistent à l'âge adulte. Cependant, les altérations exactes se produisant en contexte de malnutrition protéique juvénile, ainsi que les éventuels bénéfices d’une intervention probiotique sont encore mal connus. De précédentes études portant sur les hormones de l'intestin ont permis d’identifier une population de cellules productrices d'hormones impactée par la malnutrition protéique juvénile. Dans ces conditions, une diminution du nombre de cellules produisant du Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1), une hormone contrôlant la sécrétion d’insuline par le pancréas et donc le métabolisme énergétique, a été observée. De plus, les fonctions du GLP-1 étaient également impactées. Il est donc intéressant d'explorer de façon détailléé le métabolisme énergétique dans ces conditions. En utilisant un modèle murin de malnutrition protéique juvénile, permettant une approche de physiologie intégrée, l'objectif de ce projet est de caractériser finement les altérations métaboliques induites par une carence protéique ainsi que le potentiels effets bénéfiques d'une bactérie probiotique.

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition protéique dans un contexte juvénile sont encore mal connues. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises du métabolisme qui surviennent en condition de malnutrition et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec une bactérie probiotique. De futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition protéique chronique au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté pourront ainsi être identifiées.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéine (qui entraîne un retard de croissance modélisant la malnutrition protéique juvénile) ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi qu’à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. Les animaux seront soumis une fois à une mesure de composition corporelle par Résonance Magnétique Nucléaire. La mesure s’effectue sous contention et dure quelques minutes. Les animaux seront soumis à une expérience de calorimétrie indirecte impliquant un isolement des animaux pendant 72h. Un test de tolérance à l’insuline sera réalisé sur les animaux vigiles (injection intra-péritonéale) et 7 prélèvements sanguins (2-3 μL) seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer la glycémie au cours du temps. Enfin, un prélèvement de sang dans la veine porte sera réalisé 15 minutes après un gavage au glucose. Pour cela, après une injection de buprénorphine, les animaux seront anesthésiés avec de la kétamine et de la lidocaïne et une laparotomie sera réalisée. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 80 animaux appartenant à 4 groupes expérimentaux (10 mâles et 10 femelles par groupe).

Impact sur les animaux

Cette procédure devrait entraîner des nuisances modérées sur les animaux. Le régime pauvre en protéine utilisé dans le cadre de cette procédure a déjà été utilisé et il n’engendre pas de sensation de faim, ni d’aggressivité chez les animaux juvéniles. Ce régime vise à modéliser le retard de croissance induit par la malnutrition protéique chronique, il entraîne donc une plus faible croissance en taille et en poids par rapport au régime contrôle pendant la durée de la procédure. Aucune modification de l’activité, ni de stress anormal n’a cependant été détecté chez les animaux nourris avec le régime pauvre en protéine. Pour limiter les effets délétères du régime pauvre en protéine sur les animaux, leur poid et leur taille seront mesurés chaque semaine et les animaux seront mis à mort si un des points limites est atteint. Leur comportement sera également surveillé de manière régulière. Les expériences de Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN) et de calorimétrie indirecte peuvent induire un stress chez les animaux en raison du bruit environnant et de l’isolement. La mesure de RMN s'effectue sous contention dans un tube adapté et dure 2 minutes maximum. Pour limiter ce stress, les expériences de calorimétrie indriecte sont réduites en temps au minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables. De plus, une période d’acclimatation est prévue avant l’expérience pour limiter le stress lors de l’expérience et l’enrichissement sera accru dans les cages suite à la période d’isolement pour limiter le stress post-expérience. Le test de tolérance à l’insuline implique une injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. L’injection intrapéritonéale peut entraîner un gonflement ou un œdème, dont l’apparition sera surveillée quotidiennement après la procédure. La cicatrisation du bout de la queue sera également surveillée.

Devenir

L'ensemble de animaux mis en procédure seront mis à mort après le prélèvement en veine porte en vue du prélèvement des organes d'intérêt. Les mères, qui n'auront pas subi de procédure expérimentale, seront réformées dans l'animalerie.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Le nombre de 10 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité, la différence de moyenne attendue entre les groupes ainsi l’écart-type attendu des données au vu de nos résultats précédents. Le test statistique réalisé sera une analyse de variance à trois voies. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Notre protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agrée. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur nous permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, les animaux seront surveillés de manière quotidienne. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés par tatouage (au début de la procédure, sous anesthésie légère à l'isoflurane 3%) afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Les animaux seront ensuite progressivement habitués à la nourriture en mangeoire en vue de la procédure de calorimétrie indirecte. Afin de limiter le stress lié au transport, une période d’acclimatation est prévue après le transport et avant le début des procédures expérimentales. Pour la procédure de calorimétrie indirecte, pendant laquelle les souris seront isolées pour une période de 72h, les animaux conserveront une partie de leur litière afin de limiter le stress. Lors du test de tolérance à l'insuline, l'état général des animaux sera surveillé et l'expérience sera stoppée s'il vient à se dégrader. De plus, si la glycémie des animaux descend sous un certain seuil au-delà duquel ils risquent une hypoglycémie, ils recevront une injection intrapéritonéale de glucose. A la suite du test de tolérance à l’insuline, l’apparition d’un œdème ou d’un gonflement au point d’injection intrapéritonéale ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés quotidiennement et pourront donner lieu à l’application locale d’antispetiques le cas échéant. Des points limites suffisament prédictifs pour pallier à tout stress et toute souffrance animale seront établis. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un probiotique dans un contexte malnutrition. Les animaux seront suivis à partir du 21ème jour post-natal (âge du sevrage et de l'identification par tatouage de la patte), et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage (traitement commencé à jour 21 (P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’à jour 56 (P56). Ce stade est choisi car l'objectif du projet est de connaître les effets d'une malnutrition juvénile sur le métabolisme.

2 vaches vont être utilisées, gardées vivantes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans la caillette, huit semaines de perfusions digestives continues de nutriments, puis l'obturation chirurgicale du cathéter, avec un suivi comportemental et des prises de sang pour mesurer le stress et l'inflammation. Le projet cherche à mettre au point une chirurgie moins invasive que la canule permanente du duodénum, présentée comme un raffinement au service d'études futures sur la digestion des ruminants. Le porteur affirme que les systèmes in vitro et in silico ne peuvent reproduire la répartition des nutriments entre organes et justifie le recours à l'espèce bovine.

Objectifs

Ce projet porte sur le développement d’alternatives à l’utilisation de ruminants fistulés avec des canules permanentes pour développer de futurs essais sur la digestion et le métabolisme avec des vaches opérées par des techniques chirurgicales moins invasives. Il répond ainsi aux principes de réduction du nombre de bovins canulés de façon permanente et de raffinement des approches chirurgicales (règles des 3R). L’élevage des bovins doit faire face à de nombreux enjeux, tels que limiter les impacts environnementaux et la compétition avec l’alimentation humaine. Pour cela, il est nécessaire de bien connaitre les processus de digestion afin d’optimiser l’apport de nutriments (azotés, minéraux, vitamines) à l’animal et les processus métaboliques qui permettent à l’animal à la fois d'utiliser ces nutriments pour les différentes fonctions (immunitaire, reproduction, la synthèse de viande et de lait) et limiter leurs rejets dans l’environnement (pollutions). Du fait de la digestion microbienne dans le rumen, pour établir les recommandations sur les nutriments absorbés dans l’intestin grêle, il faut pouvoir maitriser leurs apports, ce qui ne peut se faire que par des perfusions de ces nutriments dans un compartiment post-rumen (comme la caillette ou le duodénum). L'objectif de cette demande d’autorisation est donc de soumettre à l’évaluation, une procédure chirurgicale moins lourde que la pose de la canule permanente du duodénum en la remplaçant par la pose d’un cathéter dans la caillette de petit diamètre. La chirurgie se fera sous anesthésie et analgésie locale. Une vérification de l’adéquation de la prise en charge de la douleur à la pose et de la bonne récupération des animaux à l’issue de la pose et après l’obturation du cathéter sera effectuée par un suivi multiparamétrique (grilles comportementales et paramètres sanguins du stress et de l’inflammation). Une vérification de la fonctionnalité du système de perfusion des nutriments dans la caillette sur un temps comparable à un essai de perfusions de nutriments dans le duodénum sera également réalisée.

Bénéfices attendus

Le bénéfice majeur de ce projet est de pouvoir réduire le nombre de bovins canulés du tube digestif de façon permanente et de raffiner les procédures en permettant de développer une approche chirurgicale (règles des 3R) moins invasive (anesthésie et analgésie multimodales locales vs. anesthésie et analgésie générale). Le bénéfice scientifique de la mise au point d’une telle procédure est de poursuivre le travail sur l’amélioration des systèmes d’alimentation des ruminants visant à calculer au plus juste les apports alimentaires en terme de nutriments absorbés dans l’intestin et leur effet sur le métabolisme. Ces différentes études nécessitent la connaissance / la maitrise des apports par perfusions digestives des nutriments étudiés. Pour éviter les modifications (transformations, utilisations, synthèses) dues à la digestion microbienne dans le rumen, ces perfusions doivent être réalisées dans les compartiments digestifs se situant en aval du rumen (comme la caillette équivalent de l’estomac chez les monogastriques). En effet, les recommandations alimentaires actuelles en acides aminés, vitamines et minéraux sont incomplètes en termes de composés et de situation d’élevage. Il est important, dans une démarche de transformation agroécologique des systèmes d’élevage, de pouvoir préciser les besoins des ruminants, les apports réels dans la ration, la biodisponibilité pour l’animal et le statut de déficit (carence en calcium, insuffisances en vitamine, acides aminés limitants), ou d’excès (pollutions) correspondant. Ces aspects ne peuvent être évalués qu’au travers d’expérimentations visant le plus souvent à relier des apports maitrisés de ces différents composés aux réponses de leurs biomarqueurs sanguins chez les ruminants. Ainsi, des projets sur l’étude de l’effet de certaines vitamines, minéraux et acides aminés (méthionine) sur la fourniture d’antioxydants et la santé des ruminants laitiers dans un concept d'une seule Santé (nutrition de l’animal et santé de l'animal et de l’homme par les produits laitiers) sont en cours d’évaluations. De plus, des études seront menées pour maitriser l’apports de nutriments tels que les acides aminés et le phosphore pour établir leurs recommandations tout en limitant leurs impacts environnementaux (excès d’azote ou de phosphore, deux sources de pollutions). Ces études nécessiteront le recours à l’apport de nutriments pour l’intestin par perfusions digestives dans la caillette.

Procédures

Les 2 vaches subiront 3 étapes décrites ci-dessus : - Etape 1 : Pose d'un cathéter dans la caillette sous anesthésie locale et analgésie. Dans cette procédure qui dure 14 jours, l’animal aura une intervention chirurgicale et la douleur sera gérée grâce à des antalgiques adaptés, et grâce à un suivi multiparamétrique (grilles comportementales et prises de sang pour dosage d’hormone du stress). - Etape 2 : Perfusions digestives de nutriments sur deux vaches munies d'un cathéter dans la caillette. Ces perfusions seront réalisées en continue (24h/24) durant 4 séquences de 7 jours (soit 8 semaines, ce qui correspond aux temps de perfusions de nutriments dans le duodénum). Ces perfusions ne sont pas douloureuses, et sont réalisées sur animal vigile. - Etape 3 : Obturation du cathéter de la caillette placé en sous-cutané sous anesthésie locale. Dans cette procédure qui dure 14 jours, le suivi de la bonne cicatrisation se fera par une approche mutiparamétrique (grilles comportementales et prises de sang pour dosage d’hormone du stress).

Impact sur les animaux

La présence d'un cathéter de la caillette n'engendre pas de nuisance pour les animaux, une fois qu'ils ont récupéré de la chirurgie (sous anesthésie locale, anti-inflammatoire et analgésique de type dérivé morphinique). La contention physique pour la réalisation des prises de sang (via des cathéters à la jugulaire) sera brève et très légère (tenue de la tête avec un licol) par des personnes formées et habituées à ces manipulations. Ce stress sera de courte durée et sans douleur pour les animaux. Lors des essais de perfusions de nutriments il existe un petit risque de développement d'un point d'infection à la sortie du cathéter au niveau de la peau. Pour pallier à ce risque, une surveillance quotidienne de cette zone sera effectuée avec un nettoyage par des antiseptiques de la zone deux fois par semaine. En cas de début d'infection, notre vétérinaire sera consulté. Ce cathéter ne peut pas être retiré car il est cousu à la caillette mais il peut être raccourci (coupé au raz de la peau) et obturé par un nœud avant d'être placé en sous-cutané. Ceci permet une cicatrisation complète de la peau au niveau du point de sortie. Pour éviter toute nuisance au moment de l'obturation du cathéter et de son placement en sous cutanée, les animaux seront de nouveau placés sous anesthésie locale et un suivi multiparamétrique sera effectué sur les jours suivants. Une fois le point de sortie du cathéter cicatrisé, nos collègues n'ont constaté aucun développement d'infection sous cutanée. Cependant, la zone sous-cutanée où se trouve placé le cathéter fera l'objet d'une surveillance hebdomadaire des animaux tout au long de leurs vies (par exemple au moment de la traite ou de l’alimentation) pour vérifier l’absence de rejets.

Devenir

A chaque étape (pose d'un cathéter à la caillette, perfusions de nutriments et obturation du cathéter en sous-cutanée) l'animal est gardé en vie. Cette décision sera prise par le responsable de l'établissement utilisateur ou son délégataire.

Remplacement

Il s’agit de mettre au point de nouvelles approches chirurgicales moins invasives en remplacement de la pose de canules permanentes du duodénum, pour pouvoir étudier in vivo la digestion et le métabolisme des nutriments absorbés par l’animal et les réponses de l’animal à ces variations de flux de nutriments digérés. Les réponses multiples des animaux en termes de digestion et répartition des nutriments entre différentes fonctions comme la synthèse de lait par la mamelle (ex : exportation de calcium dans le lait), la reconstitution des réserves (ex : calcification osseuse) et les fonctions de santé ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants ; les cultures cellulaires de différents tissus ne miment en effet pas la répartition des nutriments qui s’opère entre différents organes et fonctions. Des systèmes ayant été mis en œuvre par le passé pour étudier des phénomènes d’absorption épithéliale (type cellules ou chambres de Ussing) nécessitent d’utiliser des fragments de paroi du tube digestif fraichement prélevés mais sont peu reproductibles et donc peu utilisables pour des comparaisons entre groupes d’individus recevant des alimentations contrastées, par exemple. Leur intérêt repose plutôt pour l’étude de mécanismes biologiques d’absorption ou de transfert trans-épithélial. Enfin, les systèmes in vitro d’étude des phénomènes de digestion intestinale (comme le TIM gastro-intestinal system proposé par le TNO) ne sont pas adaptés aux modèles ruminants dont l’étape de digestion et fermentation ruminale entraine une modification trop importante du bol alimentaire pour le mimer dans un système in vitro de ce type et les spécificités des phénomènes biologiques d’absorption (liés à l’espèce ou au type de composés d’intérêt dont certains nécessitent des protéines de transport membranaires ou intracellulaires) ne sont pas transposables à des systèmes de membranes non biologiques. Compte tenu de l’absence presque totale de données dans la littérature pour certains de composés d’intérêt (vitamines par exemple), une approche in silico est actuellement impossible.

Réduction

Notre stratégie d’expérimentation est de réduire au maximum le nombre d’animaux participant à ces tests méthodologiques de raffinement des procédures chirurgicales. Pour la procédure de pose de cathéters dans la caillette, il s’agit d’adapter une technique pratiquée couramment en médecine vétérinaire, l'omentopexie, qui consiste en la fixation de la caillette sur le flanc droit. L’introduction d’un cathéter dans la caillette est pratiquée par nos collègues Canadiens (Doepel et al., 2006) qui nous ont guidé dans le développement du mode opératoire. Nous souhaitons faire la demande pour seulement 2 chirurgies pour 2 vaches, sachant que 2 autres vaches ont déjà été utilisées pour réaliser la même procédure sur un autre site. Notre vétérinaire maitrise à la fois la technique d’omentopexie et celle de poses de cathéters. Ce nombre de deux animaux a été raisonné avec notre vétérinaire pour rester faible mais suffisant pour être capable de reproduire le geste. Ainsi 4 animaux auront (2 par sites) été utilisés pour mettre au point cette nouvelle méthodologie sachant que les essais futurs nécessitant ces techniques utiliseraient également 3 à 5 animaux.

Raffinement

Tout est mis en œuvre pour le raffinement des conditions d'hébergement qui seront réduites au maximum individuellement et les surfaces par animal respectent les normes en expérimentation. De plus, lors de la pose du cathéter à la caillette, et de son obturation, le protocole médicamenteux est adapté afin de s'assurer de la prise en charge de toute douleur lors de ces actes. Pour cela des antiinflammatoires ainsi que des antalgiques sont administrés sur 9 jours post opératoires pour permettre à l'animal de se remettre dans de bonnes conditions. Pour vérifier que son bien-être n'est pas impacté, des grilles comportementales seront mises en œuvre (au moment de la pose et de l'obturation du cathéter à la caillette) deux fois par jour de J-2, J-1, J0, J1, à J2, puis une fois par jour à J3, J6, J8, J10 et J13, ce qui permettra d'adapter si besoin le protocole de prise en charge de la douleur (analgésie et/ou anti-inflammatoire). Elles comportent des critères relatifs aux comportements (changements de comportements, postures antalgiques, etc.), des paramètres zootechniques (ingestion, etc.) et physiologiques (température rectale, fréquences cardiaque et respiratoire, etc.), et des critères liés à l’aspect des cicatrices. Des prises de sang sont réalisées en parallèle des grilles comportementales pour vérifier l'évolution d'une hormone indicatrice du stress (cortisol sanguin) et des protéines de l’inflammation (Haptoglobine et interleukines) pour vérifier si une douleur résiduelle existait malgré l’analgésie multimodale pratiquée.

Choix des espèces

Ces techniques permettront de continuer de travailler sur les recommandations alimentaires en nutriments et micronutriments des vaches dans un concept d’évolution agroécologique. En effet, il s’agit de réduire certains apports nutritionnels pour diminuer les rejets polluant pour l’environnement tout en maitrisant le volume et la qualité technologique du lait. Il s’agit aussi d’intégrer dans ces conditions le concept d’une seule santé pour l’animal et l’homme en apportant les nutriments nécessaires à une bonne santé de la vache, du veau, tout en améliorant la qualité nutritionnelle des laits pour l’homme (protéine idéale, calcium, vitamines, antioxydants, micronutriments etc.). Pour cela, des études de digestion et métabolisme de certains nutriments et métabolites spécifiques sur les vaches laitières sont requises pour diffuser des recommandations d’alimentation d’animaux adultes. Il faut donc travailler sur l'espèce bovine. Le troupeau est constitué de vaches Prim'Holstein, la race de vaches laitières la plus utilisée.

30 xénopes femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée et le reste réopéré à plusieurs reprises. Chacune subit une chirurgie de prélèvement d'ovocytes d'une dizaine de minutes sous anesthésie, répétée jusqu'à dix fois au cours de sa vie avec un intervalle minimal de six mois, pour étudier des systèmes de transport végétaux. Le porteur indique qu'une infection au site opératoire reste possible et que les femelles de plus de onze ans ou ayant subi dix laparotomies ne sont pas réveillées puis euthanasiées. Il qualifie l'ovocyte de xénope de modèle "indispensable" reconnu depuis plus de trente ans, difficilement remplaçable par des cellules en culture plus petites.

Objectifs

Notre laboratoire étudie les mécanismes permettant aux plantes de mieux répondre aux stress environnementaux liés notamment au changement climatique. Nous nous intéressons en particulier aux systèmes de transport membranaires nécessaires à l'acquisition et au transport d'eau et de minéraux par les plantes et les champignons vivant en symbiose avec les plantes. Pour nos travaux, l'utilisation d'ovocytes de grenouilles xénopes est cruciale. Ce système est reconnu depuis plus 30 ans comme modèle pour l'étude des transporteurs et canaux ioniques de plantes. Dans notre laboratoire, l'utilisation d'ovocytes de xénopes a par exemple contribué de manière déterminante à la caractérisation moléculaire et fonctionnelle des canaux potassiques végétaux impliqués dans les mouvements des stomates (pores qui assurent les échanges gazeux avec le milieu extérieur et permettent la résistance des plantes au déficit hydrique) et des aquaporines qui permettent le transport de l’eau depuis la racine. Ce projet se déroulera sur 5 ans et permettra de caractériser les systèmes de transport impliqués en combinant des approches pluridisciplinaires (génomique, biophysique, physiologie moléculaire, modélisation) pour comprendre comment les plantes coordonnent leur développement en s'adaptant aux contraintes environnementales.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes gouvernant la nutrition minérale des plantes et leur réponse aux stress environnementaux est un enjeu majeur de la recherche fondamentale en Sciences des Plantes. Les résultats de nos travaux devraient notamment permettre à court terme d'avoir une vision plus précise du fonctionnement de ces systèmes de transports chez la plante (conditions ioniques saturant leur activité, sélectivité, régulation de leur activité en fonction de différents stimuli environnementaux, ...), des voies de signalisation qu’ils déclenchent et des régulations cellulaires qui en résultent. A plus long terme ils pourraient contribuer au développement d’une agriculture durable, économe en ressources naturelles et respectueuse de l’environnement.

Procédures

Le projet ne comporte qu'une seule procédure permettant l'obtention d'ovocytes par chirurgie sur animal anesthésié (procédure chirurgicale simple d'une dizaine de minutes). La durée de vie de ces animaux étant longue (une quinzaine d'années en captivité, une dizaine d'années dans notre animalerie) les femelles issues de la procédure pourront être opérées à plusieurs reprises au cours de leur vie (jusqu'à 10 fois en respectant un intervalle de repos de 6 mois au minimum entre chaque opération), en s'assurant de la complète récupération de l'animal et après accord du vétérinaire chaque année.

Impact sur les animaux

Toutes les mesures seront prises pour limiter au maximum tout stress et toute douleur à l'animal lors de la procédure de chirurgie (10 min) en réduisant notamment au maximum les étapes de manipulation de l'animal pour ne pas lui causer de stress au moment de l'anesthésie et du réveil. Une infection au site de prélèvement restant possible, l’animal sera mis en observation pendant quelques jours afin de s’assurer qu'il a pleinement recouvré son état de santé avant de retourner en stabulation avec ses congénères.

Devenir

La durée de vie des xénopes est longue (une quinzaine d'années). Les femelles issues de la procédure pourront être à nouveau opérées, en respectant un intervalle de repos d'au minimum 6 mois entre chaque opération et après accord du vétérinaire. Le suivi du poids de l'animal à une fréquence semestrielle et la pesée avant chaque opération permet également de s'assurer de la bonne récupération de l'animal entre 2 opérations (5 à 10% de tolérance de perte de poids) et les animaux seront sytématiquement mis "au repos" pendant un an au moindre doute. Les animaux âgées de plus de 11 ans ou ayant subi 10 laparotomies ne seront pas réveillées à la fin de la procédure et seront euthanasiées en respectant les dispositions règlementaires propres à l'espèce.

Remplacement

L'ovocyte de xénope est un modèle de choix pour l’étude de certaines protéines végétales permettant le passage des éléments minéraux, des sucres, des hormones au travers des membranes des cellules de la plante : les canaux ioniques et les transporteurs. Les ovocytes de xénopes sont de grosses cellules (1 mm de diamètre) capables de produire en quantité importante des protéines végétales fonctionnelles sur leur membrane qu’il est ensuite facile de caractériser, notamment car la grande taille des ovocytes rend leur manipulation simple à réaliser. De plus, cette cellule étant d'origine animale, les canaux ioniques et transporteurs animaux initialement présents dans les ovocytes sont de nature clairement différente de celle des canaux ioniques et transporteurs végétaux que nous souhaitons caractériser, et il est donc aisé de distinguer les deux. Les autres alternatives à l'expression en ovocyte de xénopes ont été envisagées et nous réaliserons, quand cela sera possible et parallèlement aux expérimentations sur ovocyte de xénopes, des études sur cellules animales en culture (non humaines) et/ou végétales. Cependant, les cellules animales en culture et les cellules végétales sont beaucoup plus petites (quelques dizaines de micromètres), ce qui nécessite d'autres savoir-faire et équipements beaucoup plus délicats à mettre en oeuvre que sur ovocytes, et engendre des temps de caractérisation rallongés d'un facteur 5 à 10. Les cellules végétales possèdent de plus une paroi autour des cellules qui rend l'accès à la membrane plasmique impossible pour des mesures directes et elles ont de plus de nombreux systèmes de transport natifs actifs sur leur membrane contrairement aux ovocytes qui sont des cellules "au repos". Tout ceci rend l'utilisation des ovocytes de xénope indispensable pour étudier de façon précise les systèmes de transport végétaux.

Réduction

Ce projet a été conçu pour utiliser le nombre minimum d'animaux, tout en garantissant l'obtention de résultats scientifiquement pertinents et l'atteinte des objectifs de l'étude. Ainsi les besoins des utilisateurs seront regroupés pour limiter le nombre d'opérations réalisées (2-3 opérations par mois en moyenne) et à chaque procédure les ovocytes obtenus sur une xénope femelle serviront pour les lots contrôles (non-injectés) et pour les lots injectés. Il pourra également être envisagé de mutualiser les opérations avec d'autres établissements utilisateurs toujours pour réduire le nombre d'animaux opérés (chaque opération peut permettre d'obtenir plus de 5000 ovocytes qui peuvent être conservés une semaine environ pour l'étude).

Raffinement

Toutes les mesures de raffinement appropriéees seront prises pour favoriser le bien-être de l’animal dans le cadre du projet. Les xénopes sont élevées dans une animalerie agréée où elles bénéficient d'un environnement social et physique enrichi en étant regroupées par bac de 4-5 individus (ce qui autorise une surveillance individuelle de chaque animal tout en préservant leur besoin d'interaction) et en laissant à leur disposition des cachettes dans chaque bac. Lors de la chirurgie, la douleur sera prise en charge par l'utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques appropriés et l'utilisation d'une alèse humidifiée permettra de maintenir une hydratation permanente de la peau. La manipulation des animaux est minimale et tout sera fait pour leur permettre un réveil d'anesthésie sans stress en abaissant le niveau de l'eau dans le bac de réveil. Enfin une attention particulière sera apportée à ne pas isoler longtemps un animal après son opération tout en lui apportant un soin optimal qui sera poursuivi lorsqu'il aura rejoint son bac en stabulation grâce à un suivi journalier personnalisé de l'animal opéré. Ceci sera rendu possible par l'identification aisée de l'animal au vu du nombre limité d'animaux par bac. Les possibilités de raffinement supplémentaire seront explorées tout au long du projet par la structure du Bien-être animal (qui comprend un vétérinaire spécialisé dans les espèces aquatiques) et testées pour continuer à améliorer en permanence le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le système ovocyte de xénope est reconnu depuis plus de 30 ans comme modèle de choix pour l'étude des canaux ioniques et transporteurs animaux comme végétaux. Les ovocytes permettent de réaliser facilement des études fonctionnelles car ils sont capables d’exprimer de nombreuses protéines en grande quantité qu’il est ensuite aisé de caractériser. Les autres modèles de cellules animales en culture ou de cellules végétales modifiées pour éliminer leur paroi (protoplastes), sont beaucoup plus difficiles utiliser et à mettre en oeuvre notamment en raison de leur très petite taille (de l'ordre du micromètre alors qu'un ovocyte de xénope fait un millimètre de diamètre). Pour pouvoir obtenir des ovocytes, les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés d'au moins 2 ans. Les ovocytes doivent être obtenus par chirurgie et non après ponte afin que les systèmes de transport endogènes de l'ovocyte restent peu actifs (ce qui n'est pas le cas lorsque la grenouille a été stimulée par injection d'hormones pour pondre). Outre ces caractéristiques propres à l'ovocyte, le xénope est facile à élever et à maintenir en laboratoire et les opérations de chirurgie pour récupérer les fragments d'ovaires sont simples et rapides à réaliser.