Oncologie

3 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intra-mammaire de cellules tumorales, des chimiothérapies et immunothérapies répétées par voie intrapéritonéale sur deux semaines, des mesures de tumeur au pied à coulisse tous les deux jours et des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle d'enzymes dégradant l'ADN tumoral dans l'immunité anti-tumorale. Le porteur indique que les animaux sont mis à mort après avoir atteint les points limites ou pour prélever leurs tissus. Il décrit cette question comme "fondamentale" et affirme qu'une étude sur échantillons humains ne peut remplacer des souris génétiquement modifiées développant des tumeurs mammaires.

Objectifs

Le cancer est la principale cause de mortalité en Europe et 14.1 millions d’individus dans le monde sont affectés par cette maladie. Malgré les avancées technologiques dans le diagnostic et le traitement des cancers, de nombreux patients succombent à la maladie. Il est donc urgent de développer de nouvelles études afin d’améliorer la prise en charge des patients, ainsi que d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de développer des traitements efficaces. Le système immunitaire est au centre de nouvelles approches thérapeutiques et permet d’induire une immunité anti-tumorale et donc la destruction des tumeurs. L’efficacité de ces immunothérapies requiert au préalable une inflammation dans le site tumoral. Celle-ci n’est présente que dans un nombre limité de tumeurs et peut être induite par l’ADN tumoral. De plus, de nombreuses thérapies, incluant la chimiothérapie et la radiothérapie ont été montrées comme induisant une mort des cellules tumorales conduisant à la libération de l’ADN tumoral qui stimule les réponses inflammatoires et « booste » l’immunité anti-tumorale. Ces observations posent la question fondamentale de savoir comment et par quels mécanismes est régulée la capacité de l’ADN dérivé des tumeurs à stimuler l’immunité anti-tumorale. Nous avons caractérisé récemment des enzymes dont la fonction principale est de couper/digérer l’ADN libéré par les cellules mourantes contrôlant ainsi sa capacité à induire une réponse inflammatoire par le système immunitaire. Nos résultats préliminaires suggèrent que la déficience d’une de ces enzymes limite l’impact thérapeutique des chimiothérapies et leur capacité à induire une réponse immunitaire anti-tumorale. Nous proposons donc dans le cadre de cette demande d’autorisation de projet d’étudier les mécanismes d’action de ces enzymes, ciblant l’ADN tumoral, dans la régulation de l’immunité anti-tumorale en réponse aux thérapies conventionnelles (chimiothérapie et immunothérapies). Cela nous permettra de caractériser la fonction de ces enzymes dans la régulation de l’immunité anti-tumorale et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques afin de renforcer l’efficacité thérapeutiques des traitements communément utilisés chez les patients.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de caractériser le rôle d'enzymes ciblant l’ADN tumoral dans la régulation de l’immunité anti-tumorale induite par différents traitements couramment utilisés en thérapie des cancers. C’est une question fondamentale car l’ADN libéré par les cellules tumorales joue un rôle clef dans l’activation de l’immunité tumorale en réponse à diverses thérapies. Il semble que ces enzymes soient requises pour l’induction de l’immunité anti-tumorale induite par certaines chimiothérapies selon nos résultats préliminaires. Ainsi, une meilleure compréhension du rôle de ces enzymes pourrait déboucher sur de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints de cancer.

Procédures

1. L’injection intra-mammaire des cellules tumorales est effectuée sur des animaux anesthésiées en moins d’une minute. 2. Injection intrapéritonéale avec des thérapies anti-cancéreuses conventionnelles (chimiothérapie (5 injections tous les 2 jours) et immunothérapies (3 injections tous les 4 jours) est effectué durant 2 semaines sur des animaux vigiles. Cette injection est très rapide et dure moins de 30 secondes par souris. 3. La mesure de la taille tumorale est effectuée tous les deux jours avec un pied à coulisse sur des animaux anesthésiées. Cette procédure dure moins d’une minute par souris. 4. Les prélèvements sanguins sont effectués sur des animaux anesthésiés à deux reprises espacées de deux semaines. Cette procédure est très rapide et dure moins d’une minute par souris. 5. La vaccination par les cellules tumorales morte en sous-cutanée sur des souris anesthésiées s’effectue à 3 reprises espacées d’une semaine. L’injection dure environ une minute par souris.

Impact sur les animaux

1. La présence de tumeur du sein chez la souris peut impacter le bien-être des animaux. 2. Le traitement des souris par des thérapies anti-cancéreuses conventionnelles (chimiothérapie et immunothérapies) peut induire des effets secondaires (dans notre cas mineurs) qui peuvent impacter le bien-être des animaux. 3. Les prises de sang chez les animaux peuvent conduire à un affaiblissement transitoire. 4. Les injection sous-cutanées et intrapéritonéales peuvent induire un inconfort transitoire des animaux

Devenir

Tous les animaux inclus dans l’expérimentation seront mis à mort à la fin de ce projet, soit après avoir atteint les points limites soit afin de procéder à des prélèvements tissulaires pour des analyses supplémentaires.

Remplacement

Afin d’étudier la fonction des enzymes coupant/digérant l'ADN des cellules tumorales dans l’immunité anti-tumorale et dans la régulation de l’efficacité thérapeutique de traitement anti-cancéreux, nous utilisons des animaux génétiquement modifiés qui à la fois ont des déficiences en ces enzymes digérant l’ADN et développent spontanément des tumeurs mammaires. Ainsi, cette étude ne peut pas être réalisée avec des échantillons humains. De plus nous étudions l’interaction entre le système immunitaire et les cellules tumorales dont la modélisation dans un système d’organoïdes n’est pas à ce jour optimale et ne peut remplacer les modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales ont été déterminés pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Nous utilisons les souris femelles pour notre projet car nous travaillons sur le cancer du sein. Cependant, les souris mâles issues de nos croisements ne seront pas mises à morts mais utilisées dans le cadre d’un projet sur l’obésité et pour le maintien de nos colonies.

Raffinement

1.Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maîtrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur : Les prises de sang sous mandibulaires, les injections s.c, ainsi que la mesure des volume tumoraux sont réalisés sur des animaux anesthésiés afin de réduire l’inconfort et la douleur incombé par ces procédures.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris pour répondre à nos objectifs de recherche. Les souris sont les animaux de choix pour notre projet car des souches génétiquement modifiées déficientes pour les enzymes qui digèrent l’ADN que nous étudions sont disponibles et permettent de répondre au mieux à nos objectifs. Des souris génétiquement modifiées qui développent des tumeurs mammaires seront aussi utilisées dans notre projet. Celles-ci sont idéales pour notre étude car elles récapitulent très bien le processus de développement des tumeurs mammaires humaines, ce qui en fait un excellent modèle d’étude et facilite l’applicabilité des résultats à l’Homme. Nous utiliserons les souris adultes entre 8 et 14 semaines. En effet, nous nous intéressons au rôle de nos enzymes digérant l’ADN dans l’induction de l’immunité anti-tumorale en réponses aux thérapies conventionnelles dans le cancer du sein, une pathologie qui affecte presque exclusivement l’adulte.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses du sein sous la peau, puis une résection chirurgicale de la tumeur sous anesthésie et un suivi de l'évolution métastatique. Le porteur mène un criblage pan-génomique par CRISPRi pour identifier des gènes régulant la progression métastatique du cancer du sein. La mise à mort sert à prélever les organes et à rechercher les métastases par imagerie et analyse moléculaire.

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent dans le monde (2,26 millions) et malgré les progrès des thérapies, un grand nombre de patientes décède chaque année des suites métastatiques (685,000). La majorité des cancers du sein sont d’origine canalaire, et 15% sont diagnostiquées in situ, c’est-à-dire qu’ils n’ont pas franchi la barrière physique qui les entoure constituée par la lame basale. Au moins un tiers des tumeurs resteraient in situ et bénignes, et près de deux tiers de ces tumeurs évoluant vers un stade invasif. A ce jour, en absence de marqueurs prédictifs de l’évolution vers le stade invasif, les médecins traitent les patientes porteuses de tumeurs in situ comme si elles avaient des tumeurs malignes. Ceci a un coût humain et économique important qui va en augmentant avec les progrès des techniques d’imagerie. En outre, il n’existe pas de traitement spécifique contre la transition in situ-invasif ou la progression métastatique. Il est urgent d’identifier des biomarqueurs prédictifs pour évaluer le risque de transition vers le stade invasif - première étape du processus métastatique - pour éviter un traitement lourd et inutile aux patientes porteuses de tumeurs bénignes. Il est tout aussi nécessaire de trouver des cibles thérapeutiques pour combattre la dissémination des cellules tumorales. Nous souhaitons identifier de nouvelles protéines inhibitrices de l’invasion, dont la réduction de l’expression a une action pro-métastatique. Jusqu’alors, les divers criblages génomiques de nombreux cancers n'ont pas permis d'identifier de mutations somatiques responsables spécifiquement de la progression métastatique. Une raison possible est que l'acquisition des capacités métastatiques, contrairement à la transformation et à la prolifération, serait principalement causée par des mécanismes de régulation épigénétique, post-transcriptionnelle ou post-traductionnelle. Nous proposons de réaliser un criblage in vivo afin d'identifier les gènes dont la répression de l’expression confèrerait aux cellules tumorales des propriétés agressives et métastatiques. Nous utiliserons les métastases générées après xénogreffe de cellules mammaires humaines comme sources pour identifier les ARN enrichis dans les métastases comparées aux tumeurs primaires. Notre modèle d'étude est le cancer du sein mais les gènes identifiés dans notre étude pourraient permettre de dessiner un paradigme pour d'autres cancers invasifs.

Bénéfices attendus

Au travers de ce projet, nous identifierons de nouveaux gènes régulateurs du processus métastatique dont l’étude permettra une meilleure compréhension de la progression de la maladie cancéreuse et de la transition d’une tumeur in situ à une tumeur invasive. Les gènes identifiés serviront à établir une signature du risque de développer des tumeurs invasives pour aider au pronostic et diagnostic. Enfin, les voies de signalisation associées à ces gènes ouvriront de nouvelles perspectives dans la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques des cancers métastatiques.

Procédures

Sur le plan des gestes chirurgicaux prévus dans ce projet, les animaux receveurs de greffe par voie sous cutanée seront soumis à une résection de la tumeur au site initial d’injection. Les procédures expérimentales de transplantation et de résection seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. La durée estimée pour la transplantation (de l’induction de l’anesthésie à la greffe) est de 5 minutes par animal. La procédure de résection (de l’induction de l’anesthésie à la phase de réveil sur tapis chauffant) représente 15 minutes par animal. Le retrait des agrafes qui interviendra 10 à 15 jours après l’exérèse des greffons nécessite 5 minutes par animal. En complément de ces approches, dans le contexte du suivi hebdomadaire, les souris feront l’objet d’une mesure du greffon induit. Ce geste basé sur la de préhension nécessite 1 minute par animal. La surveillance de la survenue métastatique par imagerie optique -de l’induction de l’anesthésie à l’acquisition des signaux bioluminescents - est estimée à 10 minutes pour chaque animal

Impact sur les animaux

Les principaux effets délétères attendus portent sur l’induction d’une pathologie cancéreuse chez le modèle murin. Par ailleurs, l’injection sous-cutanée d’une grande quantité de cellules est connue pour engendrer une réaction inflammatoire mais qui est contenue en raison du statut immunodéprimé de la souche murine utilisée. Outre l’application du principe des 3Rs, afin que ces dommages soient réduits à un minimum, nous procéderons par étape tout au long de ce projet et nous nous appuierons sur la mise en place d’une grille de score pour définir une fréquence d’interventions la plus adaptée afin de garantir le bien-être des animaux. L’expérience préliminaire servira de base pour déterminer l’impact de l’injection de 30x10E6 de cellules, évaluer les caractéristiques cinétiques de croissance tumorale et ajuster au mieux le suivi des animaux. Par ailleurs, les souris feront l’objet d’une phase d’acclimatation en vue de leur inclusion dans les procédures expérimentales et seules les manipulations nécessaires seront effectuées. Nous veillerons à conserver les caractéristiques de l’espèce par le maintien des animaux en groupe tout au long de leur stabulation et l’apport d’enrichissement dans les cages pour améliorer leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure en vue de l'investigation tissulaire ex-vivo. L’analyse des tissus (organes) par imagerie optique nous permet d’explorer la présence de métastases. Les foyers tumoraux distants ainsi mis en évidence seront préparés pour l’extraction de matériel biologique en vue de l’identification des gènes associés à l’évolution métastatique de la pathologie par analyse moléculaire.

Remplacement

Le processus métastatique très complexe impliquant l’organe d’origine de la tumeur, les organes receveurs des métastases et les systèmes de circulation des cellules invasives par voie sanguine ou lymphatique ne peut pas encore être reconstitué in vitro. Si la recherche de nouveaux gènes impliqués dans ce processus par un criblage pan-génomique ne peut pas être effectué in vitro, des méthodes complémentaires pourront tout de même être utilisées pour certaines étapes du projet. Sur la base des gènes identifiés in vivo, on utilisera donc des approches in vitro dès que possible et dès qu’elle sera pertinente en vue de disposer de modèles d’études complémentaires notamment en matière de caractérisation moléculaire. In fine ces modèles d’étude complémentaires nous permettront d’utiliser moins de souris.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, le suivi du développement de la pathologie maligne chez les animaux transplantés se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs, tels que la mesure des greffons à l’aide d’un pied à coulisse et le recours à l'imagerie optique in vivo par bioluminescence. Tout au long de ce projet, nous procéderons par étape et nous mettrons en place des groupes contrôles pour nous assurer de la pertinence de notre modèle et passer à l’étape suivante.

Raffinement

Afin d’améliorer le cadre de vie des animaux, les besoins physiologiques seront respectés (nourriture et eau ad libitum). Nous optimiserons les conditions d’hébergement des animaux par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés, lanières de papier et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 3 à 5 afin d’éviter le stress de l’isolement. Les procédures expérimentales de transplantation seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). C’est de plus, le modèle le plus fourni en études pour ce qui concerne le domaine de la cancérologie. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux à l’âge adulte (8-10 semaines) De par notre expérience et selon les données de la littérature, cette fenêtre d’âge est optimale pour la prise de greffe de cellules tumorales chez le modèle murin dans un contexte de xénogreffe.

57 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, puis une résection chirurgicale de la tumeur sous anesthésie et un suivi de l'évolution métastatique. Le porteur étudie le rôle de la protéine PTK7 dans le potentiel métastatique du cancer colorectal pour identifier des marqueurs et des cibles thérapeutiques. La mise à mort sert à prélever les organes et à rechercher les métastases par imagerie.

Objectifs

Le cancer colorectal est l'un des plus fréquents en France. Il touche, chaque année, plus de 43 000 personnes et cause 17 000 décès. A l'heure actuelle, nous cherchons toujours à comprendre les mécanismes de développement tumoral et métastatique afin d'améliorer la prise en charge, le traitement et le suivi des patients atteints de cancers colorectaux. L'identification de nouveaux marqueurs prédictifs de l'évolution de la maladie, ainsi que de cibles thérapeutiques qui seraient au coeur des processus tumoraux clés (initiation tumorale, dissémination dans la voie sanguine, colonisation métastatique des organes) constitue un enjeu majeur en terme de lutte contre cette maladie. Chez les patients atteints de cancers colorectaux, la protéine PTK7 a été décrite comme un facteur de mauvais pronostic. On retrouve cette protéine dans les tumeurs primaires (étape initiale) ainsi que les métastases (étape finale) chez les patients atteints de forme aggressive. Nous avons découvert que, chez ces mêmes patients, cette protéine est absente des cellules tumorales qui sont dans le sang (étape intermédiaire de dissémination). De cette observation est né le présent projet qui vise à déterminer le mécanisme de régulation transitoire de PTK7 dans les cellules tumorales. En effet, la perte de PTK7 sur les cellules cancéreuses en circulation sanguine semble primordiale dans le développement métastatique et nous voulons valider cette hypothèse afin de pouvoir déterminer comment mieux cibler cette protéine en terme de stratégie thérapeutique. Pour ce projet, nous voudrions mettre en place un modèle murin de cancer colorectal métastatique qui récapitule les observations que nous avons faites chez les patients concernant la protéine PTK7. Dans cette optique, nous utiliserons une lignée cellulaire humaine de cancer colorectal exprimant un fort taux de PTK7 que nous injecterons à des souris immuno-déficientes. Sur la base de la validation de la régulation de PTK7 dans notre modèle, nous proposons dans un second temps, de déterminer si l'absence de PTK7 est requise au niveau des celulles pour leur survie dans la circulation et la formation de métastases. Récemment nous avons mis en évidence que l'induction de la perte de PTK7 in vitro avait pour effet d'augmenter l'expression de FAK, protéine impliquée dans la survie des cellules cancéreuses. Nous prosposons, dans un troisème temps, de tester l'effet d'inhibiteurs de FAK et sa voie de signalisation sur la dissémination métastatique.

Bénéfices attendus

Au travers de cette étude chez la souris, nous pourrons valider et mieux comprendre un mécanisme nouvellement identifié chez l’homme. Sur la base des données obtenues, nous aurons déterminé l’implication de PTK7 dans la pathologie cancéreuse. Nous espérons, in fine, proposer de nouvelles pistes thérapeutiques dans le but final d’améliorer la prise en charge des patients atteints de cancers colorectaux agressifs.

Procédures

Sur le plan des gestes chirurgicaux prévus dans ce projet, les animaux receveurs de greffe par voie sous cutanée seront soumis à une résection de la tumeur au site initial d’injection. Les procédures expérimentales de transplantation et de résection seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. La durée estimée pour la transplantation (de l’induction de l’anesthésie à la greffe) est de 5 minutes par animal. La procédure de résection (de l’induction de l’anesthésie à la phase de réveil sur tapis chauffant) représente 15 minutes par animal. Le retrait des agrafes qui interviendra 10 à 15 jours après l’exérèse des greffons nécessite 5 minutes par animal. En complément de ces approches, dans le contexte du suivi hebdomadaire, les souris feront l’objet d’une mesure du greffon induit. Ce geste basé sur la de préhension nécessite 1 minute par animal. Dans le contexte du suivi des cellules tumorales circulantes, les animaux feront l’objet de prélèvements sanguins, réalisés sous anesthésie. La fréquence des prélèvements respectera un délai de 15 jour minimum entre deux prélèvements (3 prélèvements maximum par animal). Le geste technique ne prend pas plus de 5 minutes par animal (induction de l’anesthésie comprise). Les animaux recevant les cellules tumorales par voie intraveineuse, en vue de mimer la dissémination des cellules à des foyers distants seront injectés (dose unique) dans la veine caudale (durée 2 minutes par animal). L’administration de traitement avec des inhibiteurs se fera par voie orale(gavage) à raison de deux administrations pour chaque animal concerné (durée 1 minute).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux recevront les cellules par injection en voie sous-cutanée, manipulation pouvant entrainer de la douleur, du stress pour les individus concernés. La greffe de cellules ainsi que le suivi par prélèvement sanguin seront effectués sous anesthésie, procédure technique qui pourra induire une angoisse chez l’animal lors de la phase l’endormissement. De plus, le suivi de l’évolution de la pathologie cancéreuse nécessitera une préhension fréquente des animaux qui pourra également être source de stress. Lors du développement tumoral, la survenue de lésions cutanées est possible au niveau des greffons de croissance avancée. Dans le contexte du suivi de l’évolution métastatique de la pathologie, les animaux développeront des foyers tumoraux distants qui pourront induire des inconforts (tels que perte de poids, difficultés respiratoires) en fonction des sites touchés. L’administration par voie orale de composés pourra entrainer un stress / un inconfort pour les animaux. La prise en compte et l’anticipation de ces nuisances (phases d’acclimatation, d’habituation à la manipulation, enrichissement dans les cages, grille de score de bien-être et soins adaptés) nous permettront d’agir au mieux afin de réduire ces effets indésirables à leur maximum et le plus précocement possible dans le contexte du suivi des animaux, sans mettre en péril les conclusions expérimentales.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque procédure concernée en vue de l'investigation tissulaire ex-vivo. Les organes ainsi prélevés seront analysés par imagerie optique afin d’explorer la présence de métastases. Les foyers tumoraux distants ainsi mis en évidence seront préparés pour l’extraction de matériel biologique en vue de la caractérisation du profil d’expression de notre protéine d’intérêt dans le contexte de la pathologie cancéreuse et de son évolution métastatique.

Remplacement

Dans cet objectif, chaque fois que cela a été possible, nous avons utilisé des approches substitutives in vitro et mis en place des techniques de culture cellulaire. Ces méthodes ont toutefois des portées limitées dans leur capacité à récapituler l’ensemble du processus physiopathologique de la croissance (pousse de la tumeur initiale) à la dissémination métastatique de la maladie. Le recours au modèle in vivo se fera dans la continuité de ces approches in vitro et ne sera utilisé qu’après validation de nos hypothèses au travers de ces méthodes complémentaires.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, le suivi du développement de la pathologie maligne chez les animaux transplantés se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs, tels que la mesure des greffons à l’aide d’un pied à coulisse et le recours à l'imagerie optique in vivo par bioluminescence. Le recours à l’outil statistique nous a permis en outre de déterminer le nombre d’animaux suffisants mais nécessaires pour permettre de fournir des résultats significatifs.

Raffinement

Afin d’améliorer le cadre de vie des animaux, les besoins physiologiques seront respectés (nourriture et eau ad libitum). Nous optimiserons les conditions d’hébergement des animaux par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés, lanières de papier et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 3 à 5 afin d’éviter le stress de l’isolement. Les procédures expérimentales de transplantation seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). C’est de plus, le modèle le plus fourni en études pour ce qui concerne le domaine de la cancérologie. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux à l’âge adulte (8-10 semaines). De par notre expérience et selon les données de la littérature, cette fenêtre d’âge est optimale pour la prise de greffe de cellules tumorales chez le modèle murin dans un contexte de xénogreffe.

911 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de mutations dans les voies de réparation de l'ADN, elles subissent des prélèvements sanguins tous les quatre mois pendant un an et développent pour certaines des syndromes tumoraux, celles-ci étant tuées dès l'apparition des tumeurs. Le porteur étudie le rôle de la réparation de l'ADN dans le développement des systèmes immunitaire et nerveux et dans la genèse de cancers comme la leucémie lymphoïde chronique. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative in vitro" pour ces processus de développement.

Objectifs

Les cassures double brin de l’ADN (CDB) sont les lésions génomiques les plus toxiques et font pourtant partie intégrante de processus biologiques au cours du développement du système immunitaire et du système nerveux. Des mécanismes puissants de réparation de ces lésions ont été conservés au cours de l’évolution afin d’éviter l’instabilité génétique qu’elles peuvent engendrer. La mauvaise réparation des CDB est à la base de nombreuses pathologies chez l’homme allant de certaines maladies neurodégénératives (Ataxie télangiectasie), aux déficits immunitaires sévères en passant par le développement de cancers. Chez l’animal, les formes les plus sévères de déficit de réparation des CDB se traduisent par une létalité embryonnaire tardive consécutive à la mort massive des neurones. Néanmoins, les voies de réparation de l’ADN constituent des cibles thérapeutiques privilégiées pour le développement des traitements anticancer. Notre laboratoire a identifié plusieurs gènes impliqués dans diverses voies de réparation des CDB à partir de l’analyse de situations pathologiques chez l’homme. Depuis de nombreuses années nous associons ces études issues du patient au développement de modèles animaux d’invalidation génique afin de mieux comprendre la physiopathologie des facteurs identifiés.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet une meilleur compréhension du rôle des mécanismes de réparation de l'ADN au cours du développement du système immunitaire et du système nerveux central. Ce projet nous aidera également à mieux comprendre comment les défauts de ces mécanismes de réparation participent à la genèse de syndromes tumoraux que l'on rencontre en pathologie humaine, notamment la leucémie lymphoïde chronique.

Procédures

sacrPour évaluer la survenue de leucémie chez les animaux porteurs de mutation dans les voies de réparation de l'ADN, des prélèvements sanguins (une minute sous anesthesie) seront réalisés tous les 4 mois sur une période de 1 an (soit 3 prélèvement par animal) pour l'analyse de l'apparition de cellules pré-leucémiques.

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables que nous anticipons sont le développement de syndromes tumoraux dans certaines situations. Les animaux seront particulièrement suivis pour l'existence de ces tumeurs et euthanasiés dès leur apparition.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue des procédures pour prélèvements d'organe et analyse phénotypique

Remplacement

Le développement du système nerveux central et du système immunitaire sont des processus très complexes pour lesquels il n’existe malheureusement pas d’alternative in vitro aux analyses sur animaux entiers pour avoir une vision d’ensemble. Pour certaines études mécanistiques il existe néanmoins la possibilité d’utiliser des lignées cellulaires après immortalisation in vitro des lymphocytes. Nous utiliserons cette approche afin de diminuer le nombre d’animaux dans la mesure du possible.

Réduction

Notre expérience préalable sur ce type de modèles animaux nous montre que les phénotypes, lorsqu’ils sont dommageables (létalité embryonnaire, baisse de viabilité avant sevrage ou déficit immunitaire), sont en général suffisamment importants et homogènes pour être statistiquement significatifs sur de faibles cohortes. Nous calculons le nombre minimal d'animaux nécessaire à l'aide d'outils statistiques.

Raffinement

Un des phénotypes dommageables possible des animaux par ailleurs viables étant un déficit immunitaire plus ou moins sévère, ils seront obtenus et maintenus en portoirs ventilés, en zone protégée afin de minimiser leur exposition à des agents pathogènes. Un suivi quotidien permettra de s’assurer que les animaux ne développent pas de signes cliniques d’infection. Devant un état moribond du pelage, une voussure ou prostration sévère ou un amaigrissement important laissant supposer une telle infection ou un mal-être général, les animaux seront systématiquement sacrifiés. Les animaux sont par ailleurs maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social.

Choix des espèces

Le développement du système nerveux central et du système immunitaire sont particulièrement bien étudiés depuis de nombreuses années chez la souris. De nombreuses lignées mutantes existent déjà et peuvent être croisées sur de nouveaux modèles. Le développement de nouvelles technologies permet l’ingénierie de mutations « fines » calquées sur les mutations observées en pathologie humaine. De nombreux réactifs existent pour l’analyse phénotypique des modèles murins. - Pour évaluer le phénotype dommageable affectant la survie (embryonnaire et postnatale) le génotypage des animaux sera réalisé au moment du sevrage (3 semaines) - Pour confirmer un éventuel phénotype dommageable embryonnaire, les embryons seront récupérés à E18, date à partir de laquelle il est possible de réaliser un immunophénotypage - Pour évaluer le phénotype dommageable sur le système immunitaire, les animaux seront sacrifiés à 6-8 semaines, période classique d’analyse pour laquelle le système immunitaire est pleinement fonctionnel

164 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules de chondrosarcome, tumeur du cartilage, dont le développement est suivi au pied à coulisse avant la mise à mort pour analyses. Le porteur compare quatre modèles de cette tumeur afin de choisir le plus pertinent pour tester ensuite un anti-inflammatoire vectorisé, le projet restant une étape préparatoire sans évaluation thérapeutique. Il affirme que la culture cellulaire ne reproduit pas le microenvironnement tumoral et que le passage in vivo est inévitable pour sa stratégie de vectorisation.

Objectifs

Le chondrosarcome, ou tumeur maligne du cartilage, représente 30 % des tumeurs malignes osseuses. Caractérisé par un microenvironnement peu favorable, il est radio- et chimio-résistant. Actuellement, le seul traitement efficace est la chirurgie pouvant entraîner de lourdes incapacités pour le patient. De plus, le taux de survie à 5 ans est inférieur à 50 % en cas de récidive pour les formes les plus agressives, rendant ce cancer redoutable. Dans le cadre d’un nouveau projet de recherche, notre unité s’intéresse à la composante inflammatoire du chondrosarcome dans le but de proposer une nouvelle prise en charge thérapeutique. La stratégie envisagée consiste à acheminer spécifiquement au niveau du cartilage tumoral anti-inflammatoire, le célécoxib. En effet, bien que peu étudié dans le chondrosarcome, la littérature démontre largement l’efficacité du célécoxib in vitro et in vivo dans les tumeurs tout en soulignant les effets indésirables qui limitent son utilisation. La stratégie que nous développons, pour acheminer spécifiquement le célécoxib, consiste à exploiter deux caractéristiques du microenvironnement du chondrosarcome : (i) sa richesse en protéoglycanes et (ii) la surexpression de certaines métalloprotéinases. Après des résultats in vitro encourageants, nous souhaitons évaluer les molécules développées in vivo. Dans le but de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous souhaitons dans un premier temps définir le modèle in vivo de chondrosarcome le plus adapté pour l’évaluation in vivo de nos dérivés. Ainsi, l’objectif de cette demande de projet sera de comparer 4 modèles de chondrosarcome classiquement utilisés et maitrisés au laboratoire, à différent stade du développement tumoral et d'évaluer l'expression des cibles exploitées pour notre stratégie. Les résultats obtenus nous permettrons de valider le modèle qui sera le plus pertinent pour envisager l’évaluation in vivo par la suite.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de caractériser la composante inflammatoire de 4 modèles in vivo de chondrosarcome et de valider le modèle le plus pertinent pour une évaluation des dérivés développés au sein de notre unité.

Procédures

Innoculation de cellules tumorales en sous cutanée et sous anesthésie (5min) (1 par souris) Suivi du volume tumoral au pied à coulisse et sous anesthésie (5min) (1 à 2 fois par semaine) Procédure chirurgicale (10 min) (1 par rat) Mise à mort (tous les animaux)

Impact sur les animaux

Cette demande de projet n'entraine que très peu de nuisance envers les animaux. L'induction du modèle impliquant une anesthésie peut engendrer un stress. A un stade plus avancé, le développement tumoral pourrait entrainer une légère gène au déplacement.

Devenir

Procédure 1 et 2 : Mise à mort pour analyses mécanistiques

Remplacement

La culture cellulaire ne représente pas la complexité du micro-environnement tumoral et notamment de sa composante inflammatoire. Une évaluation in vitro nous permettra de réaliser un premier screening des molécules développées dans notre unité mais nous ne permettra pas de valider notre stratégie thérapeutique, cette dernière étant basée sur une stratégie de vectorisation. Le passage sur un modèle in vivo est donc inévitable pour juger de façon optimale la stratégie de vectorisation que nous développons.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, chacune de nos études mécanistiques ont été réfléchi afin d’avoir la quantité de matériel tumoral adéquat.

Raffinement

Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne). De plus, des injections d’antalgiques pourront être appliqués.

Choix des espèces

Les rongeurs sont classiquement utilisés en expérimentation animale comme en cancérologie. Trois des modèles d’étude sont des chondrosarcomes humains qui de ce fait doivent être implantés chez des souris immunodéprimées. Le dernier modèle d’étude est un chondrosarcome de rat pouvant être implanté directement chez le rat. Les souris seront commandées à 4 semaines afin de permettre le développement tumoral qui est relativement long.* Les rats seront commandés à 150g afin de permettre le développement tumoral qui est relativement long (3 semaines chez le rat).