Oncologie

1 910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies cérébrales d'injection virale et d'implantation d'électrodes et de fibres optiques, l'implantation sous-cutanée de puces RFID, puis une exposition à la nicotine et une manipulation optogénétique de leurs circuits neuronaux. Le porteur indique que les bagarres entre animaux peuvent les blesser gravement, que les manipulations répétées peuvent diminuer leur bien-être et qu'une trop forte dose de nicotine risque une overdose. Il affirme que seul l'animal vivant permet cette étape d'intégration entre comportement social et neurophysiologie, le bénéfice annoncé visant les troubles addictifs et psychiatriques.

Objectifs

L’addiction au tabac est un problème majeur de santé publique. Cependant nous ne sommes pas tous égaux devant l’addiction et les raisons pour lesquelles nous fumons sont souvent très variées. Les mécanismes qui sous-tendent des différences de vulnérabilité, bien qu’essentiels pour comprendre pourquoi un individu devient et reste dépendant, sont peu étudiés d’un point de vue neurobiologique. Dans ce projet, nous développerons une approche intégrative pour lier les variations dans les traits individuels et la vulnérabilité aux drogues. Nous analyserons l’histoire individuelle de souris au sein d’un groupe pour étudier, sur de longues périodes, les dynamiques sociales entre congénères et les différentes stratégies utilisées dans des tâches de prise de décision. La consommation et le sevrage nicotiniques seront ensuite évalués pour lier les variations de comportements individuels observées avant exposition à la drogue et la vulnérabilité à la nicotine. Nous étudierons électrophysiologiquement comment les relations sociales et les prises de décision individuelles façonnent l’activité des circuits neuronaux impliqués dans la réponse à la nicotine et la susceptibilité à la drogue. Nous insisterons sur les circuits dopaminergiques impliqués dans la motivation et la réponse aux récompenses, ainsi que leurs innervations cholinergiques à travers les récepteurs nicotiniques. Ces circuits seront ensuite manipulés à l’aide d’outils optogénétiques, chémogénétiques ou de « modifications de l’environnement de l’animal » afin de modifier la vulnérabilité individuelle. Tous ces paramètres neuronaux et comportementaux seront des facteurs prédictifs utiles pour comprendre la mise en place des dépendances. Ce projet aborde donc le problème de l’individu face à la drogue. Cela représente un effort unique pour comprendre, à plusieurs niveaux d'analyse (de la molécule au comportement), le rôle des caractéristiques et des histoires individuelles dans le processus d’addiction.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier des voies neuronales spécifiques de la vulnérabilité individuelle aux substances addictives, mais aussi comment un individu adapte ses stratégies face à celles-ci, dans un milieu social. Les prises de décision dans un environnement social sont d'une importance majeure pour s'adapter à son environnement. De nombreuses pathologies sont associées à un déficit d'adaptabilité dans un environnement complexe et social, notamment les troubles du spectre autistique, la schizophrénie ou encore les conduites addictives, souvent favorisées par un contexte favorable à leur développement. Une meilleure compréhension de ces mécanismes, notamment à un niveau comportemental et physiologique, permettra donc d'appréhender plus efficacement les cibles cellulaires en vue de traitements futurs face à un enjeu sociétal majeur.

Procédures

Les souris subiront des procédures chirurgicales en vue d'injecter des adenovirus-associés (AAV) permettant l'expression de gènes spécifiquement dans le cerveau, mais aussi d'implantations d'électrodes d'enregistrements et de fibres optiques afin d'enregistrer l'activité neuronales. Les chirurgies d'injection durent environ 45 mins à 1h. Les chirugies d'implantation d'électrodes et de fibres aux alentours de 1h aussi. Les chirurgies d'injection d'AAV et d'implantation sont séparées car l'expression d'un AAV au sein du cerveau est d'environ 3 semaines. Ainsi, afin d'éviter d'abimer les électrodes et les fibres implantées, celles-ci seront implantées 3 semaines plus tard, augmentant grandement les chances d'avoir des résultats exploitables à l'enregistrement. A leur réveil, le comportement des animaux sera évalué pour coupler la neurophysiologie et l'aspect comportemental. Des micropuces RFID seront implantées en sous-cutané pour permettre de suivre la position de l'animal au sein de l'environnement étudié. Le comportement des animaux sera évalué durant 2 semaines où ceux-ci vivront en communauté dans une grande cage enrichie de 50cm sur 50cm et seront placés par 3. Pour la procédure où l'animal sera étudié seul, le comportement dans la cage durera 5 jours pour limiter l'isolement. En fin de certaines procédures, les animaux seront anesthésiés et un enregistrement unitaire de neurones sera effectué. A la fin de l'enregistrement, la souris sera euthanasiée sans être réveillée.

Impact sur les animaux

Les animaux qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures. Certaines infections au niveau des sutures pourraient éventuellement survenir. Les bagarres entre animaux peuvent aussi arriver, blessant superficiellement ou gravement certaines souris lors du comportement en groupe. Une même souris passera dans un nombre maximum d'expériences afin de réduire l'utilisation d'animaux. Le fait de passer dans plusieurs expériences d'affilées peut possiblement diminuer le bien-être de l'animal avec les manipulations répétées. Certains effets indésirables liés à la stimulation optogénétique peuvent survenir et troubler l'activité locomotrice. Si de tels troubles sont visibles, la stimulation sera immédiatement arrêtée et l'animal laissé au repos. L'administration de nicotine en eau de boisson ou injection intrapéritonéale peut induire un risque d'overdose à trop forte concentration.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés. - Soit directement à la fin de la procédure si aucune autre procédure n'est nécessaire à effectuer sur ces animaux. Les animaux n'ayant effectué que du comportement seront euthanasiés. - Soit pour extraire le cerveau de l'animal pour l'étudier. En effet, nous devons confirmer la bonne expression des virus injectés dans le cerveau et l'emplacement des électrodes/fibres implantées. Cette confirmation est indispensable comme contrôle pour prouver que l'enregistrement ou la manipulation de l'activité neuronale est bien liée à la zone cérébrale étudiée.

Remplacement

Notre projet vise à étudier la complexité du comportement de la souris. Nous souhaitons utiliser cette méthodologie afin de mesurer de manière automatique les comportements sociaux, la hiérarchie et son incidence sur les comportements individuels ainsi que sur la susceptibilité de certains profils comportementaux à s'administrer des drogues d'abus. Le découplage et la corrélation entre comportement et neurophysiologie est aussi une composante majeure de ce projet. Au sein du laboratoire, l'expérience sur les animaux a été préparée en amont par des méthodes ex-vivo (telle que le patch-clamp recording). Cette dernière étape d'intégration ne peut être réalisée in silico et nécessite donc de se faire sur des animaux vivants. Cette étude n’est donc réalisable que sur des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux, pour ce projet, est déterminé sur la base d'une litterature vaste et robuste dans des domaines similaires. Afin de réduire l'utilisation de souris au minimum, nous nous imposerons un cahier des charges strict. Pour ce faire, les procédures ont été pensées pour qu'une même souris puisse passer dans un nombre maximum d'expériences afin de réduire l'utilisation de nouveaux animaux pour chaque expérimentation. De plus, notre projet s'inscrit dans un temps long, avec l'observation d'une même souris sur une période étirée, limitant de ce fait l'utilisation répétée d'animaux. Les effectifs d'animaux à utiliser ont été calculés au plus juste grâce à des tests de puissance statistique effectuées en amont des expériences. De plus, l'analyse de la littérature dans ce domaine, qui est vaste, nous permet d'estimer au mieux le nombre d'animaux à utiliser pour chaque expérience. Enfin, de notre propre expérience au sein du laboratoire, ayant l'habitude d'effectuer ce genre de procédures, tout ceci nous permet d'estimer un nombre juste d'animaux afin de générer des résultats consistants et interprétables.

Raffinement

Dans nos environnements, l'espace pour chaque souris, ainsi que l'enrichissement, sont supérieurs aux cages conventionelles de stabulation. La taille de la cage, les différentes zones accessibles, la présence d'un nid au centre de l'environnement ainsi que d'un levier permettant d'obtenir de la nourriture ad libitum permettent de diversifier les actions locomotrices et exploratrices des animaux, contribuant à leur bien-être. Tout ceci relève donc d'un plus grand enrichissement. Les souris sont pesées tous les jours et suivies en temps réel via des caméras nous permettant de monitorer à distance le comportement des animaux. Il nous est donc possible d'intervenir rapidement en cas de quelconque soucis. De plus, le bien-être des souris est conditionné par la mise en place de protocoles et de points limites lors des procédures visant à réduire les éventuelles souffrances animales. Par exemple, en cas d'agression entre animaux, des soins seront apportés aux souris blessées et celles-ci seront isolées le temps de la récupération. Si l'animal n'a pas pu récupérer dans une temps raisonnable, la procédure s'arrêtera pour celui-ci. Une fois le regroupement effectué, une surveillance accrue sera effectuée pour observer tout comportement agressif envers l'animal préalablement blessé. Si les comportements aggressifs persistent, la procédure sera arrêtée pour l'animal. Notre design d'électrode pour enregistrer l'activité des neurones est plus léger et moins encombrant que les autres systèmes connus et vendus sur le marché. Lors des chirurgies, certaines douleurs peuvent survenir en post-opératoire. Pour diminuer et abolir ces douleurs, des anesthésiques locaux et des anti-douleurs seront administrés. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale gazeuse controlée durant la totalité de la chirurgie afin de permettre un rétablissement rapide de l'animal. Si l'animal n'a pas récupéré dans les 48h, la procédure s'arrêtera pour celui-ci. Un tapis chauffant sera placé sous l'animal afin d'éviter l'hypothermie.

Choix des espèces

Le système dopaminergique mesocorticolimbique des rongeurs est relativement bien conservé par rapport à l’Homme, anatomiquement et fonctionnellement. Les récepteurs nicotiniques et les afférences cholinergiques sont organisées de manières similaires. Ce n’est pas le cas chez les invertébrés, poissons et oiseaux. Par ailleurs, il existe beaucoup d’endophénotypes de l’addiction clairement établis chez la souris. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d’autres modèles. Si les modèles d’invertébrés et poisson peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes de renforcement aux drogues, l’organisation anatomique est trop différent pour qu'ils puissent être utilisés pour comprendre la modulation nicotinique du système dopaminergique. Des modèles de mammifères (rat, singe) ne se justifient pas non plus car les outils génétiques nécessaires pour disséquer les mécanismes sous-jacents n’existent pas chez ces espèces. Enfin, notre environnement élargi et enrichi a été spécifiquement développé et adapté à l'étude de la souris. Les animaux utilisés seront à l'âge jeune adulte - adulte. Avant 8 semaines, les souris sont considérées comme étant au stade adolescent. Ainsi, sachant que le comportement à cet âge est différent de l'âge adulte, et que notre étude porte sur l'âge adulte uniquement, nous éviterons d'étudier le comportement de souris avant 8 semaines. De plus, l'implantation de fibres et d'électrodes représentant une certaine charge de poids sur la tête de l'animal, nous préférons le faire une fois que ceux-ci sont plus grands et ne pas influencer leur comportement avant 8 semaines. Ainsi, les procédures qui nécessitent des injections virales uniquement se feront sur l'animal entre 4 et 6 semaines afin d'observer un temps d'infection nécessaire par le virus concerné (entre 3 et 6 semaines d'expression). Les souris qui se verront implanter des fibres optiques ou des électrodes d'enregistrement subiront une chirugie à partir de 8 semaines (âge adulte pour une souris). Les expériences comportementales se feront aussi à partir de 8 semaines d'âge.

90 souris au système immunitaire humanisé vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules de leucémie pouvant induire une tumeur et des métastases, avec des prélèvements sanguins réguliers et une imagerie sous anesthésie deux à trois fois par semaine. Le porteur indique que les animaux développant des métastases douloureuses seront euthanasiés. Il qualifie ces souris humanisées d'approche "indispensable" et affirme que les interactions entre système immunitaire, pathologie et traitement ne peuvent être recréées in vitro.

Objectifs

Les lymphocytes T sont des cellules du système immunitaire qui présentent des fonctions « tueuses » puissantes et leur capacité à reconnaître et tuer spécifiquement des cellules tumorales est une promesse thérapeutique d'importance. Le but de cette expérimentation animale est de vérifier si des cellules précurseurs des lymphocyte T sont capables de migrer dans le thymus et s'y différencier afin d'acquérir les caractéristiques fonctionnelles des lymphocytes T matures : c'est-à-dire, reconnaissant une cellule tumorale afin de s’activer et d’éliminer les cellules cibles l'exprimant.

Bénéfices attendus

Les lymphocytes T immatures peuvent au préalable être modifiés génétiquement pour leurs permettant de s'attaquer à des cellules tumorales cibles. Il s'agit donc de vérifier l'efficacité d'un modèle permettant de développer des nouvelles méthodes thérapeutiques pour guérir les cancers. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous validons en outre un modèle davantage spécifique de l'utilisateur final des ces cellules à visées thérapeutiques : l'Homme.

Procédures

Injection : 3 maximum, d'une durée de 10 à 15 secondes chacune; prélèvements sanguins : toutes les 2 semaines, d'une durée de 10 à 15 secondes chacun. Imagerie in vivo sous anesthésie générale : 5-10 minutes par souris 2 à 3 fois par semaine.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales peut induire une tumeur et la présence de métastases.

Devenir

Les animaux ayant reçu une injection de cellules tumorales risquent de développer des métastases amenant une souffrance. Ils seront dès lors euthanasiés.

Remplacement

Les tests in vitro ont été envisagés. Néanmoins, il n’est pas possible de recréer, in vitro, les interactions complexes qui peuvent exister entre un organe fonctionnel (le système immunitaire), une pathologie et les effets thérapeutiques et toxicologies de composés à visées thérapeutiques les impliquant. Les souris aux organes humanisés constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de nouvelles thérapies.

Réduction

Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux par groupe (n=10) est réalisée sur la base de notre expérience, ainsi que sur la littérature scientifique tout en tenant compte du taux d’humanisation de 82,5%. Trois groupes sont prévus et un total de 3 études sera réalisé, au total, pour valider le modèle.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Six morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposes. A leur entrée dans le projet, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation et seront habituées a la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle cumulative de scores prenant en compte : l’aspect du pelage, les mouvements, l’activité, la couleur des muqueuses et le score corporel. Les souris seront évaluées quotidiennement et l’échelle sera appliquée dès que nécessaire. Une souris avec un score clinique ≥ à 7 sera euthanasiée pour raison éthique. Le poids sera monitoré 3 fois par semaine. Une perte de plus de 20%, calculée à partir du poids le plus élevé sera considérée comme une raison de mise à mort. Toute anormalité non objectivable par l’échelle de score clinique devra être rapportée au vétérinaire qui aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur si elle/il le juge nécessaire.

Choix des espèces

Nous maitrisons l'humanisation du système immunitaire sur les souris NCG. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de continuer sur cette espèce. La procédure expérimentale requiert des animaux entrant en étude vers l’âge de 3-4 semaines. Des animaux plus âgés présentent des taux de succès inférieurs pour la prise de greffe.

4 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une implantation de tumeur cérébrale par stéréotaxie, un suivi par IRM répété, des injections intraveineuses, sous-cutanées ou intracérébrales sur plusieurs cycles et des gavages, pour tester un peptide et des nanotechnologies portés par une société de biotechnologies. Le porteur décrit des effets possibles d'hyperpression intracrânienne, d'œdème et de perte de poids, et justifie l'effectif élevé par les 17 procédures prévues. Il qualifie le passage par un modèle animal d'"indispensable" et conclut que le glioblastome ne peut être reproduit in vitro, les bénéfices pour les patients restant conditionnés à des étapes réglementaires ultérieures.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde, une survie médiane de 14 mois et aucun traitement curatif. Le traitement actuel consiste en une extraction chirurgicale de la tumeur suivie par le protocole de Stupp (radiothérapie et chimiothérapie avec le témozolomide). Des travaux ont montré l’activité anticancéreuse du peptide NFL sur des cellules de GBM (rats, souris, humain) cultivées en laboratoire et sur des rats porteurs d'un GBM (après une simple administration directement dans la tumeur). Ce peptide tue également les cellules responsables de l'apparition du GBM. De plus, lorsque le peptide se trouve à la surface de nanotechnologies, ce peptide augmente leur entrée dans des cellules de GBM de souris comparativement aux nanotechnologies seules. Chez l'animal (souris), une seule injection des nanotechnologies couplées au peptide et chargées en un anticancéreux, directement dans la tumeur, diminue de manière plus efficace le volume de la tumeur comparativement aux nanotechnologies chargées en anticancéreux mais sans peptide à leur surface. Une société de biotechnologies en santé travaille sur les formulations de ce peptide seul et combiné à des nanotechnologies pour en faire de futurs candidats-médicaments pour le traitement du GBM. Leur développement pharmaceutique a permis de les formuler pour une utilisation clinique. Le but de ce projet de recherche pré-clinique non réglementaire est d’étudier la tolérance et l’efficacité de ce peptide seul ou combiné à des nanotechnologies après administrations chez des souris saines ou porteuses de GBM humain en déterminant la voie d’administration la plus adaptée afin de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients.

Bénéfices attendus

La société de biotechnologies en santé qui travaille sur les formulations du peptide NFL seul et combiné à des nanotechnologies visent à en faire de futurs candidats-médicaments dans le traitement du GBM. Ces travaux avancés de recherche pré-clinique non réglementaire ont pour but de valider l’innocuité des traitements et leur efficacité et ainsi, confirmer leur intérêt thérapeutique. Si l’intérêt thérapeutique est attesté et la posologie déterminée, ces travaux pourront servir de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques chez l'Homme. Le but de ce projet est de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients opérables ou non.

Procédures

Dans la mise au point du modèle, les animaux subiront 3 types d'intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (4 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours) et une injection intraveineuse. Dans l'étude de toxicité, les animaux subiront un type d'intervention : des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) ou une injection intracérébrale. Dans l’étude de biodistribution et pharmacocinétique tissulaire, les animaux subiront jusqu'à 5 types d’intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (3 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours), des injections intraveineuses ou sous-cutanées sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) ou une injection intracérébrale qui durera plusieurs minutes et une perfusion cardiaque. Dans l’étude de pharmacocinétique, les animaux subiront deux types d’intervention, une injection unique intraveineuse ou sous-cutanée ou intracérébrale qui durera plusieurs minutes et des prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudal, de la veine jugulaire ou du sinus retro-orbital (3 prélèvements maximum, qui dureront quelques minutes chacun et qui seront espacés de plusieurs minutes à plusieurs heures). Dans l’étude d'efficacité, les animaux subiront quatre types d’intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (1 à 6 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours), des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) ou une injection intracérébrale qui durera plusieurs minutes et des gavages répétés (1 gavage par jour pendant 5 jours suivi de 2 jours de repos, sur 5 cycles maximum).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de chaque phase du projet. Les nanotechnologies pouvant être chargés d’anticancéreux (paclitaxel, etc.), des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’acte chirurgical et la croissance tumorale (hyperpression intracrânienne, oedème, etc.) ainsi qu’à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).

Devenir

A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements de sang et/ou d’organes.

Remplacement

L’utilisation des candidats médicaments étant à visée humaine, dans le domaine de la neuro-oncologie, il est nécessaire de réaliser des études précliniques pharmacologiques non-réglementaires, comme ici des études toxicologiques et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur innocuité et efficacité avant les études précliniques réglementaires et les essais cliniques chez l’Homme. Des travaux menés sur des cultures de cellules tumorales et saines ont déjà été réalisées ou sont en cours pour valider les molécules et formulations testées. Pour compléter l’étude, il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM humain avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer. Le développement de ce type de modèle (modèle CDX) dans ce projet ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques dans un microenvironnement particulier, notamment dans le cas du glioblastome, ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Réduction

L'étude de toxicité permettra de raffiner la dose administrée, et ainsi de réduire le nombre de lot d’animaux à tester dans les études suivantes (études 2, 3 et 4). Une seule dose à la fois sera testée. Ainsi, si la plus haute dose n’est pas toxique, les doses plus basses ne seront pas systématiquement testées. Le nombre de souris immunodéprimées pourra également être réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez les souris immunocompétentes. Pour finir, lors de l’étude d’efficacité, seuls les traitements ayant montré la meilleure biodistribution et pharmacocinétique tissulaires seront testés pour réduire le nombre d’animaux. Enfin, ce traitement étant destiné aux hommes et aux femmes, ces études seront d'abord effectuées sur un premier sexe, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux pour le deuxième sexe. Ce nombre n'est pas inclu dans cette saisine mais est estimé à 1526 comparativement à 4640 pour le premier sexe. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il n’est pas utile d’avoir plus d’animaux, mais il est préférable de ne pas en utiliser moins, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe. L’effectif des souris utilisées (4640) est très important, toutefois il est justifié par le nombre de procédures (17) dont la logique de déroulement est clairement établie. Si certaines de ces procédures étaient un échec complet (peu probable et non souhaitable), cela pourrait entraîner un arrêt du projet tel qu’il est établi aujourd’hui et diminuerait le nombre de vies animales utilisées, afin d’éviter de recourir inutilement à des vies animales.

Raffinement

La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien. Afin d’évaluer de façon raffiner la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sera mis en place pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, un médicament contre la douleur serait administrée jusqu’à ce que ces signes disparaissent. L'atteinte d'un des points limites par un animal impliquera sa mise à mort. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet. Au fur et à mesure des études précédentes, nous avons pu affiner cette grille et la prise en compte de la douleur animale.

Choix des espèces

Des recherches bibliographiques montrent que la souris est l'espèce la plus utilisée et adaptée pour l’implantation de cellules de GBM, qu’elles soient issues de lignées immortalisés ou de patients. Il s'agit de l'espèce la mieux décrite dans la littérature. Les souris seront utilisées entre 6 et 8 semaines d’âge. Cet âge est majoritairement retrouvé dans les études bibliographiques in vivo sur modèle orthotopique de GBM chez la souris.

20 marmousets vont être utilisés, gardés en vie à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont mis à jeun de 10 à 18 heures, séparés de leur groupe puis anesthésiés pour subir jusqu'à 20 séances d'IRM, avec injection d'un agent de contraste au fer et d'un chélateur, pour comparer le traitement de la voix entre marmousets, macaques et humains. Le porteur indique que l'anesthésie peut entraîner des complications respiratoires ou cardiaques et que l'agent de contraste affecte le foie. Il revendique un bénéfice de connaissance fondamentale sur les bases cérébrales de la perception vocale, sans application médicale annoncée.

Objectifs

Ce projet vise à utiliser des tests comportements en accès libre ainsi que l'IRMf pour mesurer l'activité cérébrale dans des conditions d'écoute passive et la comparer entre des groupes de sujets de taille comparable entre marmousets, macaques et humains. Les marmousets seront testés grâce à un système de test automatisé accroché à leurs cages et accessible à volonté, et ils seront scannés sous anesthésie en IRM 3T. Pour la partie comportement, deux expériences seront réalisées grâce à des boites de tests automatiques : catégorisation vocalisations par rapport à d'autres sons et discrimination du locuteur. En parallèle deux expériences seront menées dans le box expérimental : l'enregistrement des vocalisations et l'interaction vocale avec des 'singes virtuels' . Pour la partie IRMf, deux expériences seront réalisées: la localisation d'un patch vocal (neurones sensibles et spécifiques au traitement des vocalisations des marmousets) et comparaison inter-espèces; puis le codage normalisé de l'identité.

Bénéfices attendus

Nous espérons que cette recherche fournira de nouvelles informations cruciales sur les bases cérébrales et comportementales du traitement de l'information vocale chez les marmousets.

Procédures

Des nuisances sont attendues chez les animaux pour la partie imagerie. Lors de la préparation: les animaux vont être mis à jeun la veille de l'intervention (pour une durée minimale de 10 h et maximale de 18 h) et séparés de leur groupe le temps de la session (maximum 4h de séparation). L’imagerie dure environ 4h comprenant la capture de l’animal, le transport jusqu’au scanner, l’acquisition (environ 2h30), le retour à l’animalerie et la réintroduction de l’individu dans son groupe familial. Lors de l'acquisition : les animaux seront anesthésiés et pourront avoir une injection d’agent de contraste mais également être intubés si le protocole d'anesthésie ne nécessite. Après la séance : les animaux ayant eu une injection d'agent de contraste auront une injection d'un chélateur pour capturer le fer libéré dans le foie. L’injection se fait à la sortie de l’IRM quand le singe est pris en contention avant de le remettre dans sa boite de transport, elle dure environ 30 secondes. Au maximum chaque animal subira 20 sessions de scan IRM maximum espacés d’une semaine minimum.

Impact sur les animaux

Le projet ne prévoit la mort d'aucun individu. Cependant des nuisances sont attendues chez les animaux pour la partie imagerie lors de la préparation (mise à jeun, séparation de l'animal à son groupe, capture), lors de l'acquisition (l'anesthésie et ses potentielles complications respiratoires et/ou cardiaques, l'injection intraveineuse d’agent de contraste et ses potentiels effets secondaires au niveau du foie, l'intubation si l'anesthésie le nécessite) et après la séance (injection d'un chélateur pour limiter l'effet de l'agent de contraste sur l'organisme et le foie en particulier).

Devenir

A la fin du projet les animaux seront gardés en vie. Ils pourront être réutilisés après avis favorable du vétérinaire désigné.

Remplacement

Il s’agit d’une étude comparative : par définition celle-ci compare des résultats obtenus chez l’humain à ceux obtenus chez d’autres espèces existantes, afin d’inférer des mécanismes potentiellement présents chez un ancêtre commun, ici les mécanismes comportementaux et neuronaux de la perception de l’information vocale. Il n’est pas possible d’utiliser cette approche expérimentale sans avoir recours à des animaux.

Réduction

Un but essentiel de cette étude comparative est de comparer les performances comportementales et les activations cérébrales de macaques, de marmousets et d’humains de manière robuste. Or un problème majeur dans la littérature jusqu’ici est que les rares études publiées sur les marmousets, notamment en IRMf, rapportent des résultats chez un petit nombre de sujets, typiquement 2 ou 3) alors que le standard de publication pour l’IRMf humaine est d’étudier des groupes d’humains d’au moins 12 sujets permettant des analyses de groupe pour des inférences robustes au niveau de la population générale. Nous voulons dans ce projet adresser ce problème et étudier des groupes d’humains et de marmousets de taille comparable. C’est pourquoi nous prévoyons d’étudier un groupe d’une vingtaine de marmousets (les trois couples reproducteurs initiaux et leur descendance), espérant obtenir des données comportementales et IRMf chez au moins une douzaine d’entre eux, pour une comparaison statistique robuste avec une puissance comparable dans une analyse incluant humains et marmousets. Cette stratégie devrait notamment permettre une estimation puissante de la variabilité interindividuelle des performances comportementales et patrons d’activité cérébrale, un but important de ce projet, qui n’a pas encore pu être réalisée de manière adéquate chez les marmousets du fait du trop petit nombre de sujets typiquement étudié. Par ailleurs ces tailles de groupe familiaux, similaires à celles observées dans le milieu naturel, favoriseront des interactions sociales complexes qui sont une condition importante du bien-être du groupe et un facteur important pour le succès des systèmes de test automatiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes familiaux, avec de l'enrichissement structurel et alimentaire renouvelé fréquemment. L’ajout d’agent de contraste permettrait d’améliorer la qualité des images tout en diminuant le nombre de sessions de scan par animal. La réduction du temps d’isolement du singe de sa famille permet de réduire le stress de tous les singes et également de réduire la possibilité de tensions lorsque le singe sera replacé dans son groupe familial. La modification de la mise à jeun n’affectera pas les autres animaux puisque la mise à jeun aura lieu pendant la nuit, période durant laquelle les animaux dorment et ne s’alimentent pas. Le fait de donner la nourriture quand le singe retourne dans sa cage permet de s’assurer qu’il n’y a pas de tensions entre les individus et d’augmenter la cohésion grâce au partage de nourriture entre eux.

Choix des espèces

Cette étude comparative comparera les données du marmouset à celles observées chez l’humain et les macaques. Les raisons justifiant le choix du ouistiti sont les suivantes : Ils sont relativement proches de nous sur le plan phylogénétique de sorte que les résultats nous renseigneront sur l'histoire de l'évolution relativement récente ; Les ouistitis utilisent des vocalisations complexes et variées spécifiques à chaque espèce, bien caractérisées acoustiquement. Il s'agit d’un modèle neuroscientifique hautement étudié, en particulier pour les neurosciences auditives, de sorte que les résultats obtenus seront interprétables en relation avec une grande quantité de données complémentaires. Enfin, ils peuvent être scannés en IRMf, ce qui constitue un pont unique entre l'IRMf humaine et la littérature électrophysiologique sur les singes. La boite de test sera en accès libre pour tous les individus de chaque cage, cependant nous n’effectuerons la procédure IRM que chez les individus jeunes adultes ou adultes (fin de la période juvénile environ 10-12 mois après la naissance). Les trois femelles reproductrices ne seront pas incluses dans la partie IRM afin de ne pas stresser les gestations ni séparer les enfants de la mère. Si un contrôle hydrique doit être mis en place pour encourager l’utilisation des systèmes de tests automatiques les femelles reproductrices et les juvéniles (

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'anticancéreux (oxaliplatine, paclitaxel, bortézomib, vincristine) pour induire une neuropathie douloureuse, puis subissent chaque semaine des tests comportementaux de douleur (test du von Frey électronique, test d'immersion de la patte), avant un prélèvement terminal du système nerveux. Le porteur reconnaît que l'induction de la neuropathie est une nuisance qu'il qualifie d'"indispensable", et que les anticancéreux réduisent le gain de poids des animaux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace encore l'animal vivant pour explorer la douleur, la retombée pour les patients restant renvoyée au conditionnel.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite (CIPN) est un effet indésirable classique et dose limitant des anticancéreux neurotoxiques (sels de platine, taxanes, vinca alcaloïdes, bortézomib), qui altère profondément la qualité de vie des patients et dont la prise en charge thérapeutique reste très limité. Aucun traitement préventif ne peut être recommandé et seule la duloxétine est modérément recommandée sur les douleurs associées. En conséquence, les oncologues sont fréquemment contraints de diminuer voire d’arrêter les anticancéreux neurotoxiques lors de l’apparition des premiers symptômes de CIPN. Des travaux récents au sein de notre équipe de recherche ont démontré l’efficacité analgésique du donépézil sur des modèles animaux de CIPN. L’effet analgésique du donépézil (inhibiteur de cholinestérase) implique l’activation des récepteurs muscariniques M2 (m2AChRs) au niveau spinal. Cependant, l’action anticholinestérasique du donépézil pourrait être responsable de l’activation d’autres récepteurs cholinergiques et le mécanisme analgésique des m2AChRs n’est pas totalement connu (à priori inhibition des cellules excitatrices et pronociceptives glutamatergiques). Ainsi, l’objectif de ce projet sera d’évaluer l’implication du système cholinergique (m2AChRs) au niveau spinal et du système nerveux périphérique (ganglions spinaux - DRG) dans des modèles animaux de CIPN : mesure de l’expression génique et de la localisation des récepteurs cholinergiques au niveau spinal et des DRG, et exploration de l’effet analgésique d’agonistes spécifiques des m2AChRs.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques des CIPN. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des CIPN est très limitée (aucun traitement préventif et seule la duloxétine modérément recommandée sur les douleurs). Nos précédents travaux ont démontré l’intérêt analgésiques du donépézil sur ces modèles animaux de CIPN, et ont permis la mise en place d’une étude clinique évaluant l’effet analgésique du donépézil chez des patients souffrant de neuropathie induite par l’oxaliplatine. Le projet proposé vise à préciser l’implication des m2AChRs comme nouvelle cible thérapeutique, et dont l’objectif à terme sera de développer des agonistes de ces m2AChRs pour le traitement des CIPN, et qui pourront être testé chez l’homme à moyen terme.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections d'anticancéreux ou du véhicule. Le nombre d’injection et leur voie d’administration sera fonction du modèle animal : - Oxaliplatine : 2 injections par semaine (lundi et vendredi) pendant 4 semaines, voie intraveineuse, durée injection de 20 secondes (max) - Paclitaxel : 4 injections (J0, J2, J4, et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) - Bortézomib : 5 injections (J0, J1, J3, J4 et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) - Vincristine : 5 Injections (J0, J2, J4, J7 et J9), voie intraveineuse, durée injection de 20 secondes (max) Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaire et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - Test du von Frey électronique : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal (stabulation dans des portoirs (box) individuel pour 24 rats) - Test d’immersion de la patte : durée du test pour un animal 5 minutes (max)

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (allodynie tactile et thermique). Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg), et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux nécessitent un bon état général des animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera, in fine, de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies d’expression des récepteurs à l’acétylcholine dans une perspective thérapeutique.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones. Mais pour le moment ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexicité de la physiopathologie des CIPN, qui n'est elle même pas encore élucidée. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer de nouvelles stratégies pharmacologiques et par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nosu devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire.

Choix des espèces

Le rat Sprague-Dawley est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche (Ferrier et al. J Neurosci 2015 ; Selvy et al. Biomed Pharmacother. 2022), ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat Sprague-Dawley possède une activité et un comportement tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de test comportementaux. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont implantées dans le tronc cérébral, l'injection étant réalisée au deuxième jour après la naissance, pour valider des modèles de tumeur pédiatrique aujourd'hui incurable. Le porteur ne décrit qu'"un stress physique léger" lié à la manipulation avant anesthésie, et prévoit la mise à mort de tous les animaux pour prélever leurs cerveaux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reconstitue la complexité tumorale in vivo et juge cette souche de souris "impossible" à remplacer.

Objectifs

Avec un taux de survie proche de zéro, les tumeurs du tronc cérébral ou DIPG sont les cancers les plus mortels chez l’enfant. L’étude de cette tumeur, toujours fatale en 2022, nécessite la validation de nouveaux modèles tumoraux et l’analyse des mécanismes responsables de son apparition.

Bénéfices attendus

Démontrer qu’une ou plusieurs des trois nouvelles lignées de tumeur du tronc cérébral forment des tumeurs chez la souris et que ces lignées constituent de bons modèles pour étudier le développement de la tumeur et ultérieurement, pour tester des médicaments.

Procédures

Implantation de cellules tumorales en intracrânien dans le tronc cérébral.

Impact sur les animaux

Les nuisances prévues pour les animaux sont un stress physique léger dû à la manipulation de la cage et des animaux avant anesthésie générale.

Devenir

Les 90 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des cerveaux et leur analyse pas des approches moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris immunodéficience). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent pas encore être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris. Malgré tout, ces modèles pourraient ouvrir la voie au développement ultérieur de nouvelles approches ex vivo, notamment à l’aide d’organoïdes.

Réduction

Les effectifs des animaux utilisés sont déterminés et nos résultats sont analysés selon des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, de la douleur et/ou de l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront hébergées et suivies quotidiennement par du personnel qualifié pour détecter d’éventuels signes cliniques ou de mal-être. Les animaux sont hébergés en cages à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées aux animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal sera euthanasié sans attendre. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures. En ce qui concerne la manipulation des souris, celle-ci se fera en conditions stériles, sur tapis chauffant et sur des animaux sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

1. La souche de souris est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. La capacité d’extrapoler les résultats. 3. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 4. L’existence des équipements nécessaires à l’étude. 5. La pertinence des installations d’hébergement. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale et la manipulation. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.

1 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent des prises de sang sur animal vigile et des injections, 880 sont placées en cage métabolique jusqu'à 18 heures dont une période sans eau, et d'autres portent un modèle de drépanocytose provoquant des crises douloureuses. Le porteur indique anesthésier les gestes les plus invasifs et surveiller la douleur par une grille de score. Il affirme que la souris est "le seul modèle" permettant d'étudier à la fois les atteintes rénales et musculaires de la maladie.

Objectifs

La drépanocytose est la maladie génétique du sang la plus fréquente au monde. Cette maladie se manifeste par une déformation et une rigidification des globules rouges. Ces globules rouges déformés sont plus fragiles et sont la source de l’anémie hémolytique décrite chez les patients drépanocytaires. La forme en faucille de ces globules rouges favorise leur agglomération, l’interruption du flux sanguin et par conséquent, des crises vaso-occlusives, très douloureuses, au niveau de tous les organes du corps. La répétition de ces ischémies (un arrêt ou insuffisance de la circulation sanguine dans une partie du corps ou un organe, qui prive les cellules d'apport d'oxygène) induit des lésions sévères, notamment des organes les plus vascularisés et donc une réduction de la qualité et de l’espérance de vie des patients.Notre projet se concentre sur deux complications chroniques majeures de la drépanocytose : la maladie rénale et la fonte musculaire en s'intéressant aussi le point sur d’autres atteintes tel que la cardiomyopathie et la rétinopathie associée a la drépanocytose. Ainsi, les objectifs de notre projet sont de comprendre : 1- comment telles altérations multi-organes se produisent 2- si le muscle altéré peut avoir des effets déletèrent sur le rein ou vice-versa 3- comment pourrait on les prévenir ou les traiter

Bénéfices attendus

Cette étude pourra révéler une voie commune jusqu'alors non reconnue affectant à la fois le rein et les muscles dans la drépanocytose et éventuellement d'autres maladies hématologiques hypoxémiques. Elle pourra apporter une stratégie thérapeutique puissante pour la progression de la maladie rénale chronique et la fonte musculaire chez les patients atteints de cette maladie. En outre, l'exploration d'une interférence potentielle entre le néphropathie et la sarcopénie associées à la drépanocytose ouvre un nouveau domaine de recherche.

Procédures

Tous les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang de 20 microlitres a sur souris vigile maintenue en contention manuelle. 160 souris subiront une injection deux fois par semaine pour six semaines sur souris vigile. 160 souris subiront une injection pour 5 jours consécutifs sur souris vigile. 160 souris subiront une injections de la patte postérieure aprés anésthésie gazeuse. 160 souris subiront deux injections séparées de 56 jours, de la patte, postérieure aprés anésthésie à l'isoflurane. 80 souris subiront une injection aprés anésthésie gazeuse. Tout les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang aprés anésthésie à l'isoflurane et avant mis à mort. 880 souris seront mises en cages metaboliques, pour deux fois, séparées de 24 heures. La premier confinement en cages metaboliques sera pour 18 heures, le second sera pour 6 heures. 880 souris subiront deux mesures de pressions de 20 minutes non ivasives sur souris vigiles sur deux jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Les souris subiront le stress d'être isolées pendant 20 minutes pour les mesures de pressions. Elles subiront aussi le stress d'être isolées pendant 6 heures allant jusqu'à 18 heures en cages metaboliques. Elles resteront sans eau pour 18 heures lors du confinement en cage metabolique. Elles subiront une douleur minime lors de certains prélèvements et injections. Cependant, lors des procédures plus invasives les souris seront anésthésiées à l'isoflurane et analgésiées.

Devenir

Etant donné que les organes de ses animaux seront analysés, les animaux de ce projet seront mis à mort.

Remplacement

Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas relevantes en ce qui concernent l'étude des maladies glomérulaires et musculaire car il existe beaucoup de paramètres physiologiques qui entrent en jeu.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux requis afin de permettre une analyse statistiquement pertinente des résultats en prenant compte de la variabilité inter et intra expérience. Les résultats seront analysés par des tests statistiques adaptés à la taille de nos échantillons. Pour chaque animal, un maximum d'organes et de prélèvement biologique sera fait afin de ne pas avoir à refaire des experiences sur de nouveaux animaux.

Raffinement

Afin de réduire l'angoisse et la souffrance des animaux des mesures seront prises : 1) Une surveillance des animaux, quotidienne par les zootechniciens et bihebdomadaire par l'expérimentateur, sera réalisée. Une grille de score d'évaluation de la douleur a été établie permettant d'évaluer la souffrance des animaux et de déterminer des points limites. 2) La procédure terminale sera réalisée sous anesthésie. 3)Les procédures invasives tel que certaines injections seront réalisées aussi sous anesthésie et les souris recevront un traitement analgésique qui sera renouvelé et poursuivie si les animaux présentent des signes de souffrance. 4)Les souris seront hébergées en groupe et l’enrichissement de leur environnement sera à base de coton déchiquetable, préservant ainsi une activité et un exercice naturel.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère et d'utiliser la recombinaison homologue ou l'excision allélique dirigée afin de connaitre la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. A partir de 4 semaines, une fois que le sevrage physiologique est effectif et jusqu'à 6 mois pour ne pas observer une potentielle fibrose rénale liée au vieillissement. En effet, l'âge est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop âgées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.

1 000 poissons, 700 lamproies et chabots et 300 salmonidés, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés dans leur rivière. Chaque individu est capturé, anesthésié, mesuré, pesé, puis reçoit un transpondeur implanté par une incision ventrale, en restant hors de l'eau entre 30 secondes et une minute. Le porteur affirme que la cicatrisation est "généralement très bonne" et que l'implantation a "peu d'impact" sur le bien-être des animaux non-humains, tout en signalant une mortalité post-opératoire possible et une perte de puce chez certains individus. Il justifie l'étude par l'évaluation, en milieu naturel, de dispositifs de franchissement destinés à restaurer la continuité écologique.

Objectifs

L’objectif principal est de mesurer la mobilité des lamproies de Planer avant leur reproduction, dans deux cours d’eau présentant des obstacles à la continuité écologique, puis d’évaluer ensuite le bénéfice de l'installation de dispositifs de franchissement (passes) aménagés pour les lamproies. Les deux cours d’eau étudiés abritent également des populations de truite et de chabot, deux espèces pouvant bénéficier des actions mises en œuvre pour la lamproie, et qui seront également intégrées à l’étude. Les déplacements individuels des trois espèces seront analysés en utilisant des marquages à l'aide de puces électroniques et de dispositifs de détection fixes et mobiles.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’acquérir des informations sur les déplacements des lamproies de Planer en milieu naturel et leurs capacités à emprunter des dispositifs de franchissement existants (passes à poissons) ainsi que des dispositifs expérimentaux spécifiquement conçus pour cette espèce (rampes à rugosité). Le bénéfice de ces aménagements pour les autres espèces à enjeu (truite et chabot) sera également analysé. Cette étude servira de retour d’expériences en vue de proposer des adaptations dans le cadre des futurs projets de restauration de la continuité écologique.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur sera implanté manuellement sur 1000 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des puces est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel. L'implantation n'a pas ou peu d'impact sur le bien-être animal ou la reproduction, car la puce utilisée présente une taille minimale adaptée à la taille de l'individu. En outre, la taille de l'incision est faible, de l'ordre de 2-3 mm.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire de l’espèce considérée, dans le cas présent la lamproie de Planer, la truite de rivière et le chabot. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes et mobiles.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si report des marquages en cas de conditions environnementales très défavorables). L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux dans les deux rivières, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité des ouvrages aménagés (2 aménagements visés / rivière). Il est adapté au gabarit des cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la lamproie, il peut être attendu un taux de montaison de 30%, taux moyen constaté dans une précédente étude en milieu naturel. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des puces ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront stockés dans un vivier placé dans la rivière. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et pour éviter l’altération de l’efficacité de l’anesthésiant. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie. Les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. L’expérience du personnel permet de réduire le temps global de manipulation à moins d’une minute. La taille des puces sera adaptée à la taille de l’animal (marquage des lamproies > 120 mm à l’aide de tags de 12 mm). Les individus seront placés sur une éponge imbibée d’eau au moment du marquage. Pour les truites, un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée après marquage au niveau de l’incision (pommade recommandée et fournie par le vétérinaire référent).

Choix des espèces

L’espèce cible prioritaire est la lamproie de Planer (Lampetra planeri), espèce abondante dans les deux cours d’eau concernés et impactée par la présence d’ouvrages limitant sa migration. A notre connaissance il existe très peu d’études sur la migration de l’espèce, ses capacités de franchissement d’obstacles et le bénéfice réel des passes à rugosité. Les autres espèces cibles sont la truite commune (Salmo trutta) et le chabot (Cottus gobio) qui peuvent également bénéficier des aménagements réalisés (passes) au cours de ce projet. Pour les lamproies, le stade adulte (après métamorphose) sera ciblé, puisqu’il s’agit d’une étude sur le comportement avant reproduction. Toutefois, la métamorphose pouvant intervenir durant l’hiver donc après les opérations de marquage, les ammocètes de grande taille (> 120 mm) seront également marquées si l’effectif d’adultes escompté n’est pas atteint. Pour les truites, les juvéniles seront marqués dès 80 mm, à l’aide de puces de 13 mm ; les sub-adultes et adultes dès 120 mm à l’aide de puces de 23 mm. Pour les chabots, seuls les individus sub-adultes et adultes > 80 mm seront marqués à l’aide de puces de 13 mm. Ces tailles minimales assurent un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2% (

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des traitements par voie orale et par injections répétées pendant quinze jours, sur des modèles de cancers pédiatriques dérivés de patients. Le porteur situe les retombées dans l'objectif "final" d'augmenter la survie des patients, alors que le prélèvement des tumeurs et des organes après la mort des animaux est immédiat. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le comportement tumoral et conclut que le modèle in vivo reste "indispensable".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : i) D’évaluer l’impact des inhibiteurs d’épissage connus ii) Et des nouvelles molécules duales inhibitrices du complexe spliceosome et et histone désacétylase comme immunomodulatrices sur la réponse anticancéreuse dans les cancers pédiatriques. Après plusieurs tests in vitro, nous avons isolé plusieurs molécules candidates et ce, sur plusieurs lignées de cellules murines à l’origine du neuroblastome (8 molécules), d’ostéosarcome (8 molécules), et de rhabdomyosarcome (8 molécules). Dans une première étape nous testerons ces molécules sur des modèles de tumeurs sous cutané ectopique dans des souris immunocompétentes afin de sélectionner les molécules efficaces et les voies d’injections des molécules. Ceci nous permettra d’utiliser un nombre minimal de souris dans ce projet de modèles PDX. Pour cela, nous utiliserons les méthodes et modèles expérimentaux suivants : i) Des souris NSG qui serviront de modèles de souris PDX. Pour cela des biopsies de patients seront utilisés. Nous utiliserons deux neuroblastomes, deux ostéosarcomes, deux sarcomes d’Ewing et deux rhabdomyosarcomes

Bénéfices attendus

Les résultats du projet démontreront si le spliceosome peut être une cible thérapeutique dans les cancers pédiatriques avec comme objectif final l’identification de potentielles combinaisons médicamenteuses capables d’augmenter ultérieurement la survie des patients.Ce projet apportera les éléments précliniques permettant d’évaluer l’effet thérapeutique de nos molécules et de mieux comprendre les mécanismes liés à ces molécules. Afin de modéliser ces modèles tumoraux pédiatriques, nous utiliserons des modèles dérivés des patients (PDX) dont deux neuroblastomes, deux ostéosarcomes, deux sarcomes d’Ewing et deux rhabdomyosarcomes

Procédures

Une injection unique de cellules tumorales sera réalisée pour le developpement des tumeurs pédiatriques (durée 5 minutes). Dans le cas de la voie d'administration per os, les souris seront administrées 2 à 4 fois par semaine pendant 2 semaines (durée 30 secondes). Un prélevement de sang unique, sera réalisé sous anesthésie générale. Les traitements par injection seront faits toutes les 24h, 48h ou 72h et ce durant 15 jours (durée 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels seront ceux liés à la présence de tumeurs uniques sur le flanc, sous la peau, ainsi que ceux liés aux traitements par injection ou administration orale..

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés pour prélèvements d'organes et de tumeurs post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’évaluer les interactions entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi, la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique a recours à un modèle animal. Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d'appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents système au sein de l'organisme (systeme vasculaire, immunitaire...), l'utilisation des modèles appliqués in vivo reste donc indispensable. Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l'efficacité de nos molécules et leurs liens avec les mécanismes oncogéniques et metastiques des cancers mais également explorer et valider l'efficacitté de thérapies susceptibles d'être utilisées chez les patients.

Réduction

Une étude approfondie de la littérature a été menée avant d’initier ce projet pour s’assurer de l’absence de résultats publiés s’approchant des objectifs de notre étude. Le nombre d’animaux utilisé lors des expériences sera établi de façon à obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux utilisé tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d'utiliser un nombre suffisant d'animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan statistique. Les analyses statistiques seront effectuées en utilisant des tests non-paramétriques dont l'application ne requiert pas la vérification préalable de la normalité incompatible avec les petits échantillons.

Raffinement

Les animaux sont surveillés chaque jour afin de détecter toute modification dans le comportement/déplacement de l'animal. Les zones implantées sont également observées quotidiennement afin de detecter précocement un developpement de la tumeur. Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée. Pour la limiter, nous avons établie une grille d’observation visant à définir des points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et cadrant les mesures prises à l’apparition des premiers signes de contrainte/ douleur. Si nous détectons des signes de stress ou de douleur anormaux, nous donnerions un antalgique morphinique pour soulager les animaux. Toutes les injections seront précédées d'une anesthésie locale. Les animaux seront stabulés en groupe, avec accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un enrichissement du milieu est également apporté par des sizzlenests et de maisons en cartons.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie notamment du fait de l'existence de souches immunodéprimées qui permettent le développement de tumeur d'origine humaine. Nous utiliserons des souris jeunes (animaux âgés entre 4 et 6 semaines au début de protocole) au moment de l'injection des cellules tumorales. Nous travaillons sur des cancers qui atteignent des individus entre l'enfance et l'adolescence. De ce fait, nous serons amenés à utiliser des jeunes animaux âgés de 4 semaines à 6 semaines afin de pouvoir mimer le stade de développement