Oncologie

1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des vecteurs viraux ciblant le tissu adipeux, par injection intrapéritonéale ou par chirurgie, certaines étant rendues lipodystrophiques par le tamoxifène ou obèses par un régime gras, puis subissent échographies, mesures de glycémie et tests de tolérance mensuels. Le porteur indique que la chirurgie comporte un risque d'infection et que les prélèvements répétés à la queue causent une douleur légère. Il affirme qu'une validation in vivo est "indispensable" pour observer les réponses physiologiques intégrées, les cibles ayant été identifiées en culture cellulaire.

Objectifs

L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que des altérations de la fonction du tissu gras dit tissus adipeux jouent un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. En effet, chez l'obèse, le tissus adipeux a dépassé sa capacité de stocker du gras, et ce gras va aller se déposer dans différents organes comme le coeur et le foie. Le tissu gras est composé de cellules spécialisées appelées les adipocytes. Notre équipe cherche à décrire les mécanismes qui font qu'un adipocyte en bonne santé devient malade. Au cours de ces 10 dernières années, nous avons identifié plusieurs cibles moléculaires impliquées dans la bonne santé des adipocytes. Afin de moduler l’expression de ces cibles dans le tissu adipeux (TA) nous collaborons avec une équipe américaine qui a développé des vecteurs viraux spécifiques du tissu adipeux.

Bénéfices attendus

Le premier but de ce projet est de tester si les vecteurs viraux spécifiques du TA sont des bons moyens pour exprimer des protéines d’intérêt dans le TA dans une visée thérapeutique. D'autre part, plusieurs travaux s'intéresse à des structures qui se trouve dans les adipocytes et qui participe à la comunication intra cellules. Ces structures sont des points de contact entre deux organelles cellulaires majeurs, les mitochondries et le réticulum endoplasmique. Ces structures sont appellées les MAM. Nous émettons l'hypothése que ces structures sont noeuds de comunications importants qui contôlent l'état de santé des adipocytes. Ainsi, le deuxième but est de savoir si la modulation des MAM peut être une cible thérapeutique contre les dysfonction métaboliques associées à l’obésité.

Procédures

La lipodystrophie partielle est induite par 5 jours d’injection intrapéritonéale d'un agent pharmaceutique, le tamoxiféne. Pour les souris HFD nous commençons à nourrir des C57bl6 avec un régime gras à l’âge de 8 semaines. Nous nourrissons les souris pendant 1 mois puis nous démarrons les interventions génétiques. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, 100 µl d’une solution d’AAV sera injectée en intrapéritonéal. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, l’injection se fait directement dans le dépôt par une chirurgie. Cette procédure a lieu1 fois pendant et dure 20 minutes Les analyses d’échographie se font sous anesthésie 1 fois par mois pendant 20 minutes La mesure de glycémie requiert 3 microlitres de sang par mois. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. L'administration du glucose se fait par voie orale (gavage), celle de l'insuline par injection intra-péritonéale.

Impact sur les animaux

Pour l'induction de la lipodystrophie partielle, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour les souris HDFD, le régime gras entraîne une prise de poids mais n’a pas d’effet néfaste sur le bien être des souris. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, la chirurgie comporte un risque du fait des infections possibles. Pour les test de tolérance, les prélèvements multiples à la queue entraine une douleur légère. L'administration du glucose par gavage oral qui entrainne un léger stress sur les souris.

Devenir

Les animaux sont mis à mort afin de prélever les tissus sur lesquels les analyses moléculaires seront réalisés. Ces analyses sont l'objectif premier du projet et nous permettrons d'établir le rôle physiopathologique des acteurs étudiés.

Remplacement

Le but de notre projet est de valider l’importance de certains acteurs protéiques dans le maintien de la bonne santé du tissu adipeux et de la bonne santé métabolique de l’animal au niveau systémique. Ces cibles ont été identifiées in vitro et ce travail est parallèle à des études cellulaires complémentaires. Cependant, une validation in vivo est indispensable, notamment pour l’étude des conséquences de la modulation de l’état du tissu adipeux sur la santé cardiométabolique. Les cibles testées ici ont toutes étaient identifier par des expériences réalisées sur des lignées de cellules. La solidité de l’hypothèse du rôle des MAMs dans le tissu adipeux est actuellement tester dans des lignées cellulaires. Les expériences proposées ici interviennent à un moment ou le rationnel est solide et ou nos expériences chez l’animal sont indispensables pour observer l’effet de nos interventions dans les adipocytes matures et les réponses physiologiques intégrées.

Réduction

Le projet préconise l’utilisation d’un nombre total de 1120 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utiliserons des tests non paramétriques de Mann and whitney pour tester la valeur statistique de nos données.

Raffinement

Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate. De plus, nos interventions chirurgicales se feront avec des anesthésiques, des analgésiques et en condition de stérilité. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, qui réduise la douleur. Nous utilisons des sondes de gavages en polypropylène qui réduise la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en terme de points limites gradés et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne (week-end) compris permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.

Choix des espèces

Les 3 modèles murins utilisés sont bien maîtrisés au laboratoire et ont été largement étudiés. Notamment, ces modèles permettent d’étudier les conséquences de la dysfonction adipocytaires sur d’autres paramètres généraux de santé comme la sensibilité à l’insuline et la fonction cardiaque. Un modèle animal intégré est le seul moyen de tester ces éléments. Pour les BSCL2K0, nous utiliserons des souris de 8 semaines, âge auquel elles sont déjà sévèrement lipodystrophiques. Pour les iATSKO, nous utiliserons des souris de 8 semaines lors de l’induction de la délétion par le tamoxifène en accord avec nos résultats précédents. Pour les souris HFD, des souris sauvages seront mises sous régime gras à l’âge de 8 semaines.

336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est soumise à un régime gras obésogène, toutes subissant des tests métaboliques hebdomadaires avec injections intrapéritonéales et prélèvements sanguins répétés à la queue, un bolus d'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie. Le porteur cherche à établir que le diabète gestationnel modifie par voie épigénétique l'expression des gènes hypothalamiques de la descendance, prédisposant à l'obésité. Il affirme que ces mécanismes multi-organes ne peuvent être reproduits qu'avec la souris, jugée "indispensable" faute d'échantillons humains.

Objectifs

Notre corps est optimisé pour stocker tout apport énergétique qui dépasse les besoins de l'organisme. En effet, l’évolution a permis aux humains de traverser des périodes de famine. Cependant, ce mode de fonctionnement n’est pas compatible avec notre style de vie sédentaire d'aujourd'hui. Il en résulte l'émergence de la pandémie d'obésité et de diabète, qui survient de plus en plus fréquemment dès l'enfance et l'adolescence. Bien que des études de génétique humaine à grande échelle aient été menées avec succès, l'héritabilité de traits aussi complexes reste difficile à déterminer. De plus en plus d’études scientifiques suggèrent que la suralimentation dans des conditions telles que le diabète gestationnel (DG), peut entrainer un métabolisme altéré à travers les générations. Ces mécanismes impliquent des changements héréditaires dans l'expression des gènes qui se produisent plutôt par le biais d'une régulation épigénétique altérée. Les études chez l’animal suggèrent que le stress nutritionnel affecte le développement de l'hypothalamus et prédispose la descendance à l'obésité. En effet, l'hypothalamus orchestre un ensemble complexe de processus pour réguler l'apport et la dépense énergétiques. Par conséquent, l'hyperphagie et la réduction de la satiété représentent des caractéristiques précoces chez les enfants sujets à l'obésité. Cependant, une analyse complète du profil épigénétique de l'hypothalamus dans le contexte du DG fait largement défaut jusqu'à présent. Ainsi, nous cherchons à mettre en évidence que le DG a un impact sur l'expression des gènes hypothalamiques par le biais d'une régulation épigénétique au cours du développement intra-utérin et postnatal précoce, prédisposant la descendance à un phénotype obésogène tout au long de la vie.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de diabète de type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établies. Plus important encore, la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Nous supposons que le DG a un impact sur l'expression des gènes de l'hypothalamus par le biais d'une régulation épigénétique au cours du développement intra-utérin et postnatal précoce, prédisposant la descendance à un phénotype obésogène qui dure toute la vie. Les données récentes du laboratoire avec lequel nous collaborons pour ce projet suggèrent l'existence d'un nouveau code épigénétique qui pourrait jouer un rôle majeur dans la différenciation cellulaire et le développement de maladies. Ainsi, nous sommes convaincus que ce projet permettra de mieux comprendre l'impact de la suralimentation sur la prédisposition au diabète.

Procédures

168 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids. Par ailleurs, tous les animaux (336) seront soumis à des tests métaboliques (1 test/semaine). Le test de tolérance au glucose nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements de 6 gouttes de sang (2μl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Parrallèlement, 4x 40μL de sang sont prélevés (durée 1min) à l'aide d'un capillaire pour mesurer l'insulinémie par le même site de prélèvement. Le test de sensibilité à l'insuline nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements de 6 gouttes de sang (2μl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Le traitement hormonal nécessite 2 injection IP ( durée 10 sec)

Impact sur les animaux

Une diète riche en gras pour créer une environement obésogène, le traitement hormonal pour favoriser la reproduction et le test de tolérance au glucose peuvent créer un inconfort chez les souris. La sensibilité à l'insuline nécessite l'injection d'un bolus d'insuline qui peut entrainer une hypoglycémie chez la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur tissus seront prélevés pour determiner le profil épigénétique.

Remplacement

La nature transitoire du diabète gestationnel (la maladie n'existe que pendant la grossesse), la rareté des échantillons de tissus humain post mortem, la cause du décès... etc rendent l'étude de ce phénomène très difficile chez l'homme. De plus, la disponibilité des échantillons humains est limitée au sang, au cordon ombilical. Pour ces raisons, les modèles animaux constituent une alternative indispensable pour étudier ces mécanismes.

Réduction

Nous utiliserons un total de 336 animaux. Le nombre d’animaux testé dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris.

Raffinement

Les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire pour les analyses biochimiques et les volumes injectés seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire. Le recours aux analgésiques et anesthésiques sera systématique pour éviter toute souffrance ou douleur chez l'animal.

Choix des espèces

L'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, pancréas (ilots de Langerhans) , muscles, tissus adipeux, intestin, cerveau) . Ces mécanismes complexes ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris. Le modèle murin ne peut donc pas être remplacé dans notre cas. De plus, la nature transitoire du DG et la rareté des échantillons de tissus en dehors du sang et du cordon ombilical rendent l'étude de ce phénomène très difficile chez l'homme. Les animaux seront soumis à une diète riche en gras dès l'âge de 5 semaines, âge idéal pour permettre une prise de poids suffisante.

3 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit un cancer colorectal par chirurgie ou par injection, puis elles subissent jusqu'à deux imageries par semaine pendant neuf semaines sous anesthésie, jusqu'à cinq traitements hebdomadaires pendant six semaines et des prélèvements sanguins en sous-mandibulaire sur animal vigile. Le porteur indique que les tumeurs sous-cutanées, coliques et péritonéales peuvent provoquer des difficultés de locomotion, des diarrhées et des occlusions intestinales. Il affirme que l'étude des tumeurs et métastases ne peut pas être modélisée in vitro et qu'aucune autre méthode n'apporterait un niveau d'information équivalent.

Objectifs

Le cancer colorectal représente un défi majeur de santé publique en raison de sa gravité et de l’augmentation croissante des cas nouvellement diagnostiqués en France et à travers le monde. Malgré des avancées significatives en termes de survie grâce aux chimiothérapies à base d’anticorps thérapeutiques, certains patients ne répondent pas ou peu aux traitements. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies afin d’améliorer l’efficacité antitumorale et de lutter contre les phénomènes de résistance.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’étudier par imagerie in vivo des modèles de cancer colorectal à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments.

Procédures

Induction de cancer colorectal : 1 acte par animal soit par chirurgie (15min max d’intervention sous anesthésie générale) soit sans chirurgie : injection intrapéritonéale (quelques secondes), injection sous cutanée (quelques secondes sous anesthésie générale), injection par endoscopie (5-10min sous anesthésie générale) Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 9 semaines sous anesthésie générale. Traitements : au maximum 5 traitements par semaine pendant 6 semaines par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse Prélevement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire volume maximal de 130μL( en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours) pour une souris de 25g .

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus pour les animaux sont liés au développement de foyers tumoraux au niveau sous-cutané ainsi qu’au niveau du colon et des viscères. Une difficulté de locomotion peut éventuellement s'installer lorsque la tumeur sous cutanée évolue et des diarrhées ou occlusions intestinales peuvent apparaître lors de l’évolution des tumeurs du colon ou des métastases péritonéales. La définition de points limites, le suivi quotidien, les pesées ainsi que la grille de scoring nous permettront d’anticiper toute douleur ou souffrance qui seraient induites. Nous n’attendons pas de douleur ou d’intolérance liées aux composés tests.

Devenir

Toutes les souris seront mise à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.

Remplacement

L'étude de tumeurs ou métastases résulte de l’interaction de nombreux types cellulaires et ne peut pas être modélisée in vitro. Aucune autre méthode expérimentale ne serait en mesure d’apporter un niveau équivalent d’information que la procédure expérimentale impliquant l’utilisation d’animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans toutefois compromettre les objectifs. Les groupes témoins seront regroupés lorsque cela sera possible. La mise en oeuvre de l'imagerie (bioluminescence et échographie) permettra de suivre le même animal au cours du temps ce qui permet de réduire significativement leur nombre.

Raffinement

Les méthodes d'imagerie mises en oeuvre sont non invasives et les actes réalisés sous anesthésie ce qui limite la douleur et le stress infligé au cours de l’expérimentation. Par ailleurs, les souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des cages disposant d’un environnement enrichi et en accord avec les directives européennes. L'induction des modèles tumoraux sera réalisée sous anesthésie générale. Durant les actes de chirurgie, la douleur sera également prise en charge par l'utilisation d'antalgiques (paracétamol) la veille et 24h post opératoire et par l’administration d'anti inflammatoire (tolfédine) le jour et 24h post opératoire. Des grilles de scoring avec les points limites prédictifs seront mis en place et le personnel examinera les animaux quotidiennement afin d'anticiper la souffrance de l'animal.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Par ailleurs il existe des souris immunodéficientes bien adaptées pour les implantations de cellules d'origine humaine. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.

2 bovins vont être utilisés puis rendus au troupeau après récupération, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit deux chirurgies sous anesthésie générale pour poser puis retirer une canule dans le rumen, ainsi que jusqu'à vingt-six prélèvements sanguins, pour mettre au point une canule temporaire présentée comme moins invasive que les canules permanentes. Le porteur indique une possible gêne mécanique pendant la cicatrisation et un léger écoulement au retrait. Il revendique un "besoin constant d'animaux" pour la recherche agronomique et affirme ne pas pouvoir remplacer le bovin par un fermenteur artificiel.

Objectifs

L'agriculture est depuis toujours en constante évolution. Pour l'aider dans cette mutation la recherche agronomique a initié de nombreux programmes de recherche. Auparavant orientée vers l'augmentation des performances et l'amélioration de la productivité des espèces animales élevées et destinées à produire du lait et/ou de la viande, aujourd'hui elle s'orienterait plutôt à maintenir le niveau de production des animaux (ovins, bovins...) tout en prenant plus en compte les contraintes du milieu, les risques environnementaux (production des GES, pollution des sols...) ou les attentes sociétales (bien-être animal, qualité des produits, traçabilité de l'alimentation...). Pour répondre à une partie de ces enjeux, notre établissement utilisateur a un besoin constant d'animaux. Pour réaliser des études fines des mécanismes physiologiques d'ingestion et de la digestion des aliments chez les ruminants, les animaux modèles utilisés sont ici des bovins. C'est un modèle animal de référence pour établir les valeurs de digestibilité et d’ingestibilité des aliments pour ruminants, et pour comprendre les processus digestifs afin de les modéliser. De par son caractère générique, les résultats qu’il permet d’obtenir sont le plus souvent extrapolables aux autres catégories de ruminants (ovins, caprins, brebis et agneaux). Pour certaines études, en particulier pour la compréhension des mécanismes de digestion et de mesure de la cinétique de dégradation des aliments, le recours à des animaux porteurs de canules est indispensable. L’objectif de ce projet est de trouver une alternative à certaines méthodes invasives sur animaux en particulier les canules permanentes sur ruminants. Ici, il s’agit premièrement de concevoir une canule ruminale temporaire pour bovin avec un diamètre d’insertion dans le rumen le plus étroit possible (= 3 cm, diamètre interne = 1.5 cm, réalisé en plastique afin d’être peu dense et donc le plus léger possible pour éviter une gêne de l’animal) et pouvant être retirée quelques semaines après (max : 24 semaines). La pose de la canule se fera par chirurgie mais le retrait devra être réalisé sans chirurgie supplémentaire. Le but est que ces dispositifs ne soient positionnés sur l’animal que pour la durée de l’expérimentation et non sur la carrière de l’animal tout en permettant d'étudier les mécanismes fins de la digestion.

Bénéfices attendus

Pouvoir étudier les mécanismes fins de la digestion en utilisant des animaux porteurs de canules. Les animaux ne seront équipés de ces canules que pour la durée des procédures, soit quelques semaines. Les animaux ne seront plus équipés de canules permanentes durant toute leur carrière.

Procédures

Les deux animaux subiront deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale : la pose de la canule durera environ 30 minutes et le retrait de la canule durera moins de 10 minutes. Des prélévements sanguins par voie caudale (13, si besoin au maxium 26) seront réalisés sur les deux bovins vigiles et chacun durera moins d'une minute entre la contention et la réalisation de la procédure.

Impact sur les animaux

Il est possible d’avoir une possible gêne mécanique de la canule au niveau des faisceaux musculaires le temps de la cicatrisation des tissus. Par conséquent la gêne occasionnée est temporaire. De plus, au moment du retrait de la canule, un léger écoulement pourrait survenir pendant quelques heures, le temps que l'orifice ne se ferme naturellement de manière mécanique.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, les 2 vaches retourneront dans le troupeau après avoir complétement récupérées.

Remplacement

Dans certains cas de figure, notamment pour l'étude des mécanismes fin de la digestion, nous ne pouvons pas utiliser de méthodes alternatives (fermenteurs artificiels). C'est pour cela que nous avons recours à des bovins dans ce projet.

Réduction

Nous avons réduit au maximum les effectifs avec seulement deux animaux utilisés. Pour vérifier toutes les étapes, nous devons les confirmer avec au moins une répétition. Il serait vraiment très difficile de tirer des conclusions robustes avec seulement un seul animal.

Raffinement

Tout est mis en œuvre pour le raffinement notamment les conditions d'hébergement qui seront réduites au maximum individuellement et les surfaces par animal respectent les normes en expérimentation. De plus, lors de la pose et du retrait le protocole médicamenteux est adapté afin que l'animal souffre le moins possible, pour cela des antiinflammatoires ainsi que des antalgiques sont administrés sur 9 jours post opératoires pour permettre à l'animal de se remettre dans de bonnes conditions. Pour vérifier que son bien être n'est pas impacté, des grilles comportementales seront mises en oeuvre (au moment de la pose et du retrait de la canule temporaire) deux fois par jour de J-1, J0, J1, à J2, puis une fois par jour à J3, J6, J8, J10 et J13, ce qui permettra d'adapter si besoin le protocole de prise en charge de la douleur (analgésie et/ou anti-inflammatoire). Elles comportent des critères relatifs aux comportements (changements de comportements, postures antalgiques, etc.), des paramètres zootechniques (ingestion, etc.) et physiologiques (température rectale, fréquences cardiaque et respiratoire, etc.), et à l’aspect des cicatrices. Des prises de sang sont réalisées en parallèle des grilles comportementales pour vérifier l'évolution d'une hormone indicatrice du stress (cortisol sanguin) et des protéines de l’inflammation (Haptoglobine et interleukines) pour déceler si l'animal souffre des procédures réalisées.

Choix des espèces

Nous étudions la digestion des ruminants et le bovin est l'un des modèles d'études de ces mécanismes. C'est pour cela que nous avons choisi l'espèce bovine. Il s’agit de mettre au point de nouvelles approches chirurgicales moins invasives que la pose de canules permanentes ruminales, pour pouvoir étudier in vivo la digestion et le métabolisme des nutriments absorbés par l’animal et les réponses de l’animal. Nous étudions les mécanismes de digestion d'animaux qui peuvent être utilisées à différents stades physiologiques : vaches en production ou taries. Le stade de lactation important peu pour cet essai.

585 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules ou sont suivies dix à douze mois pour laisser survenir une leucémie qui se manifeste par des tumeurs palpables, pour analyser quatre facteurs de la leucémogenèse B. Le porteur indique que les tumeurs peuvent gêner les déplacements et prévoit une mise à mort avant que la tumeur ne dépasse une taille définie. Il affirme que ces processus ne peuvent être étudiés dans des lignées cellulaires et conclut que la génétique connue de la souris "impose" son choix.

Objectifs

Les cellules B jouent un rôle crucial dans notre système immunitaire grâce notamment à leur capacité à produire des anticorps. Dans certains contextes encore mal compris, de rares cellules B peuvent devenir cancéreuses. Ce processus pathologique peut survenir à différents stades du développement des cellules B. En général, la leucémie touche des cellules B aux stades précoces ou immatures de leur développement, alors que les lymphomes ou myélome ciblent des cellules B plus matures. Malgré d’intenses efforts et d’importantes avancées, les mécanismes et les facteurs qui déclenchent le processus tumoral à des stades déterminés du développement des cellules B et favorisent l’expansion des rares cellules cancéreuses initiales, ou au contraire leur blocage, restent obscurs. Ceci est en grande partie dû à l’absence de modèles animaux appropriés qui miment la situation chez l’Humain. Notre projet est à visée biomédicale et a pour objectif d’analyser le rôle de 4 facteurs, connus pour jouer un rôle important dans le développement des cellules B, dans la survenue de la leucémie. Ces 4 facteurs seront étudiés dans un modèle de leucémie chez la souris. Nos travaux relèvent de la recherche publique et sont réalisés au sein d'une unité mixte de recherche.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif de comprendre le rôle de 4 facteurs dans la prolifération tumorale, ou au contraire dans son inhibition, au cours de la leucémie B. A court et moyen termes, la réalisation du projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes en jeu lors de la prolifération tumorale. Mais au-delà de cet aspect fondamental, le projet a des implications pour la santé humaine dans la mesure où la leucémie B reste un problème de santé majeur, en particulier en raison des problèmes récurrents de rémission observés chez les patients, chez qui les conséquences sont souvent fatales. Cette étude devrait donc apporter une contribution originale et importante aux efforts déployés par différentes équipes pour la compréhension des mécanismes de la leucémogenèse en particulier et des différents cancers touchant les cellules B en général (lymphome, myélome, etc). A plus long terme, les résultats obtenus devraient ouvrir la voie à des approches thérapeutiques, notamment par des criblages pharmacologiques et des essais d’immunothérapie, ciblant les facteurs qui se révéleront les plus prometteurs.

Procédures

Dans une procédure, les souris subiront une injection de cellules et d’un suivi de la survenue de la leucémie. A la fin de la procédure, les souris seront mises à mort et certains de leurs organes prélevés pour analyse. Dans une deuxième procédure, aucune intervention n’est prévue. Les souris seront suivies pendant 10-12 mois pour vérifier la survenue de la leucémie, qui se manifeste par l’apparition de tumeurs d’abord palpables à la main lors des examens réguliers, puis visibles à l’œil nu. A la fin de la procédure, les souris seront euthanasiées et certains de leurs organes prélevés pour analyse.

Impact sur les animaux

Deux types de nuisance ou d’effets indésirables sont attendus dans le cas du protocole rapide : l’injection intraveineuse est relativement douloureuse pour les souris. L’injection se fera au niveau des queues des souris. Les souris seront d’abord mises sous anesthésie gazeuse (anesthésie générale). Une anesthésie locale sera en plus réalisée en appliquant une pommade sur la zone de piqure. Par ailleurs, en cas de survenue de leucémie, l’apparition de tumeurs peut gêner le mouvement des souris (voir point 3 : Raffinement). Dans le protocole standard, aucune injection n’est prévue et les nuisances ou effets indésirables sont ceux liés à l’apparition des tumeurs, i.e., mobilité réduite. Dans tous les cas, nous adopterons en plus des critères généraux d’arrêt par rapport à la souffrance (arrêt d’alimentation, amaigrissement, poil hérissé, prostration durable) un critère lié à la taille de la tumeur (< 5 mm). Avant ce point limite, les souris seront mises à mort pour analyse.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyse.

Remplacement

La nature des travaux que nous menons, et qui concernent la physio-pathologie du développement des cellules B, impose le choix de la souris dans la mesure où sa génétique est bien connue. En effet, les processus développementaux que nous étudions ne peuvent être abordés dans leur complexité physio-pathologique (développement, interactions avec d’autres molécules et cellules, vieillissement, etc) dans des lignées cellulaires ou d’autres systèmes in vitro. Néanmoins, aussi souvent que possible, dans le respect du principe de remplacement, nous utilisons des lignées cellulaires ou d’autres systèmes de culture cellulaire. Enfin, notre démarche inclut également la responsabilisation de tous les membres de l’équipe amenés à faire de l’expérimentation animale grâce notamment à des formations spécifiques et au strict respect des règles en vigueur.

Réduction

Dans toute notre démarche, de l’hébergement des souris à l’expérimentation, nous nous faisons un devoir de respecter la règle des 3R (Réduction, Remplacement, Raffinement). En étroite interaction avec les animalier(e)s, le nombre des souris est réduit au strict nécessaire permettant de réaliser nos expériences en tenant compte de la reproductibilité et de la significativité statistique. Ci-dessous, nous présentons le nombre de souris prévues dans les 2 cas de figures : 1) succès du protocole rapide, 2) échec du protocole rapide, impliquant le recours au protocole standard. A noter que les nombres totaux de souris sont donnés pour la durée globale du projet. En pratique, les expériences seront échelonnées dans le temps et conditionnées par les résultats de l’étude pilote. 1. Succès du protocole rapide : Dans un premier temps, nous procèderons à une étude pilote dans laquelle nous nous focaliserons sur un seul facteur (sur la base des données de la littérature). Nous utiliserons donc 3 lignées de souris : une pouvant développer à terme la leucémie, une correspond au facteur cible (et contrôle négatif), et une qui permettra l’étude de l’effet du facteur étudié sur la survenue de la leucémie (amplification ou inhibition) (45 souris au total). En cas de succès de l’étude pilote, l’étude défintive, réalisée une fois, sera étendue aux 4 facteurs. Dans ce cas le nombre de souris prévu (incluant tous les contrôles) est de 540 souris. 2. échec du protocole rapide : En cas d’échec de l’étude pilote, nous adopterons une procédure consistant en un suivi à long terme des lignées. Dans ce cas, le nombre total de souris est de 360 souris, dont la moitié sera hébérgée en zone stérile et l’autre moitié en quarantaine.

Raffinement

Le raffinement inclut d’un côté les conditions d’élevage et d’hébergement qui sont optimisées par les animalier(e)s (nombre de souris ne dépassant pas 5/cage, inclusion de différents objets dans les cages, nourriture au sol en cas de mobilité réduite, etc), et d’un autre côté le choix des méthodologies induisant le moins de souffrance. Notre souci premier dans ce contexte est la prévention de souffrances inutiles, incluant notamment l’observation régulière tous les 2 jours, grille de scoring (établie par la SBEA, structure du bien-être animal), respect des nouvelles règlementations mises en place, etc. Pour ce qui est de la grille de scoring, elle est basée sur 3 critères majeurs : I. Aspect (état corporel, état du pelage et de la peau, écoulement, yeux, bouche) II. Fonctions corporelles (surtout respiration) III. Comportement (interaction sociale, posture et mobilité, comportements indésirables) La grille comporte une échelle de 0 à 3 à renseigner pour chaque souris à chaque observation : 0 (normal), 1 (légère altération), 2 (altération forte), 3 (altération très forte). Le score final se décline comme suit : Score total de 0-3: Normal Score total de 4-7: Observer attentivement, envisager l'utilisation d'un antalgique Score total de 8-11: Souffrance, prévoir un mode de soulagement et observer régulièrement. Demander un 2ème avis. Considérer l'euthanasie Score total de 12-15: Souffrance sévère. Fin de la procèdure par l'euthanasie de l'animal (sachant que la procédure est impérativement arrêtée lorque le total de point atteint 12).

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle d'étude est justifié à plusieurs titres : 1) sa génétique est bien connue permettant une certaine souplesse dans le choix du fond génétique approprié aux questions posées, 2) il existe de nombreuses lignées mutantes permettant des analyses génétiques fines, 3) le fonctionnement de son système immunitaire est relativement bien connu, 4) son ontogénie est bien connue de sorte que les lymphocytes B peuvent être prélevés à des stades précis du développement, 5) il existe une grande panoplie d'anticorps spécifiques et de banques de séquences très utiles à nos travaux et projets.

184 souris vont être utilisées, 120 tuées à l'issue et 64 réutilisées ou écartées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues prédiabétiques par un régime riche en graisses, elles subissent des gavages quotidiens pendant quatre semaines et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec coupure de la queue et injections, pour évaluer des bactéries et un métabolite comme futur complément alimentaire. Le porteur indique un stress lié à l'isolement en cage individuelle et aux contentions répétées, et fixe une perte de poids de 20 % comme point limite. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne simule les interactions entre organes et conclut au recours à la souris.

Objectifs

Des résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire ont mis en évidence un effet anti-hyperglycémiant de souches bactériennes commensales du groupe Streptococcus salivarius inactivées par la chaleur, et d’un métabolite dérivé de la sérine (sécrété par les bactéries et les plantes) dans un modèle murin de prédiabète (définit pas une glycémie à jeun > 1.26g/L) induit par un régime riche en graisse. L’objectif de notre projet est de déterminer les mécanismes par lesquels ces souches bactériennes naturellement présentes dans l’intestin et ce métabolite exercent cet effet anti-hyperglycémiant dans un modèle de souris pré-diabètique . Le prédiabète désigne une glycémie, c'est-à-dire un taux de sucre dans le sang, plus élevée que la normale. Il est réversible s’il est traité avant son évolution vers le diabète qui lui est un état irréversible. Pour ce faire, plusieurs souches bactériennes ainsi que ce métabolite dérivé de la sérine seront administrées à un modèle de souris rendues prédiabétiques via un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

L’objectif final de ces recherches est de déterminer si les bactéries commensales étudiées et le métabolite bactérien dérivé de la sérine permettent la réversion du prédiabète c’est à dire de réduire l’intolérance au glucose et l’insulino-résistance induites par des régimes déséquilibrés. Si tel est le cas, ceux-ci pourraient servir de traitements pour prévenir le développement du diabète de type 2 chez l’homme. En effet, ce projet de maturation vise à developper un complément alimentaire, pour l’homme, à partir des bactéries et/ou de ce métabolite.

Procédures

Les animaux seront soumis à une contention régulière nécessaire lors des gavages quotidiens (quelques secondes) sur une période de 4 semaines et au cours des tests de tolérance au glucose et de tolérance à l’insuline. Pour ces deux tests (réalisés deux fois sur chaque animaux) les souris subiront une petite coupure à l’extrémité de la queue (incision : 1 seconde) et massage de la queue pour récupérer la goutte de sang (quelques secondes) et à une piqûre (5 secondes) lors de l’injection de l’insuline en intrapéritonéal . Un prélèvement de sang à la veine submandibulaire sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure 2 avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 10-15 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress de par leur placement en cage individuelle tout au long de la procédure et à un stress au cours de la contention nécessaire lors des gavages, des prélèvements et des injections quotidiens sur une période de 4 semaines D’après les résultats préliminaires du laboratoire, le gavage des souris avec ces différents composés tests, n’induit pas de perte de poids ni d’effets négatifs sur les souris. La prise de poids associée au régime riche en graisses et la période de jeune necessaire au test de tolérance oral au glucose (OGTT) et au test de tolérance à l'insuline (ITT) génèreront des stress faibles à modérés.

Devenir

En procédure 1 environ 64 souris non répondeuses au régime seront euthanasiées ou mutualisées et 120 souris seront utilisées pour la procédure 2. A la fin de la procédure 2 les 120 souris seront euthanasiées pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les interactions inter-organes impliqués dans le contrôle de l’homéostasie glucidique d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données phénotypiques (poids, prise alimentaire) et biologiques obtenues à partir du sang (glycémie), des tissus endocrines (stimulation de la sécrétion d’insuline) et intestinaux (tissus producteurs d’incrétine) ainsi que des organes impliqués dans la régulation de cette homéostasie glucidique (foie et muscle).

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, nous estimons que ce nombre est nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, un bâton à ronger et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront surveillés deux fois par semaine (surveillance visuelle) au moment de la mesure du poids et le prise alimenaire mesurée (par pesée de l’aliment) une fois par semaine. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de trois jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limite entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie . Au moment du test de tolérance oral au glucose (OGTT) et du test de tolérance à l'insuline (ITT), les animaux seront placés dans la salle d’expérimentation (differente de celle d’élevage) 1h avant le test afin de limiter le stress dû à un environnement nouveau.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal et ce travail fait suite à des travaux conduits depuis 2018 sur ce modèle. Nous avons choisi de travailler sur des animauxde 8-12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé et car nos données préliminaires ont été réalisées sur des animaux du même âge.