Oncologie

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Des souris immunodéficientes reçoivent une greffe de cellules humaines de cancer du rein, puis un traitement par gavage et injection cinq jours par semaine, avant d'être tuées pour prélever les tumeurs, afin de tester une combinaison censée lever la résistance au sunitinib. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance importante et prévoit une mise à mort avant l'apparition de nécroses tumorales. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les interactions entre cellules et vaisseaux au sein de la tumeur.

Objectifs

Malgré une réponse objective ou une stabilisation de la maladie, les patients atteints d’un cancer du rein vont progresser de manière inéluctable et résister au traitement sunitinib après environ 1 an de traitement. Dans ce protocole nous proposons de combiner le traitement sunitinib à un inhibiteur d’une voie métabolique qui semble jouer un rôle majeur dans la résistance au sunitinib. Ainsi, valider l’efficacité de cette combinaison chez l’animal représente un enjeu thérapeutique important pour le cancer du rein. Nous espérons ainsi pouvoir proposer une nouvelle alternative thérapeutique afin de contrecarrer la résistance au traitement sunitinib.

Bénéfices attendus

L'échec thérapeutique auquel font face les patients atteints d'un cancer du rein est inéluctable. Grâce à nos recherches, nous espérons ainsi proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d'offrir une solution pour empêcher les mécanismes à l’origine de la résistance au traitement sunitinib. Un transfert vers la clinique serait donc l'accomplissement de ce projet.

Procédures

Pour mener à bien ce projet, nous injecterons dans le flanc droit de souris jeunes (6 à 8 semaines) des cellules tumorales humaines de cancer du rein (modèle de xénogreffe). Ensuite, lorsque la tumeur atteindra un volume suffisamment important, ces mêmes souris seront traitées soit avec un traitement de référence du cancer du rein (sunitinib), soit avec un composé chimique (le NCT-503 / inhibiteur voie métabolique), soit avec une combinaison des 2 traitements (le sunitinib et le NCT-503). Ces traitements seront réalisés 5 fois par semaine. Ces injections, que ce soit de cellules tumorales ou l’inhibiteur NCT-503 (voie intrapéritonéale), ne dureront que quelques secondes à chaque fois. Le traitement par gavage (sunitinib), réalisé à l’aide d’une canule de gavage est également une procédure très rapide. Enfin, aucune autre intervention ne sera réalisée sur l’animal vigile. Les souris impliquées seront monitorées quotidiennement afin d’assurer une bonne gestion de la douleur. Chacune des 80 souris de ce projet sera suivie à l’aide d’une fiche de score adaptée à son traitement puis mise à mort à la fin de la procédure expérimentale ou si l’animal atteint un point limite. Avec l’ensemble des procédures comprenant : l’injection de cellules tumorales et les traitements par gavage ou par voie intrapéritonéale, nous classons la procédure en modérée.

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les injections sous-cutanées de cellules tumorales, nous n'attendons pas de nuisance importante chez la souris liée à la procédure en elle-même. Celle-ci ne nécessite aucune anesthésie. Ces cellules tumorales ne metastasent pas. Les animaux seront mis à mort suffisamment tôt afin d'éviter l'apparition de nécroses au niveau des tumeurs. S'agissant d'un protocole impliquant l'injection de cellules tumorales et le suivi du développement des tumeurs qui en résulteront, nous classons la procédure en modérée. On rappelle que les souris Nudes ne sont pas à phenotypes dommagables. Le sunitinib et l'inhibiteur NCT-503 ont déjà été utilisés dans des modèles in vivo, par notre équipe et d'autres équipes, respectivement et n'ont pas présenté d'effets indésirables.

Devenir

Le prélèvement des tumeurs pour analyse nécessitera la mise à mort des souris.

Remplacement

Aucune méthode alternative ou modèle in vitro n’existe pour mimer les interactions qui existent entre les différents acteurs cellulaires présents au sein de la tumeur. Le sunitinib est un inhibiteur de l’angiogenèse, il est donc nécessaire de travailler sur un système plus complexe mettant en jeu les vaisseaux sanguins.

Réduction

Avant de passer au modèle in vivo, toutes nos expériences ont été préalablement validées in vitro. Nous avons également effectué une large recherche bibliographique. Les effectifs ont été choisis afin d’obtenir des résultats significatifs avec le nombre de souris minimum. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous baserons sur les données de la littérature et sur nos résultats antérieurs pour les doses administrées de composés pharmacologiques. Le nombre minimum de souris est établi à 10 par groupe pour être statistiquement significatif (en nous basant sur le fait que les traitements expérimentaux induiront une diminution de la prise/croissance tumorale d’au moins 20%). Enfin, nous utiliserons un test statistique paramétrique (test Anova) afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de données statistiquement exploitables.

Raffinement

Pour limiter la douleur modérée que notre procédure expérimentale pourrait induire, nous avons établi une grille d’observation visant à définir les points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et qui indique les mesures que nous prendrons à l’apparition des premiers signes de la douleur ou d’une perte de poids. D'autre part, en plus du personnel de l’animalerie, un suivi sanitaire tri- hebdomadaire puis journalier (à partir du début des traitements) sera réalisé par les membres de l’équipe (expérimentateurs) à l’aide d’une feuille de score adapté au modèle (Annexe 1). La fréquence de ces examens sera intensifiée en fonction des symptômes relevés sur un animal jusqu'à la disparition du problème ou la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

Les modèles murins sont les modèles les plus répandus pour étudier l’effet des drogues sur la croissance tumorale. En effet, la souris constitue un modèle classique pour la validation de l'activité pro/anti-tumorale de protéines et de composés pharmacologiques. De plus, cette espèce animale est un modèle expérimental que nous connaissons parfaitement et qui est couramment utilisé par la communauté scientifique. Dans ces études, nous utiliserons les souris NUDE, qui constituent le meilleur modèle (données publiées). Ces souris sont immunodéficientes ce qui permet de réaliser des xénogreffes de cellules humaines dans un modèle murin (NUDE femelles, agées de 6 à 8 semaines lors de l'injection des cellules tumorales) sans rejet par le système immunitaire. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines. Une fois les groupes expérimentaux réalisés, les animaux seront acclimatés durant une semaine avant de réaliser les différents traitements, ce qui implique de débuter les expériences sur des animaux âgés de 7 à 9 semaines (utilisation de souris jeunes mais ayant déjà atteints leur maturité sexuelle et ayant une courbe de poids stable).

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Toutes reçoivent une greffe de cellules de lymphome puis des cellules CAR-T par voie intraveineuse, avec plusieurs prélèvements sanguins, et 320 d'entre elles sont irradiées, pour étudier comment le métabolisme de la tumeur influence la réponse à cette immunothérapie. Le porteur indique que la croissance tumorale ne provoque des signes de souffrance qu'à un stade avancé, où l'animal est alors mis à mort. Il présente comme bénéfice attendu de mieux sélectionner les patients éligibles, et affirme qu'aucune alternative in vitro ne reproduit ce dialogue immunitaire.

Objectifs

Le lymphome diffus à grandes cellules B (LDGC-B) est un cancer du sang très agressif et très fréquent dans les pays industrialisés. Cette maladie est très diverse et hétérogène, ce qui explique qu'environ 40 % des patients ne répondent pas au traitement de référence. S'ils sont éligibles, les patients qui échappent au traitement peuvent bénéficier d'une thérapie innovante appelée "thérapie par transfert de cellules adoptives" (ou cellules CAR-T). Pour cela, un type spécifique de cellules du système immunitaire du patient (lymphocytes) est prélevé puis génétiquement modifié en laboratoire pour leur permettre de reconnaître les cellules tumorales du patient. Une fois ces cellules immunitaires réintroduites chez le même patient, elles peuvent alors reconnaître et éliminer les cellules cancéreuses. Bien que très efficace dans le traitement du LDGC-B, environ 50 % des patients ne répondent pas à ce traitement ou rechutent rapidement (dans l'année qui suit). Il est donc important de comprendre comment améliorer la réponse à ce traitement. Les LDGC-B ont différentes façons de produire leur énergie cellulaire, un support essentiel à leur division constante et rapide. En effet, ces cellules tumorales utilisent soit la voie des sucres (glycolyse), soit l'usine de fabrication d'énergie de la cellule (la mitochondrie). Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer si la façon dont la cellule tumorale produit son énergie va limiter ou favoriser la réponse des cellules CAR-T.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à terme de mieux sélectionner les patients qui pourraient bénéficier de cette thérapie innovante.

Procédures

Toutes les souris (640) seront injectées par voie intra-veineuse dans la veine caudale 2 fois au cours de l’expérience pour 1/ recevoir les cellules de lymphome (allogreffe) puis 2/ 7 jours plus tard les cellules T (contrôle ou CAR-T). Chaque injection prendra environ 5 min par souris et sera réalisé sur souris vigile. Un prélèvement de sang (100 µl) sera effectué sur souris vigile 2-3 jours avant l’injection des cellules CAR-T puis une fois par semaine dans la veine caudale de la souris ou en sub-mandibulaire à l’aide d’une aiguille 25G (le volume maximal qui sera prélevé à chaque fois est de 100 µl). Ainsi chaque souris aura entre 4 et 6 prélèvements sanguin sur l’ensemble de la durée de l’expérience. Les souris de la procédure 2 (320) seront irradiées à une dose sublétale (4 Gy). Pour cela elles seront placées 5 par cages (cage spéciale pour l’irradiateur) et seront irradiées pendant 206 secondes (3 min et 26 secondes) pour atteindre 4 Gy (notre irradiateur dispense 1,16 gray par 60 secondes). Cette irradiation ne sera réalisée qu’une fois par souris.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les souris pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection des cellules immunitaire (CAR-T), soit par l'irradiation modérée. Nous avons une grande expertise de ce modèle. Nous savons que la croissance tumorale n’entrainerait des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, absence de toilettage, une prostration et/ou une agitation) qu’à un stade avancé de la maladie. Cependant en cas de persistance des signes décrits ci-dessus, l’animal sera mis à mort. Les sites d’injections seront surveillés attentivement.

Devenir

mise à mort et mesure du poids des organes, analyses métabolomiques, cytométrie de flux, analyses moléculaires et immuno-histochimiques

Remplacement

Notre projet évalue l’importance de la source de production de l’énergie par la cellule tumorale sur la réponse au traitement par les CAR-T. Le métabolisme tumoral au sein de son environnement est profondément différent de celui observé in vitro et il n’existe pas à ce jour d’autre alternative à l’utilisation des souris pour l’étude in vivo des mécanismes métaboliques impliqués dans l’échappement des cellules tumorales aux thérapies proposées.

Réduction

Bien qu’il n’existe à ce jour pas de méthode de remplacement pour réaliser ces études, notre expérience des modèles utilisés nous permet de définir le nombre minimum de souris à utiliser afin d’être statistiquement significatif.

Raffinement

Une grande importance sera accordée au bien-être des souris. En terme de raffinement, les souris sont hébergées par groupe de 5 avec un milieu enrichi. Leur suivi permet de détecter tout signe de souffrance, de détresse et ainsi la prise immédiate des mesures adéquates grâce à l’application de points limites adaptés. La notion d’enrichissement du milieu des rongeurs utilisés est familière aux demandeurs. Tous les participants à ce projet sont dûment qualifiés et ont validé les compétences requises pour les manipulations proposées.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche phylogénétiquement de l’homme, et est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour étudier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un modèle facile à élever. Finalement, en absence de système pouvant reproduire in vitro la réaction immunitaire et le dialogue entre les différents médiateurs cellulaires, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet. Les souris auront entre 5 et 20 semaines car c’est durant cette période qu’il y a la meilleure prise de tumeur.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Des femelles reçoivent un régime déséquilibré autour de la gestation, puis leur descendance subit un transfert de flore intestinale et des tests comportementaux avant d'être tuée pour prélever des tissus, afin de relier alimentation, microbiote et traits autistiques. Le porteur qualifie ces tests comportementaux de non invasifs sans préciser lesquels, et déclare peu d'effets indésirables. Il affirme que l'autisme ne peut être modélisé qu'au niveau de l'"animal entier" exprimant tout son répertoire comportemental.

Objectifs

Les troubles du spectre autistique (TSA) sont des maladies neurodeveloppementale de plus en plus fréquentes, avec une incidence moyenne de près de 1% d’après de récentes études à grande échelle. Les causes de ce trouble sont encore mal identifiées. Le développement de l’autisme pourrait être le résultat d'une combinaison de facteurs environnementaux toxiques et d’une susceptibilité génétique. Parmi les causes environnemantales possibles, l’obésité, conséquence d’un régime alimentaire déséquilibré, est un facteur particulièrement intéressant, puisqu’elle est de plus en plus répandue dans les sociétés occidentales et pourrait ainsi expliquer l’augmentation inquitétante des cas d’autisme dans ces pays. Des études cliniques récentes montrent que les mères souffrant d’obésité ont un risque accru d’avoir un enfant souffrant de TSA. Actuellement il n’existe pas de modèle animal mimant ce facteur de risque, qui permettrait d’en comprendre les mécanismes. Nous avons montré que la descendance de souris gestantes exposées à un régime cafétéria présente une trajectoire développementale altérée ainsi que des symptômes d’autisme à l’âge adulte. La composition de la flore intestinale des ces souris est également altérée. Nous voulons maintenant la contribution du mircobiote intestinal aux altéartions comportementales observées chez les souris exposées au régime cafétéria. Le projet comprendra deux étapes : 1)Exposition de femelles au régime cafétéria une semaine avant l’accouplement et pendant la gestation puis la lactation, 2)Etude comportementale de la descendance avant et après un transfert de flore microbienne entre le groupe exposé au régime cafétéria et le groupe exposé au régime contrôle. L’enjeu de ce projet est d’identifier une nouvelle cause potentielle de développement des troubles autistiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de l’impact du microbiote intestinal sur le développement du phénotype autistique des animaux exposés de manière précoce à un régime déséquilibré.

Procédures

Les animaux seront soumis à un transfert de flore. Ce type d'intervention est en essai clinique chez l'homme pour soulager les patients atteints d'autisme. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux ethologique non ivasif. L'ensemble de notre protocole expérimental durera 16 semaines. Les tests comportementaux, que réaliseront auront une durée maximale de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental ne présente pas d’effet indésirable notoire. Dans une expérirnce précédente, l’exposition au régime cafétéria a conduit à une augmentation de 10-15% du poids des mères, et de moins de 10% chez leur descendance. L’ensemble des tests comportementaux ne génère pas de stress particulier.

Devenir

En fin d'expérience les animaux seront euthanasié dans le but de prélever des tissus et étudier l'impact du transfert de flore au niveau moléculaire

Remplacement

La compréhension des mécanismes causaux de l’autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du répertoire comportemental des animaux modèles permet de vérifier que ces modèles valident bien le critère de validité d’aspect pour la pathologie autistique, et aussi d’évaluer le cas échéant l’efficacité d’une approche thérapeutique. L’évaluation des effets bénéfiques d’un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu’au niveau comportemental : en effet, il n’existe pas de marqueur biologique pour l’autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.

Réduction

Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.9 pour une taille d’effet f de cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.

Raffinement

Nous raffinerons nos expériences en soulageant l’inconfort ou le stress potentiels subis par les animaux tout au long du protocole expérimental, en logeant les souris par groupe sociaux de 2 à 4 individus, en mettant à disposition le matériel nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et en manipulant quotidiennement les animaux par le même expérimentateur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons les animaux des deux sexes, nous testerons chaque animal dans différentes tâches et nous utiliserons les tests statistiques adéquats. Nous ne pouvons toutefois pas nous passer du modèle animal car l’autisme est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant tout son répertoire comportemental. Pendant les expériences, nous suivront quotidiennement le bien-être de nos animaux en particulier leurs poids, leur posture. Nous mettrons en place des points limites adaptés afin d’éviter de faire souffrir inutilement les animaux.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux, chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique . Les déficits comportementaux détectés chez les souris modélisant l’autisme sont suffisamment importants et robustes pour tester la validité d’aspect du modèle et, le cas échéant, permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. La trajectoire développementale des animaux sera étudiée dès la naissance des animaux. Nous suivrons le développement des animaux jusqu’à l’âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les éventuels déficits comportementaux fixés.

193 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une neurochirurgie pour induire dans l'hypothalamus l'expression d'une protéine, et 16 femelles reçoivent en plus un frottis vaginal quotidien pendant cinq semaines, afin d'étudier l'effet de l'hormone IGF1 sur le contrôle cérébral de l'ovulation. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer des hémorragies et une baisse de température, et que les animaux atteignant les points limites sont mis à mort. Il affirme que la reproduction, fonction intégrée, ne peut s'observer que sur un "organisme vivant", ce qui justifierait selon lui le recours au rat.

Objectifs

L'ovulation dépend de l'intégration de facteurs hormonaux, métaboliques, et environnementaux par le cerveau et plus particulièrement par les neurones hypothalamiques à kisspeptine (KP) qui vont orchestrer la sécrétion de la gonadolibérine ou GnRH permettant le pic de l'hormone lutéinisante (LH) à l'origine de l'ovulation. L'objectif est de développer et de mettre en oeuvre une technique permettant d'induire la synthèse d'une proteine dans une région cible du cerveau sur une période de temps étendue (supérieure à 3 semaines) afin d'étudier l'influence de cette proteine sur le contrôle central de l'ovulation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de deux ordres: le premier consiste en une meilleure compréhension des effets de l' Insulin Growth Factor 1 (IGF1), hormone périphérique, sur le fonctionnement dans le noyau arqué des neurones à KP et plus généralement sur la synchronisation du moment de l'ovulation par l'hypothalamus; le second est la mise au point d'une technique innovante, ne nécessitant pas la mise en oeuvre de bâtiments ayant un niveau de biosécurité élevé, pour induire une proteine dans une région délimitée du cerveau et à un âge déterminé de l'animal ce qui permettra de mieux comprendre sa fonction. Cette technique si elle est validée pourra être déployée chez des espèces animales (telles les espèces de rente) chez lesquelles les outils de génie génétique sont peu disponibles.

Procédures

Tous les animaux (n=193) seront soumis à une neurochirurgie d'une durée moyenne de 15 minutes par animal. Pour ce faire, les animaux seront anesthésiés et leur température corporelle sera maintenue grâce à un tapis chauffant. Parmi ces 193 animaux, 16 femelles auront un suivi de cyclicité par frottis vaginal réalisé pendant cinq semaines à raison d'un frottis quotidien (les femelles vigiles sont maintenues le temps du frottis).

Impact sur les animaux

Effets directs: Toute neurochirurgie peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies. L'incision de la peau du crâne peut induire une douleur localisée. Effets indirects: Mobilité et hygiène du pelage éventuellement réduites suite à la neurochirurgie, l'induction de la synthèse d'IGF1 pourrait avoir des effets sur le poids de l'animal (perte ou gain). Les effets directs sont de courte durée (

Devenir

Le projet porte sur le cerveau et sur l'analyse anatomique et fonctionnelle d'un traitement in situ constitué par un transfectant et un plasmide. De ce fait, il est nécessaire d'euthanasier tous les rats de ce projet en fin d'expérimentation afin de confirmer la zone d'injection, de mesurer son étendue et de caractériser d'éventuelles lésions tissulaires.

Remplacement

La fonction de reproduction étant une fonction intégrée sous contrôle de l'hypothalamus, elle ne peut s'observer que sur un organisme vivant. Les expériences s'appuieront néanmoins sur les données de la littérature pour choisir les critères expérimentaux les plus pertinents et réduire le nombre de tests.

Réduction

Le choix du nombre d’individus par lot s'appuie sur les données de la littérature et notre expérience antérieure montrant que des résultats exploitables et statistiquement fiables peuvent être obtenus avec des groupes compris entre 5 et 7 animaux selon les données à exploiter. La réalisation successive des expériences (et non en parallèle) permet de réduire le nombre de lots expérimentaux car chaque critère établi sera réutilisé dans l'expérience suivante. La taille des lots a été déterminée en nous basant sur notre expérience antérieure où selon les données quantifiées, la variabilité inter-animale et le test statistique utilisé il faut au minimum 7 animaux/groupe. Nous avons ajouté 1 animal par lot afin de prévenir tout risque lié à la chirurgie.

Raffinement

Les rats seront hébergés par trois en présence d'objets en carton (boites à oeufs, tube). Une semaine d'habituation à la manipulation par l'expérientateur sera prévue pour chaque lot de chaque série d'expérience. Les rats seront anesthésiés lors des chirurgies et recevront un traitement antalgique consécutivement à la neurochirurgie. Les rats recevront une pommade ophtalmique pour conserver une bonne lubrification de l'oeil pendant la chirurgie. La surveillance post-opératoire s'appuiera sur l'observation quotidienne du comportement, de l'apparence physique et du poids corporel. La molécule étudiée est une hormone endogène qui n'est pas connue pour avoir des effets nocifs sur la santé des animaux, de même l'absence de nocivité du transfectant a été établie. Néanmoins, une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée tout au long de l'expérimentation ainsi qu'un suivi de poids bihebdomaire.

Choix des espèces

C’est une espèce de référence pour l'étude du contrôle central de la reproduction utilisée en routine par de nombreux laboratoires. L'intérêt de cette espèce dans le cadre de notre projet est la durée courte des cycles ovariens (4 jours) et la bonne reproductibilité/fiabilité des coordonnées stéréotaxiques pour les approches de neurochirurgie. Les animaux seront sexuellement matures afin d'avoir un axe gonadotrope activé et, dans le cas des femelles une activité de reproduction régulière facilement observable par la réalisation de frottis vaginaux. De plus, les coordonnées stéréotaxiques de l'atlas de référence s'appliquent pour des animaux dont le poids est proche de 280g.

63 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous anesthésie, puis douze perfusions intraveineuses d'une heure par un cathéter alors qu'elles sont éveillées, avant un prélèvement de sang cardiaque terminal, pour tester un candidat médicament anticancéreux dans un modèle de cancer de la vessie. Le porteur annonce un effet "vaccinal" contre les récidives, à partir de résultats antérieurs, et vise des données précliniques pour un futur essai chez l'humain. Il indique que le cathéter peut s'obstruer et que la pousse tumorale peut gêner la locomotion.

Objectifs

Le TLR3 est un récepteur impliqué dans l’immunité et est exprimé par les cellules normales mais aussi dans de très nombreuses cellules tumorales. L’activation de ce dernier par certaines molécules entraîne une mort spécifique des cellules cancéreuses (mais pas des cellules normales), ainsi qu’une activation de l’immunité ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes induit une vaccination à long terme contre la tumeur empêchant ainsi les récidives cancéreuses. Des études précédentes ont démontré l’ensemble des effets cités ci-dessus (guérisons complète de 45% des souris traitées et vaccination à vie des souris guéries contre les récidives dans 66% des cas). Ces résultats ont été obtenus lors d’injections intratumorales d’une toute nouvelle famille de molécules activant le TLR3 (spécifique, utilisable en clinique et bien tolérée). Dans la présente étude, le candidat médicament adapté à une injection dans le système veineux (ici perfusion intraveineuse sur souris vigiles sans contention) va être comparé en doses croissantes sur 63 souris dotées d’un cathéter pour déterminer : (1) l’efficacité antitumorale, (2) la tolérance et (3) les mécanismes d’action (dont l’action sur le système immunitaire). Pour ce faire, le modèle de cancer de la vessie sera utilisé pour que l’activité de ce candidat médicament puisse être directement comparable aux études précédentes et à venir.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer l’efficacité du candidat médicament par voie d’administration en perfusion intraveineuse et à trouver sa dose efficace pour une action anti-tumorale. L’hypothèse est également que ce candidat médicament permettra d’éviter les récidives avec un effet vaccinal. Il est testé ici sur un modèle de tumeur de la vessie mais il pourrait avoir des actions sur une multitude de cancer.

Procédures

- Anesthésie pour identification, tonte, injection de cellules tumorales dans le flanc …. (5 min) - Douze traitements (injection intraveineuse lente par le cathéter) d’une heure sur souris non anesthésiées. - Une anesthésie pour prélèvement de sang intracardiaque suivi d’une mise à mort (10-15 min).

Impact sur les animaux

Les animaux sont reçus déjà dotées d’un cathéter dans la veine jugulaire avec un injecteur double qui est susceptible de s’obstruer. Les animaux subiront un stress lors des contentions, mesures, entretien des cathéter, anesthésies et greffe tumorale. L’anesthésie terminale en vue du prélèvement sanguin intracardiaque peut entraîner l’arrêt du cœur. La pousse tumorale peut engendrer une gêne dans la locomotion.

Devenir

A la fin de l'unique procédure, tous les animaux seront mis à mort avant prélèvements en point final sans réveil (analyses pharmacocinétiques, biodistribution et biomarqueurs).

Remplacement

Pour cette étude, des souris ayant un système immunitaire complet et dotées d’un cathéter sur la veine jugulaire permettant les injections et les prélèvements seront directement reçues du fournisseur. Ces expériences sur petits animaux ne peuvent pas être REMPLACEES. Seul un modèle in-vivo, possédant un système immunitaire complet, permet l'étude de l'effet vaccinal thérapeutique et anti-récidives contre les tumeurs. Il en va de même pour les facteurs physiologiques pouvant influer sur l’effet de la molécule testée (biodisponibilité, métabolisation, distribution cellulaire, réponse immunitaire...). Aucune donnée bibliographique n’étant disponible sur ces molécules, seules les expérimentations permettront de disposer de ces données et d'étudier l'efficacité du candidat médicament aux différentes étapes de la progression tumorale. Ces expériences s'inscrivent dans le cadre du développement d'une application thérapeutique et fournira des données précliniques précieuses pour la conception d'un essai clinique chez l’Homme.

Réduction

Une précédente preuve de concept a permis de déterminer que le nombre de souris prévu pour cette expérience était adapté. Ainsi, la REDUCTION du nombre d'animaux sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats sera respectée, tout en utilisant les méthodes statistiques adaptées. Des études statistiques seront effectuées sur les mesures de croissances tumorales et sur le nombre de tumeurs n’atteignant pas une taille critique.

Raffinement

Le RAFFINEMENT sera respecté par la mise en place d’une définition précise des points limites précoces et prédictifs, sur la base d'une grille de score validée sur ce modèle et sur ce type de traitement. Une surveillance adaptée des animaux 3 fois par semaine permettra d'éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 et isolés pendant le temps du traitement dans des cages transparentes et pourront ainsi se voir à travers les parois. Ils auront accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’à de l’enrichissement. Un prélèvement de sang aura lieu à la fin de 2 des 12 traitements sans que l’animal s’en rende compte par le cathéter. Les autres prélèvements seront des prélèvements terminaux pratiqués sous anesthésie et antalgie. Ce modèle se rapproche donc physiologiquement d’une infusion clinique sur l’Homme. Ce dispositif permet aussi de ne pas piquer plusieurs fois dans la même veine, ce qui peut l’abîmer.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques et immunologiques : (1) En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé, avec des grilles de comparaison entre la souris et l'homme très bien définis pour les perfusions intraveineuses. (2) La réponse immunitaire chez cette espèce est également très bien définie. Or, seul le modèle animal possédant un système immunitaire complet permet l'étude de l'effet vaccinal contre le cancer. Les expériences s’effectueront sur des souris de 9 à 11 semaines après 7 jours d'acclimatation dans l’EU. A ce stade de développement, la croissance tumorale est plus reproductible et bien tolérée, de plus, le système immunitaire est suffisamment mature pour induire une réponse vaccinale. Les souris utilisées seront toutes des femelles afin de limiter le risque d’agressivité inter-individu par rapport aux mâles. De plus, les études précédentes ont également été effectuées sur des souris femelles, ce qui permettra de comparer les résultats de cette étude.

2 259 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales ou un produit cancérigène suivi d'un agent provoquant une inflammation du côlon, puis sont tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs organes, afin d'étudier le rôle des lymphocytes T régulateurs dans les cancers. Le porteur indique un risque de prolapsus rectal et une perte de poids, et renvoie ses retombées thérapeutiques éventuelles chez l'humain à un horizon lointain. Il affirme que la complexité du développement tumoral impose l'animal et revendique une expertise de plus de vingt ans pour fixer les effectifs.

Objectifs

Les cancers représentent la première cause de décès en France. L'immunothérapie a permis de faire des avancées spectaculaires dans leur traitement. Des recherches précliniques et cliniques laissent espérer une augmentation du nombre de patients que nous pourront traiter dans le futur. Notre projet s’inscrit dans cette perspective. Il est maintenant clairement établi qu’une population de cellules du système immunitaire qu’on appelle lymphocytes T régulateurs, appelés plus simplement « Treg », a un rôle délétère dans les cancers en inhibant fortement les réponses immunes contre les tumeurs. Certains traitements efficaces en immunothérapie des cancers agiraient par destruction des Treg. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle joué par les Treg dans la physiopathologie des cancers et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques. Du fait de la complexité des mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies, nous devons avoir recours à l'animal pour mieux comprendre ces mécanismes et tester de nouvelles approches thérapeutiques. Le rôle fondamental du microenvironnement dans le développement tumoral ne peut être reproduit et analysé dans des modèles de culture cellulaire. Il est d'ailleurs important de rappeler ici que toutes les avancées récentes en immunothérapie des cancers proviennent directement de données obtenues d'abord chez la souris. On voit donc l'intérêt de pouvoir tester ces approches chez la souris avant de pouvoir les appliquer à l'homme. Nous allons travailler sur le rôle joué par certaines molécules exprimées par les Treg infiltrant les tumeurs ou impliquées dans la régulation du métabolisme de ces cellules. Pour ce faire, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées dans lesquelles l’expression de ces différentes molécules est éliminée dans les seuls Treg. Mieux comprendre le rôle de ces molécules dans les Treg permettra de mieux comprendre la physiopathologie des cancers. De plus, le ciblage de certaines de ces molécules dans les Treg pourrait amener à de nouveaux traitements des cancers. C’est l’objectif général de ce projet.

Bénéfices attendus

Grâce à ce travail, nous espérons avoir une meilleure connaissance de la biologie des Treg en général et plus particulièrement de la physiopathologie des cancers, notamment concernant la régulation de ces maladies par les Treg. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’homme.

Procédures

Le projet comprend 2 procédures. Pour la première procédure, l’expérience débutera par l’injection de cellules tumorales sous la peau chez des souris anesthésiée et maintenues sur une plaque chauffante. L’injection en elle-même des cellules ne durera pas plus de 30 secondes et l’anesthésie durera moins de 5 minutes par souris. On effectuera ensuite un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal, la taille des tumeurs avec un pied à coulisse et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 90 secondes par souris. Pour la mesure de la taille des tumeurs, on fera une contention par la peau du cou et pour la mesure du poids des souris, on fera une contention par la queue. Certaines de ces souris seront également traitées 10 à 17 jours après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 18 ou 30 jours après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris). Pour la deuxième procédure, le début de l’expérience consistera à injecter un produit carcinogène. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Puis, on donnera dans l’eau de boisson un produit déclenchant une inflammation dans l’intestin qui va favoriser l’apparition d’un cancer du colon sur le long terme. Ce dernier produit sera administré 3 fois (à 1 semaine, 4 semaines et 7 semaines après le début de l’expérience) pendant 1 semaine. On effectuera un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 20 secondes par souris. Certaines de ces souris seront traitées pendant 1 semaine, 6 semaines ou 9 semaines après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 12 semaines après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

A l'état basal, aucun phénotype dommageable n'a été reporté ou observé au laboratoire pour les différentes lignées utilisées dans ce projet. L’inoculation des 3 lignées tumorales n’entraine pas de douleur systémique spécifique. L'induction du cancer colorectal provoque l'apparition de tumeurs dans le colon distal en 1 à 3 mois avec risque de prolapsus rectaux et une perte de poids inférieure à 10% du poids initial. Le traitement par le tamoxifène entraine une perte de poids modérée (

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (rate, ganglions, tumeurs, colon etc…) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.

Remplacement

Etant donnée la complexité du développement des cancers, seule l'expérimentation animale permettra une approche intégrée de la compréhension des mécanismes impliqués. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des cancers et que nous avons développé au laboratoire des modèles de souris génétiquement modifiées uniques qui permettent de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, on effectuera un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.

Réduction

REGLES GENERALES. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de maladie interindividuelle entre souris, nous utiliserons 7 souris par groupe pour les analyses de croissance tumorale, d’immunophénotypage par cytométrie de flux et d’analyse histologique. Les groupes seront constitués de 4 souris pour les analyses transcriptomiques. Les expériences seront répétées 3 fois. Nous ne pouvons descendre en dessous de ces valeurs. La taille des effectifs et le nombre de fois où les expériences seront reproduites ont été établis en tenant compte de l’expertise que nous avons développée depuis plus de 20 ans. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. STRATEGIE D’ANALYSES GROUPEES. Dans la plupart des cas, nos études portent sur des analyses multifactorielles. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est de réaliser les expériences sur différentes lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin les comparer entre elles et par rapport au même groupe témoin. STRATEGIE D'UTILISATION DE SOURIS GENETIQUEMENT MODIFIEES HOMOZYGOTES. Dès qu'il sera possible de le faire, nous maintiendrons nos souris génétiquement modifiées à l'état homozygote pour les transgènes. De cette façon, toutes les souris seront utilisables pour les expériences. STRATEGIE D’OPTIMISATION DES ANIMAUX EUTHANASIES. Nos études in vivo portent sur l’analyse de différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié nous prélèverons le maximum d’organes afin de collecter et conserver le plus de données possibles par animal. L’ensemble de ces stratégies permet de réduire le nombre de souris utilisées à un total de 2259 pour l’ensemble du projet.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum dans des cages de Longueur 36,50 cm, largeur 20,5 cm et hauteur 12,5 cm). Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. L'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi pour permettre aux souris de faire un nid avec des lanières de papier Kraft. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie et par les expérimentateurs au moins 3 fois par semaine. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au vétérinaire responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. Une discussion sera engagée pour déterminer s'il y a lieu d'administrer un analgésique et si oui lequel. Le choix dépendra de l'intensité et de la durée de la douleur éventuelle. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, soit nous l'euthanasions et le sortons de l'étude soit on lui donne un analgésique. En général, on choisira plutôt de le sortir de l'étude car les analgésiques peuvent interférer avec le système immunitaire. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Le modèle d’induction de cancer du colon est un modèle préclinique mimant la pathologie humaine. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. Pour l’ensemble des expériences, celles-ci seront initiées chez des jeunes adultes de 6 à 12 semaines d’âge, à un moment où le système immunitaire est mature.