Oncologie

540 poissons, des raies et des requins de six espèces, vont être capturés puis relâchés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont marqués sous anesthésie par un émetteur acoustique, inséré dans la cavité péritonéale par incision chez les roussettes et les requins taupes, ou fixé par perçage de la nageoire chez les raies, pour suivre leurs déplacements autour des parcs éoliens en mer. Le porteur indique que le marquage peut occasionner des mortalités directes ou indirectes, qu'il présente comme rares, et que les individus sont remis à l'eau à l'endroit de leur capture. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour étudier les mouvements en milieu naturel.

Objectifs

Le développement des parcs éoliens en mer est aujourd’hui en plein essor. Ces infrastructures génèrent des modifications de l’habitat au sein des écosystèmes marins ayant un impact potentiel sur la biodiversité. Ils peuvent agir comme des récifs artificiels pour certaines communautés de poissons avec des espèces présentant une forte résidence pour ces milieux. De plus, les câbles électriques sous-marins qui relient les éoliennes entre-elles et raccordent le parc éolien à la côte, peuvent générer des champs électromagnétiques et affecter le comportement d’espèces électro- et magnéto-sensibles, tel que les requins et raies. La croissance de l’éolien en mer risque d’amplifier ces effets, mais les conséquences sur les communautés ichtyologiques restent peu connues. Ce projet de 3 ans, vise à identifier et évaluer les effets des parcs éoliens en mer et leur raccordement sur les peuplements de raies et requins, espèces peu étudiées et à fort enjeu de conservation. Pour cela, ce projet se base sur l’utilisation de la télémétrie acoustique comme méthode de suivi, qui consiste à équiper un animal d’un émetteur acoustique (tag) émettant un signal sonore unique détecté par des hydrophones (récepteurs) placés dans les milieux ce qui permet d’étudier les déplacements et les comportements des individus dans le temps et l’espace. Cela permet de déterminer différents processus écologiques, notamment comment une espèce connecte et utilise les habitats, information essentielle pour mieux comprendre son rôle dans l’écosystème, ainsi que l’effet d’une modification d’habitat comme l’implantation d’un parc éolien en mer. Le projet a pour objectif d’étudier le comportement de raies et requins sur des zones de parc éolien en mer à différent stades de développement (pré-construction à exploitation). Ainsi, 6 espèces seront équipées de tags acoustiques : La raie brunette Raja undulata, la raie bouclée Raja clavata, la petite roussette Scyliorhinus canicula, la grande roussette Scyliorhinus stellaris, l’émissole tachetée Mustelus asterias et le requin taupe commun Lamna nasus. Les individus marqués seront suivis sur différents sites et habitats grâce à des récepteurs placés au sein des parcs éoliens et habitats côtiers. Ce projet servira à évaluer l’effet des parcs éoliens en mer sur le comportement de ces communautés et ainsi permettre de proposer des mesures d’amélioration pour la conservation de ces espèces et le développement des parcs éoliens offshores.

Bénéfices attendus

L’implantation d’un parc éolien en mer entraine des modifications d’habitats. Au vu de la forte croissance de ces projets de développement, il est nécessaire de mieux connaitre les effets de ces structures sur les écosystèmes marins. A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’écologie des espèces suivies et ainsi répondre à différentes questions telles que : comment ces espèces réagissent-elles à des champs électromagnétiques générés par un câble sous-marin ? Quels sont les profils d’occurrence des espèces à enjeux de conservation dans la zone de parc éolien en mer ? Quel est le degré de connectivité entre les parcs éoliens en mer et les autres habitats marins pour ces espèces? Les individus font-ils preuve d’une fidélité pluriannuelle au site ? Comment les conditions environnementales influencent-elles ces tendances ? Il existe très peu de connaissances à ce sujet sur les raies et les requins. Ces connaissances relatives à l'écologie du mouvement de ces espèces, que le marquage en milieu naturel rend possible, serviront de cas concrets pour la mise en place de suivis pérennes des populations au sein des parcs éoliens en mer afin d’atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines en général.

Procédures

Les petites roussettes, les grandes roussettes et les émissoles tachetées seront marquées chirurgicalement sous anesthésie générale. L'acte d'insertion de la marque acoustique (13mm de diamètre) dans la cavité́ péritonéale est relativement simple et parfaitement maitrisé par les applicateurs du projet. Seule la paroi musculaire de l’individu à marquer est ouverte pour l’insertion de la marque, aucun organe interne autre que la peau et les muscles n'est impacté par cette incision. L'incision est ensuite suturée avec du fil résorbable qui disparait en 3 à 4 semaines. L'acte de chirurgie en lui-même dure moins de 5 minutes par individu. Les raies seront marquées sous anesthésie générale pour la pose d’un émetteur externe de 13 mm de diamètre sur la nageoire pectorale de l’individu. Deux aiguilles de 3mm de diamètres perceront la nageoire de la raie pour fixer l’émetteur. Des études précédentes ont montré que ce type de marquage n’altéré pas la nage de l’individu et son comportement. L’acte de pose de l’émetteur en lui-même dure moins de 5 minutes par individu. Les requins taupes seront marqués chirurgicalement sous anesthésie locale afin de limiter le temps de la procédure et le stress de l’individu comme il est conseillé par de nombreuses études sur les requins de grande taille (>2m). L'acte d'insertion de la marque acoustique (16mm de diamètre) dans la cavité́ péritonéale est relativement simple et parfaitement maitrisé par les applicateurs du projet. Seule la paroi musculaire de l’individu à marquer est ouverte, aucun organe interne autre que la peau et les muscles n'est impacté par cette incision. L'incision est ensuite suturée avec du fil résorbable qui disparait en 3 à 4 semaines. L'acte de chirurgie en lui-même dure moins de 5 minutes par individu. Les individus seront relâchés dans la zone de capture le plus rapidement possible.

Impact sur les animaux

Au niveau individuel, cette étude nécessite un marquage (chirurgical pour les requins, externe pour les raies). Même si cela reste rare, ces procédures peuvent occasionner des mortalités directes ou indirectes. Aucun autre effet du marquage n’est à signaler.

Devenir

Tous les animaux marqués seront replacés dans leur milieu naturel, à l'endroit précis de leur capture.

Remplacement

Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser les mouvements individuels en milieu naturel, il n’est pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement. L’apport de la télémétrie acoustique (détection de la présence de poissons marqués à proximité d’un récepteur) devrait permettre l’amélioration de connaissance sur les habitats occupés par les espèces et de leurs mouvements. Pour atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines, l’évaluation de l’état écologique des écosystèmes marins doit pouvoir s'appuyer sur des connaissances relatives à l'écologie du mouvement des espèces et à la fréquentation des habitats essentiels, que le marquage en milieu naturel rend possible.

Réduction

Le nombre d’individu a été réduit au minimum d’après les préconisations de la littérature pour la télémétrie acoustique. Des tests de puissance préalables ont été́ effectués permettant d'estimer la taille de l'échantillon nécessaire pour confirmer ou infirmer les hypothèses de manière significative. Le fait de marquer 30 individus par espèce et par site, permet la réalisation d’analyses statistiques fiables et robustes permettant d’extrapoler à la population. Ainsi, le comportement des individus et des espèces analysées permettra de refléter un comportement global de la population et ainsi d’évaluer les effets des parcs éoliens sur le comportement de ces espèces.

Raffinement

Dans le cadre des procédures, plusieurs mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors du marquage, incluant la capture (engins sélectifs en direct, l’hameçon ou traits de chalut courts), pour limiter au maximum le temps où l’animal est en phase « capture », ainsi que des procédures d’anesthésie optimales durant les phases pré opératoire, opératoire et post opératoire. Le protocole de pêche seront adaptés pour être les moins traumatisants avec notamment la sélection d’hameçons spécifiques et un personnel spécialement formé à ce type de capture. Les individus seront surveillés de manière régulière durant toute la période de détention. Lors de leur manipulation, en plus de l’utilisation d’anesthésiant, les individus seront placés en immobilité tonique afin de limiter le stress et la douleur. Un analgésique sera aussi utilisé conjointement. Les individus seront remis à l’eau le plus rapidement possible (quelque heures maximum). Après implantation, les individus ayant subi une anesthésie générale sont gardés en bassin de réveil et surveillé individuellement au moins 30min. Aucune remise à l’eau ne sera faite avant que l’animal ait retrouvé tous ses réflexes et sa mobilité. Aucune sortie de l’eau sans anesthésie ne sera effectuée de manière prolongée (supérieur à quelques secondes). Lors des sorties de l’eau pour chirurgie, les poissons resteront en permanence en milieu humide (dos dans l’eau, flux d’eau dans la bouche). Les individus seront retirés de la procédure si les points limites préalablement établis sont atteints. Les points limites sont identifiables à travers le comportement des poissons (activité de nage anormale, absence de réaction) ou des signes extérieurs de stress (e.g. couleur de peau, plaies). La taille et le poids des marques pour chaque espèce sont choisies bien en dessous des critères normalement appliqués (>2% du poids des individus).

Choix des espèces

Les raies et les requins sont des espèces présentes dans les zones d’étude où se situent potentiellement des habitats essentiels pour ces poissons (ex. zone de reproduction, aire de nourrissage). Ces espèces électrosensibles sont aussi susceptibles d’être impactées par les champs électromagnétiques générés par les câbles sous-marins des parc éolien en mer. L’ensemble de ces espèces sont présentes sur les différents sites d’étude et présente des degré de mobilité diffèrent (territoriale/résidentes à fortement migratrice). Les espèces sélectionnées sont exploités ou présentes dans les pêcheries et sont considérées comme robuste avec une capacité de récupération rapide. La méconnaissance sur l’écologie de ces espèces limite notre capacité d’évaluation de leur statut de conservation. Il est important de les étudier en milieu naturel afin d’apporter les connaissances nécessaires permettant d’établir le statu des populations et leur vulnérabilité face aux pressions des activités humaines. Seules les adultes de chaque espèce seront marqués car leurs conditions physiologiques sont jugées plus robuste que le stade juvénile.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein ou du poumon, puis un traitement par gavage pendant trois à six semaines, pour comparer un dosage adaptatif des anticancéreux au dosage maximal habituel. Le porteur indique que la greffe provoque une douleur modérée sous anesthésie et que la tumeur sera limitée à 2 000 mm3, toutes les souris étant tuées pour analyser les cellules tumorales. Il affirme avoir déjà travaillé sur cellules en culture et par modélisation mathématique, mais juge le passage à l'animal nécessaire pour reproduire la formation des tumeurs.

Objectifs

Le cancer du sein est la première cause de mortalité des femmes par cancer en France, avec plus de 12.000 décès par an. Chez l’homme, le cancer du poumon est le plus mortel avec > 22.000 décès / an. L’échec thérapeutique dans les deux cancers est causé par le développement d’une résistance cellulaire aux drogues. L'approche conventionnelle d'administration d'anti-cancéreux consiste à donner les Doses Maximales de drogues Tolérées par les patients (MTD). Toutefois, en raison du grand nombre de cellules cancéreuses et de leur hétérogenéité, cela conduit inévitablement à une sélection de cellules qui sont adaptées pour résister aux traitements, et qui sont responsables des rechutes. Cette sélection des cellules résistantes par les thérapies est un problème d’écologie, et les écologistes ont conclu que le meilleur moyen de limiter les effets néfastes des éléments nuisibles est de les contrôler plutôt que de tenter de les éradiquer. Transposé au cancer, cela consisterait à appliquer des régimes adaptatifs de drogues où l'on diminue la dose si la charge tumorale diminue. Cela permettrait de maintenir une compétition cellulaire entre cellules sensibles aux traitements et cellules résistantes, tout en limitant les effets secondaires des drogues. Bien que cette "Thérapie Adaptative" (AT) connait déjà des succès dans la clinique, les paramètres essentiels pour l’implémenter, et les mécanismes cellulaires et moléculaires en jeu, restent inconnues. Nous avons récemment montré par une combinaison de modélisation mathématique et d'expériences à partir de cellules cancéreuses en culture, que la compétition entre cellules sensibles et résistantes est réelle et détermine l’efficacité de l’AT. Dans nos expériences, des régimes avec des faibles doses de drogues contrôlaient mieux la croissance des cellules cancéreuses dans le temps que des doses plus élevées, tout en évitant l'apparition de cellules résistantes. Ces expériences sont publiées dans une revue internationale. Comme il s'agit d'utilisation exclusive de cellules en culture, notre stratégie est conforme à la première règle des 3R (remplacement). Cependant, il est important de maintenant procéder aux expériences chez l’animal pour mieux reproduire la tumorigénèse, afin de mieux comprendre comment implémenter l’AT chez l’homme. Le but de ce projet est de tester les avantages et mécanismes de l'AT in vivo chez la souris dans des modèles cliniquement relevants de cancers du sein et du poumon.

Bénéfices attendus

La réussite de ce projet serait d'une importance majeure, car il permettrait d'envisager des essais cliniques avec des drogues déjà autorisées mais jusqu'à présent inefficaces pour lutter contre la résistance. Les avantages de l'AT seraient un gain de temps de survie des patients et la diminution des effets secondaires. L’AT est potentiellement applicable à n'importe quel cancer et n'importe quelle drogue.

Procédures

Greffes de cellules cancéreuses une fois, et traîtement avec des inhibiteurs de kinases par gavage orale une fois par jour pendant 3 à 6 semaines.

Impact sur les animaux

La greffe des cellules tumorales chez la souris engendrait une douleur modérée mais sera réalisée sur souris anaesthésiées. La croissance des tumeurs sera limitée à une taille maximale de 2000mm3, ce qui n'engendre pas de douleur. L'application des drogues par le gavage des animaux implique une nuisance transitoire mas pas de souffrance sévère ni durable. Les drogues utilisées n'ont pas d'effets secondaires chez la souris aux doses utilisées.

Devenir

L'intégralité des animaux sera mise à mort pour éviter de dévélopper des souffrances et pour permettre l'analyse des cellules cancéreuses des tumeurs.

Remplacement

Nous avons déjà analysé in vitro des paramètres relevants des cellules de cancer mammaire (4T1) et du poumon (PC9) sensibles ou résistants aux drogues, et avons également réalisé la modélisation mathématique de ces données. L'ensemble de ces études nous a permis d'identifier et préselectionner les conditions d'intérêt. Mais il n'existe pas d'approches, autre que l'expérimentation in vivo chez l'animal, pour évaluer l'efficacité des différents régimes de drogues sur la diminution de la progression tumorale et de la résistance.

Réduction

Nous avons conçu les expériences pour utiliser le minimum d'animaux permettant de tirer des conclusions statistiquement robustes. Dans chaque expérience, nous comparerons la progression tumorale dans les souris nude entre deux groupes. Chaque expérience prévoit l'utilisation de 10 souris dans le bras AT et 10 dans le bras MTD, à répéter une fois si les résultats sont prometteurs. Ceci donne lieu à 80% puissance pour détecter un effet de différence de 10% avec une confiance p

Raffinement

Les expériences sont conçues pour éviter la souffrance des animaux, selon la règle 3R (raffinement): par exemple en arrêtant les expériences avant les signes de souffrance et en surveillant quotidiennement les animaux pour les points limites correspondant à des signes de souffrance. Les conditions d'hébergements sont les suivantes: 5 animaux par cages (501 cm2) avec pour litière un mélange de sciure de peuplier et de copeaux de peuplier

Choix des espèces

Les modèles choisis (greffe sous cutanées dans des souris nude) sont cliniquement relevants, ayant conduit à des essais cliniques qui ont permi l'approbation des drogues utilisées chez les patients. 8 semaines : il faut des souris adultes jeunes et du même stade pour les expériences de tumorigénèse afin de réduire la variance et diminuer le nombre d'animaux utilisés.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est provoqué par injection de streptozotocine, puis elles subissent des prélèvements de sang hebdomadaires à la queue et des explorations auditives sous anesthésie, par otoémissions acoustiques et potentiels évoqués, pour mesurer l'atteinte de l'audition. Le porteur indique qu'une souris perdant plus de 20 % de son poids ou montrant un mal-être sera tuée, et que toutes seront tuées en fin d'étude pour prélever les os de l'oreille. Il affirme que ces tests fonctionnels sur l'audition ne peuvent se faire que sur l'animal vivant et qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer ce protocole.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris : la souris de souche CBA/J Rj (ayant une fonction auditive stable sur près de 2 ans).

Bénéfices attendus

Le diabète représente aujourd’hui la plus fréquente des maladies chroniques puisqu’elle touche près de 6 % de la population. Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par un excès du taux de sucre dans le sang (hyperglycémie). Actuellement le patient diagnostiqué et pris en charge dispose de nombreuses propositions thérapeutiques plus souples d’utilisation et l’innovation pharmacologique est au coeur des progrès dans le traitement du diabète. Cependant au fil du temps, un diabète mal surveillé et mal géré peut entrainer des conséquences dont les plus fréquentes et les plus connues sont la cécité et les amputations des extrémités (doigts et orteils) ou des membres. Ces complications semblent être induites par la détérioration et l’obstruction des petits vaisseaux ou la dégénérescence des nerfs. Cette atteinte des nerfs est classiquement appelée neuropathie. Par ailleurs, les données de la littérature concernant la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques (de type 1) sont contradictoires. Selon une récente méta-analyses, la prévalence de la surdité serait évaluée entre 5.17% et 48% chez les patients diabétiques de type 1. Une autre étude clinique ne révèle aucune différence significative de la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques de type 1 comparativement aux sujets non diabétiques. Les outils d’exploration audiologiques sont-ils assez sensibles pour détecter l’installation d’une atteinte auditive subtile ? De nombreuses études pré-cliniques ont révélé que des pertes massives de cellules ciliées internes, ou de fibres nerveuses pouvaient être sans conséquence sur les seuils liminaires (seuils de détection, déterminés par l’audiométrie). L’atteinte auditive chez les patients diabétiques pourraient donc être sous-estimées car mal évaluée. Il semble donc indispensable de documenter du point de vue fonctionnel et histologique plus précisément sur des modèles murins cette complication « silencieuse » du diabète.

Procédures

- La glycémie sera déterminée par des "prélèvements capillaires" sanguins (gouttes de sang) suite à une légère piqûre au niveau de la queue de l'animal (utilisation de lecteur de glycémie identique au lecteur clinique humaine avec bandelette de prélèvement stérile à usage unique). Cette procédure dure moins de 5 minutes. Cette procédure de détermination de la glycémie est réalisée de façon hebdomadaire. - Injection intrapéritonéale de streptozotocine (1 fois en moins de 2 minutes). Le test pour évaluer si un diabète a été induit par l'apparition d'une neuropathie périphérique, sera effectuée à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%). Par l'insertion de deux paires d'électrodes distantes (une stimulatrice et une enregistreuse du signal) au niveau de la queue de l'animal, une réponse éléctrophysiologique du nerf caudal sera mesurée afin de montrer une possible neuropathie périphérique liée à l'induction du diabète. Une asepsie sera pratiquée sur la queue des animaux par une application d'alcool 70°. Les explorations auditives sont effectuées à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%) . Les deux méthodes utilisées dans ces explorations fonctionnelles sont : -Les otoémissions acoustiques : lorsqu’une stimulation acoustique calibrée est appliquée dans le conduit auditif externe, il est possible de recueillir en retour une réponse physiologique acoustique issue d’une population particulière de la cochlée : les cellules ciliées externes. Cette technique de réalisation simple et rapide (5min par animal) renseigne sur la fonction cochléaire et sur la physiologie des cellules ciliées externes. -Les potentiels évoqués auditifs précoces : il est possible à l’aide d’électrodes intradermiques (3 électrodes placées : au niveau de la mastoïde (électrode active), du vertex et au niveau dorsal) de recueillir la réponse électrophysiologique de la cochlée et des voies nerveuses auditives périphériques. Ainsi à l’aide de stimulations calibrées adéquates il est possible de déterminer des seuils auditifs (corrélat de l’audiogramme clinique, pour les fréquences de 8, 10, 16, 24 et 32kHz) et de déterminer des latences de conduction des voies nerveuses (temps de réalisation 15-20min par animal).

Impact sur les animaux

Si les animaux sont diabétiques, une altération de leur état de santé général peut être visible (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…)).

Devenir

A la fin des explorations fonctionnelles, l’euthanasie de tous les animaux sera réalisée au moyen d’une injection léthale d'euthanasiant chimique en vue de prélèvement des os temporaux pour une étude histologique des cochlées. Les animaux ayant reçu une injection de streptozotocine mais ne développant pas un diabète seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2). Les animaux présentant une altération de leur état de santé général (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être) seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2).

Remplacement

Ce projet a pour but d'évaluer l'impact du diabète induit sur l'appareil auditif chez deux souches de souris (étude fonctionnelle et histologique). Le modèle de diabète induit par la STZ fait référence dans la communauté scientifique. Du fait d’une grande similitude de la fonction auditive de la souris avec celle de l’homme, cette espèce a depuis longtemps été retenue dans notre équipe de recherche. Pour mieux caractériser l'impact du diabète sur l'audition d'un point de vue fonctionnel, les tests auditifs doivent être réalisés sur des animaux vivants. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal anesthésié, sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements dans de prochains projets.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au minimum, nous projetons d’employer les mêmes animaux diabétiques (n=20) et témoins (n=10) pour les tests fonctionnels auditifs et pour les analyses histologiques. Cependant, dans un premier temps, nous devons déterminer si une seule injection intra-péritonéale de 150mg/kg de streptozotocine induit un diabète chez la souche de souris CBA/J Rj (10 animaux). Pour cela, la glycémie (prélèvement sanguin caudal -1goutte par dosage – animal vigil légèrement contraint) des animaux traités par STZ sera évaluée quotidiennement sur 6 semaines pour déterminer le statut « diabétique » définitif des animaux (selon la souche). Les animaux seront euthanasiés dès statut «diabétique » confirmé (inhalation de CO2). L’étude statistique sera réalisée à l’aide d’un test de Student en comparant les valeurs obtenues de chaque groupe exposé avec les valeurs du groupe témoin pour chaque test fonctionnel aux différents temps du suivi.

Raffinement

Les animaux seront pesés et observés tous les jours (mobilité dans la cage et/ou immobilité, prostration, prise alimentaire). Le comportement général de l’animal, son apparence, la présence d’eau et de nourriture dans chaque cage seront surveillés quotidiennement (7j/7). Si besoin, les souris diabétiques recevront une injection sous-cutanée (s.c.) d’insuline (dissoute dans du sérum physiologique, 0,6UI/souris) tous les deux jours, afin de leur assurer un statut clinique satisfaisant et de limiter l’inconfort dû au diabète. Les explorations fonctionnelles seront effectuées sous anesthésie gazeuse. L’animal sera euthanasié s’il présente un des symptômes suivants : -une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, -une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), -l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…). En référence au document « points limites » (The reporting of clinical signs in laboratory animals), tout comportement de léchage excessif, d’autotomie, de prostration ou de vocalisation conduira à l’euthanasie rapide des animaux par inhalation gazeuse de CO2. Les animaux seront habitués à la zone d’expérimentation et aux expérimentateurs la semaine suivant leurs arrivées avant la réalisation des tests et des injections. C’est une procédure habituelle avant toute expérmentation.

Choix des espèces

La souris de souche CBA/J Rj est connue pour posséder une fonction auditive stable sur près de 2 ans. Les animaux utilisés sont âgés de 6 semaines à l'initiation des expérimentations (réception à l'âge de 5 semaines, 1 semaine d'habituation aux conditions d'hébergement). L'appareil auditif de la souris est mature à l'âge de 30 jours.

312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes de tumeurs murines ou humaines, sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine MIF dans la réponse à l'immunothérapie anticancéreuse. Le porteur indique que la croissance tumorale sera limitée à 300 mm2 pour les tumeurs solides et que les animaux seront tués lorsque les points limites seront atteints, celles qui n'y parviennent pas étant considérées comme "protégées" et tuées elles aussi. Il justifie le recours à la souris par l'impossibilité de reproduire fidèlement l'environnement tumoral et par l'accès aux modèles transgéniques et humanisés.

Objectifs

L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers avancés. Ces immunothérapies sont basées sur l’inhibition des points de contrôle immunitaires qui permet d’activer le système immunitaire et sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre la tumeur. Ce projet est dans la continuité de nos études précédentes au cours desquelles nous avons montré que l’une protéine du système immunitaire, appelée MIF, peut contrôler les réponses anticancéreuses de type immunitaire du patient. Ce projet comporte deux parties : 1) Évaluation de la qualité du système immunitaire dans un contexte d’immunothérapie bloquant les immuno-checkpoints chez des souris avec une expression plus ou moins forte de MIF. 2) Étude de l’efficacité anticancéreuse des cellules immunitaires humaines activées in vitro et injectées dans des souris porteuses de tumeurs humaines. Les résultats obtenus devraient donner des informations pour améliorer les immunothérapies en cancer.

Bénéfices attendus

La recherche qui est proposée dans ce projet a par objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant l’effet bénéfique de MIF dans l’activité des cellules T . Nos résultats ont démontré que la cytokine pro-inflammatoire MIF est essentielle pour la réponse à l’immunothérapie anti-PD-1 et l’immunothérapie par transfert adoptif en cancer. Nous avons aussi montré que cette réponse est potentiellement dépendante de l’expression élevée de MIF et que la basse expression de MIF pourrait avoir un effet délétère. Nous avons des agents thérapeutiques qui peuvent reverser l’effet d’une basse expression de MIF et potentiellement reverser l’effet délétère. Les résultats qui découleront de ce projet et permettront d'accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.

Procédures

Aucun prélèvement sera fait et non plus de procédures chirurgicales. Toutes les procédures seront réalisées lorsque les points limites seront atteints comme décris dans les procédures.

Impact sur les animaux

Les souris seront soit injectées avec des tumeurs murines (MC38,B16) dans les cas des souris 5CATT et 7CATT ou avec des tumeurs humaines (NALM6, Raji ou A549 ) pour les souris NSG. L’injection des tumeurs se fera sous anesthésie à l’isoflurane et la croissance tumorale ne dépassera jamais les 300 mm2 pour les tumeurs solides et plus de 25% des cellules tumorales dans le sang (~3 semaines) dans le cas des tumeurs sanguines.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, lorsque les points limites seront atteints, tous les animaux seront mis à mort. Lorsque l’effet thérapeutique est étudié, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront considérés protégés et seront mis à mort également par anesthésie à l’isoflurane et dislocation cervicale.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’importance de MIF dans notre modèle et le potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats nous devons passer dans un modèle de souris pour étudier notre hypothèse dans l’environnement tumorale

Réduction

Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une force statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon univarié en raison de la taille des groupes. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permettant d’avoir une réelle puissance statistique. Les expériences ne seront réalisées que deux fois et les rates, et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.

Raffinement

Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées tous les jours pour limiter leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolation du groupe, absence de toilettage). De plus les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également des points limites spécifiques seront appliqués. Ces mesures assureront le raffinement de l’étude

Choix des espèces

Il est impossible de nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique pour améliorer la maladie, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature

136 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses humaines dans la glande mammaire sous anesthésie, puis un gavage répété d'une molécule, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le projet cherche à établir un lien entre sénescence cellulaire et invasion tumorale, avec des retombées thérapeutiques renvoyées au long terme et à une "preuve de concept". Le porteur affirme qu'on ne peut pas recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier".

Objectifs

La sénescence cellulaire ou vieillissement cellulaire est associée à un arrêt de la croissance cellulaire. Le cancer est considéré le plus souvent comme une maladie du vieillissement. La transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) au cours de la cancérogenèse consiste à faire passer les cellules cancéreuses d’un état non agressif à un état agressif caractérisé par la capacité des cellules cancéreuses à se déplacer dans l’organisme et à former des métastases. La formation des métastases est responsable de 90% des décès des patients atteints de cancer. La sénescence et la TEM pourraient ainsi se produire dans les mêmes cellules cancéreuses, ce qui nous fait penser que la sénescence pourrait être un prérequis à la TEM. Notre projet vise à démontrer que la sénescence et la TEM peuvent se produire dans les mêmes cellules cancéreuses, à disséquer les régulateurs communs à ces deux processus, et à étudier si l'élimination des cellules en sénescence empêchera la TEM. Nous utiliserons différents types de cellules cancéreuses que nous cultiverons et que nous injecterons à la souris de façon à reproduire le développement d’un cancer dans un organisme entier. Les résultats obtenus seront validés à l'aide d'échantillons de cancers humains présentant une TEM. Différentes approches de biologie cellulaire seront utilisées pour manipuler la sénescence et la TEM.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet devraient établir fermement le lien entre la sénescence des cellules tumorales et la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), et fournir de nombreuses informations critiques sur le processus impliqué dans l'étape précoce de dissémination et d'invasion des cellules tumorales. Les travaux pourraient conduire à la découverte que la TEM et la sénescence cellulaire, pourraient être deux processus coexistant qui apparaissent et participent à une réponse biologique commune impliquée dans la dissémination et l'invasion précoces des cellules tumorales. La « preuve de concept » d'un lien direct entre la TEM et la sénescence cellulaire, aura un impact sur la biologie du cancer en reliant divers domaines d'investigation et en ouvrant de nouvelles voies de recherche. Ces travaux devraient également ouvrir la voie au développement de stratégies innovantes pour prévenir la progression précoce des tumeurs en ciblant la sénescence cellulaire. Les travaux devraient donc fournir des pistes prometteuses pour de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à prévenir ou à retarder la progression tumorale et les métastases, augmentant ainsi la durée de vie des patients atteints de cancer. Ce projet devrait donc permettre de décrypter le rôle de la sénescence dans la TEM. À long terme, cela pourrait aider à identifier des médicaments ciblant les cellules en sénescence pour bloquer l’agressivité d’un cancer et ainsi la formation des métastases. Comprendre comment les métastases se forment est un enjeu majeur de santé publique, et notre projet devrait apporter des éléments dans la compréhension de la formation des métastases.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - une injection unique de cellules cancéreuses humaines dans la glande mammaire sous anesthésie générale (10-12 minutes/animal) ; - un gavage d’une molécule (ou son solvant) qui intervient 3 semaines après l’injection des cellules à raison de 5j/7 ou 3j/7 durant 1 à 7 semaines selon les groupes de traitements (1 minute/animal). Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses nécessaires pour répondre à la question scientifique.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux peuvent être une inflammation au site d’injection des cellules tumorales, une détresse respiratoire lors de l’anesthésie de l’animal, un amaigrissement de l’animal ou une gêne de l’animal en raison du développement de la tumeur. Les traitements seront administrés par gavage pouvant induire un stress léger mais non traumatique.

Devenir

A l’issue des temps de traitement prévus, les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses nécessaires pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans la progression tumorale qui est au cœur de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Le modèle d’injection intraductale des cellules tumorales à la souris SCID reste un des meilleurs modèles à ce jour pour étudier spécifiquement l’invasion tumorale in vivo

Réduction

Le projet impliquera un total de 136 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique (test de comparaison des portions binomiales) a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation (surveillance quotidienne 7j/7, contrôle des températures/hygrométrie, nombre d’animaux par cage, etc.), les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nous travaillons avec des souris immunodéprimées car ces animaux acceptent la xénogreffe de cellules tumorales humaines et constituent des modèles validés pour l’étude la progression tumorale. Description du ou des modèle(s) : La souris SCID est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets d'anti-tumoraux sur des cellules humaines. Stade de développement : Les souris seront utilisées à 10 semaines d'âge après 1 à 2 semaines d’acclimatation au sein de l’établissement utilisateur. Cet âge est optimal pour notre étude. En effet, la formation des tumeurs in situ à 4 semaines et des tumeurs invasives à 10 semaines a été rapportée après injection intraductale des cellules tumorales mammaire à des souris SCID femelles âgées de 10 semaines.

210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation corporelle totale, une injection de cellules leucémiques ou de moelle humaine, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des cures de traitement injectées dans l'abdomen sur animal vigile, puis sont tuées pour analyser leur moelle osseuse. Le porteur indique que les souris porteuses de leucémie peuvent présenter des signes de souffrance selon la progression de la maladie. Il affirme que le modèle murin reste "indispensable", le contrôle d'une moelle saine traitée étant selon lui impossible à obtenir autrement.

Objectifs

Le génome silencieux (qui ne permet pas la production de protéines) représente plus de 50% du génome. Il est composé de fragments d’ADN capables de se déplacer dans le génome. Chez l’homme comme dans d’autres espèces animales, il est démontré que ces séquences peuvent interférer avec le génome codant pour des protéines avec un retentissement fonctionnel. Dans le cancer, les insertions de ces séquences dans des gènes suppresseurs de tumeurs peuvent être responsables de la cancérogénèse mais elles peuvent également interagir avec des séquences codantes de l’ADN pour produire de nouveaux antigènes (néoantigènes) spécifiques de la tumeur. Lorsqu’une séquence d’ADN ne doit pas être exprimée, la cellule le signale en marquant cette séquence avec une étiquette appelée méthylation. Ce phénomène de marquage est très présent sur le génome silencieux dans des maladies comme les leucémies aigues myéloïdes (LAM) limitant sa capacité d’interaction avec le reste du génome. A l’heure actuelle une partie des traitements utilisés dans ces maladies est connu pour avoir la capacité de retirer ce marquage. Notre hypothèse principale soutenue par des travaux préliminaires est que ces traitements pourraient favoriser l’interaction du génome silencieux avec le reste de l’ADN induisant des erreurs qui seraient faciles à repérer par le système immunitaire afin d’éliminer la maladie. L’objectif de ce projet est d’étudier de manière systématique l’expression du génome silencieux dans les leucémies aigues myéloïdes (LAM) soumis à un traitement. Il permettra tout d’abord une meilleure compréhension des mécanismes d’actions de ces traitements mais les erreurs favorisées par le traitement peuvent également constituer une source de cibles pour des thérapies spécifiques et contribuer à améliorer le pronostique effroyable de ces hémopathies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Sur le plan scientifique, il permettra la description fine des mécanismes d’action des traitements qui retirent les marquages sur l’expression du génome silencieux dans les LAM et permettra une comparaison à des moelles saines traitées, impossibles à obtenir en dehors du cadre murin. Il permettra également d’établir un modèle de souris atteintes de LAM d’origine humaine afin de pouvoir tester d’éventuels traitements spécifiques des cibles identifiées dans le cadre d’un autre projet. Sur le plan médical, il peut permettre la découverte de cibles thérapeutiques permettant l’amélioration du pronostic de ces hémopathies.

Procédures

Les souris seront soumises à une irradiation corporelle totale (1 fois) suivie d’une injection de cellules tumorales ou de moelle saine. Des prélèvements sanguins hebdomadaires seront réalisés sur une partie des animaux. Des traitements seront administrés aux autres animaux. Ces traitements seront injectés directement dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 5 jours consécutifs. Deux cures seront réalisées avec 2 jours de repos entre chaque cure. Tous ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles. Les gestes seront inférieurs à 2 minutes pour les injections/prélèvements. L’irradiation des animaux n’excédera pas 5 minutes au total

Impact sur les animaux

La réalisation des injections et prélèvements peut être source de douleur pour les animaux au moment de la piqûre. Les souris étant irradiées, le risque de toxicité en particulier digestive est présent avec une durée de quelques jours. Cependant, la dose d’irradiation étant faible, ce risque est très modéré. Les souris étant injectées avec des leucémies aigues myéloides, elles peuvent présenter des signes de souffrance dans le cas d’une progression de la leucémie.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expériences pour analyse post mortem de la composition de leur moelle osseuse

Remplacement

L’analyse transcriptomique sera au préalable réalisée sur les mêmes lignées de LAM traitées in vitro. Cependant, le contrôle nécessaire qui est celui d’une moelle saine traitée par les mêmes agents est impossible à obtenir en dehors de la souris, ce traitement n’étant administré qu’à des patients malades. Par ailleurs, ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement auquel est soumis la cellule tumorale. L’utilisation du modèle Souris reste donc indispensable pour le projet.

Réduction

Le nombre d’expériences et donc d’animaux utilisés seront réduits au minimum pour permettre la reproductibilité des phénomènes observés en assurant la puissance statistique nécessaire en tenant compte de la variabilité expérimentale du modèle employé. L’analyse statistique entre les différentes conditions s’appuiera sur l’étude de l’expression différentielle des gènes en utilisant des modèles de régression linéaires. Les organes hématopoïétiques (moelle osseuse et rate) seront analysés chez toutes les souris après mise à mort.

Raffinement

Les animaux seront suivis tous les 2/3jours afin d’assurer leur bien-être et pour monitorer les éventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des points-limites ont été établis et une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux.

Choix des espèces

Dans le cadre de notre projet, la souris est le modèle de choix pour ces expériences qui étudient la cancérogénèse et la recherche en thérapeutique du cancer. C’est la seule espèce présentant une souche exprimant les facteurs de croissances hématopoïétiques humains permettant une bonne prise de cellules myéloïdes à partir de moelle osseuse humaine saine dans un environnement médullaire proche de celui de l’être humain. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 12 semaines après la naissance). Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris sur la croissance tumorale.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour pendant dix jours un gavage ou une injection intrapéritonéale, subissent deux tests de tolérance au glucose, une coupure d'un à deux millimètres au bout de la queue et un prélèvement sanguin, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le projet vise à comprendre l'effet anti-hyperglycémiant de paraprobiotiques en vue d'un complément alimentaire pour l'homme. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "nécessaire", aucun modèle in vitro ne simulant selon lui les interactions entre organes qui règlent la glycémie.

Objectifs

Des résultats préliminaires ont mis en évidence un effet anti-hyperglycémiant de bactéries non pathogènes naturellement présentes dans l’intestin, inactivées par la chaleur (appelé paraprobiotiques) et d’un métabolite dérivé de la sérine (présent chez les bactéries et les plantes) dans un modèle in vivo de prédiabète induit par un régime riche en graisse mais également dans un modèle de souris saine. Un des objectifs de notre projet est de déterminer le mécanisme biologique impliqué dans cet effet anti-hyperglycémiant. Ce projet a pour objectif final le développement d’un complément alimentaire pour prévenir le prédiabète et ainsi le développement du diabète. Pour ce faire, plusieurs paraprobiotiques ainsi que des métabolites dérivés de la sérine seront administrées par gavage ou injection intrapéritonéale à un modèle de souris saines afin d’élucider le mécanisme d’action et les tissus cibles mis en jeu.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de determiner le mécanisme mis en jeu par les bactéries sélectionnées ou le métabolite bactérien dérivé de la sérine pour obtenir cet effet anti-hyperglycémiant. La mise en evidence de ce mécanisme est incluse dans un projet de maturation qui vise, à terme, à developper un complément alimentaire, pour l’homme, à partir de ces paraprobiotiques et/ou de ce métabolite. Ce complément alimentaire jouerait un rôle anti-hyperglycémiant au stade de pré-diabète et permettrait ainsi de prévenir le développement du diabète.

Procédures

Les animaux seront gavés ou recevront une injection en intra-péritonéale quotidiennement pour une durée totale de 10 jours (deux fois 5 jours). Les animaux seront soumis également à deux tests de tolérance au glucose (test de tolérance orale (gavage oro-gastrique du glucose, de quelques secondes) ou test de tolérance avec injection de glucose en intra-péritonéale (de quelques secondes). Pour ces tests de tolérance au glucose les souris subiront une petite coupure unique à l’extrémité de la queue de 1 à 2mm (1 seconde). Un prélèvement de sang sera effectué sur animaux vigiles, au niveau de la veine submandibulaire une seule fois avant de l’euthanasie (15 secondes). Les animaux seront mis à jeun des animaux avant les tests (6h) en période diurne.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress sur un temps très court (moins de 10 secondes) au cours de la contention nécessaire lors des gavages et à de l’injection en IP sur une période de 5 jours. Les gavages et l’IP seront réalisés par du personnel expérimenté. D’après les résultats préliminaires du laboratoire, ces gavages avec les différents composés n’induisent pas de perte de poids. Le poids des souris sera de plus contrôlé deux fois par semaine. Comme nous devrons mettre les souris à jeun avant les tests de tolérance orale au glucose, afin d’éviter une période de jeûne trop drastique, celui-ci ne sera pas réalisée durant la phase nocturne mais en phase diurne durant 6h.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin de chaque procédure et certains de leurs organes et tissus seront prélevés pour des analyses, ncessaires au projet.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les interactions inter-organes impliquées dans la régulation de la gycémie d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données obtenues à partir du sang (glycémie), des tissus du système digestif (l’intestin) et des organes internes impliqués dans la régulation des taux de glucose dans le sang (pancréas, foie et muscle).

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives (P value de 5% avec une puissance de 80%) compte-tenu de la variabilité connue du paramètre « glycémie » mesuré. De plus, nous avons fait le choix d’utiliser les mêmes groupes de souris contrôles et de souris traitées avec la metformine pour les deux expériences de la procédure 1 et le même groupe de souris contrôles pour les deux expériences de la procédure 2 afin de réduire le nombre d’animaux utilisés : au total 2 groupes de 12 souris contrôles et 2 groupes de12 souris traitées avec de la metformine sur les deux procédures = 48 souris au lieu de de 4 groupes de 12 souris contrôles et 4 groupes de souris 12 traitées avec de la metformine sur les deux procédures, soit 96 souris (nombre divisé par 2). Des études de biochimie sur des bactéries disponibles au laboratoire nous ont permis d’identifier des protéines de la surface des paroies bactériennes potentiellement intéressantes dans le contexte de la régulation de la glycémie (ces protéines ont des structures proches d’une autre protéine bactérienne connue pour ses effets améliorateurs de la glycémie). Ces protéines sont présentes sur huit souches d’intérêt (alors que nous disposons d’une collection de 40 souches donc cela nous a permis de réduire le nombre de paraprobiotiques à tester). Des points limites ont été définis pour chaque procédure.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, d’un bâton à ronger et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront surveillés 2 fois par semaine (surveillance visuelle plus suivi du poids). Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de deux jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limites entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie. Les souris seront 3 par cage pour éviter l'isolement et réduire le stress.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques en raison de ses réponses reproductibles due à une moins grande variabilité individuelle. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons choisi de travailler sur des animaux de 8-12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé et car nos données préliminaires ont été réalisées sur des animaux du même âge.