Oncologie

1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent, sous anesthésie, une injection de Staphylococcus aureus ou de sa toxine, avec des prélèvements de sang, pour tester si l'absence de cavéoline-1 aggrave l'infection. Le porteur indique que les souris peuvent montrer prostration, apathie, hérissement des poils, perte de plus de 20 % du poids et forte variation de température, et que les effets sont irréversibles. Il affirme que la perméabilité vasculaire au cours de l'infection ne peut être évaluée qu'en système intégré chez l'animal.

Objectifs

Staphylococcus aureus (S. aureus) est une bactérie fréquemment retrouvée dans le nez, le tractus respiratoire et la peau. Dans certaines conditions, S. aureus peut causer un grand nombre de maladies, allant des infections mineures comme des infections superficielles de la peau et des tissus mous jusqu’à des infections mortelles telles que le syndrome de choc toxique, la pneumonie, la septicémie et l'endocardite infectieuse. C'est toujours actuellement l'une des cinq causes les plus fréquentes d'infections acquises dans les hôpitaux et souvent la cause d'infections postopératoires. Chaque année, environ 750 000 patients dans les hôpitaux de France contractent une infection staphylococcique, soit environ 4 000 décès. Par conséquent, il est crucial de définir les facteurs de risque qui contribuent à l'invasion de l'hôte par S. aureus. Les toxines de S. aureus induisent la formation de pores à travers les cellules qui favorisent la perméabilité des vaisseaux sanguins et la dissémination de la bactérie dans les organes. La protéine cavéoline-1 est un régulateur critique qui limite la formation et l’élargissement de ces pores. La perte d’expression de la cavéoline-1 entraine un doublement du nombre de pores et leur élargissement d’un facteur 3. Ces résultats étant basés sur des études in vitro, l’objectif de notre étude est de démontrer que la perte d’expression de la cavéoline-1 chez l’animal est responsable d’une hyper-susceptibilité des animaux à l'infection par S. aureus.

Bénéfices attendus

Les travaux préalables ont permis de montrer un lien causal entre la formation des pores induits par S. aureus et la survenue de dysfonctions vasculaires (œdème, hémorragie et aggravation de l’infection). Ce projet doit permettre d’apporter un bénéfice à la compréhension de la formation des pores vasculaires et leur importance dans la régulation de la perméabilité vasculaire . Ceci aura en outre des retombées probables dans la compréhension de certaines formes de maladies vasculaires conduisant à des hémorragies spontanées sans diminution du nombre de plaquettes.

Procédures

L'injection des bactéries aura lieu une seule fois sur animaux anesthésiés (durée d'anesthésie 10 min). Des prélèvements sanguins à la queue seront effectués également après anesthésie et la souris maintenue endormie jusqu'à l'arrêt des saignements (anesthésie totale 15 min). Les expériences d'injection de colorant non toxique pour vérifier l'intégrité des vaisseaux seront effectuées sur animaux sous anesthésie, maintenue pendant 20 minutes, jusqu'au prélèvement de sang en aorte qui entraine l'arrêt cardiaque et respiratoire.

Impact sur les animaux

L’ensemble des résultats obtenus in vitro sur cellules concordent pour indiquer que la perte d’expression de la cavéoline-1 entraine une augmentation du nombre et du diamètre des pores cellulaires lors de l’intoxication par la toxine EDIN. On peut anticiper que si les effets in vitro sont reproduits chez l'animal, l'absence de cavéoline-1 devrait aggraver les symptomes lors de la bactériémie à S. aureus produisant l’EDIN-B. Les animaux pourraient ainsi montrer des signes d’hyper-susceptibilité à l’infection à travers l'augmentation de perméabilité vasculaire, manifestés par un phénotype caractéristique de prostration, immobilité, apathie, hérissement des poils ou/et perte de poids de plus de 20%. La multiplication des bactéries pourrait entrainer une modification importante de la température corporelle, soit une fièvre, soit une hypothermie en cas de choc septique. Par ailleurs, concernant les nuisances liées aux actes expérimentaux, les animaux vigiles seront soumis à des actes de contentions afin d'injecter un mélange anesthésiant. Toutes les autres manipulations seront effectuées sous anesthésie. Les prélèvements non terminaux à l'extrêmité de la queue seront effectués par section < à 0.5 mm et les souris réveillées une fois l'hémostase réalisée afin de minimiser les nuisances au réveil.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue du projet car les effets des bactéries et de la toxine sont irréversibles après l’injection et les animaux ne peuvent être ré-utilisés sous peine de créer des biais.

Remplacement

La cavéoline-1 est un gène de susceptibilité à la formation de pores transendothéliaux induits par l’EDIN-B, une toxine produite lors d'une infection par Staphylocoque. La formation de ces pores corrèle avec l’apparition de complications vasculaires. L’évaluation de la pathogénicité vasculaire de l’exotoxine EDIN-B en terme de perméabilité vasculaire au niveau des différents organes ne peut se faire que par une étude chez l’animal en système intégré.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux nous partirons de nos données antérieures sur l’infection bactérienne induite par Staphylococcus aureus. Pour limiter le nombre d’animaux engagés dans cette étude nous procèderons en étapes successives, la première étape étant la comparaison des sensibilités des souris contrôles ou présentant une absence de cavéoline-1 aux souches bactériennes exprimant ou non la toxine. Si une différence est présente, l'étape-2 servira à confirmer le rôle de la toxine Edin avec des souches mutantes contrôles. Enfin, la perméabilité vasculaire sera examinée après injection i.v. de la toxine EDIN purifiée. Les effectifs ont été calculés sur la base d'une analyse de puissance. Sachant que toutes les souris ne développent pas de bactériémie, pour un risque 5% et une puissance de 80%, nous avons calculé des effectifs de 30 animaux par groupe. Ceci correspond à une différence entre les groupes variant de 0.13 à 0.35, suffisante pour répondre à la question biologique.

Raffinement

Les points-limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance, et une surveillance quotidienne des animaux nous permettra de détecter au plus tôt ces points limites. Les souris sont maintenues dans leur groupe, qui aura été mis en place une semaine avant le démarrage des expériences. La cage est enrichie en jouets, et en frisure et coton à déchiqueter pour favoriser la nidation et maintenir la température en cas de refroidissement des animaux. De la nourriture sera systématiquement placée dans le fond de la cage avant le début de l'expérience, et aux premiers signes d'apatie on rajoutera de la nourriture gélifiée, plus apétante et hydratée.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour l'étude de l'infection par Staphylococcus aureus. C'est une espèce naturellement colonisée par S. aureus comme l'homme, qui développe des symptomes similaires à ce que l'on observe chez l'homme. De plus dans le cas de cette étude, il s'agit de déterminer le rôle de la cavéoline-1 dans le développement de l'infection, et l'utilisation des souris transgéniques invalidées pour la cavéoline-1, mâles et femelles, nous permettra d'obtenir des conclusions claires.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des antiviraux anti-VIH par gavage ou injection dans l'abdomen cinq jours par semaine, pendant huit à seize semaines, pour créer un modèle de vieillissement accéléré qui n'existe pas encore. Le porteur indique que le protocole peut provoquer perte de poids, chute de poils, lésions au site d'injection et altération de l'état général, et que les animaux trop atteints sont mis à mort. Il affirme que le vieillissement de l'organisme ne peut se réduire à des études in vitro et justifie ainsi le développement du modèle murin.

Objectifs

Le vieillissement est responsable de nombreuses pathologies (Cancer, diabète). De nombreux stimuli sont responsable d'un vieillissement accéléré. Plusieurs études ont montré que certains traitements médicamenteux peuvent induire des effets secondaires induisant un vieillissement accéléré. C'est le cas des antiviraux (notamment utilisées chez les patients atteints du VIH), qui en plus d'avoir des effets secondaires à court terme, accélèrent le vieillissement du sujet (niveau cardiovasculaire, osseux, ...). Toutefois aucun modèle animal de vieillissement accéléré via l'administration de ce type de molécules anti-VIH n'a alors été mis au point. Or cela permettrait de proposer des solutions thérapeutiques pour lutter contre ce vieillissement accéléré. Le but de ce protocole est (1) de mettre au point un modèle de vieillissement accéléré via l'administration d'antiviraux de type antiprotéase utilisés par les personnes atteintes notamment du VIH et (2) dans un second temps de tester des solutions pour éviter ce vieillissement accéléré. Dans cette seconde partie il y a un premier axe dans lequel l'effet de l'induction de la mort des cellules sénescentes sur le phénotype de vieillissement accéléré sera testé. Deux nouvelles molécules induisant la mort de cellules vieillissantes seront testées. Dans un second axe le rôle de gènes pro-vieillissement dans ce modèle sera testé. Cela permettrait alors de proposer des solutions thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le présent projet permettra dans un premier temps de mettre au point un nouveau modèle de vieillissement accéléré par administration d'antiviraux anti-VIH, modèle qui n'existe pas à l'heure actuelle et qui mimera ce qui se passe chez l'Homme. Cela permettra également de tester de nouvelles molécules pour voir si elles permettent la réversion de ce vieillissement accéléré et apporter des solutions thérapeutiques à ces patients afin d'améliorer leur confort de vie. De plus l'implication potentiel de gènes pro-vieillissement dans ce modèle pourra être mise en évidence. Les bénéfices attendus sont (1) la création d'un nouveau modèle animal qui n'a pas encore développer et (2) potentiellement l'identification de solutions thérapeutiques pour palier les effets secondaires du traitement du VIH avec les antiviraux.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à différents traitements, administrés soit par gavage (1 gavage par jour, pendant 5 jours, pour une durée de protocole pouvant aller de 8 semaines à 16 semaines maximum. La durée du geste par souris est estimé au maximum à une minute à chaque gavage) soit par injection intra-péritonéale (1 injection par jour, pendant 5 jours, pour une durée de protocole pouvant aller de 8 semaines à 16 semaines maximum. Depuis l'anesthésie locale à base de pommade à la lidocaïne à l'injection en elle-même, le temps est estimé à 5 minutes par souris à chaque fois. Cette durée tient compte du temps entre la pose de la pommade et l'injection pour que l'anesthésie soit effective). Un prélèvement d'urine pourra également être réalisé lors de la mise au point du protocole. Lors de la préhension de la souris on peut récolter de l'urine dans un tube. Le temps maximum entre la prise de l'animal et l'arrêt du prélèvement d'urine est estimé à 1 minute.

Impact sur les animaux

Nous allons développer un nouveau modèle de vieillissement accéléré, et de ce fait cela peut amener des phénotypes de type perte de poids, alopésie, altération de l'état général. C'est pour cela que les animaux inclus dans ce projet seront suivi très fréquemment afin de rapidement identifier ces effets indésirables et apporter des solutions pour les atténuer, et dans le cas où cela n'est pas possible les animaux seront alors mis à mort et sortis du protocole. Des nuisances peuvent également dues à la fréquence de traitement et/ou au mode d'injection. Nous testerons l'injection intra-péritonéale avec une fréquence d'injection de 5 fois par semaine. Nous serons alors vigilant sur la possible apparition de lésion au niveau de la zone d'injection. En cas d'apparition de ce type de lésion le traitement sera stoppé pendant 3 jours, la zone sera alors traitée avec de la Vétédine. En cas d'amélioration le traitement sera repris. En absence d'amélioration l'animal sera mis à mort. Pour palier à l'apparition de lésion au niveau du site d'injection nous chercherons à alterner tous les jours les sites d'injection. Il faut également noter que notre équipe a une expérience importante sur le suivi du vieillissement des animaux, que ce soit du vieillissement "physiologique" ou bien du vieillissement induit par un stress métabolique. Cela permettra une très bonne prise en charge des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les organes d'intérêt et réaliser les analyses nécessaires à l'étude.

Remplacement

La sénescence à l'échelle de la cellule peut être bien étudiée via des modèles in vitro. Ainsi des études préliminaires in vitro ont été réalisées en traitant des cellules primaires humaines de type fibroblastiques ou épithéliales avec des antiprotéases, à savoir le mélange Atazanavir et ritonavir (noté ATV/r). Nous avons alors pu montrer l'entrée en sénescence de ces cellules via les tests classiques comme la mise en évidence de l'activité de la Béta-Galactosidase à pH 6 (coloration bleue) dans les cellules sénescentes, l'arrêt de prolifération (comptage cellulaire), la forme des cellules, l'expression de marqueurs de sénescences comme p16, p21 par qRT-PCR et également la sécrétion de molécules dans le milieu de culture (dosage ELISA), spécifique des cellules sénescentes. Le vieillissement au niveau d'un organisme, qu'il soit du à l'âge ou à l'exposition à différents stress comme un stress métabolique, un stress chimique (ingestion de molécules ayant un effet à long terme), est le résultat d'un processus complexe. Son étude ne pouvant malheureusement pas se résumer à des études in vitro et être modélisé, elle nécessite donc l'utilisation de modèles animaux, comme le modèle murin, dans lesquels l'impact global pourra être visualisé. C'est pour cela que nous avons choisi de développer le modèle murin qui est l'objet de ce protocole expérimental.

Réduction

Pour minimiser le nombre d'animaux utilisés dans ce protocole la mise au point du modèle (procédure 1) sera réalisée séquentiellement. Plusieurs voies d'administration, plusieurs doses, deux temps seront testés. Si les premiers tests se révèlent concluant toutes les conditions ne seront pas testées. De plus si la procédure 1 ne permet pas de mettre au point le modèle de vieillissement accéléré alors les procédures 2 et 3 ne seront pas réalisées. C'est pour cela que c'est le nombre maximal d'animaux qui est donné et le nombre d'animaux réellement utilisés pourra être inférieur. Dans la procédure 1 la mise au point du modèle ne nécessite pas d'étude statistique, c'est pour cela qu'il y aura 5 souris par groupe. Dans les procédures 2 et 3 des tests statistiques seront réalisés, c'est pour cela qu'il y a 10 souris par groupe. Enfin pour visualiser l'effet sexe des mâles et des femelles seront utilisées. Cela permettra d'éviter de relancer d'autres protocoles pour vérifier le biais lié au sexe et cela renforcera l'analyse statistique de cette étude.

Raffinement

La grande expérience des équipes qui gèrent les protocoles de vieillissement est un gage quant à la garantie du suivi du bien-être animal. Une surveillance adaptée et individuelle des animauix afin de s'assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance est mise en place. L'apparition de signes évocateurs de souffrance, de mal-être comme la prostation, un comportement erratique ou une altération de l'état général de la souris permettra rapidement, en fonction de la gravité des observations, de procéder soit à une prise en charge de l'animal (traitement antalgique) soit à la mise à mort de l'animal concerné. En cas de traitement avec un antalgique de la brupénorphine à la dose de 0,05 mg/Kg sera administrée quotidiennement, pendant 3 jours. En absence d'amélioration après 3 jours de traitement l'animal concerné sera mis à mort. Pour les injections intra-péritonéales, pour éviter le stress d'une anesthésie générale à l'animal, une anesthésie locale du site d'injection avec une pommade à base de lidocaïne quelques secondes avant l'injection sera réalisée. Pour éviter également d'injecter plusieurs jours de suite au même niveau sur l'abdomen de la souris le site d'injection sera modifié tous les jours en alternant entre le haut et le bas de l'abdomen et entre le côté droit et le côté gauche de l'animal.

Choix des espèces

La souris est un animal très utilisé dans les modèles de vieillissement induit par des stress comme le stress métabolique notamment. En effet on peut alors voir l'impact de ce vieillissement au niveau des différents organes de la souris. De plus la souris est un modèle de prédilection dans la réalisation de modèle transgénique avec notamment la perte d'expression de nombreux gènes. Nous pourrons alors utiliser ces modèles transgéniques au sein de notre protocole de vieillissement accéléré et valider ou non l'implication de gènes d'intérêt dans le phénotype observé. Les expérimentations seront réalisées chez des souris adultes d'environ 5 mois. Chez l'Homme les observations initiales à l'origine de notre protocole ont été faites avec des patients âgés en moyenne de 30 à 40 ans. De plus à 5 mois la prise de poids des souris n'est plus très importante, ce qui permet d'avoir un poids plus stable en début d'expérimentation. Cela sera plus simple pour évaluer la perte de poids en cas de douleur chez la souris. Enfin ces animaux auront atteint la maturité, notamment au niveau du système immunitaire et hormonal.

100 chèvres vont être utilisées, réutilisées ensuite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un implant sous-cutané et une injection de lipopolysaccharide dans la jugulaire pour déclencher une inflammation qui imite une mammite, avec une fièvre attendue d'environ deux degrés, suivie de onze prises de sang. Le porteur relie ces travaux à la "capacité d'adaptation" dégradée par la sélection sur la production et vise à terme des animaux "plus résilients, productifs et en bonne santé". Il affirme que la réponse inflammatoire du ruminant ne peut être étudiée qu'in vivo.

Objectifs

L’objectif principal du projet est d’évaluer les capacités d’adaptation des chèvres à une épreuve inflammatoire, en lien avec leur génotype. Dans le cadre du projet nous produisons et utilisons des chèvres laitières de race Alpine, issues d’une sélection divergente sur le caractère de longévité fonctionnelle (chèvres de génotype Longévité élevée (LGV+) et chèvres de génotype Longévité faible (LGV-). L'ensemble des chèvres est génotypé et caractérisé sur des caractères de croissance, de métabolisme énergétique, de production de lait, de santé et de réponse à des épreuves nutritionnelles afin de mieux comprendre les déterminants de la capacité d'adaptation des chèvres à une épreuve transitoire nutritionnelle. Dans cet avenant, nous proposons de réaliser une épreuve inflammatoire transitoire sur un sous ensemble de 2 groupes chèvres LGV+ et LGV- de ce dispositif afin d’élargir le concept d’adaptation à la réponse anti-infectieuse en relation avec le génotype. En effet, la santé des animaux d’élevage fait partie intégrante de leur capacité d’adaptation et de leur bien-être. Les mammites, en particulier, représentent la maladie infectieuse majeure chez les ruminants laitiers. Pour ce faire, nous proposons une épreuve inflammatoire par voie générale à base de Lipopolysaccharide (LPS), un composé non infectieux d’origine bactérienne permettant de mimer une inflammation de type mammite afin de doser les cytokines circulantes et caractériser la cinétique de réponse suite à cette stimulation.

Bénéfices attendus

La capacité d'adaptation est une caractéristique qui a été dégradée, chez les animaux de rente, par la sélection pour des niveaux de production élevés. Ce qui a eu des conséquences négatives sur la santé, la reproduction, et la longévité de ces animaux et par conséquent a impacté l'efficacité de production. Les causes du déclin de la capacité d'adaptation sont majoritairement inconnues. La capacité d'adaptation d'un animal est due à des mécanismes adaptatifs opérant à différents niveaux d'organisation physiologique. Ils sont en partie sous le contrôle des conditions d’élevage et de nutrition, du statut physiologique de l’animal, mais aussi de son patrimoine génétique. Nous savons, en particulier, que la longévité fonctionnelle, qui traduit des mécanismes d’adaptation des adultes, est partiellement contrôlé par la génétique. Ce projet doit permettre de mieux comprendre le rôle de la génétique sur les capacités d'adaptation des chèvres adultes. A court terme (durée du projet), il doit permettre de valider l’utilisation d’un ensemble de cytokines sanguines pour caractériser la résilience de la chèvre, dans le cadre d’une épreuve in vivo par du LPS (mimant une mammite). Si cette étape est concluante, cela permettra de tester une procédure équivalente, in vitro, à partir de simples prélèvements sanguins (sans épreuve LPS). A plus long terme, ce phénotypage pourra être utilisé, le cas échéant, pour sélèctionner des animaux plus résilients, productifs et en bonne santé, afin de garantir la durabilité de l’élevage caprin.

Procédures

Les animaux seront soumis à la pose d’un implant sous cutané après contention pour la mesure de la température interne de l’animal. Réalisée une seule fois sur chacune des 100 chèvres du projet. Utilisation d’une seringue à usage unique qui contient l’implant à injecter (de la grosseur d’un grain de riz). Ensuite les chèvres se verront injecter des lipopolysaccharide (LPS : Escherichia coli ultrapur) réalisée au niveau du cou dans la veine jugulaire. Réalisée une seule fois sur chacune des 100 chèvres du projet. Enfin des prélèvements de sang seront effectués à l’aide d’une aiguille montée sur un prolongateur à partir de ponctions à la veine jugulaire. Pour la collecte de 11 tubes (volumes de 4ml) maximum pour chacune des 100 chèvres du projet : 1 prélèvement de 4 ml toutes les deux heures avant l’épreuve (J-1), puis toutes les deux heures entre l’injection de LPS et jusqu’à 12h, et ensuite une fois par jour jusqu’à 72heures. Soit un volume total inférieur à 50mL correspondant à moins de 1% du volume sanguin total de l’animal.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous réalisons des prises de sang et la pose d’un implant sous cutané pour le suivi de la température. Les chèvres peuvent éprouver un stress léger lors des contentions nécessaires pour les prises de sang et la pose de l’implant. Une douleur et une inflammation transitoires peuvent apparaitre lors de la pose des implants sous cutanés. Une eventuelle nuisance serait l'apparition d'hematome suite aux prises de sang. Par ailleurs, nous proposons dans ce projet une épreuve inflammatoire par voie générale à base de Lipopolysaccharide (LPS), un composé non infectieux d’origine bactérienne permettant de mimer une inflammation de type mammite, s. Dans une expérience préalable réalisée sur un petit effectif, l’injection par voie générale (0,5 µg/kg poids vif), de LPS a permis de déclencher une réaction inflammatoire des chèvres qui s'est accompagnée d’une élévation de température réctale moyenne de +1,9°C entre +3 et +6 heures après l'épreuve. Le retour à l’état normal (température et fréquence respiratoire) s’observe entre 12 et 48 heures après l’injection. Ainsi il est attendu que les chèvres impliquées dans cette procédure auront recouvré leur état antérieur de santé à la fin de l’essai. Les nuisances eventuellles en lien avec l'injection de LPS pourraient être une fièvre >40°C, un décubitus prolongé, une perte de poids et efin impliquer une prostration, une cachexie ou alopecie.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie Aucune mise à mort n’est prévue, car les chèvres auront recouvré leur état antérieur de santé à la fin de l’essai. Dans le cas, peu probable, d’atteinte des points limites, la mise à mort sera opérée par le vétérinaire sanitaire soit en urgence par un opérateur expérimenté et habilité de la structure, à l’aide d’un matador et suivi d’une saignée. Les animaux pourront être réutilisés selon l’avis du vétérinaire sanitaire.

Remplacement

La réponse anti inflammatoire du ruminant laitier implique des modifications biologiques complexes, qui incluent également leur impact sur la production de lait et le métabolisme énergétique qui nous intéressent ici et qui donc ne peuvent être étudiés qu’in vivo.

Réduction

Le nombre d’individus a été défini afin de pouvoir évaluer la réponse à l’épreuve inflammatoire en interaction avec le génotype de la chèvre. Dans l'esprit des 3R, nous avions proposé initialement d’évaluer 80 chèvres primipares, car les données d’héritabilité (h²) des réponses immunitaires etaient élevées dans la littérature . Ces heritabilités sont en moyenne plus de 3 fois supérieures à celle de la longévité (h²=0.08 en race Alpine). Les analyses préliminaires (n = 96 chèvres des cohortes 1 et 2) du projet ont montré que le Beta Hydroxy Butyrate plasmatique du sang discrimine les génotypes longévité. Toutefois, une étude récente dans l’espèce bovine, utilisant le dosage de cytokines après stimulation par LPS montre des héritabilités plus faibles (0.07 à 0.15 dans de nombreux cas, et aucune h²>0.15). Ainsi, afin d’atteindre la puissance statistique espérée, nous proposons donc d’augmenter l’effectif total de 20 chèvres, soit 100 chèvres évaluées au total.

Raffinement

Les chèvres seront hébergées en groupe, sur litière paillée. L’utilisation d’un composé non infectieux pour le déclenchement de l’inflammation réduit l’intensité de l’inflammation et permet de mimer les premières étapes d’une vraie infection. Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention manuelle minimale, les animaux étant habitués à être manipulés par les opérateurs de la structure. Les chèvres feront l’objet d’une surveillance accrue pendant toute la durée du protocole, selon une grille permettant d’évaluer la température, le poids, le comportement alimentaire, l’anorexie, la présence d’un décubitus latéral et l’apparition de comportements anormaux. Un score sera donné par animal et si il est superieur à 2 alors il est sorti de l'experimentation. La mise en place des implants sous cutané pour le suivi de la température sera réalisée par des opérateurs expérimentés et habilités (animaliers), qui côtoient ces animaux quotidiennement. Un baume décongestionnant, antiseptique et cicatrisant sera appliqué en massage sur la zone concernée après mise en place de l’implant. Ces implants permettent donc de relever automatiquement la température et de supprimer les prises de température par voie transrectale. Un traitement en cas d'hyperthermie prolongée est administré. En cas de non recouvrement de l'etat , une euthanasie sera realisée.

Choix des espèces

L’espèce caprine est l’espèce cible. La physiologie et la réponse immunitaire des ruminants sont particulières à ces espèces. Le choix est d'étudier des chèvres primipares non gestantes en lactation.

1 430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles subissent des régimes gras ou déficients pendant une à seize semaines, des prélèvements répétés, un gavage ou une injection, pour étudier une protéine des macrophages dans l'obésité et le diabète de type 2. Le porteur indique que les souris privées de la protéine peuvent développer des lésions cutanées et que celles au régime déficient sont surveillées pour ne pas dépasser 20 % de perte de poids. Il conclut que les cultures cellulaires ne donnent pas un modèle physiologique d'obésité et que la souris est "nécessaire", en vue d'une éventuelle approche thérapeutique chez l'humain.

Objectifs

Le diabète ainsi que l’accumulation de graisse dans un organisme peuvent provoquer une cascade de réactions immunitaires. Ces dernières sont connues comme étant déterminantes dans la survenue d’un diabète de type 2 et les nombreuses complications associées à cette maladie. Les mécanismes impliqués commencent à être connus. Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un modulateur du système immunitaire susceptible d’être impliqué.

Bénéfices attendus

Nous devrions démontrer l'importance de ce modulateur dans la maladie du diabète de type 2 et dans ses complications. Ce projet de recherche fondamental a pour objectif de définir les conséquences que pourrait provoquer l'absence de cette protéine, uniquement dans les macrophages, et donc de comprendre son rôle dans l’inflammation et la régulation du glucose chez des souris. A terme, influencer l'activité de cette protéine pourrait être proposé comme une nouvelle approche thérapeutique chez l'Homme pour contrôler l'inflammation afin d'atténuer le risque de diabète de type 2 et de stéatose hépatique.

Procédures

Selon les groupes, les animaux seront soumis à différents types d'alimentation sur des durées comprises entre 1 et 16 semaines et à des prélèvements répétés (entre 2 et 9 prélèvements par souris) espacés de 2 semaines et qui durent chacun 30 secondes. En fin d’expérience, les animaux subiront une mise à jeun de 16h ou 6h et un gavage ou une injection (10 secondes chacun) suivi de 6 prélèvements de sang. Un groupe d’animaux recevra l’injection d’une molécule pour pouvoir accumuler et récupérer les cellules d’intérêts pour le projet. Cette injection aura lieu une seule fois et durera 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux ne possédant pas la protéine étudiée (uniquement dans les macrophages) peuvent être amenés à développer des plaies au niveau du dos à partir de l'âge de 6 mois : perte de poil et lésions cutanées. Pour cette raison aucun animal ne sera étudié au delà de l'âge de 6 mois, de cette façon nous évitons l'apparition éventuelle de ces plaies. Les animaux placés sous régimes enrichis en lipides vont prendre du poids tout au long des semaines de régime et vont devenir un peu moins actifs. Les souris placées sous régime décifient vont perdre du poids, elles seront surveillées de près pour ne pas qu'elles dépassent une perte de poids de 20%.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de leur procédure afin de prélever différents organes pour les analyser. Nous pourrons ainsi étudier les altérations du foie, des tissus graisseux, et du pancréas par différentes techniques permettant des observations précises au niveau cellulaire, génomique ou protéique et ce afin de bien décrire le processus de la maladie et notamment le rôle de la protéine que nous étudions.

Remplacement

Ce sont des études in vitro, elles même appuyées sur des données issues de cohortes de patients, qui ont déterminé le choix de cette protéine à étudier. Cependant, les études in vitro seules, comme les cultures cellulaires, ne permettent pas d'obtenir un modèle physiologique d'obésité, d'homéostasie glucidique et de stéatose hépatique. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour évaluer in vivo l’effet de l'absence de notre protéine d'intérêt au niveau des macrophages, mais également pour définir la réponse globale d’un animal face à la maladie (obésité, diabète, athérosclérose, stéatose hépathique modérée ou majeure).

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé est de 1430. Afin de limiter le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons développé́ des protocoles permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même animal, comme par exemple l'évaluation de la tolérance au glucose et l’évaluation de la sensibilité à l’insuline successivement. De plus afin de réduire le nombre d'animaux, le groupe contrôle (régime non enrichi ou déficient) servira de comparaison aux cinq types d'alimentation. Pour chaque condition (type d'alimentation et durée), des groupes de 80 souris seront générés (40 qui possèdent la protéine étudiée et 40 qui n'en possèdent pas dans les macrophages), il s'agit du nombre minimal d'individus nécessaire pour analyser correctement les résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés sur des portoirs ventilés et ont un accès libre et illimité à l'eau et la nourriture. Les conditions de température et d'humidité sont contrôlées et monitorées tous les jours pour qu'elles soient optimales pour les souris. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h), les souris étant des animaux nocturnes une période importante d'obscurité est indispensable à leur bien-être. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum, en effet la souris est un animal grégaire, la vie en groupe est un facteur important pour son bien-être. Si, pour des raisons de protocole, une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté. Pour s’assurer du confort des souris, elles bénéficieront de coton et de «maisons» afin de les occuper et qu’elles puissent se construire un « nid ». Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l'équipe professionnelle de zootechnie. En ce qui concerne les procédures expérimentales nous avons mis en place des fiches de suivi permettant la prise en compte de différents facteurs visibles chez l'animal révélant son bien-être (évolution du poids, comportement, aspect physique). Nous avons également veillé à ce que le matériel soit adapté pour les prélèvement ou l'administration. Nous avons également mis en place des mesures en vue de réduire au maximum les douleurs pouvant être dues aux prélèvements (mise sous anesthésie ou application d'une solution antiseptique).

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence dans l'étude de l'obésité et du diabète, en effet les gènes impliqués dans l’obésité et le diabète (dont les gènes de l'inflammation chronique) jusqu’à présent identifiés sont très proches chez la souris et chez l’Homme. De plus la souris est un modèle permettant l'obtention relativement rapide du nombre d'individus suffisant et que nous sommes en capacité d'héberger dans des conditions (surface, température, luminosité) nécessaires à son bien-être. La souris est également un modèle pour lequel il existe beaucoup d’outils disponibles : modification du génome pour créer les meilleurs modèles d'études possible, méthodes n'analyses des tissus prélevés, etc. L'ensemble de ces critères font de la souris le modèle optimal pour répondre aux questions du présent projet. Nous avons choisi de commencer les études sur des souris qui ont entre 8 et 10 semaines. Cela correspond à la maturité sexuelle (stabilisation hormonale) et équivaut à l'entrée dans l'âge adulte chez l'Homme.

2 500 rongeurs, 2 000 souris et 500 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur une plateforme d'irradiation ouverte à d'autres équipes. Chaque animal reçoit une ou plusieurs séances d'irradiation sous anesthésie, puis retourne dans son animalerie d'origine, son sort final dépendant du projet qui l'utilise. Le porteur indique que l'irradiation d'une tumeur peut entraîner des nécroses et que l'irradiation du corps entier peut provoquer des douleurs à long terme. Il affirme que le recours à l'animal reste "essentiel" malgré des cultures cellulaires en 2D ou 3D, et justifie le nombre d'animaux par le seul "minimum nécessaire pour assurer une étude statistique".

Objectifs

La radiothérapie est un traitement localisé qui consiste à utiliser des radiations pour détruire les cellules cancéreuses. Les dommages induits par les rayonnements vont bloquer la prolifération cellulaire, tout en préservant le plus possible les zones périphériques saines. A l’heure actuelle, elle est utilisée seule ou en combinaison avec la chirurgie et/ou la chimiothérapie et concerne aujourd’hui 60% des traitements contre le cancer. Ainsi, la radiothérapie représente une technique nécessaire aux équipes de recherche travaillant dans le domaine de la cancérologie pour la compréhension des mécanismes biologiques en jeux et l’amélioration des traitements. Ce projet a pour objectif de permettre l’accès à un équipement de radiothérapie dédié au rongeurs à la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans la recherche thérapeutique utilisant l’irradiation pour mieux comprendre les mécanismes en jeux et/ou pour le développement de nouveaux traitements. Ce projet s’inscrit de ce fait dans une volonté de faire progresser les connaissances sur le développement tumoral ainsi que d’améliorer le traitement des patients en augmentant ainsi aussi bien la qualité de vie que leur survie.

Procédures

L’ensemble des animaux sera soumis à une ou plusieurs séances d’irradiation sous anesthésie générale. La durée de l’irradiation avec mise en place, irradiation et retour dans la cage prendra au maximum 30 minutes. L’anesthésie générale durera au maximum 20 minutes et l’irradiation au maximum 15 minutes. Chaque session aura une durée courte et pourra être réitérée au maximum deux fois par jour sur une durée de 1 jour à plusieurs semaines.

Impact sur les animaux

L’irradiation n’induit pas d’effets indésirables directs. Néanmoins, l’irradiation de tumeurs peut induire des nécroses suite à l’évolution de la croissance tumorale post-traitement et l’irradiation totale d’un animal peut aussi induire des douleurs à long terme.

Devenir

Après irradiation chaque animal retournera dans son animalerie d'appartenance. L'issue finale des animaux dépendra de chaque projet et sera détaillée dans chacune des procédures expérimentales présentées dans les demandes de projet.

Remplacement

Nous tacherons dans la mesure du possible d’utiliser des cultures cellulaires en 2D ou 3D (sphéroïdes et organoïdes). Néanmoins, il est nécessaire de valider les résultats obtenus in vivo afin de prendre en compte toute la complexité du vivant et avant de pouvoir faire l’objet d’essai clinique sur l’homme. Ainsi, le recours à l’animal s’avère essentiel pour avancer dans la validation de nouveaux traitements.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est établi afin de correspondre au minimum nécessaire pour assurer une étude statistique.

Raffinement

L’irradiation n’induit pas de souffrance ni de douleur à l’animal pendant et directement après. Les séances d’irradiation seront réalisées sous anesthésie générale de l’animal avec maintien de leur température corporelle. La durée de l’irradiation prendra de 5 à 30 minutes maximum. De l’onguent ophtalmique sera déposé sur les yeux pour éviter leur dessèchement. En cas d’irradiation ciblée, l’animal sera protégé par un bouclier adapté en fonction de la zone à irradier. La structure en charge du bien-être animal accompagnera chaque projet séparément dans sa mise en œuvre avec les conseils du vétérinaire désigné qui prendra les dispositions nécessaires au maintien du bien-être des animaux. Si un animal (rat ou souris) venait à montrer des signes de problèmes respiratoires, il pourrait être euthanasié sur site. Cette procédure ne sera réalisée qu’après accord du porteur du projet.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Sa petite taille, sa prolificité, les facilités zootechniques, les risques sanitaires moindres et une littérature abondante sont autant d’arguments complémentaires en faveur du choix de cette espèce. Le rat est une alternative à l’utilisation de la souris de par sa taille permettant d’atteindre une maturité de tumeur plus importante nécessaire dans certaines études. Nous utiliserons des rongeurs à différents stades de développement pour couvrir le plus largement les situations rencontrées dans les services cliniques.

75 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections dans le cerveau d'un virus puis de cellules de gliome, avant des enregistrements optiques sous anesthésie sans réveil, pour tester la faisabilité d'une méthode d'imagerie calcique. Le porteur présente cette étude pilote comme un moyen de réduire à terme le nombre d'animaux en remplaçant l'électrophysiologie, et indique que les souris sont tuées par perfusion intracardiaque ou décapitation sous anesthésie pour prélever le cerveau. Il précise avoir privilégié, quand c'était possible, des approches ex vivo sur tranches de cerveau.

Objectifs

L'objectif du projet est la mise en place d'une approche expérimentale, l'imagerie calcique par photométrie in vivo pour évaluer les dommages fonctionnels occasionnés au sein de la substance blanche par la présence de cellules de gliome. Ce projet a donc pour objet de valider la faisabilité d’une nouvelle approche expérimentale dans cette thématique. A terme, cette technique devrait donc améliorer nos connaissances sur les interactions neurones-cellules de gliome dans la substance blanche. La photométrie à fibre optique (fiber photometry) désigne une méthode d’imagerie in vivo basée sur l’utilisation de fibres optiques de diamètres modérées (de quelques dizaines à quelques centaines de µm de diamètre), généralement implantées stéréotaxiquement dans des régions cérébrales d’intérêt. c'est une technique qui s'enligne dans la règle des 3R, puisqu'à terme, cette approche permettra de faire de l'imagerie in vivo, sur plusieurs semaines. Cette imagerie permet donc de faire de l’imagerie en profondeur et s’avère être une technique de choix pour beaucoup de chercheurs dans le domaine des neurosciences, en raison de sa simplicité relative comparée à d’autres techniques d’enregistrement in vivo (notamment l’électrophysiologie), de son rapport signal/bruit élevé et de son prix modéré. Les questions de ce projet sont les suivantes : peut-on utiliser cette approche pour monitorer l'activité des axones, dans les faisceaux de substance blanche ? Si c'est le cas, sera-t-il possible de détecter des changements d’activité neuronale dans les zones infiltrées ? L'objectif de ce projet est d'évaluer dans une étude pilote, la faisabilité de cette approche, par une étude in vivo sur souris anesthésiées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de deux ordres. 1 - d'un point de vue scientifique : Ce projet est un projet pilote pour évaluer la faisabilité d'une technique. Une fois validé, il sera possible d'utiliser cette technique pour de monitorer l’activité d'axones dans la substance blanche dans un contexte physiopathologique et de mettre en évidence d'éventuels changements d’activité au sein de la substance blanche dans les zones d’infiltration, sur plusieurs semaines. 2 - d'un point de vue éthique : cette nouvelle approche constituerait une technique alternative à d’autres techniques d’enregistrement in vivo telles que l’électrophysiologie in vivo (plus chères, plus longues à mettre en oeuvre et à maitriser pour les étudiants, nécessitant de fait plus d'animaux) et s'intègre donc ici dans la règle des 3R, puisque nous permettrait à terme de réduire le nombre d’animaux, dans certains aspects du projet.

Procédures

75 souris subiront des procédures chirurgicales sous anesthésie et analgésie (procédure 1, durée : 23-30 min), pour l'injection stéréotaxique d'AAV ou de cellules tumorales. Parmi ces souris, 5 subiront une perfusion intracardiaque de PBS puis PFA 4% pour le prélèvement de cerveau à des fins histologiques (procédure 2, durée 20 min). Parmi ces souris, 10 subiront une euthanasie par décapitation sous anesthésie, à des fins de prélèvements de tissus pour des expériences ex vivo (pas de procédure, durée : 1 min). Parmi ces souris, 60 souris seront soumis à des expériences sous anesthésie/analgésie pour des enregistrements aigus de photométrie in vivo (procédure 3, sans réveil, durée : entre 2 et 6 h)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, certaines souris seront soumises à deux procédures chirurgicales stéréotaxiques sous anesthésie et sous analgésie (Procédure décrite dans la procédure numérotée 1, avec l'injection stéréotaxique d’AAV suivie quelques semaines plus tard d’une injection de cellules tumorales), ainsi qu’à deux procédures sous anesthésie et analgésie, sans réveil (Procédure décrite dans la procédure numérotée 2 , pour la mise à mort en vue de prélèvements de tissus fixés au formaldhéhyde, et dans la procédure numérotée 3, pour l'enregistrement par imagerie calcique in vivo). Ainsi, une attention particulière devra être apportée à l'utilisation adéquate des analgésiques et anesthésiques, et à la surveillance post-opératoire en aval des deux chirurgies (voir dans la procédure 1, la section "méthodes pour supprimer la douleur, la souffrance et l'angoisse" , dans le paragraphe "SUIVI DES ANIMAUX").

Devenir

Les animaux étant soumis à la procédure 1 (" Injections stéréotaxiques cérébrales répétées sur souris adultes, sous anesthésie et sous analgésie") seront maintenu en vie, puis apres quelques semaines seront soumis à des procédures sans réveil : soit la procédure 2 ("mise à mort de souris adultes en vue de prélèvement de tissu fixés au formaldéhyde), soit la procédure 3 ("enregistrement calcique sous anesthésie et analgésie), soit seront décapités sous anesthésie (isoflurane 5%) afin de prélever les tissus cérébraux et effectuer des expériences ex vivo.

Remplacement

Quand cela a été possible et justifié, l'utilisation d'approches ex vivo a été privilégiée dans ce projet. Elle permettra de limiter le nombre d'expériences in vivo à son maximum. Il s'agit d'approches sur tranches de cerveau de souris (perfusées avec du liquide de survie, de l'oxygène. Il s'agit de tranches aigues ou organotypiques) pour évaluer ex vivo l'activité calcique dans les soma et axones des neurones, au sein des tissus.

Réduction

La réduction est un objectif final phare de ce projet de recherche. En effet, il s’agit d’une étude pilote (réalisés sur un nombre réduit d’animaux, sur deux ans), pour évaluer la faisabilité d’une approche expérimentale pour le bénéfice d’un plus large projet de recherche sur le glioblastome. Si la photométrie in vivo permettait effectivement d’évaluer l’activité des axones par imagerie calcique, alors elle pourra être utilisée au sein du laboratoire, pour des enregistrements sur plusieurs semaines, chez un même animal - permettant ainsi de cumuler de nombreux résultats avec un seul animal – et servira d’alternatives dans certaines expériences, à d’autres approches in vivo comme l’électrophysiologie. Au sein même du projet, le nombre de souris a été réduite au minimum, et a été conçu pour permettre une recherche « pas à pas ». Si la première partie du projet n’est pas validée (validation sur des souris naÏves) alors la deuxième partie n’aurait pas lieu. De plus, ce projet est un projet pilote, utilisé pour évaluer, par évaluation de la puissance statistique a posteriori, le nombre minimum de souris nécessaire pour évaluer l’excitabilité et les changements d’excitabilité axonales chez la souris, par photométrie in vivo.

Raffinement

HEBERGEMENT AVEC ENRICHISSEMENT : les animaux sont hébergés en groupe dans les conditions réglementaires, nourris et abreuvés ad libitum selon un rythme nycthéméral de 12h/12h, à 22°C, avec un enrichissement dans chaque cage, pour leur permettre de faire des nids. SURVEILLANCE QUOTIDIENNE POUR EVALUER DES POINTS D ARRETS ANTICIPES : Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement afin de déceler des signes précoces de stress ou de douleur. Après toute chirurgie, les animaux seront en plus pesés pour détecter des pertes de poids anormales (révélateurs de douleur et/ou stress éventuels). Les expériences et le suivi des animaux seront réalisés par du personnel expérimenté. UTILISATION D UN ANIMAL POUR PLUSIEURS PROCEDURES : Lors que cela est possible et justifié, un même animal sera utilisé à plusieurs fins. TRAVAIL DE PAIR AVEC LE RESPONSABLE DE L ANIMALERIE : pour optimiser Les doses d’anesthésie et d’analgésie nécessaires.

Choix des espèces

La progression des cellules tumorales dans l'organisme dépend d'une part des propriétés intrinsèques des cellules tumorales mais aussi de l'environnement spécifique dans lequel la tumeur évolue. Il est donc essentiel de pouvoir étudier les cellules tumorales dans leur environnement immédiat, par le biais de greffes orthotopiques. Des souris Nude et/ou C57BL6 seront utilisées respectivement pour la greffe de lignées tumorale humaine (GMB-Hum) et la greffe de lignée tumorale murine (GMB-Murin). L'utilisation de souris Nude permet l'étude de lignées de souris humaines, ce qui constitue un modèle proche de la pathologie observée chez l'homme. D'autre part, parce que l'activation du système immunitaire est inhérante à la progression des cellues tumorales cérébrales, nous procéderons à des expériences sur des souris C57BL6, greffées de lignées de cellules murines de glioblastome. Les expériences sont faites sur des jeunes souris adultes (injection d'AAV et de cellules tumorales à 4-10 semaines). les Expériences de photométrie seront effectués 2 à 4 semaines plus tard. Chez l'homme, le glioblastome est un cancer cérébral malin particulièrement fréquent chez l'adulte.

3 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras ou par mutation génétique, elles reçoivent une injection derrière l'œil et des injections abdominales répétées pendant deux à douze semaines, pour étudier une modification de protéines liée au métabolisme du foie. Le porteur décrit des effets limités, une douleur au point d'injection disparaissant dans la journée, et indique que les souris sont tuées à la fin pour prélever leurs organes. Il affirme qu'aucune approche in vitro ou in silico ne peut modéliser la régulation circadienne du métabolisme et juge le recours au modèle animal "primordial".

Objectifs

Les rythmes biologiques endogènes, générés par l’horloge circadienne moléculaire (HC), permettent l’homéostasie métabolique. Chez les mammifères, une HC centrale synchronisée par la lumière régule les fonctions physiologiques comme le cycle de veille/sommeil ou les phases de jeûne et d’alimentation. Bien que synchronisés par l’HC centrale, les organes périphériques possèdent leur propre HC. Au niveau du foie, le rythme alimentaire a un fort pouvoir synchronisateur sur l’HC hépatique et sur la rythmicité du métabolisme. Nous avons montré l’importance des modifications post-traductionnelles (PTMs) des protéines dans la régulation des rythmes métaboliques. Le répertoire des PTMs est vaste et leur exploration circadienne constitue un défi majeur pour comprendre le lien entre l’HC et les troubles métaboliques. La malonylation des lysines (Kmal) est un PTM lié au métabolisme. Nous avons récemment observé au niveau hépatique que la Kmal est rhythmique, sous le contrôle de l’HC et dérégulée dans les maladies métaboliques tels que l’obésité et le diabète de type II. Nous avons aussi observé que l’expression de l’enzyme mitochondriale ACSF3 (ACSF3 acyl-CoA synthetase family member ; impliquée dans la régulation de la Kmal) est aussi rhythmique et dérégulée dans les maladies métaboliques. Les perturbations des rythmes quotidiens de Kmal accompagnent les perturbations du métabolisme et notre hypothèse de travail est que la Kmal sous le contrôle de l’enzyme mitochondriale ACSF3 est impliquée dans l’apparition et la progression des troubles métaboliques. Ainsi, les objectifs du projet sont d’étudier dans un contexte d’obésité, (1) la régulation temporelle de la Kmal et (2) le rôle d’ACSF3 dans cette régulation. Ce projet étudiera aussi l’implication du (3) rythme alimentaire et de (4) l’HC hépatique dans le pouvoir régulateur de la Kmal sur le métabolisme quotidien.

Bénéfices attendus

Nos travaux précédents ont étendu l’état des connaissances sur l'orchestration quotidienne du protéome hépatique. Ils ont aussi mis en évidence le rôle des modifications post-traductionnelles (PTMs) comme la phosphorylation et l'acétylation dans la régulation du protéome et du métabolisme rhythmique. Un défi majeur en chronobiologie reste de comprendre comment l'HC synchronise le métabolisme et coordonne la physiologie quotidienne au niveau post-traductionnel. Dans ce contexte, nous possédons une expertise unique pour étudier le rôle des PTMs chez les mammifères dans un contexte physio-pathologique. Le syndrome métabolique a une incidence épidémiologique et économique importante en France et plus largement dans le monde mais le rôle des rythmes biologiques (e.g. rythme alimentaire et HC) reste sous-estimé : En effet, les études nutritionnelles se concentrent souvent principalement sur la composition et la quantité des aliments. Cependant, la régulation quotidienne du métabolisme par l'HC et le moment de la prise alimentaire sont des facteurs importants de la santé métabolique chez les mammifères. Par conséquent, non seulement la qualité et la quantité, mais aussi le moment de la prise alimentaire sont importants pour une nutrition saine et pour prévenir les maladies métaboliques. La compréhension des mécanismes moléculaires impliqués est justifiée par (1) la forte incidence des troubles métaboliques, 30% des adultes étaient en surpoids et 17% étaient obèses en 2020 en France (Enquête Odoxa) (2) les perturbations toujours plus importantes dans les activités sociales et professionnelles modernes (le travail de nuit a presque doublé en 20 ans en France et ne cesse pas d'augmenter). En étudiant l’implication de la malonylation au niveau du lien entre l’HC, le rythme alimentaire et le métabolisme quotidien, ce projet va approfondir l’état des connaissances du fonctionnement et du dysfonctionnement moléculaire hépatique dans le cadre des désordres métaboliques liés à l’obésité et au diabète de type II. Compte tenu de l'éventail des maladies et de la population concernée par nos travaux, en clarifiant les rôles respectifs de l'HC et des signaux régulés par le rythme alimentaire dans la régulation du métabolisme quotidien, les résultats issus de ce projet de recherche pourront être appliquer au traitement des maladies métaboliques et auront sur le moyen/long terme un effet bénéfique sur la santé de la population en général.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une injection rétro-orbitale unique. Sur certaines procédures, certains animaux recevront une injection unique en intrapéritonéale. Sur certaines procédures, certains animaux seront injectés en intrapéritonéale quotidiennement pendant 2 à 12 semaines.

Impact sur les animaux

Les adéno-virus, le PBS et le malonate utilisées au cours de ce projet peuvent générer une douleur au site d’injection qui disparait rapidement dans la journée. Les injections d’adéno-virus en retro-orbitale, font apparaitre occasionnellement une pâleur ou une cyanose temporaire si l’injection est réalisée sur des souriceaux. Ces effets secondaires rares, ne se produisent jamais chez les souris d’age adulte utilisées lors de ce projet.

Devenir

A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort et les organes collectées pour réaliser les études de protéomiques ou de microscopie.

Remplacement

Ce projet préclinique d’étude de la physiopathologie métabolique commun aux mammifères nécessite l’utilisation de modèle murins d’obésité induite par le régime gras et d’obésité génétique (ob/ob) ainsi que l’utilisation de modèles murins d’invalidation et de surexpression de gènes d’intérêts pour évaluer le rôle spécifique du foie dans les effets métaboliques généraux. La régulation circadienne du métabolisme chez les mammifères implique simultanément de nombreux niveaux de régulation faisant intervenir des processus biologiques intégrés au niveau de l’organisme. L’expérimentation animale reste nécessaire afin d’étudier les réactions de l’organisme soumis à l'ensemble des contrôles nerveux, hormonaux et humoraux mis en place par l'horloge circadienne. Il est donc impossible de substituer ou de modéliser par des approches in-vitro ou in-silico de l’ensemble de ces processus biologiques et le recours au modèle animal est donc primordial. De plus, les souris C57Bl6 soumises à un régime gras et ob/ob sont des modèles déjà validés pour l'étude du métabolisme et validés pour les études portant sur les rythmes circadiens.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utiliser au total, nous commencerons ce projet par une phase pilote avec un nombre limité d’animaux. Par la suite, afin de réduire et d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante, nous avons (1) analysé des données récemment publiées et (2) utilisé les directives récemment publiées par les leaders mondiaux en chronobiologie. Ceci nous a permis de fixer le nombre de réplicas biologiques à 4 lors des études de rythmicité quotidienne, et à 10 animaux par groupes d’études lors de la réalisation des tests métaboliques.

Raffinement

Dans un but de raffinement, ce projet débutera par une phase pilote avec un nombre limité d’animaux. Les phases suivantes ne seront conduites que si la première phase valide les niveaux d’inhibition de nos gènes cibles. L’utilisation de système de mesure de calorimétrie indirecte et de suivi en temps réel de prise alimentaire limite le nombre d’interventions et la gêne/stress occasionné(e) sur les animaux (e.g. limitation du nombre d’interventions répétées pour peser le bol alimentaire dans le cadre du suivi du rythme de prise alimentaire). Le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations et soins appropriés pour garantir une efficacité expérimentale et une souffrance minimale. Le cycle jour/nuit sera contrôlé par des armoires circadiennes dédiées. Le nombre de souris par cage respectera la règlementation en vigueur avec un environnement enrichi (frisottis de papier). Les animaux seront observés quotidiennement pour déceler toute apparition de signes de détresse ou souffrance (points limites généraux). La fréquence d’observation sera ajustée si besoin.

Choix des espèces

Les souris C57Bl6 et ob/ob C57Bl6 constituent un modèle de choix pour les études métaboliques et de l’horloge circadienne. De plus, le modèle C57Bl6 est particulièrement adapté pour l’étude des pathologies métaboliques induites par régime gras et irrégulier dans le temps. Lors de ce projet les souris C57Bl6 seront âgées entre 10 et 30 semaines ce qui correspond à un age adulte chez l’être humain. A cet age, les effets secondaires indésirables liés aux injections rétro-orbitales sont inexistants (cf. 3.3.2.4).

1 404 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent du tamoxifène par la nourriture et par injections pour supprimer un récepteur dans la prostate, une partie développant des lésions pré-cancéreuses puis des adénocarcinomes. Le porteur indique qu'elles sont tuées selon un calendrier échelonné, jusqu'à quinze mois après induction, pour prélever la prostate, et qu'une euthanasie intervient en cas de perte de plus de 20 % du poids. Il affirme que son projet "nécessite" un modèle in vivo, aucun modèle in vitro ne reproduisant la complexité des communications cellulaires de la prostate.

Objectifs

Le récepteur des androgènes et le récepteur des glucocorticoïdes jouent un rôle très important dans la prostate saine et le cancer de la prostate. Des données suggèrent que ces deux récepteurs ont un mode de fonctionnement similaires, c’est pourquoi nous souhaitons comprendre si la perte de l’un de ces récepteurs peut être compensée par l’autre. Afin de répondre à cette question, nous avons établi des souris génétiquement modifiées où l’expression du récepteur des androgènes ou du récepteur des glucocorticoïdes peut être spécifiquement délété dans la prostate saine ou dans un modèle de cancer de la prostate. Ainsi, avec ces souris nous pourrons étudier l’impact de la perte du récepteur des androgènes ou du récepteur des glucocorticoïdes dans la prostate saine ou dans un modèle de cancer de la prostate. Une meilleure compréhension du mode d’action de ces deux récepteurs est importante afin de pouvoir développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le cancer de la prostate, qui représente aujourd’hui la deuxième cause de mortalité par cancer.

Bénéfices attendus

Actuellement, le traitement de référence du cancer de la prostate métastatique consiste à bloquer toute activation de la voie de signalisation du récepteur des androgènes. Cependant, après 12 à 18 mois, la plupart des patients rechutent et développent une résistance à cette thérapie. De plus, des glucocorticoïdes sont administrés aux patients ayant un cancer de la prostate afin d’améliorer leur qualité de vie (contrôle de la douleur / diminution des effets secondaires). Toutefois, de plus en plus de données suggèrent que l’administration de glucocorticoïdes pourrait stimuler la croissance tumorale. Ainsi, il s’avère important de mieux comprendre le mode d’action du récepteur des androgènes et du récepteur des glucocorticoïdes et leur interconnexion dans la prostate sous des conditions physiologiques et dans le cancer de la prostate. Cette étude est importante afin de pouvoir développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le cancer de la prostate, qui est aujourd’hui la deuxième cause de mortalité par cancer.

Procédures

Toutes les souris de ce projet seront nourries avec de la nourriture tamoxifène. De plus, la première semaine une injection de tamoxifène en intrapéritonéale (c’est-à-dire dans la cavité abdominale) par jour pendant 5 jours sera réalisée. Il s’agit de la seule intervention réalisée chez ces souris avant leur euthanasie après 1 mois, 3 mois, 5 mois, 6 mois, 9 mois et 15 mois (temps de cinétique pouvant varier en fonction de l’étude pilote).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous souhaitons étudier l’impact de la perte du récepteur des androgènes et des glucocorticoïdes dans la prostate saine et le cancer de la prostate. Nous disposons donc au laboratoire de souris génétiquement modifiées où l’expression de ces deux récepteurs peut être spécifiquement délétés dans la prostate à l’aide d’une molécule appelée tamoxifène. Les souris seront nourries avec de la nourriture contenant du tamoxifène et injectées en intrapéritonéale (c’est-à-dire dans la cavité abdominale) avec du tamoxifène pendant 5 jours. Le site d’injection du tamoxifène sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. De plus, les souris seront pesées afin de vérifier une absence de perte de poids suite au nourrissage avec la nourriture contenant du tamoxifène. Cependant, au laboratoire, nous réalisons souvent ce type de traitement et n’attendons pas d’effet indésirables notables à ce stade. Concernant l’étude du rôle du récepteur des androgènes et des glucocorticoïdes dans la prostate sous des conditions physiologiques, nos connaissances actuelles sur la fonction de ces deux récepteurs nous mènent à penser qu’aucun effet indésirable n’est attendu chez ces souris. Concernant l’étude du rôle du récepteur des androgènes et du récepteurs des glucocorticoïdes dans le cancer de la prostate, nous nous attendons à ce que les souris développent des lésions pré-cancéreuses 2 mois après l'injection au tamoxifène, dont certaines pourraient évoluer en adénocarcinomes 8 – 10 mois après injection de tamoxifène. Toutefois, nos connaissances actuelles concernant le rôle du récepteur des androgènes et du récepteur des glucocorticoïdes dans le cancer de la prostate suggèrent que l’apparition d’adénocarcinomes pourrait être retardée suite à la délétion de ces récepteurs, comparé à notre modèle de cancer de la prostate chez la souris. Pour cette partie, les souris seront euthanasiées au plus tard 15 mois après induction au tamoxifène.

Devenir

Après traitement au tamoxifène (nourrissage + injection en intrapéritonéale (c’est-à-dire dans la cavité abdominale)), l’ensemble des souris seront euthanasiées selon une cinétique définie à l’issue de l’étude pilote réalisée sur un petit nombre de souris. La prostate sera alors collectée pour y effectuer l’ensemble des analyses nécessaires à la bonne mise en œuvre du projet de recherche.

Remplacement

Notre projet de recherche vise à comprendre le rôle du récepteur des androgènes et du récepteurs des glucocorticoïdes dans la prostate saine et le cancer de la prostate. Au sein d’une prostate saine, les communications entre les cellules épithéliales et cellules stromales sont importantes au bon fonctionnement de la prostate. De plus, les communications entre le microenvironnement tumoral et les cellules cancéreuses prostatiques jouent un rôle crucial dans le développement et la progression du cancer de la prostate. A ce jour, aucun modèle ne permet d’étudier une telle complexité in vitro. C’est pourquoi, notre projet nécessite d’utiliser un modèle in vivo afin que l’ensemble de ces facteurs soient pris en compte. Toutefois, des études in vitro seront réalisées dans la mesure du possible (i.e. interaction protéine-ADN pourront être validée in vitro, génération d’organoïdes et utilisation de lignées cancéreuses de la prostate pour certaines analyses moléculaires).

Réduction

Le nombre de souris nécessaires pour nos expériences a été déterminé de façon à obtenir des résultats publiables et significatifs à l’aide de tests statistiques adaptés en fonction des expériences réalisées. Il n’est pas rare d’observer une forte hétérogénéité entre des souris du même groupe. En effet, il peut s’avérer nécessaire d’éliminer un échantillon de l’analyse car il possède une réponse différente des autres souris. Afin de réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous commencerons notre étude par une cinétique pilote avec un petit nombre de souris (5 souris par génotype). Cette cinétique nous permettra de raffiner notre étude mais également de réduire le nombre d’animaux utilisés dans le cas où le point limite serait atteint plus tôt que prévu. Par ailleurs, cette cinétique nous permettra de déterminer les temps les plus intéressants à utiliser pour les analyses plus approfondies et ainsi éviter d’utiliser des souris inutilement sur des temps d’étude qui n'aboutirait pas à un résultat convaincant. Notre expertise en expérimentation animale nous a permis de définir au mieux le nombre d’animaux qui sera utilisé pour cette étude. De plus, de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés, lorsque cela sera possible, une même prostate sera utilisée pour plusieurs expériences (par exemple, recherche de différents marqueurs biologiques sur une même prostate).

Raffinement

Dans un souci de raffinement, une cinétique pilote sera réalisée avec un petit nombre de souris afin d’éviter toute souffrance inutile des animaux. Cette cinétique nous permettra d’évaluer la vitesse d’évolution des lésions pré-cancéreuses dans nos nouvelles lignées de souris, et donc de supprimer des temps trop tardifs qui pourraient altérer le bien être de l’animal. Durant toute l’étude, tous les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés tous les jours par le personnel de l’animalerie. De plus, l’état de chaque souris sera référencé deux fois par semaine dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement euthanasié par dislocation cervicale. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, une euthanasie par dislocation cérébrale sera réalisée.

Choix des espèces

A ce jour, la souris représente un modèle de choix pour notre étude en raison de : -Temps de gestation court, nous permettant d’avoir de larges cohortes contribuant à l’obtention de résultats significatifs. -L’Histologie de la prostate murine et humaine est similaire (présence de glandes et canaux constitués d’un épithélium composé de cellules luminales, basales et neuroendocrines). -Notre modèle de cancer de la prostate chez la souris présente la même cinétique de développement tumoral que celle observée chez l’homme (lésions pré-cancéreuses évoluant en adénocarcinomes). -Le système immunitaire chez la souris est proche du système immunitaire chez l’homme avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude. -Les voies de signalisation et gènes exprimés dans la prostate sont similaires chez l’homme et chez la souris. Les animaux utilisés seront adultes. Ils seront traités au tamoxifène à 8 semaines et sacrifié comme indiqué après 1 mois, 3 mois, 5 mois, 6 mois, 9 mois et 15 mois. Cette cinétique pourra être ajustée en fonction de l’étude pilote réalisée dans un premier temps sur un petit nombre de souris. Cette cinétique est importante pour étudier le rôle de AR et GR dans le développement et la progression du cancer de la prostate.

756 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau, des injections répétées et, pour 378 d'entre elles, des séances d'irradiation cérébrale, pour tester une molécule antioxydante seule ou avec la radiothérapie. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids, de motricité et de sensibilité, et que l'irradiation dégrade l'état général, les souris étant tuées par perfusion intracardiaque pour prélever leur cerveau. Il affirme que les modèles in vitro ne peuvent pas reproduire les tumeurs multi-compartimentales et juge le modèle in vivo "indispensable".

Objectifs

Ce projet a pour but de caractériser l’impact de la modulation du métabolisme de l’interactome des espèces réactives (RSI) au sein de différents modèles murins de glioblastome (GBM) (immuno-compétent et immuno-déficients). En effet une meilleure compréhension de ce métabolisme permettrait de mettre en évidence de nouvelles stratégies thérapeutiques qui viendraient compléter ou améliorer l’efficacité des traitements actuels tels que la radiothérapie (RT). Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin de trouver de nouvelles approches pour le traitement du GBM en cherchant notamment à avoir un effet propre du traitement sur la tumeur mais aussi un effet sur la radiorésistance. Le projet consiste à étudier l’effet d’une molécule innovante aux propriétés antioxydantes « SOD-like » sur différents modèles murin in vivo de GBM. Cette molécule va également être évaluée en complément de la RT afin de voir si elle peut présenter des effets radio-sensibilisants. Des études préliminaires in vitro ont permis de déterminer que l’administration de ce traitement « SOD-like » couplé ou non à de la RT permettait de réduire significativement le nombre de cellules U251-MG après irradiation des cellules. Ces résultats in vitro étant encourageants, l’étude in vivo a pour but de vérifier les effets de ce traitement sur un modèle murin immuno-compétent présentant un microenvironnement complet de la tumeur et sur des modèles murins immuno-déficients présentant un microenvironnement partiel mais permettant l’étude de cellules humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’étudier le potentiel thérapeutique et radio-sensibilisant d’une molécule innovante « SOD-like ». Il a également pour but d’apporter de nouvelles connaissances sur le métabolisme du RSI dans différents modèles de GBM. Sur le long terme cet apport d’informations à la communauté scientifique va permettre de tester de nouvelles cibles thérapeutiques dans le domaine des tumeurs cérébrales permettant d’améliorer et de compléter les traitements utilisés de façon conventionnelle en clinique.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, les 756 animaux sont concernés. - Injection intra-péritonéale (animal vigile): 3 fois par semaine pendant toute la durée du protocole ; 5 minutes maximum par animal, les 756 animaux sont concernés. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy espacées de 48h (Groupe A), ou sur 3 jours consécutifs (Groupes B, C, D) : 15 minutes maximum par animal, 378 animaux sont concernés.

Impact sur les animaux

Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de GBM. Toutefois, ces critères seront pris en compte dans les points limites de l’étude. Nous nous attendons également à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation. Nous avons adapté en conséquence le suivi des animaux, le raffinement des conditions expérimentales et le scoring afin d’anticiper et d’éviter l’exclusion des animaux par atteinte de points limites.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort par perfusion intracardiaque dans le but de récupérer les cerveaux pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la cellule tumorale. L’utilisation de modèles in vivo complets permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir la meilleure molécule SOD-like mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasie de plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous avons réalisés des simulations statistiques à l’aide des données précédemment acquises au sein de l’équipe pour les groupes A, B et C. Ces simulations ont été réalisées à l’aide de l’outil BiostaTGV disponible sur le site internet https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#. Ces simulations ont permis de mettre en évidence un nombre minimum de 4 animaux par sous-groupe de traitement pour obtenir une différence significative en espérant une valeur statistique de 5% pour une puissance de 80%. En raison d’une certaine variabilité observée sur les différents modèles d’injection au sein de l’équipe nous estimons que le nombre d’animaux par sous-groupe de traitement doit être augmenté à 10 animaux par sous-groupe. Ce nombre de 10 animaux est cependant un nombre maximum et pourra être revu à la baisse durant l’étude. Aucune simulation statistique n’a pu être réalisée pour le groupe D car les cellules ne sont pour l’instant pas en notre possession. D’après l’expertise de notre laboratoire, les cellules PDX présentes généralement une variabilité inter-individuelle assez importante. Pour cette raison, nous estimons un nombre de 12 animaux par sous-groupe de traitement maximum.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (5 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et bénéficierons également d’enrichissement (roue d’activité, tunnel en carton, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée 3 fois par semaine. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

La souris immunodéprimée retenue pour réaliser ce travail est la souche Swiss Nude. C’est une souche de souris déficiente en lymphocytes T, mais présentant des lymphocytes B et des cellules tueuses naturelles (NK). Elle est particulièrement préconisée pour les études s’intéressant au développement du GBM d’origine humaine. Lorsque les cellules tumorales sont d’origine murine (issues de souris C57Bl/6) alors nous pouvons utiliser des animaux immuno-compétents de même souche (souris C57Bl/6) afin de prendre en compte l’ensemble du système immunitaire et le contexte inflammatoire du micro-environnement étudié. Le choix de la souris se justifie dans ce projet car cette espèce permet d’obtenir des résultats fiables et reproductibles, permettant de réduire à un minimum le nombre d’animaux utilisés. Ces modèles sont bien caractérisés au sein du laboratoire. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 10 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 10 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs.