Oncologie

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements sanguins sur animal vigile, une irradiation destinée à les rendre aplasiques, des greffes de cellules souches, des injections intraveineuses, sous-cutanées et intrapéritonéales, et une induction de lymphome par des globules rouges de mouton et du tamoxifène, les animaux étant tués dès une perte de poids de 20 % ou un gonflement abdominal. Le projet cherche à comprendre le rôle des cellules myéloïdes dans un cancer du sang humain et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Le porteur affirme que la souris est un modèle "irremplaçable" et qu'"aucun autre système" ne peut s'y substituer.

Objectifs

Le lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL) est un groupe de cancers du sang qui se disséminent dans les organes lymphoïdes. Il est très agressif et la survie du patient atteint de DLBCL se compte en nombre de mois en absence de traitement. Malgré des traitements standards efficaces, environ 30 à 40 % des patients atteints de DLBCL meurent de leur maladie. Ce manque d'efficacité thérapeutique contre le DLBCL a été attribué entre autres par la présence de cellules immunitaires d’origine myéloïde. Ces cellules myéloïdes pourraient participer à la survie et au maintien des cellules tumorales chez des patients atteints de DLBCL, et pourraient aider les cellules tumorales à échapper à la reconnaissance immunitaire, donc pourraient contrecarrer les bénéfices des thérapies administrées aux patients. Jusqu’à présent, toutes les études visant à comprendre le rôle des cellules myéloïdes dans le DLBCL portaient sur des échantillons prélevés sur des patients atteints de DLBCL. Cependant, les accès aux biopsies sont limités : les biopsies ne sont pas fréquentes, et pour celles qui nous parviennent, elles ne contiennent que peu très peu de cellules myéloïdes et tumorales, et ne nous permettent pas de poursuivre des analyses expérimentales poussées. Ainsi, ce projet vise à développer des modèles de DLBCL chez la souris afin de déterminer comment, au cours de la progression tumorale, les cellules myéloïdes alimentent l’expansion des cellules tumorales. Les objectifs de ce projet sont : 1) Analyser les populations de cellules myéloïdes infiltrant les organes atteints par les cellules tumorales ; 2) Déterminer le rôle des populations myéloïdes dans le maintien de la survie des cellules tumorales ; 3) Identifier des cibles thérapeutiques exprimées par les cellules myéloïdes, et les valider expérimentalement. Ce projet en expérimentation animale est critique pour avancer sur notre compréhension du lymphome agressif DLBCL chez l’homme, contre lequel les traitements actuels ne sont pas efficaces à 100%.

Bénéfices attendus

Ce projet en expérimentation animale est essentiel pour plusieurs raisons : - il permet de mieux comprendre comment les cellules myéloïdes favorisent la persistance des cellules tumorales, et la résistance des patients atteints de DLBCL aux thérapies anti tumorales utilisées actuellement en clinique. - il participe à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques présentes sur ces cellules myéloïdes, qui pourraient être spécifiquement ciblées et/ou neutralisées en clinique pour améliorer les traitements actuellement appliqués, et qui restent sans effet chez des patients DLBCL. - il permet de valider l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements de DLBCL sur des modèles précliniques murins.

Procédures

En ce qui concerne les interventions, aucune intervention chirurgicale n’est prévue dans ce projet. Des prélèvements sanguins via la veine sous maxillaire sont effectués sur animaux vigiles (540 animaux). 560 animaux seront irradiés. Quant aux gestes techniques, le projet comprend des injections intraveineuses et sous-cutanées sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane et oxygène) (972 animaux), des injections par voie intrapéritonéale (772) sur animaux vigils selon la réglementation en vigueur.

Impact sur les animaux

Dans ce projet d’expérimentation animale, nous réalisons plusieurs gestes techniques nous amenant à : 1) administrer de cellules de lymphome d’origine murine; 2) irradier des animaux pour les rendre aplasiques et pouvoir reconstituer leur système immunitaire avec des cellules souches hématopoïétiques modifiés; 3) effectuer des administrations par voie intraveineuse de cellules immunitaires purifiées; 4) administrer un inhibiteur du développement des cellules myéloïdes par la voie intra-péritonéale, ou administrer des inhibiteurs de la vascularisation des tumeurs par la voie sous-cutanée; 5) induire des lymphomes B par administration de globules rouges de mouton et de tamoxifène. Toutes ces procédures nécessitent de la contention à l’origine d’un stress passager de l’animal (5 minutes). Les procédures impliquant l’administration d’un traitement par voie intrapéritonéale sur animaux vigils entrainent une douleur locale de 2 secondes causée par la piqure de la seringue. Toute autre administration (voie intraveineuse ou sous-cutanée, prélèvements sanguins) se réalise sur animaux anesthésiés et ne provoque pas d’inconfort le temps de la manipulation. Les injections intraveineuses et les prélèvements sanguins par voie rétro-orbitales entrainent un inconfort passager (5 minutes) de l’oeil qui est soignée par l’application d’un gel oculaire dès la fin de la procédure. L’irradiation n’entraine aucun effet indésirable dès lors que les animaux reçoivent une greffe de cellules souches hématopoïétiques suivie d’un traitement antibiotique continu de 4 semaines. L’immunisation par des globules rouges de mouton et le transfert adoptif n’entraine aucun effet indésirable sur le long terme. L’administration de tamoxifène peut entrainer une perte de poids de 10% le temps du traitement (ici, 9 jours). La croissance tumorale du lymphome peut entrainer une perte de poids dans 10% des cas ou un gonflement abdominal. La mise à mort des animaux concernés sera appliquée dès lors que la perte de poids atteindra 20% du poids total, ou qu’un gonflement abdominal est observé.

Devenir

Les animaux (mus musculus) sont euthanasiés pour effectuer des prélèvements de plusieurs organes, et effectuer des analyses biologiques en laboratoire.

Remplacement

Il nous est à ce jour impossible de recréer grâce à des modèles informatiques ou des modèles de culture cellulaire tous les facteurs physiologiques et environnementaux permettant à une tumeur de se développer, d’être irriguée par le sang, drainée par la lymphe, de modifier son environnement, et d’interagir avec les cellules du système immunitaire. Ainsi aucun autre système ou modèle actuellement disponible ne peut se substituer au modèle murin, modèle animal irremplaçable pour notre projet.

Réduction

Des résultats fiables sont obtenus avec 5 animaux par groupe expérimental, et pour des expériences répétées deux fois. Tous les animaux ont un fond génétique uniforme pour limiter les variations entre les individus et assurer la reproductibilité des résultats. Nous appliquons des analyses statistiques spécifiques à chaque expérience pour déterminer si les différences que nous observons entre nos groupes d’animaux sont exactes et suffisamment fiables pour conclure sur les effets observés, établir de nouvelles hypothèses et avancer dans notre recherche de potentielles molécules candidates pouvant être ciblées dans les lymphomes de type DLBCL.

Raffinement

Les animaux sont gardés en groupes sociaux, avec nids et dômes protecteurs, et suivis quotidiennement. Les analgésiques administrés régulièrement en systémique modifiant les réponses immunitaires étudiées, leur utilisation n’est pas recommandée. La totalité des animaux utilisés dans ce projet et porteurs de cellules tumorales sont mis à mort avant l’apparition de signe de stress ou de souffrance. Cependant, un animal présentant des signes de trouble du comportement et/ou de douleur fera l’objet d’une surveillance accrue, disposera de nourriture humidifiée au fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire, et sera mis à mort dès lors qu’il présente simultanément une perte de poids, des troubles du comportement, une déshydratation, et une baisse d’activité. Dans les expériences nécessitant des injections sous-cutanée, intraveineuse et des prélèvements sanguins, les souris sont anesthésiées par voie gazeuse (un mélange oxygène/isoflurane), ou chimiquement.

Choix des espèces

La physiopathologie de la souris est proche de celle de l’homme : une étude de la souris nous permet de mieux comprendre le fonctionnement du système immunitaire chez l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle d’étude le plus simple et le mieux approprié pour 1) Analyser l’impact des mutations génétiques à l’origine des pathologies des lymphomes agressifs de type DLBCL chez les patients, et 2) Visualiser et analyser des cellules myéloïdes qui participent à l’émergence et à la persistance des cellules tumorales dans les tissus tels que la rate, la moelle osseuse et les ganglions grâce à des techniques d’imagerie de pointe (cytométrie, microscopie). Dans ce projet, les animaux utilisés ont atteint l'âge adulte (> 8 semaines d’âge).

3 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en fer, une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie et, pour certaines, des injections d'un anticorps d'immunothérapie, les tumeurs étant laissées à croître jusqu'à un point limite de taille. Le porteur met à mort toutes les souris deux à treize semaines après la greffe, quand ce point limite est atteint. Il affirme que la complexité du microenvironnement tumoral ne peut pas être reproduite in vitro, ce qui obligerait à recourir à l'expérimentation animale.

Objectifs

Le développement de tumeurs chez des individus immunocompétents reste un paradoxe. En effet, chez les patients atteints de cancer, on détecte fréquemment des réponses immunologiques spontanées dirigées contre la tumeur mais qui malheureusement ne se traduisent que trop rarement par des réponses cliniques efficaces (destruction de la tumeur/guérison). Le principal frein est l’existence de points de contrôles négatifs du système immunitaire correspondant entre autres à l’expression par certains acteurs de l’immunité de molécules inhibitrices bloquant leurs fonctions. Pour remédier à ce problème, des protocoles “d’immunothérapies” anti-tumorale se sont développés avec succès permettant de réactiver la réponse immunitaire anti-tumorale. Cependant, seule une fraction des patients répond au traitement et développe une réponse anti-tumorale efficace. Nos résultats préliminaires montrent que le fer augmente significativement les réponses des lymphocytes T in vivo et in vitro. Cet effet “adjuvant” se traduit par un fort ralentissement de la croissance de lignées tumorales transplantées chez la souris. Au regard de ces résultats, nous souhaitons poursuivre et approfondir notre étude en associant notamment supplémentation en fer et immunothérapie anti-tumorale.

Bénéfices attendus

Au terme de ce projet, nous pourrons déterminer si l’association d’une supplémentation en fer aux stratégies d'immunothérapie actuelle pourrait être bénéfique pour la mise en place de réponses immunitaires anti-tumorales efficaces. Chaque traitement, séparément, augmente les réponses immunes anti-tumorales, provoquant un ralentissement voire un arrêt de la croissance tumorale. Nous espérons que les effets de ces 2 traitements, non seulement s’additionnent, mais également qu’une synergie puisse être observée, càd que l’effet anti-tumoral des 2 traitements ensemble soit supérieur à la somme des effets des 2 traitements appliqués séparément. En conclusion, ce projet vise à montrer l’effet bénéfique d’une supplémentation en fer pour la mise en place de réponses anti-tumorales plus efficaces et devrait confirmer le bénéfice de l’associer aux immunothérapies actuelles.

Procédures

-Régimes alimentaire contrôle ou enrichie en fer (de l'âge de 8 semaines jusqu'à la fin de l'expérimentation) -Injection sous-cutanée de cellules tumorales, sous anesthésie générale par isoflurane (10-15min par souris) - Certains animaux seront également injectés à 5 reprises par voie intra-péritonéale avec un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse (30secondes/injections/souris). Les injections seront toutes espacées de 3 jours.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisées pour ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Le régime enrichi en fer peut induire au cours de la première semaine une perte de poids des animaux n'excédant pas 10%. Cependant, celui-ci n'induit pas de pathologies sur la durée des procédures de ce projet. Le stress et les douleurs pouvant être occasionnés lors des injections sous-cutanées et intra-péritonéales sont à proprement parlé légers. La croissance tumorale peut occasionner encore une fois un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress chez les animaux.

Devenir

Toutes les souris seront mise à mort 2 à 13 semaines après l’injection sous-cutanée en fonction de la vitesse de croissance des différentes lignées tumorales car le point limite de taille de la tumeur sera atteint.

Remplacement

La complexité inhérente au microenvironnement tumoral ne permet pas de récapituler les évènements immunologiques impliqués dans des systèmes in vitro, obligeant à utiliser l’expérimentation animale. Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro pour évaluer nos hypothèses. Ces expériences nous ont permis, par exemple, de confirmer que le fer permet l'activation, la prolifération et la différenciation de certaines cellules du système immunitaire, cruciales pour la mise en place de réponses anti-tumorales.

Réduction

Des lots d’un nombre adapté d’animaux seront utilisés en anticipant la validité statistique des données obtenues. Les tumeurs transplantées sont très majoritairement de type “mâle”. Nous utiliserons donc des souris mâles pour notre étude. De plus, les expériences de la première procédure nous permettrons de réduire le nombre d'animaux utilisés lors de la seconde.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons en cartons. Nous nous efforçons de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux au cours de chaque procédure grâce à l’utilisation d’anesthésie générale sous isoflurane lors des injections sous-cutanées et grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. En effet, il est important de maintenir les animaux immobiles pour pouvoir les raser et procéder aux injections sous-cutanées sans risque de les blesser. Nous avons défini des points limites pour lesquels les animaux seront mis à mort. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie. A partir du 4eme jour suivant l’injection de cellules tumorales les animaux seront suivi 4 à 5 jours par semaine par le responsable du projet pour notamment mesurer la croissance des tumeurs. Les souris seront également pesées une fois par semaine. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en oeuvre (mise à mort et analyse des animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral car de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques, déficientes pour l'expression de tel ou tel gène, nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques comme le fer in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 20 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral et l’effet du fer sur celui-ci.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

3 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer des lésions précancéreuses de la prostate, elles reçoivent des injections de tamoxifène et des prélèvements de sang répétés, les tumeurs pouvant grossir jusqu'à un point limite fixé à 2 000 mm³ ou une perte de poids de plus de 20 %. Le porteur met à mort les animaux à différents temps pour prélever la prostate et d'autres organes. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique et la complexité de la formation des lésions, ce qui rendrait l'expérimentation in vivo nécessaire.

Objectifs

Le cancer de la prostate ( CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020. Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires à l’origine de l’agressivité des tumeurs est donc requise afin de d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate, développés au laboratoire, répliquent les mutations du gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines. Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'homme. L'objectif de ce protocole est le suivi et caractérisation des lésions précancéreuses de la prostate. Suite à l'invalidation du ou des gènes, des lésions, nommées néoplasies intraépithéliales prostatiques (PIN), se développent. L'évolution des PIN sera suivie pendant un délai suffisant à l'apparition des formes agressives. En conclusion, cette étude permettra de caractériser les mécanismes d'apparition des formes agressives du cancer de la prostate afin d’identifier des nouvelles cibles thérapeutiques et des outils diagnostiques.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de cartographier l’évolution des lésions précancéreuses et l’implication des gènes étudiés dans cette évolution. Les prélèvements de fluides (urines et sang) nous aideront à mettre en évidence des biomarqueurs du cancer de la prostate permettant un diagnostic précoce de la maladie.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections intrapéritonéales du tamoxifène réalisés au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, 100 µL du sang sera prélevé sur 20 animaux à chaque point de la cinétique ( 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 12 et 15 mois après injections du tamoxifène), un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Une injection en intra péritonéale prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris. Un sous groupe subira sous anethesie générale à l'isofluorane, une injection en retro-orbitale suivi du sacrifice. (maximum 5 minutes sous anethesie gazeuse)

Impact sur les animaux

Suite à l'injection du tamoxifène, une infection peut se développer au niveau de l'abdomen de la souris dans les journées suivantes l'injection. Lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. La taille de tumeur sera donc un point limite clé(2000 mm3). Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

L’effectif demandé a été calculé afin d’obtenir les groupes des souris mutantes à différents points cinétiques de taille suffisante pour réaliser les tests statistiques de sorte à pouvoir tirer des conclusions pertinentes de nos expériences. Pour un type de souris donné et un point cinétique donné, 20 souris seront utilisées. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction de nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. En revanche, sur les points clés, des expériences supplémentaires pourront être réalisées, toujours dans la limite de 3200 souris maximum.

Raffinement

Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Après injection, les souris seront observées pour détecter les éventuels signes de douleur ou de souffrance, à savoir la posture inhabituelle, le dos vouté, le poil hérissé, les grimaces, les vocalisations. Si ces signes persistent dans la journée suivant l'injection, les souris seront sorties de l'étude. De plus, lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, elles seront observées par l'expérimentateurs et le personnel de l'animalerie d'hébergement chaque semaine afin de contrôler la taille de la prostate par palpation et l’apparence générale de la souris. Les points limites de l’expérience seront le volume de la prostate et le poids de la souris. Si le volume de la prostate est supérieur à 2000 mm3, les souris seront mises à mort et disséquées pour analyse histologique. Si la perte de poids est supérieure à 20% et/ou si la souris présente des signes de souffrance ou de détresse (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif, léthargie), la souris sera retirée de l’expérience et sacrifiée. Après chaque prélèvement sanguin, un volume équivalent au prélèvement de sérum physiologique sera injecté en sous-cutanée. De plus, le lieu de l'injection sera surveillé dans les journées suivantes afin de détecter des signes d'une éventuelle inflammation (rougeur, gonflement).

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans des gènes Pten et Trp53 le plus fréquemment mutés dans les cancers de la prostate humain pour générer nos modèles. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à l’organisme adulte. Les animaux utilisés seront adultes, les injections de tamoxifène se feront sur des jeunes adultes à partir de 8 semaines après naissance.

2 592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès un à deux jours après la naissance, elles reçoivent une injection de virus dans le cerveau ou dans une veine, puis, adultes, subissent des tests de mémoire reposant sur des chocs électriques aux pattes et des tests d'anxiété, pour évaluer une thérapie génique contre le syndrome de Wolfram. Le porteur met à mort tous les animaux pour prélever le cerveau et divers organes. Il affirme que ce modèle murin est "indispensable" car il serait le seul mammifère non humain à reproduire les signes neurologiques de la maladie dans un délai court.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par un diabète sucré de type 1, un diabète insipide, une surdité neurosensorielle, une atrophie optique bilatérale et des signes neurologiques. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de la maladie n’existe et seul le traitement des symptômes (diabète principalement) permet d’améliorer l’espérance de vie des patients. L'objectif principal de ce projet de recherche est de déterminer le potentiel thérapeutique d'une thérapie génique via l'injection de particules virales. Cette injection devrait restorer les déficits de mémoire et d'anxiété chez un modèle souris du syndrome de Wolfram. Cette étude permettra la validation de notre stratégie de thérapie génique chez le modèle murin de la maladie.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans le syndrome de Wolfram sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Touchant plusieurs organes, le syndrome de Wolfram est une maladie complexe qui nécessite des approches combinées. En développant une thérapie génique unique, qui sera délivrée de manière intra-cérébrale ou via la circulation sanguine, nous espérons arrêter la progression de la maladie. L'efficacité de notre thérapie génique dans notre modèle souris du syndrome de Wolfram permettra, à terme, le développement clinique de la thérapie génique chez les patients.

Procédures

Les nouveaux nés, 1 à 2 jours après la naissance, seront exposés à différentes procédures: anesthésie, administration cérébrale ou intraveineuse de vecteurs viraux. Cette injection sera unique, et n'excèdera pas 15 secondes. Suite à ce traitement, des analyses comportementales de la mémoire et de l'anxiété de ces animaux seront testées (6 à 8 tests de 30min maximum).

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront soit "légers" soit "modérés" suivant les actes. Les animaux auront, 1 à 2 jours après la naissance, une chirurgie, associée à une anesthésie, permettant l'injection de virus dans le cerveau ou dans une veine de la tête. Cette intervention pourra engendrer un léger stress chez l'animal. Afin de tester leur mémoire, les souris, à 3 mois, recevront un choc éléctrique de faible intensité et de courte durée au niveau des pattes pouvant engendrer un léger stress.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de collecter les structures du cerveau ainsi que divers organes. Cela permettra des analyses approfondies pour comprendre l'efficacité de notre traitement.

Remplacement

L'utilisation de modèles souris du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes neurologiques du syndrome de Wolfram dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet, les animaux utilisés en comportement seront ensuite euthanasiés et leurs organes périphériques et centraux collectés, complétant ainsi les groupes de souris pour les analyses tissulaires. Les croisements entre males et femelles seront optimisés afin de limiter le nombre d'animaux générés.

Raffinement

Au quotidien, nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. Lors des tests comportementaux, les animaux ne seront pas séparés de leurs congénères et placés 20min avant le début du test dans la pièce d'expérimentation afin de leur permettre une habituation au nouvel environnement. Après les tests comportementaux, les animaux seront directement remis dans la cage d'origine à l'écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Durant les périodes de tests comportementaux, les animaux seront pesés avant chaque test afin de permettre un suivi du poids, toute perte de poids supérieure à 15% entrainant la sortie de l'animal de la procédure. Une grille de scorage définissant les points limites sera mise en place suite à l'injection des particules virales sur nouveau né. Un antalgique sera administré avant toute procédure afin de limiter la douleur des animaux.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie touchant de nombreux organes, pour laquelle les altérations auditives et visuelles s'accompagnent de signes neurologiques et cognitifs. Seul un modèle robuste qui mime la pathologie humaine permet de tester et caractériser, au niveau fonctionnel et biologique, l'efficacité de notre traitement par thérapie génique. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement. Les procédures d'injection de particules virales seront effectuées 1 à 2 jous après la naissance afin de garantir une dissémination efficace. Les tests comportementaux ainsi que l'euthanasie des animaux se feront à 1mois, 3 mois et 6 mois pour permettre une vision de l'évolution du traitement dans le temps.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont rendues obèses et insulino-résistantes par un régime gras de huit semaines, avec des prélèvements de sang hebdomadaires, la moitié subissant en plus la pose chirurgicale d’un cathéter dans la veine jugulaire, pour comparer l’effet d’une huile interestérifiée de l’industrie agroalimentaire sur le métabolisme du glucose. Le porteur situe la retombée du côté d’une meilleure compréhension de cet additif alimentaire. Il indique explorer des approches in vitro de type organe sur puce, tout en jugeant le modèle animal encore nécessaire.

Objectifs

Ce projet vise à étudier l'effet d'un apport en graisse interestérifiée sur le métabolisme glucidique chez la souris. Les graisses interestérifiées. Les graisses interestérifiées sont issues de l'industrie agro-alimentaires et ont été développées par de nombreux fabricants d’aliments transformés pour trouver un substitut approprié lorsque des études scientifiques ont exposé les dangers inhérents aux acides gras trans pour la santé publique. Les industriels de l'agro-alimentaires devaient trouver une forme de graisse qui offrirait toujours la durée de conservation prolongée des huiles partiellement hydrogénées, mais qui ne contiendrait pas d’acides gras trans. Les graisses interestérifiées ont donc été développées. Il s'agit d'un produit entièrement hydrogéné avec bon nombre des mêmes caractéristiques que les graisses trans, mais chimiquement plus proche des graisses saturées. La graisse interestérifiée est produite par un processus appelé interestérification, qui réorganise la structure moléculaire des huiles végétales grasses. Des données chez l'animal et l'Homme montre cependant qu'un apport de graisse interestérifiée pourrait avoir un effet délétère sur l'homéostasie énergétique (prise de poids, intolérance au glucose voire insulino-résistance). Notre projet a pour but d'étudier l'effet des graisses interestérifiées sur l'homéostasie du glucose par rapport à un régime hyperlipidique n'en contenant pas chez des souris.

Bénéfices attendus

L'ensemble de cette étude permettra de mieux comprendre les effets d'une supplémentations en huile de palme interestérifié sur le métabolisme glucidique dans un modèle préclinique d'insulino-résistance.

Procédures

Quarante souris du lot 1 et quarante souris du lot 2 animaux seront soumises à un régime hyperlipidique pendant 8 semaines qui entraînera une prise de poids et la mise en place d'une insulino-résistance. De plus les animaux subiront des prélèvements sanguins une fois par semaine (10 microlitres) et 30 microlitres la semaine 7 pour le lot 1 un pendant le test de tolérance au glucose (qui dure 120 min, 3 prélévements de 10 microlitres aux temps 0, 15 et 120 min ). Pour le lot 2, un cathéter sera implanté dans la veine jugulaire à la semaine 7 (pour les 80 souris de ce lot 2) et 30 microlitres de sang seront également prélevés à la semaine 8 pendant le clamp hyperinsulinémique euglycémique (la durée du clamp est de 120 min, et les prélèvement s ont lieu aux temps 90, 100 et 120).

Impact sur les animaux

L'étude étant limitée à 8 semaines, nous n'attendons pas de nuisances ou d'effets indésirables. Hormis l'apparition d'une prise de poids et d'une insulino-résistance qui sont les effets attendus du régime hyperlipidique. Siur la base de notre expérience de trente ans d'utilisation des régimes obésogènes, il faut noter que la prise de poids attendue n'induit pas une obésité massive (environ 5 grammes pour une souris de 30 g). Il n'y aura pas donc d'effets délétères majeurs. En ce qui concerne la chirurgie, l’antalgie est assurée par du BUPRECARE (buprénorphine) en intra-péritonéale (1/100) que l'on administre en complément de l'isoflurane. Les outils sont désinfectées à l’alcool 70°, les animaux sont nettoyés à la vétadine afin de limiter le risque infectieux. En post opératoire, les souris reposent sur un tapis chauffant à 37°C, jusqu’au réveil. Pour poursuivre l’antalgie en post opératoire, dès la fin des sutures, du KETOPROFENE® (10%) est injecté en IP (0,15 à 0,3ml d’une dilution au 1/100 de KETOPROFENE® 10%) ainsi que le jour suivant l’opération si nécessaire. Le KETOPROFENE est un anti-inflammatoire, on l'administre après la chirurgie pour les douleurs post-opératoires. Le suivi post-chirurgical sera également effectué conformément aux bonnes pratiques. Le point limite est une perte de poids supérieure à 15% en suivi post-chirurgie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux vivants est encore nécessaire. Cependant, nous avons entamé une réflexion sur le développement d'approches in vitro du type "organ on chips" qui permettent de mimer quelques interactions entre organe. De plus, nous allons effectuer en parallèle de nos études in vivo des études in vitro sur des cultures cellulaires pour disséquer les effets de l'huile de palme interestérifiée et identifier les mécanismes moléculaires les relayant.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nos collègues brésiliens ont commencé des études in vitro sur des cultures cellulaires pour tester les concentrations d'huile de palme que nous pourrons utiliser in vivo. Ils ont aussi réalisé une étude in vivo pour trouver la bonne dose d'HPI à utiliser pendant les 8 semaines de l'expérience. Ainsi nous utiliserons le nombre minimum nécessaire à générer des données interprétables. Les échantillons prélevés sur chaque animal permettront de générer un grand nombre d’informations sur des marqueurs moléculaires (métabolites, transcripts, protéines inflammatoires). De plus, grâce aux donnees de la littérature et aux nombreux résultats obtenus lors de projets précédents (nous travaillons sur des modèles de souris obèses depuis une 20aine d'années) nous avons estimé la taille des echantillons ( n=10 par groupe) permettant une analyse statistique efficace (test non paramétrique Mann-Whitney U). En effet les groupes de souris sont généralement très homogènes en terme de tolérance au glucose, des données physiologiques et biochimiques.

Raffinement

Les animaux seront maintenus avec leurs congénèes dans des milieux enrichis avec des morceaux de bois et des tubes en carton, ce qui permettra d'améliorer leur bien être. Ils seront également observés quotidiennement et un suivi du poids et de la prise alimentaire seront réalisés 1 fois par semaine. Cela nous permettra d'identifier rapidement les animaux en souffrance. En cas de perte de poids supérieure à 15 % l'animal sera euthanasié. Pendant les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, les prises de sang seront réduites au minimum pour permettre le dosage d'insuline par des kit Elisa ultrasensibles (nécessitant 5µl de plasma), et les tests eux-mêmes seront espacés d'une semaine. Pour la série desitnée à la réalisation des clamps euglyémqiues-hyperinsuliénmiques, l'implantation du cathèter sera réalisée dans des conditions strictes d'asseptie par du personnel hautement qualifié ayant l'habitude de ce type de chirurgie. Les animaux sont anesthésiés par inhalation à l’ISOFLURANE® en 2 temps : la phase d’endormissement pendant laquelle est délivré 3,5% d’ISOFLURANE® dans l’air à un débit de 2L/min puis la phase d’entretien de l’anesthésie avec de l’ISOFLURANE® à 1,5% d’air à un débit de 0,4L/min. L’ISOFLURANE® n’ayant pas de propriétés analgésiques, l’antalgie est assurée par du BUPRECARE (buprénorphine) en intra-péritonéale (1/100) que l'on administre en complément de l'isoflurane. Les outils sont désinfectées à l’alcool 70°, les animaux sont nettoyés à la vétadine afin de limiter le risque infectieux. Le cathéter est passé sous la peau et est externalisée au niveau interscapulaire. En post opératoire, les souris reposent sur un tapis chauffant à 37°C, jusqu’au réveil. Pour poursuivre l’antalgie en post opératoire, dès la fin des sutures, du KETOPROFENE® (10%) est injecté en IP (0,15 à 0,3ml d’une dilution au 1/100 de KETOPROFENE® 10%) ainsi que le jour suivant l’opération si nécessaire. Le KETOPROFENE est un anti-inflammatoire, on l'administre après la chirurgie pour les douleurs post-opératoires. Le suivi post-chirurgical sera également effectué conformément aux bonnes pratiques et le point limite est une perte de poids de 15%.

Choix des espèces

Les modèles précliniques de souris obèses et insulino-résistantes, partagent avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique et de l’adiposité. Le laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur la souris en régime gras et a accumulé un grand nombre d’informations physiologiques et moléculaires qui seront utilisées pour interpréter les résultats obtenus. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (30 jours) et seront nourris aux différents régimes pendant 8 semaines. La mise sous régime à un âge précoce permet d'avoir des résultats plus marquant qu'une mise sous régime qui se produirait à un âge plus avancé et mime l'apport excessif de calories pendant l'adolescence dans l'espèce humaine.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un régime gras qui les rend obèses et diabétiques, des mises à jeun de douze heures, des gavages de glucose et, pour la moitié d’entre eux, un traitement antibiotique destiné à perturber leur flore intestinale, avant le prélèvement de leurs organes, pour étudier le lien entre microbiote et diabète. Le porteur indique que le gavage et la contention constituent un stress modéré et que les antibiotiques peuvent provoquer des diarrhées. Il affirme qu’aucun modèle in vitro ou in silico ne rend compte des liens entre alimentation, microbiote et régulation de la glycémie.

Objectifs

Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte et une grande diversité de microorganismes. Les bactéries y jouent un rôle crucial pour le développement et le maintien d'un système immunitaire sain. Ainsi un déséquilibre de la composition du microbiote a été montré chez les patients atteints de maladies métaboliques comme l’obésité dont l’une des principales conséquences est le diabète. Ces 35 dernières années la prévalence du diabète a été multipliée par quatre avec 9.3% de la population mondiale souffrant de cette pathologie. Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et le rôle que ces interactions pourraient avoir dans des maladies métaboliques telles que le diabète. En cas d'obésité, de nombreux changements se produisent dans l’intestin. Ces modifications intestinales sont maintenant reconnues comme participant à l'auto-aggravation de l'obésité. Parmi les changements qui s’opèrent, la densité des cellules de l'immunité, qui sont nombreuses dans l’intestin, augmentent chez les personnes obèses et leur activation va notamment modifier la régulation de la glycémie. Les mêmes mécanismes sont à l’œuvre dans les modèle de rats rendus obèses par l’alimentation. De nombreuses études suggèrent que les bactéries de l’intestin, dont la composition est perturbée par l‘obésité, sont en partie responsables des changements de fonction des cellules immunitaires. Cette triade (microbiote-cellules immunitaires intestinales-régulation de la glycémie) constitue donc une cible intéressante pour mieux comprendre la mise en place du diabète. Nous souhaitons dans un premier temps caractériser les populations de cellules immunitaires et leurs (dys)-fonctions dans différentes régions de l’intestin chez des rats obèses en comparaison avec des rats non obèses et ceci en présence ou non d’une perturbation majeure du microbiote intestinal. Sur les mêmes animaux un suivi de la glycémie sera réalisé ainsi qu’une analyse fine du microbiote intestinal et des populations et fonction de l’intestin. Des outils de bio-informatique nous permettant de faire des études de corrélation entre ces différents paramètres seront par la suite utilisés dans les analyses.

Bénéfices attendus

Les perspectives de ce travail sont d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques intestinales, donc accessibles par voie orale afin de prévenir ou limiter les effets néfastes de l’obésité sur le diabète. Le diabète est une maladie évolutive qui se caractérise par une hyperglycémie chronique liée à une réponse altérée à l’insuline. Ce déséquilibre du métabolisme glucidique est notamment lié aux déséquilibres nutritionnels et à l’obésité. Le système immunitaire a aussi un rôle dans la mise en place du diabète qui est souvent associé à une inflammation élevée chez les sujets obèses. Le diabète entraine des complications vasculaires graves à long terme et une surmortalité. Son impact sur le budget santé, qui peut atteindre 5 à 20% des dépenses de santé de nombreux pays, est évalué à la hausse pour les décennies à venir. Il est donc important de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour cette pathologie.

Procédures

Les animaux recevront un régime riche graisses induisant une prise poids et un diabète. Les animaux seront mis à jeun deux fois pour une durée de 12h durant l'ensemble de la procédure. Ils recevront également un gavage de glucose (entrainant une contention de 10 secondes). Un test de tolérance au glucose (appelé OGTT) visant à mesurer la glycémie (via une seule petite piqure à la queue) sera réalisé sur l'ensemble des animaux. Ce test sera réalisé deux fois à 3 semaines d’intervalle durant la procédure. La moitié des animaux recevra un traitement antibiotique pendant deux semaines afin de perturber la flore intestinale. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine en étant placés durant quelques secondes dans un pot individuel. Deux pesés sur l'ensemble du projet nécessiteront une pesée plus longue (de quelques minutes) afin de laisser le temps aux rats d'expulser une crotte qui sera ensuite récoltée dans le pot.

Impact sur les animaux

Le gavage lors de l’OGTT constitue un stress modéré notamment dû à la contention (d'une durée < 10 secondes). La contention et le gavage seront réalisés par un experimentateur expérimenté. Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux. la procédure de prélèvement de sang nécessaire à la lecture de la glycémie ne présente qu’une douleur très faible car il est réalisé via une petite coupure au niveau de la queue réalisée une seule fois par l'espérimentateur lors du premier prélèvement du test. Par la suite un simple massage permet de prélever du sang sans avoir à recouper la queue. Le traitement antibiotique pourra éventuellement entrainer des diarrhées.

Devenir

Dans ce projet la mise à mort est nécessaire pour le prélèvement des organes.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les liens entre l’alimentation, la composition du microbiote, les fonctions immunitaires de l’intestin et la régulation de la glycémie.

Réduction

D’après les études déjà menées, nous estimons que 15 rats par groupe expérimental sont nécessaires afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux hébergés 2 par cage bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront entrainés à la manipulation (notamment à la contention). Afin de limiter le stress lors des mesures de glycémie qui se feront dans une autre salle que la salle d'hébergement, les animaux seront transférés dans la salle expérimentale 1h avant. Un anesthésique local sera appliqué sur la queue avant les prélèvements de sang réalisés pour les mesures de glycémie. Des points limites, décrits dans les procédures expérimentales, seront également mis en place.

Choix des espèces

Les rats utilisés seront des rats wistar RjHan:WI. Cette espèce est choisie car cette étude fait partie d’un projet collaboratif réunissant 2 autres équipes de recherche et nécessitant une harmonisation du modèle rongeur. De plus ce projet repose sur de nombreux travaux préliminaires ayant utilisé des rats wistar RjHan:WI. Ce projet étudie le rôle du microbiote sur le développement du diabète chez l’adulte. Le modèle de rat utilisé est donc un modèle adulte qui aura 7 semaines en début d’expérimentation (le microbiote des rats est stabilisé à partir de 5-7 semaines) et 21 semaines en fin d’expérimentation. 3 mois de régime riche en graisses correspond au temps nécessaire pour rendre les animaux obèses avec une perturbation des fonctions immunitaires et de la régulation de la glycémie.