Oncologie

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée par injection de cellules cancéreuses, 80 d’entre elles recevant en plus un médicament, la tumeur pouvant atteindre deux centimètres cubes et gêner leurs déplacements avant leur mise à mort pour prélèvement, afin de valider le rôle d’un ARN non codant dans le carcinome rénal. Le porteur indique que des métastases pulmonaires peuvent se former et provoquer une perte de poids et d’appétit. Il affirme que les cultures in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes de la formation tumorale et compte ouvrir une collaboration avec l’industrie pharmaceutique.

Objectifs

Le carcinome rénal à cellules claires (CRCC) est un cancer agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies, les patients diagnostiqués au stade métastatique ont toujours un mauvais pronostic. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles pour les tests de diagnostic précoce et pour les traitements de la maladie métastatique. Ce projet vise à démontrer que l'expression d'un ARN long non codant in vivo altère la formation de carcinome des cellules rénales et la progression de métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant être testés dans des essais précliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation d'une cible pour le traitement du carcinome rénal à cellules claires. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant faire l'objet d'essais précliniques, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le carcinome rénal à cellules claires chez l'homme.

Procédures

Toutes les souris seront injectées avec des cellules tumorales (104). L'injection se fait sous anesthésie gazeuse et dure une dizaine de secondes. Les souris de l'étude expérimentale (80) subiront en plus l'administration de médicament 3 fois à 3 jours d'intervalle. Ce traitement supplémentaire est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et potentiellement la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Cette tumeur primaire devrait apparataitre à partir de 5 jours suivant injection et croitre assez rapidement. La temps d'atteinte du point limite du volume de 2cm3 est estimé à moins de 3 semaines. Les métastases ne seront pas visibiles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Lors des expériences précédentes d'injection de cellules tumorales dans le laboratoire, les souris ont du être sacrifiées du fait de la taille de la tumeur primaire et non d'effets dus aux métastases.

Devenir

Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Les tumeurs et métastases seront prélevées à des fins d'histologie pour étudier les marqueurs de cancer et la composition des tumeurs ainsi que pour d'autres analyses : séquençage d'ARNs, quantification protéique afin d'évaluer le résultat des différents traitements.

Remplacement

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance d'un ARN non codant dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.

Réduction

L'étude se fera en deux étapes : * la première procédure constitut l'étude-pilote de la tumorigénicité des modèles cellulaires utilisés (12 souris par lignée cellulaire, donc 24 souris). * Si l'étude pilote est concluante (les lignées injectées vont entraîner une croissance tumorale), elle sera suivie de la seconde procédure : l'étude expériementale visant à étudier l'effet du médicament sur la croissance tumorale : 80 souris injectées avec les lignées modifiées pour la surexpression de l'ARN non codant et traitées ensuite soit avec le véhicule, soit avec le médicament. Ce nombre représente le nombre minimal de souris pour obtenir un résultat significatif d’un point de vue statistique en tenant compte de l’éventualité de mort précoce. Le nombre total de souris expérimentales sera de 104. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides).

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale, ce qui confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance évidente, les souris seront sacrifiées.

Choix des espèces

In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. L'utilisation du modèle de xénogreffe chez la souris ne peut être remplacée par d'autres méthodes expérimentales, il est fiable et facile à manipuler et déjà largement utilisé. De plus, les données que nous produirons à partir de nos tumeurs (cinétique tumorale, séquençage d'ARN, quantifications de protéines) seront comparées à celles collectées par notre laboratoire et nos collaborateurs dans des modèles similaires pour d'autres études. Pour cette expérience d’injection de lignées cellulaires murines sur des souris immunocompétentes, nous ferons correspondre la souche d'origine des lignées cellulaires avec celle des souris réceptrices. Nous utiliserons des souris jeunes adultes de 6 semaines. Le médicament à tester étant un inhibiteur des points de contrôle immunitaires, il convient que sa cible, la population de lymphocytes T, soit à son meilleur stade de développement. A 6 semaines, les souris présentent un système immunitaire développé et fonctionnel, que ne présentent pas des souris plus jeunes. Après cet âge, certaines sous-populations de cellules immunitaires ainsi que la fonction immunitaire globale commence à décliner : la diminution des lymphocytes T naïfs, l'augmentation des lymphocytes T à mémoire dont la fonctionnalité est réduite et la diminution de la diversité de la reconnaissance des antigènes par les lymphocytes T entraînent l'immunosénescence.

80 lézards mâles adultes de deux espèces, capturés dans la nature ou en enclos semi-naturel, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés sur leur site de capture. Chaque animal subit une restriction d’eau poussée pendant huit jours jusqu’à une forte déshydratation, deux prises de sang et des mesures répétées de course et d’endurance, pour décrire l’effet de la déshydratation sur les performances locomotrices. Le porteur situe les retombées du côté de la prévision des effets du réchauffement climatique et de la sécheresse. Il fixe un point limite à 30 % de perte de masse et affirme que ces mesures sur animal vigile ne peuvent être remplacées par des modèles cellulaires ou informatiques.

Objectifs

Chez les ectothermes terrestres, le maintien de performances optimales suppose une régulation fine de la température corporelle et de l’état d’hydratation individuel. D’une part, les performances augmentent généralement avec la température avant de décliner brutalement auprès de la limite thermique critique maximale. La thermorégulation comportementale assure le maintien des températures corporelles autour de la gamme de ces températures optimales. D’autre part, les performances déclinent avec l’état de déshydratation. L’hydrorégulation comportementale assure le maintien d’un état d’hydratation optimal de l’organisme en fonction des besoins saisonniers ou du cycle de vie. Des travaux sur les amphibiens ont démontré que leurs capacités locomotrices chutaient après un seuil de déshydratation de l’ordre de 10-30% de perte de la masse corporelle. De plus, chez certaines espèces, la déshydratation influence la sensibilité thermique des performances en diminuant l’optimum thermique, la largeur de la niche thermique ou la limite thermique critique maximale. Cependant, il reste encore à mieux comprendre tous les facteurs qui expliquent les variations entre espèces et entre traits. Les ectothermes terrestres à peau sèche comme les reptiles sont aussi sensibles à la déshydratation même s’ils sont beaucoup plus résistants que les amphibiens. La déshydratation corporelle peut provoquer chez ces organismes la mort mais peut aussi engendrer des effets sub-létaux comme des réallocations d’énergie. L’analyse des relations entre déshydratation et performance chez ces espèces est encore très parcellaire. Aucune étude n’a quantifié les effets d’interaction de l’eau et de la température sur les performances locomotrices des reptiles. Cependant, une publication récente démontre une baisse de la tolérance thermique chez les lézards déshydratés. Ce projet vise donc spécifiquement à décrire la relation entre déshydratation et courbes de performance thermique de la locomotion chez deux espèces de lézards sensiblement différentes dans leurs adaptations thermiques à savoir le lézard vivipare (Zootoca vivipara) et le lézard des murailles (Podarcis muralis).

Bénéfices attendus

Les espèces sauvages de reptiles sont soumises à un double stress du changement climatique à savoir le réchauffement climatique et des évènements plus fréquents et plus prolongés de sécheresse. La capacité à prédire l’impact de ces changements climatiques dépend d’une bonne compréhension des effets interactifs de l’état d’hydratation et de la température corporelle sur les performances de ces espèces ectothermes. Les capacités locomotrices sont un indicateur des performances des animaux pour s’alimenter, se reproduire ou éviter les prédateurs, et ce projet va donc permettre pour la première fois de (1) quantifier le seuil de tolérance hydrique des capacités locomotrices chez deux espèces de lézards, et (2) de vérifier si une déshydratation impacte la tolérance thermique de ces espèces, en supposant que les animaux tolèreront moins des températures élevées s’ils sont déshydratés. Ces travaux permettront par ailleurs de mieux qualifier les seuils critiques de déshydratation chez ces deux espèces et donc d’améliorer notre suivi du bien-être animal dans les conditions d’élevage dans le futur.

Procédures

L'étude sera effectuée successivement sur 40 mâles adultes de deux espèces de lézards dont une espèce (lézard vivipare) prélevée dans des enclos semi-naturels en captivité et une autre espèce (lézard des murailles) prélevée en milieu naturel, soit 80 animaux au total. Après la capture, les animaux seront maintenus en acclimatation dans des cages individuelles pendant une semaine. Ils seront ensuite mesurés pendant une journée, transférés en habituation dans des grandes cages par paire et maintenus pendant deux jours d'acclimatation puis exposés soit à des conditions d'alimentation et d'eau ad libitum soit à des conditions expérimentales avec restriction de l'eau pendant 8 journées (10 individus dans le lot témoin, 30 dans le lot expérimental par espèce). Au début et à la fin de la période de manipulation, une prise de sang de 20 ul sur animal vigile sera effectuée pour quantifier l'osmolalité plasmatique (geste impliquant une contention de 2-3 minutes). Au début, au bout de 3-4 jours, puis au bout de 7-8 jours de manipulation, les performances locomotrices de sprint et d'endurance seront mesurés sur chaque animal à chaque fois pendant une journée. Après la manipulation, les animaux seront maintenus en cage individuelle dans des conditions d'alimentation et d'eau ad libitum pendant une semaine puis relâchés sur leur site de capture d'origine.

Impact sur les animaux

Nos protocoles sont choisis pour permettre de comparer des animaux dans des lots témoins (nourriture et eau ad libitum) à des animaux soumis à une restriction hydrique forte pendant 8 jours. Il s’agit d’une période courte de déshydratation qui reste écologiquement réaliste à la lumière de nos travaux précédents et des observations en conditions naturelles. Nous anticipons que les animaux soient faiblement déshydratés après 3-4 journées d’expérimentation puis fortement déshydratés après 8 journées, mais cet état est réversible et les animaux seront ensuite tous maintenus avec eau et alimentation ad libitum à la fin de l’étude. L’autre source de nuisance sera les mesures répétées de vitesse de sprint et d’endurance. Ces procédures induisent seulement un stress ponctuel au moment de la manipulation et éventuellement une fatigue des animaux. Les mesures de sprint seront effectuées plusieurs fois la même journée mais espacées d’une heure ce qui est suffisant pour permettre la récupération. Les mesures d'endurance seront effectuées sur plusieurs journées mais très espacées et après les mesures de sprint. Toutes ces procédures expérimentales sont pour l’essentiel non invasives en dehors de deux prises de sang qui sont très bien tolérées par les animaux adultes. Les lézards sont aussi très tolérants à la mise en élevage dans les conditions de captivité de ce projet et à la manipulation par un expérimentateur.

Devenir

Les animaux sont tous relâchés dans les enclos semi-naturels donc replacés en captivité dans des conditions extérieures proches du milieu naturel.

Remplacement

Cette étude consiste à mesurer sur des animaux vigiles les performances locomotrices en fonction de la température et l'hydratation, et elle ne peut donc se pratiquer avec des équivalents cellulaires, des modèles in silico ou des robots.

Réduction

Un échantillon très réduit d’animaux sera utilisé pour quantifier les conséquences de la déshydratation sur les performances locomotrices (40 individus maximum par espèce, 80 individus au total). Afin de réduire le nombre d'animaux, nous effectuerons trois mesures répétées sur chaque animal avant la manipulation, après une déshydratation faible et après une déshydratation plus forte. On exploitera cette gamme temporelle, exprimée à l'échelle individuelle par la perte de masse, pour quantifier la relation exacte existant entre déshydratation individuelle et performances locomotrices. Ainsi, le nombre de lots expérimentaux sera réduit. De plus, un échantillon minimum pourra être utilisé en étudiant uniquement une seule classe d'âge (adulte) et de sexe (mâle) ce qui permettra de réduire la variabilité initiale entre lézards et la prise en compte de covariables associées au plan expérimental.

Raffinement

On raffinera les conditions d'élevage grâce à un enrichissement des cages (utilisation d'abris, de zones de thermorégulation et d'un susbtrat pour les comportements fouisseurs) et à l'utilisation de conditions climatiques optimales du milieu naturel pour l'été (cycle thermique jour et nuit, éclairage optimale pendant la journée avec des conditions de lumières enrichies en UV) en dehors du stress de déshydratation. Des points limites associés à la perte de masse (perte de masse supérieure à 30% de la masse initiale ad libitum) seront appliqués avec arrêt des procédures expérimentales en cas de dépassement du point limite et basculement des conditions d'élevage des animaux vers des conditions d'alimentation et d'eau optimales ad libitum si les points limites sont dépassés.

Choix des espèces

Ce projet vise spécifiquement à décrire la relation entre déshydratation et courbes de performance thermique chez deux espèces de lézards sensiblement différentes dans leurs adaptations thermiques à savoir le lézard vivipare (Zootoca vivipara) et le lézard des murailles (Podarcis muralis). Le lézard vivipare est une espèce typique des milieux froids et humides et présente des taux de pertes hydriques cutanées élevés par rapport aux autres espèces de lézards du même groupe. Le lézard des murailles est une espèce saxicole qui affectionne les milieux plus chauds et plus secs et est plus résistant à la déshydratation. Le comportement des deux espèces est sensible à la déshydration ; notamment, il a été démontré pour le lézard des murailles des effets de la disponibilité en eau de boisson sur les préférences thermiques et les limites critiques maximales. Les animaux utilisés seront des animaux mâles adultes en bonne santé sur lesquels il est possible de faire des prises de sang répétées. En utilisant des adultes plutôt que des subadultes, on aura moins de variation de taille corporelle et on disposera d'animaux de plus grande taille plus faciles à manipuler pour les tests de performance de locomotion.

1176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang répétés, jusqu'à seize sur la joue chez l'animal vigile, un prélèvement dans le fémur, des injections et des gavages, certaines lignées développant une leucémie suivie sur environ un an, pour étudier l'effet du vieillissement sur la formation du sang. Le porteur affirme que les points limites précoces font qu'aucun effet indésirable n'est à prévoir, malgré une gravité déclarée modérée. Il indique que la leucémie et le vieillissement forment des modèles intégrés que la culture in vitro ne peut reproduire.

Objectifs

Les deux objectifs de ce projet sont de déterminer l'impact du vieillissement sur l'hématopoïède normale et leucémique

Bénéfices attendus

La détermination de l’impact de l’âge sur la fonction des CSH pourrait aider à comprendre les mécanismes qui induisent la survenue de syndromes myéloïdes chez les sujets âgés et ainsi améliorer la prise en charge et les traitements des patients

Procédures

Prélèvements sanguins sur animaux vigiles en sub-mandibulaire, durée 1min, nombre : pour la procédure 3, 16 Prélèvement intrafémoral sur animaux anesthésiés, durée 2min, nombre : 1 fois pour toutes les procédures Injections intrapéritonéales sur animaux vigiles : durée 1 min, nombre : 1fois par expérience pour la procédure 2 Gavages sur animaux vigiles : durée 1min, 1 fois pour toutes les procédures

Impact sur les animaux

Les points limites étant précoces, aucun effet indésirable n'est à prévoir sur les animaux

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure afin de récupérer les échantillons (tissus, sang) nécessaires pour étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu (génétiques, transcriptomiques, étaboliques, protéiques, phénotypiques)

Remplacement

Les leucémies ainsi que le vieillissement sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal. De plus, nos modèles murins permettent de suivre les cellules souches hématopoïétiques donnant la possibilité d’étudier leurs fonctions dans un environnement physiologique natif à la fois au cours du vieillissement mais également lors du développement de leucémies.

Réduction

les lignées transgéniques utilisées comportent 1. des systèmes inductibles qui vont permettre à la fois d’induire l’expression des transgènes dans un tissu spécifique mais également à un temps donné et 2. des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules leucémiques et ainsi permettre de diminuer le nombre d’animaux utilisés. De plus lors de l’établissement des lignées, l'élevage sera minimisé le plus possible pour ne produire que les animaux nécessaires

Raffinement

les lignées transgéniques utilisées comportent 1. des systèmes inductibles qui vont permettre à la fois d’induire l’expression des transgènes dans un tissu spécifique mais également à un temps donné et 2. des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules leucémiques et ainsi permettre à la fois de diminuer le nombre d’animaux utilisés mais également de détecter l’apparition de cellules leucémiques très précocement ce qui permettra d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge plus rapide. Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leurs naissances à leurs morts, les animaux seront hébergés en groupe et l'enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Ainsi, la surveillance des souris sera faite quotidiennement ce qui permettra de prendre des mesures spécifiques pour le bien-être de ces animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. C’est la raison pour laquelle l’ensemble des techniques de la transgénèse chez les mammifères a débuté chez la souris. De surcroit, toute la collection des systèmes Cre-lox nécessaires à nos études n’existe que chez la souris. Nous utiliserons des souris jeunes de 8 à 10 semaines lorsqu’elles ont atteint leur maturité sexuelle pour les deux lignées murines. Les souris âgées auront 18 à 20 mois pour la lignée MAP17 Tomato et 12 mois pour la lignée KSB (puisque la cinétique de la maladie est d’environ 1an)

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de vessie est greffée dans leur flanc, puis elles reçoivent deux injections par semaine pendant six semaines et deux prélèvements de sang dans l'œil, avant une exsanguination terminale sous anesthésie, pour comparer deux candidats médicaments en doses croissantes. Le porteur indique que la pousse tumorale peut gêner les déplacements et qu'aucun anti-inflammatoire ne peut être administré car l'inflammation participe au mécanisme testé. Il affirme que ces expériences sur petit animal ne peuvent être remplacées par des cultures in vitro.

Objectifs

La cible du candidat médicament est un récepteur l’immunité et est exprimé par les cellules normales mais aussi dans de très nombreuses cellules tumorales. L’activation de ce récepteur par certaines molécules entraîne une mort spécifique des cellules cancéreuses (mais pas des cellules normales), ainsi qu’une activation de l’immunité ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes induit une vaccination à long terme contre la tumeur empêchant ainsi les récidives cancéreuses. Des études précédentes (utilisant le même modèle de cancer de la vessie que celui de ce protocole) ont démontré l’ensemble des effets cités ci-dessus (guérisons complète de 45% des souris traitées et vaccination à vie des souris guéries contre les récidives dans 66% des cas). Ces résultats ont été obtenus lors d’injections intratumorales de d’une toute nouvelle famille de molécules activant ce récepteur (spécifique, utilisable en clinique et bien tolérée). Dans la présente étude, deux candidats médicaments (CM1 et CM2) adaptées à une injection dans le système veineux (ici une injection intrapéritonéale) vont être comparées en doses croissantes pour leur : (1) efficacité antitumorale, (2) tolérance et (3) mécanismes d’action (dont leur action sur le système immunitaire). Pour ce faire, le modèle de cancer de la vessie sera utilisé pour que l’activité de ces candidats médicaments puisse être directement comparables aux études précédentes et à venir. Sept doses croissantes de chacun des deux candidats médicament seront testées sur des groupes de 12 souris rentrant en protocole. Ajouté au groupe contrôle, cela donne 15 groupes de 12 souris en traitement. Pour ce faire, 225 souris seront injectées avec des cellules cancéreuses de vessie. Sachant que 80% des souris injectées développent des tumeurs pouvant entrer protocole, cela donne 180 souris qui intègreront les 15 groupes de traitement. Les molécules seules (sans autre molécules ajoutées), seront administré deux fois par semaine pendant 6 semaines.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’effectuer un choix/classement entre deux molécules lors d’une injection par voie sanguine. Elle permettra d’affiner les doses à utiliser dans les futures études ainsi qu’en clinique. Il s’agit d’une étude de recherche à la fois fondamentale et translationnelle en vue de définir les fondements d’une étude clinique chez l’homme en injection par voie sanguine.

Procédures

Cette étude nécessite : - Une injection de cellules tumorales dans le flanc de la souris (sous anesthésie) - Des traitements injectés par voie sanguine (piqure d’aiguille sur souris vigiles). - Deux prises de sang intermédiaires de petits volumes (100µl - 3 à 4 minutes anesthésie incluse), espacés de deux semaines (sous anesthésie) - Une exsanguination terminale pouvant induire un arrêt cardiaque (sous anesthésie générale - environ 4 min anesthésie incluse), immédiatement suivie d’une mise à mort par dislocation cervicale (toujours sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

225 souris C3H/HeN (de phénotype non dommageable), sont acclimatées pendant une semaine à daté de leur réception. Les animaux subiront un stress lors des contentions, préparations, greffes, traitements, suivis et prélèvements ainsi que lors de leurs anesthésies : 1/ Anesthésie par voie gazeuse (isoflurane) pour permettre : (i) leur numérotation par poinçonnage auriculaire, (ii) la tonte pour préparer (iii) la greffe tumorale. 2/ Stress à la contention et à la piqure lors des traitements par injections sanguine sur souris vigiles (2 fois par semaine). 3/ Stress à la contention lors des pesées et mesures de la croissance tumorale par pied-à-coulisse sur souris vigiles. 4/ Les deux prélèvements de sang intermédiaire rétro-orbitaux de 100µl de sang après le premier et le 5eme traitement peuvent générer de la douleur au niveau de l’œil prélevé c’est pourquoi chaque œil sera prélevé une fois. Les volumes et fréquences de ces prélèvements sont adéquats pour ne pas engendrer de stress volémique chez ces souris. 5/ La pousse tumorale peut engendrer une gêne dans la locomotion (pris en compte dans la grille de score => Mise à Mort). 6/ Exsanguination intracardiaque terminale sous anesthésie générale (kétamine/Xylazine), immédiatement suivie d’une mise à mort par dislocation cervicale.

Devenir

A la fin de l'unique procédure, tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie (pour permettre des analyses d’efficacité et de mécanismes d’action post-mortem).

Remplacement

De nombreuses expériences in vitro ont déjà permis de mettre en évidence l’activité et les mécanismes d’action de ces deux candidats médicaments. A présent, seules des études sur le petit animal permettront d’étudier les interrelations complexes des facteurs physiologiques susceptibles d’influencer l’effet de la molécule testée, et surtout le système immunitaire complet qui permettra d’étudier l'effet vaccinal contre le cancer de ces deux candidats médicaments. Ces expériences sur petits animaux ne peuvent donc pas être Remplacées. Ces expériences s'inscrivent dans le cadre du développement d'une application thérapeutique et fournira des données précliniques précieuses pour la conception d'un essai clinique.

Réduction

Les expériences menées lors de précédentes études démontrent que le nombre de souris par groupe (12 souris par groupe), prévu pour cette expérience est adapté sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats, tout en utilisant les méthodes statistiques adaptées aux petits nombres.

Raffinement

Le « Raffinement » sera respecté par la mise en place d’une définition précise de points limites précoces et prédictifs, sur la base d'une grille de score validée sur ce modèle et sur ce type de traitement. Une surveillance adaptée des animaux 3 fois par semaine permettra d'éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 puis avec nourriture et de l’eau ad-libitum avec des bâtonnets à ronger et du coton comme enrichissement en excès. Les prélèvements seront réduits au maximum en quantité et en durée grâce à nos méthodes d’analyses. Les deux prélèvements intermédiaires rétro-orbitaux de 100µl de sang s’effectueront sous anesthésie, respectivement après le premier et le cinquième traitement (J0 et J14). Une goutte de tétracaïne sera déposée sur l’œil 1 min avant le prélèvement afin de réduire la douleur au réveil. Les prélèvements terminaux pratiqués sous anesthésie et antalgie, suivis d'une mise à mort sans réveil. Le maximum d’analyses sur les différents prélèvements intermédiaires et finaux seront effectuées afin de tirer le plus d’informations possibles. Des traitements antiseptiques et cicatrisants sont prévus en cas de plaies. cf. grille de score. Note : Les anti-inflammatoires ne peuvent être utilisés, le processus inflammatoire étant important pour notre mécanisme d'action.

Choix des espèces

Des souris possédant un système immunitaire complet seront utilisée. La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques et immunologiques : (1) En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé, avec des grilles de comparaison entre la souris et l'homme très bien définis pour les injections sanguines. (2) La réponse immunitaire chez cette espèce est également très bien définie. Or, seul le modèle animal possédant un système immunitaire complet permet l'étude de l'effet vaccinal contre le cancer. Les expériences s’effectueront sur des souris de 9 à 11 semaines après 7 jours d'acclimatation dans l’établissement utilisateur. A ce stade de développement, la croissance tumorale est plus reproductible et bien tolérée, de plus, le système immunitaire est suffisamment mature pour induire une réponse vaccinale. Les souris utilisées seront toutes des femelles afin de limiter le risque d’agressivité inter-individu par rapport aux mâles. De plus, les études précédentes ayant été faites sur des souris femelles, cela nous permettra de comparer les résultats de cette étude.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime gras pendant vingt-quatre semaines pour induire une obésité et une résistance à l'insuline, avec des injections répétées et des incisions de la queue pour prélever le sang, afin d'étudier le rôle de certains lipides dans la graisse brune. Le porteur relie ce travail au développement de thérapies nutritionnelles contre l'obésité humaine. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'"organisme entier" pour ces questions faisant intervenir plusieurs organes.

Objectifs

L’obésité (accumulation de masse grasse blanche appelée tissu adipeux blanc) est un problème de santé publique dû à un apport calorique trop important, à une sédentarité mais aussi à un déséquilibre dans les lipides ingérés, avec une consommation trop importante en lipides ω6 (huile de tournesol) par rapport aux lipides ω3 (huiles de poisson, colza). Selon les recommandations, un ratio adéquat de lipides ω6/ω3 inférieur à 5 devrait être trouvé dans l’alimentation or actuellement en France ce ratio dépasse 12 en moyenne. L’obésité induit une inflammation chronique responsable du développement de pathologies dites métaboliques comme le diabète de type 2. Une autre masse grasse existe en petite quantité chez l’homme, le tissu adipeux brun qui permet une dissipation de l’énergie ingérée sous forme de chaleur et limite ainsi l’accumulation de tissu adipeux blanc. Il a été montré que cette masse grasse brune est déficiente chez les personnes obèses. Enfin il a aussi été décrit que dans certaines conditions comme l’exposition au froid, du tissu adipeux brun pouvant apparaitre au sein de la masse grasse blanche et ce phénomène est appelé brunissement. À ce jour, il n'existe aucun traitement efficace de l'obésité et une perspective serait de développer des stratégies médicamenteuses ou nutritionnelles favorisant la formation du tissu adipeux brun ou favorisant le brunissement du tissu adipeux blanc. Nous avons montré en culture qu’un lipide dérivé des acides gras ω6 empêchait le brunissement des adipocytes blancs. Des études, montrent qu’une alimentation riche en lipides ω3 contrôle les niveaux de ce lipide et ont des effets bénéfiques sur la santé. Il est ainsi possible d’envisager que ces effets bénéfiques puissent passer par une réactivation de la masse grasse brune du fait d’une diminution de ce lipide. Nous envisageons donc de soumettre des souris à une alimentation grasse avec un fort ratio ω6/ω3 pendant 12 semaines afin d’induire une obésité. Après 12 semaines, les animaux passeront à des régimes avec de faibles ou de forts ratio ω6/ω3 pendant 12 semaines supplémentaires. Nous vérifierons si ce changement alimentaire améliore l’obésité des animaux et l’inflammation associée et si ces effets sont sous-tendus par une augmentation de la masse grasse brune ou du brunissement de la masse grasse blanche. En parallèle nous doserons dans le sang et les tissus la quantité du lipide dérivé des ω6.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à ce que ce travail nous permette de comprendre l’impact des lipides ω6 et ω3 dans le développement de la graisse brune et du brunissement de la graisse blanche, ouvrant la voie au développement de thérapies nutritionnelles pour lutter contre le surpoids/obésité et les troubles métaboliques associés.

Procédures

Les animaux recevront différents régimes pendant 24 semaines. Ils seront placés dans une armoire thermostatée à 30°C pour leur confort thermique. Lors des tests métaboliques aux semaines 12, 22 et 23, les animaux recevront des injections intrapéritonéales et auront des prélèvements (sur animaux vigiles) d'une goutte de sang à la queue. Concrètement, suite à une injection (durée max 5 secondes) de glucose (S12 et S22) ou d'insuline (S23), une légère incision (durée 1 à 2 secondes, une incision unique pour tout le test) est réalisée à la queue et une goutte de sang (5µL, il faut environ 3 à 5 secondes pour que la goutte de sang se forme à la queue par massage de celle-ci) sera prélevée à 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes pour doser la glycémie. Au cours de la dernière semaine (S24), les souris recevront une injection intrapéritonéale quotidienne (durée d'une injection max 5 secondes; 7 injections au total) d’un activateur adrénergique ou d'une solution saline. 10 minutes après la première injection, une goutte de sang sera pélevée (incision 1 à 2 secondes ; formation de la goutte 3 à 5 secondes) à la queue pour un dosage du glycérol, représentatif de l’activité lipolytique des tissus adipeux. Au total un même animal pourra recevoir au maximum 10 injections sur une période de 24 semaines et 195 µL de prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

Dans le programme présenté les nuisances prédictibles pour l’animal sont liées 1) au régime riche en graisse qui induira l’obésité et l'insulinorésistance ; 2) aux douleurs provoquées par les injections intrapéritonéales qui sont nécessaires à différents stades de l’expérimentation pour réaliser les tests métaboliques et 3) aux prélèvements sanguins à la queue pendant ces mêmes tests métaboliques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Après 24 semaines de régime alimentaire, les animaux seront anesthésiés (injection intrapéritonéale), une analyse de la composition corporelle sera réalisée par tomographie (rayons X) et le sang sera prélevé. Les animaux seront ensuite mis à mort et le prélèvement d’un maximum de tissus/organes à la fin de la procédure sera réalisé. Les tissus seront pesés, une partie sera congelée pour les analyses ultérieures (ARN... ) et l’autre partie fixée pour des analyses histologiques. Notre programme vise à étudier l'impact de différents régimes alimentaires (ratio ω3/ω6), sur la fonction des tissus adipeux et sur le métabolisme insulino-glucidique qui implique de nombreux organes (tissus adipeux, foie, muscles, ...), ce qui nous contraint à mettre à mort les animaux afin d'accéder à ces organes.

Remplacement

Ce programme vise à découvrir les liens qui existent entre composition alimentaire en lipides (ratio ω3/ω6), fonction des tissus adipeux blancs, bruns et brites et l’insulino-résistance ou le diabète de type 2. Ces processus pathologiques complexes touchent la régulation du métabolisme insulino-glucidique et impliquent de nombreux organes dont le pancréas, le foie, les tissus adipeux et les muscles. Il n‘existe pas pour l’instant de modèle in vitro qui pourrait remplacer l‘expérimentation sur un organisme entier pour répondre aux questions posées ici. De plus ces expériences font suite à de nombreuses expériences menées in vitro sur des cellules en culture qui ont permis de cibler les hypothèses les plus pertinentes à poser in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été calculé afin d’obtenir des résultats significatifs à partir d’un nombre minimum d’animaux. Nous débuterons par des groupes de 8 souris mâles (72 souris au total) puis nous réitérerons l’expérience par des groupes de 8 souris femelles (72 souris au total) et 4 souris par cage. Le nombre total de souris (cf. ci-dessus) nous permettra d’obtenir en quantité suffisante tous les échantillons tissulaires nécessaires à notre étude. Ce nombre de souris nous permettra également de réaliser des études statistiques adaptées en comparant les groupes deux par deux (régime alimentaire versus régime contrôle, ou encore régime alimentaire versus traitement mimant l’exposition au froid). Si aux termes de la première expérience avec les souris mâles nous n’avons aucun résultat concluant, nous ré-évaluerons l’intérêt de réaliser l’expérience avec les souris femelles.

Raffinement

Les souris utilisées sont des souris contrôles. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées avec le souci de préserver le bien-être de l‘animal : maintien à la thermoneutralité donc à leur température de confort (30°C) ; enrichissement de l’environnement; surveillance régulière; suivi selon une grille d’évaluation prévoyant le recours à des points limites précoces et adaptés (absence de toilettage, perte de poids) ; prélèvements sur animaux vigiles effectués par des personnes expérimentées; prélèvements espacés dans le temps au maximum et volumes prélevés correspondant au minimum nécessaire.

Choix des espèces

Nous envisageons d'utiliser des souris C57Bl6J. Ce modèle correspond à l'espèce et à la souche sur laquelle nous travaillons dans notre laboratoire et pour laquelle nous avons plusieurs données de référence pour notre étude. De plus la souche C57Bl6J est connu pour répondre aux régimes riches en graisse en développant une obésité et une insulinorésistance. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 10 semaines. Ces expériences étant d’une durée maximum de 24 semaines, l’âge maximum des souris en fin d’expérience sera d’environ 34 semaines. L’obésité nutritionnelle prend du temps à se mettre en place et nous voulons examiner des sujets adultes.

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est induit et un traitement au tamoxifène est administré, sans recours à l'analgésie ni à l'anesthésie que le porteur écarte pour ne pas perturber le développement embryonnaire, afin d'étudier les malformations cardiaques chez des souris génétiquement prédisposées. Le porteur indique que le tamoxifène peut être délétère voire mortel pour les femelles gestantes et provoquer des défauts de développement des embryons. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'une surcharge en glucose sur le développement du cœur.

Objectifs

Lors de la grossesse, le tabac, le diabète, l’obésité et l’âge de la mère sont associés à un risque accru d’avoir un enfant présentant une malformation cardiaque. Les mécanismes sous-jacents sont encore mal compris. Les facteurs épigénétiques induits par les changements environnementaux influent profondément sur l’occurrence et le spectre des malformations chez l’homme et les modèles animaux. Par conséquent, une compréhension détaillée de ces facteurs et les altérations génétiques sous-jacentes est cruciale pour un meilleur diagnostic. Les 3 formes d’hyperglycémie maternelle (diabète de type I, II, gestationnel) sont associées à diverses malformations cardiaques congénitales notamment des anomalies de latéralité (hétérotaxie), des anomalies de type conotroncale (ventricule droit à double issue, transposition des grandes artères, tronc artériel commun, ventricule unique), des défauts de septation des cavités cardiaques et d’hypertrophie cardiaque. Ce projet a pour but d’étudier l’effet du diabète pre gestationnel sur le développement embryonnaire de souris génétiquement prédisposées aux malformations cardiaques.

Bénéfices attendus

Le diabète prégestationnel chez la mère augmente le risque de malformations cardiaques chez l'enfant de 5 fois. La prévalence du diabète prégestationnel (type 1 et 2) a d'ailleurs presque doublé au cours des dernières années avec une tendance à augmenter encore plus. Cependant, les mécanismes par lesquels les altérations de l'homéostasie du glucose maternel perturbent le développement cardiaque reste encore largement incertain. Par conséquent, le but de ce travail proposé est d'acquérir une meilleure compréhension des processus compromettant le développement cardiaque dans les cardiopathies induites par le diabète. Cette connaissance nous permettra d'avoir une meilleure prédiction des risques et la possibilité d'identifier des cibles thérapeutiques pour des thérapies individualisées et de prévention. De plus, en utilisant le modèle de méthylation de l'ADN dans le sang, nous serons en mesure de présenter une gamme plus large d'outils de diagnostic pour l'identification et la quantification des facteurs environnementaux contribuant à un développement cardiaque perturbé.

Procédures

Les animaux seront soumis aux suivantes : injection sous cutanée et prélèvement sanguin de 10 microlitres au niveau de la queue..L’induction du modèle sera réalisée par une injection sous cutanée de tamoxifène (médicament bien connu) qui devrait engendrer peu de douleurs aux animaux. Dans cette étude, nous n’avons pas recours à l’administration d’analgésiants et anesthésiants, une procédure pouvant impacter sur le développement embryonnaire compte tenu de l’interaction gènes-environnement et des effets épigénétiques sous-jacents. Dans le cas d’une souffrance légère, la surveillance de l’animal sera renforcée avec une observation bi journalière. L’eau sera remplacée par une eau enrichie en pyruvate 1% jusqu’à la fin du protocole expérimental. Les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de la glycémie, seront limités à un volume de 10 ul par animal et réalisés au niveau de la queue. Ceci est rendu possible par l’utilisation de glucomètre à bandelettes réactives.

Impact sur les animaux

Le paradigme expérimental, induction du diabète, est susceptible d’être générateur de souffrance ou de stress. Un suivi journalier et un scoring au minimum deux fois par semaine seront réalisés sur les animaux afin d’établir les niveaux de douleurs, de souffrance et d’angoisse éventuellement générés lors du projet. Les souris dont les paramètres physiologiques seront modifiés seront mises à mort. Suivant les scores obtenus l’eau complémentée en sucrose pourra être remplacée par une eau sans sucrose jusqu’à la fin du protocole expérimental. L’injection de Tamoxifène peut avoir un effet délétère voir potentiellement mortel pour les femelles gravides si l’administration a lieu en début de gestation. L’administration de Tamoxifène durant la gestation est associée à des défauts de développement du placenta avec pour conséquences des défauts de formation des embryons. Des défauts embryonnaires peuvent aussi être directement liés à l’exposition au Tamoxifène. Bien qu’aucun défaut cardiaque n’ait été décrit à ce jour nous prévoyons d’inclure des groupes supplémentaires afin d’exclure l’impact du Tamoxifène sur l’apparition d’anomalies du coeur et n’envisageons pas d’administration pendant la gestation mais prévoyons une seule injection 7 jours avant la mise en accouplement, à ce stade d’injection le tamoxifène n’aura pas d’effet délétère.

Devenir

Tous les animaux entrant dans cette procédure seront mis à mort.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude d’une surcharge en glucose sur le développement du cœur.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. 810 (540 en procédure 1, 270 en procédure 2) correspond au nombre minimum d’animaux à utiliser afin d’obtenir des données scientifiquement robustes sans augmenter inutilement la souffrance infligée aux animaux. Il s’agit d’une analyse de biologie fondamentale visant à observer l’apparition potentielle d’un phénotype dans un contexte donné et de caractériser ce phénotype. Nous n’utilisons donc pas d’approche statistiques.

Raffinement

Le modèle animal de diabète pre gestationnel qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et est un excellent modèle au regard de la pathologie humaine. Par ailleurs, le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Notamment, les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de la glycémie, seront limités à un volume de 10 microlitres par animal. Afin d'assurer le bien-être des animaux, nous respecterons la réglementation européenne concernant la densité d'animaux par cage et les cycles d’éclairage diurne. Les souris seront au nombre de 5 maximum par cage de 542 cm2 afin de respecter leur instinct grégaire. L’environnement sera enrichi à l’aide de dômes en cartons et de bandelettes de kraft. Les reproducteurs ne seront pas mis en accouplement dans la semaine suivante leur déménagement de pièce ou avant 8 semaines d’âge. Les mères auront au maximum trois portées en production et nous ferons le maximum pour que ces portées ne soient pas immédiatement successives. Bien que le protocole soit relativement peu invasif, un suivi journalier des animaux permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Avant chaque procédure, nous nous assurerons que l’animal présente un bon état général. Après l’injection de tamoxifène, nous nous assurerons qu’aucun animal ne présente de signe d’infection au site d’injection. Le paradigme expérimental, induction du diabète, est susceptible d’être générateur de souffrance ou de stress. Un suivi journalier et un scoring au minimum deux fois par semaine seront réalisés sur les animaux afin d’établir les niveaux de douleurs, de souffrance et d’angoisse éventuellement générés lors du projet. Les souris dont les paramètres physiologiques seront modifiés seront mises à mort. Suivant les scores obtenus l’eau complémentée en sucrose pourra être remplacée par une eau sans sucrose jusqu’à la fin du protocole expérimental. L’animal pourra être hydraté par injection intra péritonéale de solution saline. Pour limiter leur stress, nous doublerons l’enrichissement (bandelettes de kraft et maisonnettes en carton).

Choix des espèces

Notre sujet de travail porte sur les malformations cardiaques causées par une hyperglycémie maternelle. A ce jour, les souris génétiquement modifiées sont les seuls modèles animaux permettant de mimer assez fidèlement ces pathologies. En effet, il existe une excellente homologie des gènes Kir6.2 et Nkx2.5 chez l'humain et chez la souris. Les cœurs humains et murins ont un développement anatomique remarquablement similaire. Par ailleurs, des outils génétiques robustes ont été développés chez la souris ce qui en fait l’un des meilleurs modèles d’étude pour comprendre la formation du cœur. Ce projet utilisera des femelles âgées de 12 à 14 semaines afin d’exclure l’impact de l’âge maternel sur l’apparition d’anomalies cardiaques.