Oncologie

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est provoqué par injection de streptozotocine, puis les animaux subissent des mesures répétées de glycémie par piqûre de la queue, des tests auditifs et une électrophysiologie du nerf caudal sous anesthésie, avant prélèvement des cochlées, pour préciser l'atteinte auditive liée au diabète. Le porteur prévoit la mise à mort des souris perdant plus de 20 % de leur poids ou montrant prostration, léchage excessif ou automutilation, ce seuil déclenchant l'euthanasie. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace ces tests menés sur animal vivant et retient la souris pour la "similitude" de sa fonction auditive avec celle de l'homme.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris : la souris de souche C57Bl/6J Rj (souris présentant une dégradation de sa fonction auditive dès le 2ème mois de vie, modèle de surdité liée à l’âge ou presbyacousie).

Bénéfices attendus

Le diabète représente aujourd’hui la plus fréquente des maladies chroniques puisqu’elle touche près de 6 % de la population. Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par un excès du taux de sucre dans le sang (hyperglycémie). Actuellement le patient diagnostiqué et pris en charge dispose de nombreuses propositions thérapeutiques plus souples d’utilisation et l’innovation pharmacologique est au coeur des progrès dans le traitement du diabète. Cependant au fil du temps, un diabète mal surveillé et mal géré peut entrainer des conséquences dont les plus fréquentes et les plus connues sont la cécité et les amputations des extrémités (doigts et orteils) ou des membres. Ces complications semblent être induites par la détérioration et l’obstruction des petits vaisseaux ou la dégénérescence des nerfs. Cette atteinte des nerfs est classiquement appelée neuropathie. Par ailleurs, les données de la littérature concernant la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques (de type 1) sont contradictoires. Selon une récente méta-analyses, la prévalence de la surdité serait évaluée entre 5.17% et 48% chez les patients diabétiques de type 1. Une autre étude clinique ne révèle aucune différence significative de la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques de type 1 comparativement aux sujets non diabétiques. Les outils d’exploration audiologiques sont-ils assez sensibles pour détecter l’installation d’une atteinte auditive subtile ? De nombreuses études pré-cliniques ont révélé que des pertes massives de cellules ciliées internes, ou de fibres nerveuses pouvaient être sans conséquence sur les seuils liminaires (seuils de détection, déterminés par l’audiométrie). L’atteinte auditive chez les patients diabétiques pourraient donc être sous-estimées car mal évaluée. Il semble donc indispensable de documenter du point de vue fonctionnel et histologique plus précisément sur des modèles murins cette complication « silencieuse » du diabète.

Procédures

- La glycémie sera déterminée par des "prélèvements capillaires" sanguins (gouttes de sang) suite à une légère piqûre au niveau de la queue de l'animal (utilisation de lecteur de glycémie identique au lecteur clinique humaine avec bandelette de prélèvement stérile à usage unique). Cette procédure dure moins de 5 minutes. Cette procédure de détermination de la glycémie est réalisée de façon hebdomadaire. - Injection intrapéritonéale de streptozotocine (1 fois en moins de 2 minutes). Le test pour évaluer si un diabète a été induit par l'apparition d'une neuropathie périphérique, sera effectuée à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%). Par l'insertion de deux paires d'électrodes distantes (une stimulatrice et une enregistreuse du signal) au niveau de la queue de l'animal, une réponse éléctrophysiologique du nerf caudal sera mesurée afin de montrer une possible neuropathie périphérique liée à l'induction du diabète. Une asepsie sera pratiquée sur la queue des animaux par une application d'alcool 70°. Les explorations auditives seront effectuées à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%) . Les deux méthodes utilisées dans ces explorations fonctionnelles sont : -Les otoémissions acoustiques : lorsqu’une stimulation acoustique calibrée est appliquée dans le conduit auditif externe, il est possible de recueillir en retour une réponse physiologique acoustique issue d’une population particulière de la cochlée : les cellules ciliées externes. Cette technique de réalisation simple et rapide (5min par animal) renseigne sur la fonction cochléaire et sur la physiologie des cellules ciliées externes. -Les potentiels évoqués auditifs précoces : il est possible à l’aide d’électrodes intradermiques (3 électrodes placées : au niveau de la mastoïde (électrode active), du vertex et au niveau dorsal) de recueillir la réponse électrophysiologique de la cochlée et des voies nerveuses auditives périphériques. Ainsi à l’aide de stimulations calibrées adéquates il est possible de déterminer des seuils auditifs (corrélat de l’audiogramme clinique, pour les fréquences de 8, 10, 16, 24 et 32kHz) et de déterminer des latences de conduction des voies nerveuses (temps de réalisation 15-20min par animal).

Impact sur les animaux

Si les animaux sont diabétiques, une altération de leur état de santé général peut être visible (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…)).

Devenir

A la fin des explorations fonctionnelles, l’euthanasie des animaux sera réalisée au moyen d’une injection léthale d'euthanasiant chimique en vue de prélèvement des os temporaux pour une étude histologique des cochlées. Les animaux ayant reçu une injection de streptozotocine mais ne développant pas un diabète seront euthanasiés (inhalation de CO2). Les animaux présentant une altération de leur état de santé général (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être) seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2).

Remplacement

Ce projet a pour but d'évaluer l'impact du diabète induit sur l'appareil auditif chez une souche de souris (étude fonctionnelle et histologique). Le modèle de diabète induit par la streptozotocine fait référence dans la communauté scientifique. Du fait d’une grande similitude de la fonction auditive de la souris avec celle de l’homme, cette espèce a depuis longtemps été retenue dans notre équipe de recherche. Pour mieux caractériser l'impact du diabète sur l'audition d'un point de vue fonctionnel, les tests auditifs doivent être réalisés sur des animaux vivants. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal anesthésié, sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements dans de prochains projets.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au minimum, nous projetons d’employer les mêmes animaux diabétiques (n=20) et témoins (n=10) pour les tests fonctionnels auditifs et pour les analyses histologiques. Cependant, dans un premier temps, nous devons déterminer si une seule injection intra-péritonéale de 150mg/kg de streptozotocine induit un diabète chez la souche de souris C57Bl6/JRj (10 animaux). Pour cela, la glycémie (prélèvement sanguin caudal -1goutte par dosage – animal vigil légèrement contraint) des animaux traités par STZ sera évaluée quotidiennement sur 6 semaines pour déterminer le statut « diabétique » définitif des animaux (selon la souche). Les animaux seront euthanasiés dès statut «diabétique » confirmé (inhalation gazeuse de CO2). L’étude statistique sera réalisée à l’aide d’un test de Student en comparant les valeurs obtenues de chaque groupe exposé avec les valeurs du groupe témoin pour chaque test fonctionnel aux différents temps du suivi.

Raffinement

Les animaux seront pesés et observés tous les jours (mobilité dans la cage et/ou immobilité, prostration, prise alimentaire). Le comportement général de l’animal, son apparence, la présence d’eau et de nourriture dans chaque cage seront surveillés quotidiennement (7j/7). Si besoin, les souris diabétiques recevront une injection sous-cutanée (s.c.) d’insuline (dissoute dans du sérum physiologique, 0,6UI/souris) tous les deux jours, afin de leur assurer un statut clinique satisfaisant et de limiter l’inconfort dû au diabète. L’animal sera euthanasié s’il présente un des symptômes suivants : -une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, - une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), -l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…). En référence à un document « points limites », tout comportement de léchage excessif, d’autotomie, de prostration ou de vocalisation conduira à l’euthanasie rapide des animaux par inhalation gazeuse de CO2.

Choix des espèces

La souris de souche C57Bl/6J Rj présente une dégradation de sa fonction auditive dès le 2ème mois de vie (modèle de surdité liée à l’âge ou presbyacousie). L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris présentant une dégradation spontanée de leur fonction auditive. Les animaux utilisés sont âgés de 6 semaines à l'initiation des expérimentations (réception à l'âge de 5 semaines, 1 semaine d'habituation aux conditions d'hébergement). L'appareil auditif de la souris est mature à l'âge de 30 jours.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent un traitement induisant chez leurs embryons des mutations qui reproduisent une carence complète en vitamine A, puis sont tuées par dislocation cervicale pour que les fœtus soient prélevés, observés et fixés, certains fœtus étant refroidis puis plongés dans un fixateur histologique. Le porteur décrit une "douleur minime" pour les femelles et reconnaît que la souffrance fœtale est "difficile à évaluer", les prélèvements étant programmés un jour avant la mort ou la naissance attendue. Il affirme que seul l'animal permet d'étudier l'organogenèse et conclut à l'impossibilité d'un remplacement in vitro.

Objectifs

Selon l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), les anomalies congénitales sont définies comme des anomalies de développement qui surviennent durant la vie intra-utérine et qui peuvent être identifiées avant la naissance, à la naissance ou plus tard dans la vie. Pour mieux appréhender la pathogénie des anomalies congénitales, nous proposons de comparer des reconstructions tridimensionnelles (3D) d'embryons de souris porteurs de mutations connues avec leurs congénères normaux, entre le début de la formation des organes (9.5 jours post-fécondation ; E9.5) et la fin de la gestation (E18.5). Pour les stades de développement compris entre E9.5 et E15.5, nous utilisons une nouvelle technologie d’imagerie, l’HREM (microscopie épiscopique haute résolution), qui génère des images comparables, en termes de résolution, à l’histologie : elle permet de visualiser les surfaces et les volumes des organes internes et des cavités, dans le système nerveux, le poumon, le cœur et les vaisseaux, l'intestin et le système urogénital. Les embryons et fœtus mutants pour les récepteurs de l’acide rétinoïque (Rara, Rarb et Rarg) développent des anomalies congénitales. Ce modèle imite un état de carence complète en vitamine A qui, pour des raisons techniques, n’avait jamais été analysé auparavant puisque cette vitamine est essentielle au développement embryonnaire de tous les mammifères. Ces mutants seront utilisés comme modèle d’anomalie congénitale dans notre étude en imagerie.

Bénéfices attendus

Les anomalies congénitales affectent 1 nourrisson sur 30 partout dans le monde et entraînent annuellement 3 millions d'incapacités physiques, fonctionnelles et mentales. Les anomalies congénitales ne sont diagnostiquées qu'après la naissance ou, plus rarement, en fin de grossesse. Pourtant, la plupart d'entre elles sont déterminées très précocément, au cours des toutes premières semaines qui suivent la fécondation. De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de l’ensemble de ses gènes, la souris est un excellent modèle pour comprendre les maladies humaines. Les études cliniques et les approches expérimentales ont révélé que la vitamine A et ses dérivés actifs (les rétinoïdes dont l’acide rétinoïque) exercent une grande variété d'effets sur l’embryogenèse. Ces anomalies sont retrouvées chez l’un ou l’autre des mutants combinés pour les récepteurs de l’acide rétinoïque (Rara/b, Rara/g et Rarb/g) ce qui suggère une redondance fonctionnelle entre les RARs. Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension du moment propice d’action de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque pour permettre les différentes étapes de l’organogenèse. Cet objectif sera atteint en étudiant les conséquences de l’inactivation de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque. Ceci sera réalisé par l’ablation conditionnelle (à un moment donné du développement embryonnaire) des trois gènes codant pour les RARs.

Procédures

Les souris femelles gestantes sont traitées pour permettre la mutation (recombinaison). Une contention simple qui dure 15 à 20 secondes pour administrer avec soin le traitement. Les souris femelles sont euthanasiées par dislocation cervicale (cela prend entre 5 secondes et 5 minutes selon la méthode utilisée). Les fœtus à E18.5 sont sortis des cornes utérines en incisant longitudinalement le muscle utérin. Après une observation macroscopique, ils sont ensuite euthanasiés par administration d’un euthanasiant chimique (contention de 10 secondes pour administrer l’euthanasiant). Les fœtus à E14.5 sont sortis des cornes utérines. Après une observation macroscopique sous loupe binoculaire, ils sont rendus inconscients par le froid. Ensuite, les foetus sont euthanasiés par immersion dans le fixateur histologique.

Impact sur les animaux

Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux animaux. La souffrance des femelles gestantes est limitée à la contention pour l’administration du traitement permettant la mutation (recombinaison). Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables de nos manipulations génétiques chez la femelle gestante traitée, mais tous les animaux sont surveillés soigneusement. La souffrance foetale est difficile à évaluer si la mort a lieu en fin de gestation ou au moment de la naissance. On peut estimer qu’il peut y avoir souffrance ou inconfort dans le cas d’une mutation où le nouveau-né meurt peu de temps après la naissance voire quelques jours après. Mais, dans le cadre de ce projet, pour ne pas que la femelle gestante souffre de complications et pour minimiser la souffrance ou l’inconfort, les embryons ou les fœtus seront prélevés un jour avant leur mort anticipée ou un jour avant la naissance.

Devenir

Tous les animaux décrits dans ce projet (Femelles gestantes et fœtus) seront euthanasiés. Les femelles gestantes sont euthanasiées pour permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées, adoptées ou replacées. Les fœtus à E14.5 et à E18.5 sont euthanasiés pour les analyses HREM ou les analyses sur coupes. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés, adoptés ou replacés.

Remplacement

L’organogenèse fait intervenir plusieurs types cellulaires de l’embryon. Notre étude vise à évaluer les périodes pendant lesquelles l’acide rétinoïque intervient dans la formation des structures embryonnaires dans un système physiologique. Seule une approche expérimentale avec des animaux permet de répondre à ces questions. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

La stratégie des accouplements permet d’obtenir la moitié des animaux contrôles et l’autre moitié des animaux seront mutants après le traitement utilisé pour permettre la mutation (recombinaison). La stratégie de prélèvement des embryons ou des fœtus permet aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés car les stades sont choisis à des moments clés de l’organogenèse et permettent d’éviter la dissection au hasard. Les mâles et les femelles sont utilisés pour l’étude quand l’organogenèse s’y prête. Par exemple pour les études sur le développement du crâne ou des poumons, nous pourrons analyser les deux sexes. Par contre, pour les études sur le système urogénital, nous aurons besoin d’analyser à la fois des mâles et des femelles. Les nombres d’animaux sont calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de réduction du nombre d’animaux utilisés tout en assurant la qualité des résultats obtenus et la robustesse de leur validité statistique. A chaque stade nous analyserons 3 embryons/foetus contrôles et 3 embryons/foetus mutants. La réduction du nombre d’animaux (2e R de la règle des 3R) est donc appliquée dans notre projet.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour le bien-être des animaux, la surveillance de l’état de santé et des actions appropriées sont réalisées à l’animalerie si nécessaires (soins, analgésie, …). Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux femelles gestantes (traitement utilisé pour permettre la mutation par recombinaison). Le bien-être est surveillé en permanence et toute altération du comportement des animaux (souffrance, angoisse) sera immédiatement discutée avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour prendre les mesures correctives nécessaires. Les malformations congénitales attendues suite à la mutation des gènes Rar entrainent généralement une létalité embryonnaire ou foetale. La souffrance foetale est difficile à évaluer si la mort a lieu en fin de gestation ou au moment de la naissance. On peut estimer qu’il peut y avoir souffrance ou inconfort dans le cas d’une mutation où le nouveau-né meurt peu de temps après la naissance voire quelques jours après. Mais, dans le cadre de ce projet, pour ne pas que la femelle gestante souffre de complications et pour minimiser la souffrance ou l’inconfort, les embryons ou les fœtus seront prélevés un jour avant leur mort attendue ou un jour avant la naissance. Le raffinement (3e R de la règle des 3R) est donc appliqué dans notre projet.

Choix des espèces

De part sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Par ailleurs, le développement embryonnaire normal de la souris est décrit très en détail ce qui en fait un modèle de choix. Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité de réaliser des mutations dans le génome; temps de génération court; génome connu, outils moléculaires). D’autre part la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’homme, et les mécanismes cellulaires à l’œuvre et impliquant l’acide rétinoïque dans l’organogenèse sont conservés chez l’homme. Afin d’évaluer les périodes pendant laquelle l’acide rétinoïque intervient dans la formation des structures embryonnaires (développement du crâne ou de la tête, du tractus urogénital, du tractus gastrointestinal, du système cardiovasculaire ou du système respiratoire), nous allons procéder à une ablation conditionnelle (à un moment donné du développement embryonnaire) des trois gènes codant pour les RARs chez la souris. Cette ablation sera réalisée au moment où les RARs sont supposés être nécessaires aux processus de : neurogenèse, cardiogenèse, développement des bourgeons des membres, développement de l’oeil, etc.. Nous allons prélever les embryons à des stades précis pour pouvoir observer l’organogenèse. Stade traitement des femelles (Stade prélèvement embryons/foetus) E8 (E9 et E10) E8.5 (E10.5 et E11.5) E9.5 (E11.5, E12.5, E13.5 et E14.5) E10.5 (E12.5, E13.5 E14.5 et E18.5) La liste des observations qui vont être faites et qui sont énumérées ci-dessous n’est pas exhaustive : E9 à E10 = Vasculogenèse, développement des cavités cardiaques E10.5 = Trachée et arcs aortiques E11.5 = Artères iliaques, développement des poumons, de l’œil ou des cavités nasales, E12.5 = Cœur, aorte, cavités nasales, œil, rétine, E13.5 = Glandes salivaires, Vessie E14.5 = Paupières, Gonades, Canal de Muller, Rein E18.5 = Morphologie complète de l’embryon

441 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une démyélinisation est provoquée par injection intracérébrale d'un détergent sous anesthésie, complétée par des injections d'un marqueur de prolifération, pour étudier la régénération de la myéline dans la sclérose en plaques chez des souris génétiquement modifiées. Le porteur indique une mise à mort par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque d'un fixateur pour prélever le cerveau. Il affirme que la myélinisation ne peut être reproduite que chez un animal vivant "dans son intégrité" et retient la souris comme modèle de référence des récepteurs de la vitamine A.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune affectant le système nerveux central (SNC). Causée par une dysfonction du système immunitaire, elle engendre des lésions de la myéline qui provoquent des perturbations motrices, sensitives, cognitives, visuelles et autres. Les traitements actuels sont insuffisants pour empêcher la progression du handicap à moyen terme. La myéline est une membrane biologique, essentiellement composée de lipides, qui forme une gaine autour des fibres nerveuses. Cette gaine est nécessaire pour une bonne conduction de l’influx nerveux. Lorsque la myéline est dégradée, son remplacement est effectué par des cellules spécialisées nommées oligodendrocytes (OL). Toutefois, dans la SEP, la myéline est la cible du système immunitaire qui engendre une réaction inflammatoire excessive. A long terme, cette inflammation empêche les OL de reformer la myéline conduisant aux symptomes cités précedemment. Il est important de comprendre pourquoi les OL ne forment plus la myéline. En effet, une stratégie thérapeutique serait de stimuler ces OL pour qu’ils régénèrent la myéline à nouveau. Grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées, nous étudierons des facteurs impliqués dans la génération des OL pour mieux comprendre comment les stimuler à régénérer la myéline. De plus, dans la SEP les cellules immunitaires du SNC, les cellules microgliales (CM), contribuent à la pérennisation de la signalisation inflammatoire mais assurent aussi l’élimination des debris de myéline pour stimuler la remyélinisation. Les déterminants moléculaires impliqués dans le contrôle de ces fonctions opposées des CM ne sont pas connus, alors que leur connaissance est critique pour le développement de nouveaux traitements. Afin de caractériser ces déterminants, nous étudierons les CM et la progression de la remyélinisation par les OL en induisant une perte minime de myéline chez des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

La myéline est une gaine biologique composée majoritairement de lipides qui entoure les fibres nerveuses. Cette gaine est synthétisée par des cellules spécialisées nommées oligodendrocytes (OL) et est nécessaire pour la bonne conduction des influx nerveux. La dégradation de la myéline est un processus physiologique naturel au cours duquel les cellules immunitaires du système nerveux central, les cellules microgliales (CM), éliminent les débris de myéline. Ceci stimule ainsi à nouveau les OL à renouveler la myéline. Toutefois, chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), la myéline est la cible du système immunitaire qui entraine une réaction inflammatoire importante. Une des conséquences de cette réaction inflammatoire est d’empêcher les OL à régénérer la myéline. Différents acteurs ont été identifiés comme facteur stimulant la formation de myéline dans la SEP, notamment des récepteurs de la forme bioactive de la vitamine A. En utilisant des souris modifiées génétiquement, nous déterminerons l’implication de ces récepteurs dans la formation des OL pour comprendre comment ceux-ci favorisent la myélinisation aussi bien en conditions physiologiques qu’en conditions pathologiques. Ceci pourrait mettre en lumière un mécanisme de remyélinisation précis qui pourrait également ouvrir une nouvelle voie de recherche dans la SEP et vers de nouvelles pistes thérapeutiques impliquant la vitamine A. D’autre part, nous caractériserons comment la myéline et notamment les lipides la composant sont pris en charge par les cellules microgliales (CM) pour être éliminés en utilisant des souris génétiquement modifiées. Cette information peut orienter des stratégies thérapeutiques basées sur un apport d’acides gras spécifiques dans la SEP.

Procédures

Une injection intrapéritonéale d’un produit marquant les cellules en prolifération cellulaire sera effectuée sur 231 animaux lors de la procédure 2, et sur 120 animaux lors de la procédure 3, soit sur un total de 351 animaux. Cette injection ne dure qu’une dizaine de secondes entre le moment où l’animal est saisi et le produit injecté. Nous réaliserons également une injection intracérébrale d’un produit détergent pour induire la démyélinisation unilatéralement sous anesthésie générale. Cet acte chirurgical sera réalisé sur 90 animaux en procédure 1, et sur 231 animaux en procédure 2. Cette procédure chirurgicale dure une vingtaine de minutes par animal. Au total, 321 animaux recevront une injection intracérébrale une seule fois.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales vont génèrer un stress chez l’animal. Les procédures des injections intracérébrales peuvent être douloureuses et générer un stress/déconfort à l’animal. Ces procédures seront effectuées par un expérimentateur entraîné sous anesthésie générale avec des propriétés analgésiques et ne devraient pas engendrer de troubles majeurs visibles de comportement car les lésions induites par l’injection seront unilatérales et très limitées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort de deux manières différentes : d’une part par dislocation cervicale qui permet de prélever tous les organes nécéssaires pour les analyses moléculaires (de type Western Blot). D’autre part, une mise à mort par perfusion intracardiaque d’un agent fixateur sera réalisée. Ceci permet la fixation complète et homogène des tissus, y compris du cerveau. Les organes pourront ainsi être prélevés et utilisés à des fins d’imagerie.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les modèles murins par un autre modèle animal dans cette étude pour trois raisons principales : (i) la myélinisation développementale ou remyélinisation est un processus dynamique et multifactoriel dépendant des activités des types cellulaires différents et ne peut être reproduit que chez un animal vivant dans son intégrité; (ii); une analyse de remyélinisation est espèce-dépendant et la souris reste un très bon modèle de la myélinisation chez l’homme; (iii) la souris est notre modèle de référence dans la recherche sur les récepteurs des formes bioactives de la vitamine A car c’est dans ce modèle que nous avons déjà identifié les programmes moléculaires contrôlées par ces récepteurs ainsi que les traitements pharmacologiques pour les futurs développements de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cependant, ce projet émane des nombreuses analyses in vitro réalisées sur des cultures cellulaires qui nous ont amenées à proposer ce projet et tester in vivo nos hypothèses de travail.

Réduction

Dans notre projet nous utilisons le nombre minimal d’animaux permettant d’effectuer les analyses statistiques afin de révéler les différences significatives (n=3). En effet, ces effectifs ont été déterminés à partir de données de la littérature et sont suffisants pour voir si on obtient des différences en comparant la moyenne (et autres paramètres) des différentes conditions, notamment par l'utilisation d'un test de Wilcoxon, ou de Kruskall-Wallis. De plus nous utilisons les deux sexes pour ne pas produire de façon inutile les femelles qui sont plus rarement utilisées pour ces analyses à cause d’effets possibles dus aux différences hormonales ou sexuelles au niveau des fonctions de cellules étudiées. C’est un risque dans cette étude, que nous allons contrôler par une comparaison des résultats provenant des mâles et des femelles pour chaque condition expérimentale et génotypique. Pour minimiser le nombre d’animaux nous allons injecter qu’un hémisphère pour utiliser le deuxième comme contrôle. De plus, les effets de l’intervention chirurgicale (injection de solution saline) seront évalués sur un groupe d’animaux contrôle.

Raffinement

En vue de raffiner les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales (dans des portoirs ventilés, en groupe, et avec un nid) et ils font l’objet d’un suivi adapté et régulier et de soins vétérinaires au besoin. Sont mis à la disposition des souris ad libitum des croquettes et de l’eau. La litière est renouvelée une fois par semaine. Ici, nous minimiserons la douleur chez les animaux. En effet, la dose de lysolécithine utilisée étant très faible, les dégradations de myéline seront mineures et ne devraient pas générer de troubles chez l’animal durant le suivi expérimental. Les procédures expérimentales sont réalisées sous anesthésie générale accompagnée d’analgésiques (Xylazine/Kétamine) afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. De plus, durant la chirurgie, les yeux des animaux sont protégés du dessèchement. Ils sont préservés du refroidissement provoqué par l’anesthésie par l’emploi d’isolant durant l’opération, et leur réveil se fait dans une enceinte chauffée. Les injections intrapéritonéales engendrent un stress chez l’animal. Les animaux ayant reçu l’injection seront remis en groupe en cage et surveillés. Les mises à mort des animaux seront effectuées par un personnel formé et expérimenté.

Choix des espèces

La myéline est une gaine biologique qui entoure les neurones, assurant ainsi leur protection d’une part, et la transmission des messages nerveux d’autre part. La synthèse de myéline (ou myélinisation) est assurée par des cellules spécialisées nommées oligodendrocytes (OL). Chez des patients atteints de sclérose en plaques, la myéline est dégradée par le système immunitaire. La régénération de myéline par les OL (ou remyélinisation) est très limitée voire inexistante. Par conséquent, la transmission des messages nerveux est moins efficace et les patients souffrent de différents symptomes tels que des déficits moteurs et cognitifs. Une stratégie thérapeutique serait de stimuler les OL, notamment via la vitamine A, à régénérer la myéline similairement à leur génération lors du développement embryonnaire En effet, la formation des OL se déroule durant le développement pré et post-natal. Leur formation est un processus dynamique et multifactoriel dépendant des activités de différents types cellulaires qui ne peut être reproduit que sur un animal vivant dans son intégrité. Pour comprendre comment les OL sont ainsi formés, un modèle d’étude ayant un système nerveux proche de l’Homme est nécessaire. La souris est un très bon modèle puisqu’elle récapitule très bien la formation des OL et de la myéline chez l’Homme. Bien que le rôle de la vitamine A dans la formation des OL n’est pas encore élucidé, il est nécessaire d’avoir un modèle où la vitamine A est caractérisée. La souris reste le modèle de référence sur les travaux de la vitamine A. En effet, les mécanismes d’action de la forme bioactive de la vitamine A sont très bien caractérisés chez la souris et différents traitements pharmacologiques sont déjà disponibles pour évaluer son mode d’action. Les étapes clés de la formation de myéline chez la souris ont lieu au jour de la naissance 0 (dit P0), P7, P14, P21 et à l’âge adulte (8 semaines). Pour suivre et comprendre comment la myéline est formée, nous devrons étudier des souris à ces stades de développement. Pour étudier la régénération de myéline en conditions pathologiques comme la sclérose en plaques, des souris adultes (8 semaines) seront utilisées afin d’évaluer le processus d’élimination et de régénération de la myéline.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par inhalation de CO2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules d'ostéosarcome sont injectées dans le tibia sous anesthésie, y compris chez de très jeunes animaux, pour reproduire cette tumeur osseuse de l'enfant et suivre sa progression. Le porteur indique que l'apparition de métastases peut provoquer une gêne respiratoire entraînant une mise à mort immédiate, et un boitement traité au paracétamol. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité du microenvironnement tumoral et retient une lignée conservant un système immunitaire.

Objectifs

L’ostéosarcome est la tumeur osseuse la plus fréquente chez les enfants et les adolescents (âge médian au diagnostic 15 ans). Pour mieux comprendre l’ostéosarcome et donc mieux le traiter, il est nécessaire de développer des modèles animaux récapitulant les interactions entre les cellules tumorales et l’environnement osseux prenant en compte l’âge de survenue. La majorité des modèles d’ostéosarcome sont établis à partir de lignées cellulaires humaines hors de l’os et ne permettent pas alors de reproduire l’interaction de la tumeur avec l’environnement osseux. De plus ces modèles ne possèdent pas le système immunitaire afin d’éviter le rejet de greffes des cellules humaines. Pour mieux comprendre la biologie de cette tumeur, un modèle récapitulant les caractéristiques environnementales et pédiatriques (immaturité du système immunitaire et influence hormonale notamment) serait nécessaire. Nous avons un modèle d’ostéosarcome de souris établi dans le tibia chez des animaux avec le système immunitaire (immunocompétents) et âgés de 5 semaines. Nous souhaitons à présent établir une greffe dans le tibia chez des animaux plus jeunes afin de reproduire l’ostéosarcome de l’enfant (survenue et traitement de l’ostéosarcome avant 13-15 ans). Nous souhaitons le caractériser en termes de progression, histologie, signature moléculaire et immunitaire.

Bénéfices attendus

Nous avons un modèle d’ostéosarcome implanté dans le tibia chez des souris immunocompétentes âgés de 5 semaines. Cet environnement d’origine influe sur le comportement de la tumeur (progression, résistance). Or, les hormones, notamment sexuelles, ont été démontrées comme agissant également sur le développement des os. Un modèle d’ostéosarcome au niveau de l’os établi chez des animaux plus jeunes récapitulerait les étapes essentielles de l’ostéosarcomagenèse d ans le contexte du système immunitaire immature avec une influence hormonale. Un tel modèle permettrait d’avancer les connaissances biologiques de l’ostéosarcome et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques en tenant compte de ses particularités notamment celles liées à l’âge de survenue de cette tumeur pédiatrique avec un pic à la puberté.

Procédures

Les animaux vont subir une injection orthotopique des tumeurs en intratibiale dans toutes les procédures sous anesthésie et de durée 5 min au maximum.

Impact sur les animaux

En cas d’apparition des métastases, une gêne respiratoire peut subvenir (fréquence respiratoire irrégulière ou accélérée). Cette gêne est rapidement repérée grâce aux observations cliniques régulières et l’animal sera mis à mort immédiatement pour éviter sa souffrance. Dans le cas de la douleur de l’animal, le plus souvent observer par le boitement de l’animal qui ne pose pas sa patte au sol, on administrera un antalgique (paracétamol, 300 mg/kg) dans la boisson des animaux. En cas de non amélioration de l’état de l’animal jusqu’à 3h après l’administration du paracétamol, l’animal sera mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par l’inhalation de CO2 à la fin des procédures et les tissus seront récupérés pour des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Le microenvironnement de la tumeur étant très complexe, il n’existe pas un autre moyen i.e. in vitro, pour reproduire sa complexité avec tous ses composants, notamment immunitaires et d’autres modèle in vivo sont insuffisants.

Réduction

Ces expériences de la mise en place du modèle par l’injection intratibiale des cellules tumorales de souris seront réalisées de façon séquentielle par les procédures afin de réduire le nombre d'animaux. A la fin des procédures les animaux seront mis à mort et les tissus collectés afin de construire une banque tissulaire pour d’autres analyses histologiques et moléculaires. Il n'y aura pas de statistiques pour les procédures 1 et 3 avec une détermination de la quantité des cellules à injecter par la voie intratibiale. Pour les procédures 2 et 4 des tests paramétriques ou non-paramétriques, selon les règles de leur application, pour la caractérisation de l’environnement tumoral pourront être appliqués.

Raffinement

Toute intervention d’injection intratibiale sera faite sous anesthésie générale. Les animaux seront manipulés sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale. Une définition précise des points limites conduisant à l'arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des animaux. Une surveillance adaptée des animaux, une pesée bihebdomadaire et une observation au minimum 3 fois par semaine permettront d’éviter toute douleur ou souffrance de l’animal. Dans le cas de la douleur de l'animal, le plus souvent observer par le boitement de l'animal qui ne pose pas sa patte au sol, on adminsitrera un antalgique (paracétamol) sans influence sur le système immunitaire dans la boisson des animaux. Les animaux plus jeunes à l’implantation tumorale seront surveillés avec attention accrue sur la journée après le réveil afin de vérifier que la mère ne les rejette pas. En plus, pour éviter le rejet par la mère nous minimiserons le temps de séparation des petits avec la mère. Nous remettrons les petits dans le nid après qu’ils aient été frottés avec de la litière de la cage d’origine.

Choix des espèces

Nous disposons d’un modèle d’ostéosarcome établi par l’injection dans le tibia dans les souris âgées de 5 semaines. Ce modèle est à notre connaissance le plus proche de l’ostéosarcome humain (agressivité, pouvoir métastatique, environnement immunitaire) hormis les cancers spontanés. Les cellules utilisées sont une lignée cellulaire d’ostéosarcome d’origine des souris de la même souche ; ce modèle peut donc être établi sur un animal immunocompétent, condition nécessaire pour étudier l’environnement immunitaire de cette tumeur. L’âge plus jeune ne devrait pas influer le taux de prise tumorale, voire le taux de prise peut être améliorer avec le système immunitaire immature avec moins de rejet de greffe.

40 cailles japonaises adultes vont être utilisées dans des procédures classées en gravité modérée, puis gardées pour de futurs projets ou confiées à une association pour placement. Chaque oiseau est logé en cage individuelle et déplacé deux à quatre fois par semaine pendant trois semaines pour des tests de réaction à la nouveauté, isolé au plus dix minutes, son comportement étant filmé. Le porteur situe la gravité surtout dans le logement individuel, qu'il reconnaît comme une nuisance pour les femelles, et affirme n'infliger aucune atteinte physique. Il décrit un projet collaboratif d'observation du comportement et retient la caille pour sa petite taille et son développement rapide.

Objectifs

Le projet global est un projet collaboratif multisite de science ouverte qui vise à collecter le plus de données possibles sur la cognition des oiseaux afin de comparer différentes espèces, d'évaluer la variabilité individuelle et de relier facteurs socio-écologiques (alimentation, socialité...) et évolution de capacités cognitives caractéristiques de chaque espèce. Le premier volet du projet porte sur la néophobie, c'est-à-dire la réaction à la nouveauté de différentes espèces d'oiseaux et de différents individus. La néophobie détermine la façon dont les individus vont interagir avec leur environnement et l'explorer et va donc avoir des conséquences sur l'adaptation et la survie des individus, notamment dans un environnement changeant. Toutes les espèces sont les bienvenues dans le projet collaboratif. Celle que nous étudierons est la caille japonaise. Deux autres laboratoires vont utiliser cette espèce, ce qui permettra d'obtenir plus de données et d'évaluer la reproductibilité et la généralisation du protocole et des résultats obtenus. Le projet s'articule autour de 3 questions : la première est de comparer la néophobie chez différentes espèces et de voir si l'espèce peut prédire le niveau de néophobie ; la deuxième est d'examiner les effets de facteurs socio-écologiques tels que la taille, le régime alimentaire, la socialité... sur la néophobie ; et la troisième est de tester la répétabilité dans le temps et dans le contexte des réactions individuelles.

Bénéfices attendus

Nous espérons apporter une contribution significative à un projet collaboratif multisite qui devrait aider à mieux comprendre le comportement et la biologie des oiseaux en général, et plus précisément leurs capacités cognitives. D'un point de vue plus restreint, les données collectées nous permettront aussi de mieux connaître le comportement et la variabilité individuelle des cailles. La néophobie est un comportement déterminant lors de toute situation nécessitant de placer l'animal dans un environnement nouveau ou de le confronter à des objets inconnus. Il est donc crucial de pouvoir la mesurer chez différents individus et de voir comment elle se caractérise, en général mais aussi chez chaque individu.

Procédures

Les animaux seront élevés en cages individuelles. Cela peut constituer une nuisance pour les femelles, mais pas pour les mâles, qui ne se tolèrent pas. Les cages seront néanmoins placées dans une pièce où les oiseaux pourront se voir et s’entendre. Les individus seront déplacés et testés dans un dispositif auquel ils auront été habitués. Ils seront testés au plus une fois par jour, 2 à 4 fois par semaine, pendant 3 semaines. Ils seront isolés le temps des tests expérimentaux (pas plus de 10 minutes). Leur comportement sera filmé afin que la présence d'un expérimentateur ne les perturbe pas.

Impact sur les animaux

Les éléments qui sont susceptibles de perturber les animaux et de les stresser sont le déplacement et l'isolement lors des tests (pas plus de 10 minutes par jour), et la présence d'un objet nouveau. La présence d’un objet nouveau est par exemple susceptible de réduire la mobilité des animaux qui auront peur de l’approcher. Nous nous attendons néanmoins à ce que les effets de ces perturbations soient minimes et à ce que les animaux retrouvent très rapidement un comportement habituel une fois leur cage de vie et les congénères retrouvés (les animaux seront hébergés dans des cages individuelles mais dans une pièce où ils peuvent voir et entendre des congénères).

Devenir

Le projet n’implique aucune atteinte à l’intégrité physique et comportementale des animaux. Ceux-ci pourront donc être, soit gardés au laboratoire pour de futurs projets, soit confiés à une association de réhabilitation des animaux de laboratoire pour placement en refuge ou en famille d’accueil.

Remplacement

Le projet consiste à observer le comportement d’animaux vivants libres de leurs mouvements et de leurs réactions, ce qui, par essence, exclut tout remplacement par des modèles autres que ces animaux.

Réduction

Le projet s'inscrit dans le cadre d'un projet plus vaste qui cherche à collecter le plus de données possibles venant de structures et institutions du monde entier. Il se base sur le modèle d'autres études multisites qui ont réussi à constituer de vastes banques de données qu'aucune structure ou institution aurait pu collecter à elle seule. Cette approche collaborative multisite nous permet de réduire au minimum le nombre d'individus testés, tout en gardant un échantillon suffisant pour observer des effets modérés à forts et des variations entre individus.

Raffinement

Tout sera fait pour limiter les manipulations des animaux. Les tests nécessiteront néanmoins de déplacer les animaux et de les isoler de façon ponctuelle et limitée dans le temps (pas plus de 10 minutes par jour). Les oiseaux seront hébergés dans des cages individuelles enrichies (avec nourriture et eau à volonté, abri, substrat permettant d’exprimer des comportements naturels), en présence de congénères (contact auditif et visuel). Ils seront soignés et observés tous les jours. La détection de tout changement de comportement conduira à isoler l'individu et à le soigner si nécessaire, l’objectif étant de pouvoir le remettre dans ses conditions de vie habituelles dès que possible.

Choix des espèces

Les cailles japonaises sont domestiquées depuis des siècles. En raison de leur taille relativement petite et de leur développement rapide, elles sont rapidement devenues populaires tant dans l'industrie agricole que dans la recherche scientifique. Ce sont des gallinacées dont les capacités cognitives ne sont pas toujours suffisamment explorées. Pourtant, elles sont capables d'apprentissage et sont douées d'une mémoire pouvant aller jusqu'à au moins 1 mois. En tant que telles elles ont donc toute leur place dans une étude comparative sur la cognition chez les oiseaux. Leur comportement social (notamment maternel), leur régime alimentaire et leurs cycles biologiques sont bien connus, ce qui permettra de fournir les données socio-écologiques nécessaires, à la comparaison des autres espèces du projet collaboratif qui englobe notre étude, et à la compréhension de l'évolution des capacités cognitives propres à chaque espèce. Les cailles utilisées seront âgées de 7 à 8 mois. A cet âge, elles ont atteint leur maturité sexuelle et on peut considérer que leurs traits de personnalité sont stables, ce qui nous permettra de caractériser chaque individu de façon robuste et de comparer les différents individus entre eux pour estimer la variabilité inter-individuelle.