Oncologie

110 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une tumeur humaine greffée, elles reçoivent cinq injections dans la veine de la queue puis sont imagées pour suivre la colonisation de la tumeur par des bactéries, avant mise à mort par surdose d'anesthésique et dislocation cervicale. Le porteur précise que le projet est une prestation de service pour un client privé cherchant à utiliser ces bactéries comme vecteur thérapeutique. Il affirme que la physiologie globale de l'animal ne peut être remplacée pour étudier cette colonisation.

Objectifs

Ce projet est réalisé dans le cadre de la contractualisation de prestations de services pour un partenaire privé. Cette étude vise à imager la colonisation par des bactéries d'un modèle de cancer implanté en sous-cutané grâce au 18F-fluorodeoxysorbitol (18F-FDS).

Bénéfices attendus

La visualisation des bactéries grâce au 18F-FDS permettra de valider la colonisation des tumeurs par les bactéries. Ainsi, elle permettra à notre client de définir si les bactéries utilisées dans cette étude pourraient être interessantes pour vectoriser des molécules d'intéret vers les tumeurs dans une optique d'utiliser ces bactéries comme un nouvel outils de ciblage thérapeutique.

Procédures

Les animaux recevront au total 5 injections en intraveineuse dans la veine caudale en vigile dans un système de contention dédié: J0: 1 injection intraveineuse des bactéries ou du véhicule (volume environ 50µL; durée moins de 1min) et 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). J1: 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). J4: 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). J6: 1 injection intraveineuse de 18F-FDS (volume environ 100µL; durée moins de 1min). NB: la demi-vie du 18F étant de 110min, il est nécessaire de réinjecter les souris pour chaque point de suivi soit à J1, J4 et J6.

Impact sur les animaux

Aucun effet délétaire de l'injection de 18F-FDS ou des bactéries n'est attendu sur la durée du suivi en imagerie. Les effets indésirables pourraient être liés à la pousse tumorale et à une nécrose précoce de la tumeur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par surdosage d'anesthésie gazeuse suivie d'une dislocation cervicale en vue des analyses de comptage des organes ex vivo.

Remplacement

La physiologie globale de l'animal entre en jeu dans le processus étudié (colonisation de bactéries depuis le tractus digestif vers des tumeurs). Ainsi, l'animal ne peut être remplacé dans cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience de notre client sur ces modèles murins de tumeurs et le nombre d'animaux nécessaires pour apporter une valeur statistique à l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire est réduit au maximum en sélectionnant uniquement les expérimentations essentielles.

Raffinement

Un enrichissement des cages d’hébergement sera assuré par l'ajout de briquettes de bois. Les animaux seront suivis de façon quotidienne. Ainsi tout signe d’inconfort pourra être détecté rapidement ce qui permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

La souris immunodéprimée est classiquement utilisée pour les études en cancerologie. Son statut immunitaire permettant de réaliser des xénogreffes de tumeurs humaines. Les animaux seront inoculés avec une xénogreffe chez notre client à 5 semaines. Ils seront transférés par un transporteur agréé vers notre établissement à 6 semaine et seront hébergés pour une durée estimée à 4 semaines (le temps de la croissance tumorale).

54 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par gavage une molécule dérivée d'une plante, sont maintenues en cage individuelle pour mesurer leur prise alimentaire, puis mises à mort par perfusion intracardiaque d'un fixateur afin d'examiner les réseaux nerveux de l'appétit. Le porteur reconnaît que le gavage entraîne un inconfort et que l'isolement est imposé pour la mesure. Il présente cette molécule comme un futur coupe-faim et complément alimentaire contre l'obésité, et affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier la prise alimentaire.

Objectifs

L’obésité, qui se définie par un excès de poids en raison d'une augmentation excessif de la masse adipeuse, est connue pour augmenter la prévalence des maladies cardiovasculaires, du diabète de type 2 et de certains types de cancer. L’obésité est reconnue comme une maladie par l’organisation mondiale de la santé depuis 1997. A l’échelle mondiale, on estime à plus de 600 millions le nombre de personnes obèses et à 2,8 millions le nombre de personnes décédant chaque année de surpoids ou d’obésité. Ces chiffres ne font qu’augmenter depuis des décennies, que ce soit dans les pays développés ou dans les pays émergeants. Souvent associé à l’obésité, le diabète de type 2 ou diabète sucré est l'une des maladies dont la croissance est la plus rapide au monde. Cette pathologie métabolique se caractérise par une hyperglycémie résultant d'une anomalie de la sécrétion d'insuline, d'une résistance à l'insuline ou des deux à la fois. Depuis l'Antiquité, diverses plantes ont été utilisées à des fins médicinales dans le monde entier. Cleistocalyx operculatus est une plante largement répandue dans l’Asie du sud dont l’extrait est couramment utilisé en médecine traditionnelle. Il a été récemment montré que l’extrait de Cleistocalyx operculatus exerçait une activité anti-hyperglycémique. La 2 ', 4'-dihydroxy-6'-méthoxy-3',5'-diméthylchalcone (DMC), un composé majeur de cet extrait de plante, exerce des effets anti-tumoraux, antioxydants et anti-inflammatoires. Récemment, il a été montré que le DMC empêche le développement excessif du tissu adipeux et limite les effets toxiques de l’hyperglycémie. Synthétisé à partir de la molécule DMC naturelle, une molécule X résistante à la dégradation par le foie et donc susceptible d’avoir des effets plus marqués. Dans une première étude, nous avons déjà montré l’effet coupe faim de la molécule X (65 mg/kg de poids corporel) chez des animaux obèses. Dans ce contexte, le présent projet vise à poursuivre le travail en cours i/en étudiant l’action coupe-faim d’une molécule X d’origine végétale chez la souris obèse (ob/ob) et chez la souris non obèse (C57Bl/6), ii/ en déterminant si la molécule induit des nausées et iii/ en identifiant les réseaux neuronaux activés suite à l’administration de cette molécule. Ce travail s’inscrit dans un contexte général d’études précliniques de compléments alimentaires ciblant le traitement des troubles de la balance pondérale (diabète, obésité).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer les effets de la molécule X sur le comportement alimentaire. Les résultats obtenus permettront de préciser la nature des réseaux neuronaux activés par cette molécule et ainsi déterminer si elle est capable d’affecter la prise alimentaire en agissant sur l’hypothalamus et le tronc cérébral, principales structures nerveuses impliquées dans la régulation de l’appétit. La mise en évidence d’un effet anorexigène « coupe faim » de la molécule X en ferait un bon candidat comme complément alimentaire pour le traitement des troubles de la balance pondérale.

Procédures

Les animaux recevront la molécule X ou son véhicule par gavage. Le gavage est réalisé à l’aide d’une canule d’intubation de taille adaptée, délicatement introduite dans l’œsophage jusqu’à l’estomac. L'administration par gavage étant donné le volume administré ici durera une dizaine de secondes.

Impact sur les animaux

Le gavage entraine un inconfort chez l’animal. L'isolement des souris pendant les périodes néccésitant une mesure individuelle de la prise alimentaire est indispensable.

Devenir

Les analyses histologiques post-mortem permettront de vérifier l'histologie des tissus prélevés afin d'écarter un effet potentiellement indésirable de la molécule. Une partie de tissus prélevés constituront un banque de tissu pour de future exploration histologique et immunohistochimique.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact de la consommation de la molécule X sur l’homéostasie énergétique et la prise alimentaire.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à ce projet est de 54 souris mâles. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Pour la procédure 1. Pour minimiser, le nombre d’animaux, chaque animal recevra le véhicule puis les différentes doses de la molécule X, avec une période de 72h entre chaque administration. Pour la procédure 2 : Pour minimiser les tests, seule une dose de la molécule X, validée lors de la procédure 1, sera utilisée ici. Pour la procédure 3 : Pour minimiser les tests, seule une dose de la molécule X, validée lors de la procédure 1, sera utilisée ici Pour l’effectif par lot dans les procédures 1 et 2, le nombre minimum de souris nécessaires pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives dans l’évaluation de la prise alimentaire entre les lots a été établi à 6 animaux par lot compte-tenu de la variabilité des mesures. Pour la procédure 3, le nombre d’animaux par lot est de 6 et a été déterminé à partir de nos résultats obtenus au cours d’études précédentes. Ce nombre tient compte des variabilités que nous avons pu observer dans l’expression de la protéine c-Fos d’un animal à l’autre.

Raffinement

Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fera l’objet d’une quantification par une grille de score adaptée, assortie de points limite et points d’arrêt préétablis permettant une prise en charge adaptée. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous analgésie et anesthésie. La mise à mort par perfusion intracardiaque de PFA sera réalisée sous analgésie pré-opératoire et anesthésie générale. Les animaux seront habitués à la contention et au gavage. Ces phases d’habituation ont pour objectif de réduire l’angoisse animale et d’éviter des fluctuations importantes de la prise alimentaire due à la manipulation des animaux et à la contention. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire pour une analyse fine de la prise alimentaire de chaque souris. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes pour rongeurs en polycarbonate sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères et un enrichissement plus varié est mis en place.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque, d’une part, c’est le modèle le plus documenté dans la littérature scientifique, et d’autre part notre projet implique l’utilisation de souris génétiquement obèses permettant d’étudier l'impact de la molécule X sur la prise alimentaire. Des souris adultes de 8 semaines entreront dans chacune des procédures. Ainsi, les souris seront accueillies en hébergement à 7 semaines. Les expérimentations devront être terminées à la fin de la 15ème semaine car le profil hyperglycémique des souris obèses ob/ob tend à diminuer au-delà de cet âge.

25 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une plaie est faite dans le pharynx puis suturée et recouverte d'un biomatériau, pour tester un dispositif censé prévenir les fistules salivaires après ablation du larynx chez l'Homme. Le porteur liste comme risques un hématome, une infection, une fistule, des douleurs à l'alimentation et une dégradation de l'état général. Il indique que la mise à mort est nécessaire pour l'analyse histologique et qu'aucun modèle in vitro ou in silico de fistule salivaire n'existe.

Objectifs

Le présent projet vise à développer un biomatériau innovant sous la forme d'un film double couche pour la prévention des fistules salivaires (fuite de salive par défaut de cicatrisation) après une chirurgie du cou / de la gorge (laryngectomie totale). Cette chirurgie consiste en l'ablation du larynx, généralement pratiquée pour traiter un cancer. La fistule salivaire est une complication fréquente de cette chirurgie, et elle est associée à de fréquentes complications, un allongement de la durée d'hospitalisation, des chirurgies répétées, des dépenses de soins accrues, une qualité de vie moindre, voire un décès. Le projet est une collaboration entre un établissement de santé spécialisé en cancérologie, 2 laboratoires de recherche académique spécialisés dans les biomatériaux et 2 partenaires industriels. Ce projet s’appuie sur des résultats préliminaires concernant le design d'un biomatériau. Le projet présenté ici consiste à évaluer le biomatériau sur chirurgie du cou / de la gorge chez le petit animal (n = 25 rats). L'objectif de ce projet est l'étude de la tolérance et l'intégration du biomatériau (bioadhésion et biointégration).

Bénéfices attendus

Développement d'un biomatériau innovant permettant de diminuer le taux de fistule salivaire (fuite de salive par défaut de cicatrisation) après chirurgie du cou / de la gorge (laryngectomie totale) chez l'homme. De nombreux bénéfices secondaires sont attendus, comme une diminution du taux de fistule salivaire et des complications suscitées qui en découlent, et donc de la durée d'hospitalisation moyenne après laryngectomie totale.

Procédures

Une chirurgie sous anesthésie générale consistant à effectuer une plaie dans le pharynx (situé dans le cou / dans la gorge), la suturer et couvrir la suture par le biomatériau. Chirurgie durant 30 minutes environ. Réalisation au cours de la même anesthésie d'un prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

Risque d'hématome, infection du site opératoire (abcès), fistule salivaire (pharyngostome), douleurs à l'alimentation, impact sur le comportement et déterioration de l'état général.

Devenir

Mise à mort nécessaire car l'objectif primaire de l'étude concerne l'étude de la tolérance et l'intégration du biomatériau (bioadhésion et biointégration), requérant une analyse histologique (autopsie).

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier la bioadhésion et la biocompatibilité de ce biomatériau nouveau dans une étude préalable sur modèle animal. Le dispositif médical n'a jamais été testé in vivo. Les analyses in vitro ont été réalisées, un modèle in silico n'est pas envisageable pour ce projet. De plus, aucun modèle de fistule salivaire in silico ou in vitro n'existe ou n'est envisageable à l'heure actuelle, du fait d'une grande complexité anatomique, histologique et microbiologique.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Des tests in vitro ont été réalisés au préalables afin de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés. 25 animaux sont nécessaires pour atteindre l'objectif de l'étude selon le design suivant : (risque alpha = 10%, 1-beta=90%) et (p0=70%; p1=90%).

Raffinement

Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur. Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès ad libitum à l'eau et à de l'alimentation molle (croquettes ramollies). Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages seront de taille adaptée à la règlementation à savoir un compartiment minimal de 800cm² par animal. Le change sera effectué 2 fois par semaine. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car une analyse de l'intégration du biomatériau au microscope est nécessaire (autopsie).

Choix des espèces

Rats Whistar mâles sexuellement matures pour plus de robustesse et pour faciliter la chirurgie (pharynx plus grand). Modèle animal de pharyngotomie simple, fiable et robuste, déjà décrit dans la littérature.

424 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées en vie pour de futures expériences. Chaque souris reçoit une puce RFID implantée sous la peau par une courte chirurgie sous anesthésie, avant un suivi comportemental automatisé en groupes de quatre pendant un à trois jours, par caméra de profondeur et apprentissage automatique. Le porteur indique que les animaux seront réutilisés ensuite pour de l'électrophysiologie, de la biochimie et de l'anatomie, procédures qui supposent leur mise à mort. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'analyser le comportement d'un organisme dans son environnement social.

Objectifs

Les études de neuroscience utilisent des modèles animaux pour étudier l'impact de facteurs environnementaux ou de mutations génétiques sur des traits complexes tels que la prise de décision et les interactions sociales. Nous voulons implanter une méthode d'analyse en temps réel du comportement de souris hébergées par groupes de quatre au maximum sur plusieurs jours et dans des environnements enrichis. Cette méthode combine la vision par ordinateur grâce à une caméra infrarouge à détection de profondeur, l'apprentissage automatique pour l'identification des animaux et des postures, et l'identification par radiofréquence pour contrôler la qualité du suivi des souris. Elle suit plusieurs souris avec précision, extrait une liste de traits comportementaux des individus et des groupes de souris, et fournit un profil phénotypique pour chaque animal.

Bénéfices attendus

Les souris présentent une organisation et un développement des réseaux cérébraux similaire à celle décrite chez l'homme. Les souris sont des animaux couramment utilisés en neuroscience rendant nos résultats pertinents pour une large communauté scientifique. Les souris ont un riche répertoire comportemental ; notamment en ce qui concerne l’interaction social. Il n’existe pas de méthodes alternatives à l’analyse du comportement animal, permettant d’appréhender l’ensemble d’un organisme au sein de son environnement social. À ce jour, il reste donc encore indispensable d’utiliser des modèles animaux (en l’occurrence les souris des deux sexes) pour générer des connaissances valides en recherche fondamentale, dans le domaine du comportement social. Ainsi les bénéfices attendus du rpjet

Procédures

Afin d'analysee en temps réel du comportement de souris hébergées par groupes de quatre au maximum sur plusieurs jours et dans des environnements enrichis, tout les animaux sont implanaté en sous-cutannée par une puces RFID permettant l'identification par radiofréquence pour contrôler la qualité du suivi des souris. Donc toutes les souris seront soumises à une courte chirurgie sous anesthésie. Pour effectuer le suivi comportemental automatisée et sans manipulation de plusieurs souris avec précision et créer un profil phénotypique pour chaque animal, toutes les souris seront hébergées dans le système LMT par groupe de 4, sans manipulation pendant 1 à 3 jours. Au terme de la cession expérimentale les souris seront replacées dans leur cage habituelles, dans changer les groupe social. Les nuisances attendues ont pour origine la courte chirurgie (sous anesthésie) nécessaire à l'implantation, sous-cutanée des puces RFID. Compte-tenu de la brieveté de l'intervention et des soins post-op (analgésie cutanée et surveillance des souris), peu d'effets indésirables sont à craindre.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues ont pour origine la courte chirurgie (sous anesthésie) nécessaire à l'implantation, sous-cutanée des puces RFID. Compte-tenu de la brieveté de l'intervention et des soins post-op (analgésie cutanée et surveillance des souris), peu d'effets indésirables sont à craindre.

Devenir

A la fin de la procédure tous les animaux (424) sont gardés en vie, dans leurs cages habituelles. Ils pourront être réutilisés ultérieurement pour des expériences d'électrophysiologie, de biochimie et d'anatomie afin de réduire le nombre d'animaux expérimentaux utilisés par l'équipe

Remplacement

Les souris présentent une organisation des réseaux cérébraux similaire à celle décrite chez l'homme. Les souris sont des animaux couramment utilisés en neuroscience rendant nos résultats pertinents pour une large communauté scientifique. Il existe également de très nombreux modèles souris génétiquement modifiés qui modélisent de manière adéquate les pathologies neuropsychiatriques que nous étudions.

Réduction

Réduire, Raffiner : Mâles et femelles pour rendre compte au mieux des différences entre les deux sexes et limiter le nombre d’animaux utilisés. Outre l’intérêt scientifique et translationnelle de l’étude des animaux des deux sexes, la communauté européenne recommande et le NIH impose l’étude des deux sexes. C’est également un moyen de raffiner nos expériences et de réduire le nombre d’animaux. Si aucune différence statistique n’est observée entre mâles et femelles les deux sexes seront regroupés et le nombre d’animaux utilisé réduit. De plus la méthode LMT est validée chez les souris, les articles publiés avec ce modèle ont utilisé les souris : l’existence de données publiées permettra de limiter les animaux nécessaires et nos résultats seront partagés sur la data base souris LMT.

Raffinement

Réduire, Raffiner : Mâles et femelles pour rendre compte au mieux des différences entre les deux sexes et limiter le nombre d’animaux utilisés. Outre l’intérêt scientifique et translationnelle de l’étude des animaux des deux sexes, la communauté européenne recommande et le NIH impose l’étude des deux sexes. C’est également un moyen de raffiner nos expériences et de réduire le nombre d’animaux. Si aucune différence statistique n’est observée entre mâles et femelles les deux sexes seront regroupés et le nombre d’animaux utilisé réduit. De plus la méthode LMT est validée chez les souris, les articles publiés avec ce modèle ont utilisé les souris : l’existence de données publiées permettra de limiter les animaux nécessaires et nos résultats seront partagés sur la data base souris LMT.

Choix des espèces

Les souris présentent une organisation des réseaux cérébraux similaire à celle décrite chez l'homme. Les souris sont des animaux couramment utilisés en neuroscience rendant nos résultats pertinents pour une large communauté scientifique. Il existe également de très nombreux modèles souris génétiquement modifiés qui modélisent de manière adéquate les pathologies neuropsychiatriques que nous étudions. Les implantataions de puces RFID auront lieu au moins une semaine avant la première période d'enregistrement. Ainsi les implantations eront réalisées entre P25 et P28. La première session d'enregistrement de 5 jours sera effectuée entre P35 et P40, la seconde session d'enregistrement de 5 jours sera effectuée à P100, au stade adulte.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est implantée sous la peau, puis elles reçoivent par voie intraveineuse des formulations d'un photosensibilisateur avant prélèvement de sang et d'organes après mise à mort, pour comparer la diffusion de deux formes liposomales au produit de référence. Le porteur indique que les souris maintenues à l'obscurité jusqu'à 48 heures subissent un stress, la lumière étant évitée pour prévenir la photosensibilisation. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne peut être maintenu assez longtemps pour étudier cette diffusion dans l'"organisme entier".

Objectifs

La thérapie photodynamique est un traitement employé en cancérologie pour éradiquer les tumeurs de petite taille accessibles à la lumière. Le principe repose sur l’activation, en présence d’oxygène et de lumière, d’une molécule appelée photosensibilisateur qui se localise préférentiellement dans la tumeur. La meta-tétra(hydroxyphényl)-chlorine (mTHPC) connue sous le nom de Foscan® est approuvée en clinique pour le traitement alternatif à la chirurgie des tumeurs des voies aéro-digestives supérieures mais étant peu soluble dans l’eau, elle persiste longtemps au niveau du site d’injection, freinant sa distribution aux organes et notamment à la tumeur, et entrainant des problèmes de photosensibilisation cutanée. Les objectifs de ce projet sont d’étudier le devenir au cours du temps dans le sang (pharmacocinétique) et la biodistribution au niveau tissulaire et intratumoral par imagerie de fluorescence de 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC en comparaison avec le Foscan® comme référence, administrés par voie intraveineuse chez la souris après induction d’une tumeur sous-cutanée. Lorsque la taille de la tumeur aura atteint le volume requis, les souris recevront par voie intraveineuse l’une des deux formulations liposomales ou le Foscan®. Les prélèvements de sang réalisés sous anesthésie, d’organes (peau, muscle, foie, reins, cœur, poumons et intestins) et de tumeurs réalisés après la mise à mort des animaux, seront effectués à différents temps après injection des 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC ou du Foscan®, avec 5 souris par temps de prélèvement et par produit injecté.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer la pharmacocinétique et la biodistribution tissulaire et intratumorale de 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC en comparaison avec le foscan®, composé à base de mTHPC utilisé en clinique. Le Foscan® est en effet utilisé pour le traitement alternatif à la chirurgie des tumeurs des voies aéro-digestives supérieures mais étant peu soluble dans l’eau, il persiste longtemps au niveau du site d’injection, freinant sa distribution aux organes et notamment à la tumeur, et entrainant des problèmes de photosensibilisation cutanée. Les 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC développées devraient permettre une meilleure diffusion dans l’organisme au cours du temps afin de mieux cibler la tumeur et de limiter son accès aux organes, notamment au niveau de la peau pour limiter les problèmes de photosensibilisation cutanée. Les données issues de ce projet permettront d’envisager des études cliniques chez l’Homme avec l’une et/ou l’autre des 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC testées.

Procédures

Les 180 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront soumises à l’induction d’une tumeur sous-cutanée par injection d’une suspension de cellules tumorales effectuée une seule fois en moins d’une minute et sous anesthésie générale. Un suivi de la croissance tumorale sera effectué par mesure tous les 2 jours sur animal vigile de la taille de la tumeur, à l’aide d’un pied à coulisse, mesure effectuée en moins d’une minute. Une injection intraveineuse de formulations liposomales à évaluer ou du produit de référence utilisé (Foscan®) sera effectuée sous anesthésie générale sur les 180 souris, une seule fois et en une minute environ, lorsque la tumeur aura atteint un volume défini (350 à 400 mm3), à la dose de 0,3 mg/kg pour 105 souris, et à la dose de 7,0 mg/kg pour 75 souris. Un prélèvement de sang de 0,5 ml sera effectué sur 105 des 180 souris par prélèvement intracardiaque sous anesthésie générale effectué une seule fois et en une minute environ, avant leur mise à mort, afin d’étudier le devenir au cours du temps dans le sang des formulations liposomales injectées par rapport à celui du composé de référence (Foscan®), puis d’étudier leur distribution dans différents organes et la tumeur qui seront prélevés après la mise à mort. Une injection intracardiaque d’un produit de contraste permettant de visualiser les vaisseaux sanguins au niveau de la tumeur sera effectuée sur 75 des 180 souris, une seule fois et en une minute environ, sous anesthésie générale, 7 minutes avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Un stress des animaux utilisés dans ce projet sera induit par le placement à l’obscurité après la réalisation de l’injection intraveineuse de formulations liposomales à base de mTHPC ou de Foscan® jusqu’à leur mise à mort, rendu nécessaire afin d’éviter les problèmes de photosensibilisation cutanée. Ce stress induit concernera les animaux qui seront mis à mort aux temps prolongés de la cinétique réalisée, correspondant donc aux temps 18 heures, 24 heures et 48 heures, soit 45 des 105 souris utilisées pour la partie pharmacocinétique et biodistribution tissulaire, et 30 des 45 souris utilisées pour la partie biodistribution intratumorale. Les autres animaux qui seront mis à mort aux temps courts de la cinétique réalisée, entre 30 minutes et 6 heures, le seront au cours du cycle normal jour/nuit auquel ils sont soumis. Pour ces raisons, et le fait également d’induire une tumeur sous-cutanée, de réaliser des injections de produits, sous anesthésies générales répétées mais de courte durée, la procédure expérimentale a été classée en sévérité modérée.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale, après ou non réalisation d’un prélèvement de sang, les souris seront mises à mort afin de permettre le prélèvement d’organes et de la tumeur, et de pouvoir ainsi réaliser un ensemble d’analyses permettant d’étudier la distribution au cours du temps des formulations liposomales et du produit de référence (Foscan®) qui auront été préalablement injectés.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro (culture de cellules) ou ex vivo (organes isolés) qui ne pourraient d’ailleurs pas être maintenus dans un état physiologique pendant une durée prolongée, afin d’étudier la diffusion dans l’organisme entier au cours du temps (pharmacocinétique) et dans des organes cibles (biodistribution) de composés injectés par voie générale. L’étude de la distribution intratumorale de molécules d’intérêt est nécessaire pour optimiser l’intervalle de temps entre l’injection et l’irradiation lumineuse (IDL = Intervalle Drogue-Lumière). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études antérieures, pour certaines publiées, ayant permis d’ajuster les temps de cinétique de prélèvements et montrer que 5 animaux par temps de prélèvement et par groupe de traitement était nécessaire et suffisant. D’autre part, l’objectif étant de comparer 2 nouvelles formulations liposomales à base de mTHPC au Foscan®, il n’est pas nécessaire d’utiliser de groupe d’animaux témoins recevant une formulation liposomale neutre, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les injections sous-cutanée de cellules tumorales et intraveineuse de formulations liposomales à base de mTHPC et de Foscan®, ainsi que le prélèvement sanguin, seront effectués sous anesthésie générale. Les souris seront observées quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré tous les 2 jours, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de 15% entre 2 pesées est observée, ou si des signes de toxicité des traitements, de déshydratation, de prostration prolongée, de non réponse à l’activité externe ou des modifications de leur comportement sont observés (difficultés à se déplacer, cachexie, vocalises, convulsions…), elles seront mis à mort dans des conditions éthiques. Une attention toute particulière sera portée aux animaux qui seront maintenus dans l’obscurité et mis à mort aux temps prolongés de la cinétique, 18 heures, 24 heures et 48 heures après injection des formulations liposomales à base de mTHPC et de Foscan®. Des boules de coton seront placées dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière

Choix des espèces

La souris Nude, présentant un système immunitaire déficient, est le modèle animal le plus approprié pour des études en cancérologie expérimentale, très utilisée et largement décrite dans la littérature scientifique, permettant d’injecter chez l’animal des cellules tumorales d’origine humaine sans risque de rejet. D’autre part, les études de pharmacocinétique et de distribution tissulaire et intratumorale sont principalement réalisées chez la souris car sa petite taille nécessite d’utiliser moins de composé à évaluer, composé dont le coût de développement peut être très important. Les animaux seront de jeunes souris âgées de 8-9 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge moyen de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études de pharmacocinétique et de biodistribution, et de souris utilisées lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats probants.

96 poissons marins, daurades, loups et saupes, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poisson est marqué d'une puce sous anesthésie puis soumis à des tests d'effort et de tolérance au réchauffement en tunnel de nage et en bassin, pour évaluer si la résistance à la chaleur diminue avec la taille. Le porteur indique que les poissons sont euthanasiés pour retirer la puce, dangereuse si l'animal est mangé. Une grande partie des individus sont prélevés dans les lagunes côtières méditerranéennes avant d'être tués en fin d'expérience.

Objectifs

L’objectif est d’évaluer les relations entre la masse d'un individu et sa tolérance au réchauffement, chez trois espèces de poissons marins côtiers, la daurade royale (Sparus aurata), le loup (Dicentrarchus labrax) et la saupe (Sarpa salpa). Une récente étude a montré, chez une espèce de poisson, que la tolérance au réchauffement diminue avec la taille des individus. Ce phénomène a été mis en évidence avec un test de tolérance qui évalue la capacité des poissons à nager contre un courant pendant qu’ils subissent des augmentations progressives de la température. L’étude a montré une forte relation négative entre masse corporelle et température à laquelle un individu a arrêté de nager. Ces résultats soulèvent une problématique : Cette influence de la taille sur la tolérance est-elle un phénomène universel chez les poissons ? Les trois espèces choisies utilisent les lagunes côtières méditerranéennes comme des nourriceries et zones d’alimentation. Les lagunes semblent être des habitats clefs pour ces espèces mais sont très sensibles aux effets des changements globaux, en particulier un accroissement en fréquence et sévérité d’évènements climatiques extrêmes tels que les canicules estivales. Les vagues de chaleur représentent un risque majeur pour les poissons, il est donc important de comprendre si, chez les espèces de poissons qui utilisent les lagunes, la résistance aux canicules diminue avec l’augmentation de la taille des individus.

Bénéfices attendus

L’hypothèse est que la tolérance au réchauffement va diminuer avec la taille des individus chez les trois espèces ciblées. Le projet montrera si une diminution de la tolérance thermique avec la taille est un principe physiologique universel chez les poissons. Les informations obtenues seront très utiles dans le développement de modèles pour prédire les impacts du réchauffement global et des canicules sur les populations de poissons. Les informations sur les individus sauvages seront utiles pour les plans de gestion des trois espèces, qui sont exploitées par la pêche.

Procédures

Chaque poisson subira quatre interventions : un marquage avec une puce sous anesthésie, un test d'effort en tunnel de nage sur 24h, un test de tolérance au réchauffement en tunnel de nage sur 12h, et un test de tolérance au réchauffement en bassin sur 12h.

Impact sur les animaux

Les nuisances et les effets indésirables devraient être limités, les procédures sont d'une sévérité modérée. Les procédures en tunnel de nage impliquent un confinement mais sont de relativement courte durée et ne sont pas douloureuses. Les réchauffements progressifs représentent des nuisances transitoires d’une sévérité modérée, qui ne menacent pas la survie des animaux. La fatigue dans le tunnel de nage est une nuisance transitoire, d’une durée de moins de 5 minutes.

Devenir

Les poissons seront euthanasiés pour récuperer la puce RFID (PIT-tag) intramusculaire, qui est recouvert de verre et donc dangereux si le poisson est mangé par un prédateur ou par un humain.

Remplacement

Il est impossible de remplacer les poissons sauvages par des autres modèles, l'intêrét du projet étant justement de regarder l'impact sur ces espèces.

Réduction

Le nombre total d'individus sauvages testés sera limité à n = 24 de chaque espèce, plus n = 24 individus domestiqués. Ce nombre limité d’individus permettra, néanmoins, d’établir des relations entre masse corporelle et seuils de tolérance thermique en utilisant des approches de régression. Ce nombre permettra aussi de calculer des moyennes de taux de consommation d’oxygène à chaque température pendant les protocoles, pour évaluer les effets de la température et le comparer entre espèces, en utilisant des modèles linéaires mixtes ou des analyses de variance.

Raffinement

Tout sera mis en oeuvre durant les procédures pour limiter la souffrance et le stress des animaux afin d'obtenir des mesures valides et fiables de la physiologie des individus qui ne soient pas influencées par un état préalable de souffrance, de stress ou d'agitation. Un protocole d'anesthésie optimisé pour ces espèces sera utilisé pendant le marquage. Les poissons sont à l’abri de toute nuisance visuelle et sonore pendant la récupération et les expériences. Les protocoles expérimentaux en tunnel de nage sont bien établis chez les poissons. La phase de capture et de placement dans les dispositifs empêche toute exposition à l’air, et est suivi par une période d'acclimatation d'une durée minimale de 4 heures. Le rechauffement en bassin est aussi une technique largement maîtrisée et utilisée par l’ensemble de la communauté scientifique. Pendant les procédures en bassin les poissons seront observés avec une camera, au moment où un poisson montre des signes de stress comportemental (réponses de fuite, léthargie, perte d’équilibre), il sera enlevé très rapidement et placé dans un deuxième bassin rempli d'eau aérée et à température d'acclimatation, à l’abri de toute nuisance visuelle et sonore.

Choix des espèces

La daurade royale, le loup et la saupe sont des espèces côtières emblématiques en Méditerranée. De nombreux aspects de la physiologie environnementale restent inconnus pour les populations sauvages de ces trois espèces. L’acquisition des connaissances sur leur tolérance thermique pourrait être un appui aux mesures de gestion de ces espèces, dans un contexte des changements globaux. L’utilisation de trois espèces, de familles taxonomiques différentes, permet de montrer si les effets de la taille (masse corporelle) sur la tolérance thermique est un phénomène universel chez les poissons. Pour le fait que l’objectif du projet est l’évaluation des effets de la masse corporelle, les individus auront des stades de développement qui varient de juvéniles immatures à des adultes reproducteurs, avec une gamme de masse entre 30 et 800g.