Oncologie

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont soumises à un régime riche en graisse et en sucre pour induire un diabète de type 2, puis à des injections intrapéritonéales répétées de glucose et d'insuline et à des prélèvements de sang à la queue. Le porteur décrit une douleur légère possible liée au modèle et annonce une mise à mort finale pour prélever les organes. Sur le remplacement, il affirme que l'usage d'animaux est "indispensable" pour démontrer in vivo l'implication d'une protéine avant d'en faire une cible thérapeutique.

Objectifs

L’obésité est une maladie chronique que consiste à un excès de masse grasse et à une modification du tissu adipeux. Elle est due à différents facteurs, tel que l’alimentation, la prédisposition génétique et aussi à facteurs environnementaux. Une des consequences métaboliques majeures de l’obesité est le développement du diabète de type 2. Afin de pouvoir traiter le diabète, une meilleure compréhension du dialogue entre les cellules est nécessaire. L’implication du système immunitaire dans la physiopathologie du diabète de type 2 n’est pas connue, ainsi, nous souhaitons ici comprendre l’interaction du système immunitaire avec le pancréas dans l’installation et le maintien de la pathologie. Nous avons mis en évidence la présence de la cytokine IL34 chez l’homme et la souris au niveau des îlots pancréatiques. Son expression se trouve augmentée dans des pancréas issus de patients atteints de diabète de type 2. Suite à ces observations, nous avons créé une lignée de souris déficientes en IL34 au niveau du pancréas. Le modèle a été mis en place par croisement entre une lignée IL34LoxP et PdxCre. Ainsi, nous cherchons à comprendre l’impact de l’inhibition de la cytokine au niveau du pancréas dans des conditions physiologiques et pathologiques de diabète de type 2 en comparant les souris IL34 KO avec les souris IL34 contrôles issues du croisement.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre d’identifier la cytokine d’intérêt comme un nouveau biomarqueur ou une nouvelle cible thérapeutique dans le diabète de type 2. Il aiderait également à mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans la pathologie au niveau du pancréas et plus particulièrement des îlots de Langerhans.

Procédures

Le test de tolerance au glucose et à l'insuline (GTT et ITT) nécessitent des injections intra péritonéales de glucose et insuline (10 ip par souris, 1ip de glucose et 1ip d’insuline 1 fois par mois, durée environ 3 seconds). Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu Des prélèvements de gouttes de sang à niveau de la veine caudale pour mesurer la glycémie des animaux. Il y aura 8 prélèvements d’une goutte de sang par souris pour un même test. Pour chaque prélèvement, les animaux sont anesthésiés localement au niveau de la queue (lidocaïne, sous forme de pommade). Ces tests seront effectués au début du protocole, après 1, 2, 3 et 4 mois de regime.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une régime alimentaire riche en graisse et sucre afin d’induire le diabète de type 2 lié à l’obésité. Les souris pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La réaction attendue dans le modèle de diabète peut être de douleur légère. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline nécessitent des injections intra péritonéales de glucose et insuline (10 ip par souris). Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. Des prélèvements de gouttes de sang à niveau de la veine caudale pour mesurer la glycémie des animaux seront aussi nécessaires. Il y aura 8 prélèvements d’une goutte de sang par souris pour un même test. Le prélèvement sanguin à niveau de la veine caudale, sous anesthésie locale, permet de récupérer des quantités minimes de sang pour l’évaluation répétée des paramètres circulants, sans traumatisme et sans douleur. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procedure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer cette protéine comme cible thérapeutique, nous devons démontrer son implication in vivo. En effet, seule la suppression de celle-ci dans un modèle in vivo nous assure de son implication dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique.

Réduction

Les modèles seront réalisés sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (120 souris). Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce avec un enrichissement du milieu. Le protocole expérimental comprend un suivi quotidien des animaux, des indicateurs comportementaux et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, suivi pondéral de l’animal) seront évalués quotidiennement, et constitueront les points limites de l’expérience (mise à mort de l’animal). Pour éviter toute souffrance de l’animal au cours du protocole expérimental des analgésiques seront donnés. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.

Choix des espèces

Les modèles de diabete de type 2 chez la souris sont connus et utilisés dans la littérature chez la C57BL/6J et les souris KO pour IL34 au niveau du pancréas sont de fond génétique C57BL/6J. Des souris de 4 semaines environ seront utilisées. A cet âge les animaux peuvent être nourris avec un régime riche en graisse sans risque de compromettre leur développement.

265 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de glycogénoses de type I ou III, elles suivent trois mois un régime induisant une fibrose du foie, avec prélèvements sanguins mensuels, avant une chirurgie de perfusion du foie menée sous anesthésie sans réveil. Le porteur indique que ces souris risquent des hypoglycémies pouvant être fatales, contrôlées par une surveillance et des apports de glucose. Il affirme que ces tumeurs et cette pathologie hépatique ne peuvent se reproduire en culture cellulaire et exigent l'"organisme en entier".

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire est le cancer primitif du foie le plus fréquent. Son développement est souvent associé à une accumulation de graisses dans le foie (stéatose), qui peut évoluer vers une une cirrhose du foie. Cependant, dans certains cas, ces tumeurs se développent en absence de signe de fibrose (accumulation de fibres de collagènes) ou de cirrhose, en particulier dans des maladies métaboliques comme l’obésité. De façon intéressante, le développement de tumeurs hépatiques est aussi observé chez les patients atteints de glycogénose de type I (GSDI) ou de type III (GSDIII), deux maladies métaboliques rares. Dans ces deux pathologies, une perte ou une diminution significative de la production de glucose par l’organisme entre les repas ou lors de période de jeûne mène à des hypoglycémies (faibles taux de sucres dans le sang) et à l’accumulation de glycogène (stock de sucre) dans le foie menant à des foies anormalement gros chez le nouveau-né. Les hypoglycémies peuvent entrainer des convulsions, voir un coma ou être fatales en l’absence d’un contrôle très précis de l’alimentation des patients (apport régulier de sucres à digestion lente ou un resucrage rapide lors d’une baisse importante de la glycémie). Ces maladies se caractérisent aussi par le développement de complications hépatiques importantes, avec en particulier le développement de tumeurs hépatiques. De façon intéressante, la comparaison de ces deux maladies a montré des différences importantes de la progression tumorale, avec la présence ou l’absence de graisses dans le foie, associée ou non à une inflammation du foie et d’une fibrose. Dans ce projet, nous caractériserons le rôle de la réaction inflammatoire et du développement de la fibrose qui sont classiquement associés à l’apparition de tumeurs hépatiques. En effet, les cellules immunitaires jouent un rôle central dans le développement inflammatoire et tumoral. Pour cela, nous caractériserons l’environnement immunitaire des foies de souris atteintes de GSDI ou de GSDIII, en comparaison avec des souris saines (contrôles). Les différentes cellules du foie seront isolées et purifiées à un stade précoce de la maladie, avant le développement tumoral. Ce projet devrait permettre de mieux définir les mécanismes moléculaires du développement tumoral en lien avec la présence ou non d’inflammation et de fibrose hépatique.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet devrait permettre de mieux caractériser l’importance de la réaction immunitaire et l’initiation du développement de fibrose dans le développement de la pathologie hépatique et la tumorigenèse dans le cadre de deux maladies métaboliques que sont la glycogénose de type I et la glycogenénose de type III. La comparaison de ces deux pathologies pourra aussi éclaircir les mécanismes moléculaires impliqués dans la tumorigenèse hépatique liée à l’obésité ou d’autres maladies métaboliques.

Procédures

Les animaux atteints de GSDI ou GSDIII seront soumis pendant 3 mois à un régime connu pour induire une fibrose hépatique. Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront réalisés en veine submandibullaire tous les mois. En fin d’étude, les animaux subiront une chirurgie sans réveil avec perfusion du foie pour dissocier et isoler les différentes cellules du foie qui doivent être ensuite analysées.

Impact sur les animaux

Ce projet concerne deux pathologies caractérisées par le développement d’hypoglycémies lors de jêunes courts (entre les repas) et par des atteintes hépatiques menant au développement de tumeurs du foie. Nous disposons de modèles de souris viables atteintes de GSDI et de GSDIII et qui reproduisent toute la pathologie hépatique observée chez l’homme. Sans contrôle nutritionnel strict, les hypoglycémies peuvent être fatales et mener à la mort. Afin d’éviter la mort des animaux atteints de GSDI, la délétion du gène qui est muté chez les patients a été induite uniquement dans le foie des souris, ce qui permet d’éviter les hypoglycémies au cours d’un jeûne grâce à la production de glucose par les reins et l’intestin. Cependant, ces souris peuvent développer des hypoglycémies car elles ne peuvent pas utiliser leur stock de sucres accumulé dans le foie. La connaissance du modèle animal a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémies. Pour cela, des croquettes sont accessibles aux souris directement dans la cage pour leur éviter la perte d’énergie nécessaire pour atteindre les mangeoires. De plus, dès qu’un animal ne réagit pas à un stimulus, il est injecté avec une solution de glucose (sucre), ce qui permet d’augmenter instantanément sa glycémie. Les souris atteintes de GSDIII présentent des glycémies plus faibles que les souris contrôles mais ne développent pas d’hypoglycémie fatale car elles sont capables de produire du glucose par une autre voie que la dégradation des stocks de glycogène du foie. Ces souris sont invalidées pour le gène muté chez les patients dans tous les tissus ; elles présentent donc aussi une accumulation de glycogène au niveau des muscles, entrainant une faiblesse musculaire mais qui n’a pas d’impact sur la mobilité des souris. Même si aucun phénotype musculaire délétère n’a été rapporté à l’âge de 3 mois, de la nouritture est aussi accesible directement dans la cage afin de limiter les efforts musculaires pour atteindre les mangeoires. Ces deux modèles de souris développent autour de 15 mois des tumeurs hépatiques ce qui ne constitura pas un point limite dans ce projet puisque les procédures seront limitées à 3 mois.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement du foie par une méthode éthiquement autorisée. Les cellules immunitaires du foie seront isolées pour des études moléculaires afin de caractériser leur implication dans le développement de la pathologie hépatique des glycogénoses de type I et de type III.

Remplacement

Aucune approche en culture cellulaire ne permet de développer les tumeurs et les caractéristiques de la pathologie hépatique des glycogénoses. Notre étude nécessite donc de travailler sur l’organisme en entier pour conserver le développement de ces tumeurs qui requière un dialogue complexe, entre divers types de cellules hépatiques, mais aussi avec d’autres organes du système immunitaire.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des pathologies étudiées, des modèles animaux, et du métabolisme, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept. Afin de pouvoir faire une analyse statistique, des groupes de 10 souris seront analysés. Au total, ce projet réalisé sur 3 ans nécessitera l’obtention de 265 souris (mâles ou femelles) transgéniques et contrôles, sans compter les souris d’élevage qui ne développent pas de pathologie. Un lot d’animaux sera dédié à la validation de l’isolement et la purification des cellules immunitaires obtenues après perfusion de foie et cytométrie de flux. Le nombre exact d’animaux atteints de GSDI ou GSDIII sera ajusté après l’étude de ce premier lot d’animaux en comparaison avec des souris non malades.

Raffinement

Afin d’éviter la mort précoce des animaux atteints de GSDI, la pathologie a été induite uniquement dans le foie des souris ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies au cours d’un jeûne long grâce à la production de glucose par les reins et l’intestin. La connaissance des modèles animaux a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémies et en limitant les efforts des souris pour trouver de la nourriture. Pour cela, des croquettes sont accessibles aux souris directement dans la cage. Un suivi de glycémie sera aussi réalisé si un animal est retrouvé prostré dans une cage, et ne répondant pas ou peu au stimulation du zootechnicien. En cas d’hypoglycémie (glucose inférieur à 30-40 mg/dL), la souris sera injectée avec une solution de glucose et une partie de sa cage sera placée sur une plaque chauffante afin de maintenir sa température corporelle. Les souris seront hébergées par groupe, dans un milieu enrichi pour favoriser la nidation et des morceaux de bois seront ajoutés car la nourriture utilisée pour induire la fibrose est riche en graisses et est molle. L’ajout de graisse à cette nourriture permet d’éviter la perte de poids des animaux. Les animaux seront pesés de façon hebdomadaire pour suivre leur prise de poids. De plus, l’état de bien-être sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (perte de poids, aspects du pelage, mouvement/posture de la souris, morsures...). En cas de petites plaies causées par les souris, une crème à base de teintures mères et d’huiles essentielles naturelles aux propriétés cicatrisantes et antispetiques sera systématiquement appliquée par les zootechniciens en charge du suivi du bien-être animal. Les souris seront mises à mort à la fin du protocole ou lors de l’atteinte d’un point limite défini dans le projet selon les méthodes autorisées par la législation. Avant la chirurgie réalisée pour prélever le foie, les souris sont traitées avec un analgésique pour éviter la douleur liée à la perfusion du foie. La chirurgie est réalisée sous anaesthésie profonde, et l’animal est mis à mort sans réveil.

Choix des espèces

Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production de glucose par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Les expériences seront donc réalisées avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme et qui reproduisent toute la pathologie hépatique observée chez les patients. Par ailleurs, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kits biochimiques…). Les protocoles seront réalisés avec des souris adultes âgées de 3 mois.

340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie stéréotaxique d'injection de virus dans le cerveau ou l'implantation d'une canule cérébrale reliée à une minipompe, complétées par un régime gras, des tests métaboliques, un jeûne de 24 heures et des prélèvements sanguins. Le porteur décrit une inflammation post-chirurgicale possible et l'isolement des souris en cage individuelle pour mesurer la prise alimentaire. Il situe l'intérêt du projet dans la recherche de cibles contre l'obésité, notant que ces médicaments sont "particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique", et affirme que cette régulation ne peut s'étudier que chez la souris.

Objectifs

L'homéostasie énergétique se définit comme l'équilibre entre les entrées et les dépenses énergétiques. Les dépenses résultent principalement du métabolisme basal et de l’activité physique, tandis que les apports trouvent leur origine dans l’alimentation. L'organisme doit en permanence recueillir et interpréter des signaux hormonaux, métaboliques et nerveux émis par les tissus périphériques impliqués dans l'utilisation et le stockage de l'énergie (foie, muscle, tissu adipeux). En retour, l'intégration de ces signaux par le cerveau se traduit par la mise en place d'une réponse adaptée au niveau comportemental (manger ou jeûner) et métabolique (production de sucre par le foie et libération de lipides par le tissu adipeux en période de carence, ou bien stockage d'énergie par ces mêmes tissus en période d'abondance). Au niveau du système nerveux central, une région particulière de l'hypothalamus, le noyau arqué (ARC), joue un rôle fondamental dans la signalisation et l'intégration des messages circulants de satiété et de faim. L'ARC contient deux populations neuronales clés dans la régulation du comportement alimentaire : les neurones à Agouti-Related Protein (AgRP) stimulant la prise alimentaire et les neurones à pro-opiomélanocortine (POMC) inhibant la prise alimentaire. Nous avons observé que la prise alimentaire est réduite chez des souris dans lesquelles notre gène d'interêt est invalidé dans les neurones AgRP. Nous voulons maintenant: 1. déterminer les voies de signalisation moléculaires qui sont mises en jeu dans cette population neuronale. 2. Vérifier la réversibilité du phénotype observé chez les souris dont le gène d'intérêt est invalidé. 3. Verifier si la protéine codée par le gène d'intérêt peut être une cible thérapeutique pour le traitement de l'obésité.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de Diabète de Type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établie et de façon encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Notre étude se concentre sur un rôle potentiel d'un gène d'intérêt dans la régulation neuronale de la prise alimentaire et du comportement alimentaire. Des mutations du gène étudié ont été trouvées dans de nombreuses cohortes de diabétiques DT2. Nos données laissent entrevoir un rôle spécifique de ce gène dans le contrôle de la prise alimentaire, une fonction qui n'a pas été mise en avant jusqu'à présent. Les expériences suggérées sont conçues pour explorer davantage les mécanismes moléculaires reliant notre gène d'intérêt à la prise alimentaire, ce qui sera nécessaire pour déterminer si la protéine codée par ce gène est ou non une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de l'obésité. Par ailleurs, l'utilisation d'inhibiteurs ciblant la famille de notre protéine d'intérêt nous permettra de fournir une première preuve de concept qui déterminera si l'inhibition pharmacologique est effectivement une voie à privilégier. En effet, les médicaments réduisant l'obésité sont particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique, notamment en combinaison avec des médicaments qui agissent pour restaurer la fonction cellulaire. Ainsi, notre approche jettera les bases de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints d'obésité.

Procédures

230 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Avant et après l'injection de virus, ils seront soumis à des tests métaboliques (1 test par semaine - 4 tests prévus). Pour chaque test ils subiront 4 injections IP (1inj/jour pendant 4 jours - durée 10 sec/inj). 90 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids. Ces animaux subiront, sous anesthésie générale, l’implantation par chirurgie stereotaxique d’une canule dans une zone particulière du cerveau. La canule est reliée à une minipompe implantée sous la peau du dos au cours de la même chirurgie. 1 semaine avant et 1 mois après la chirurgie, un prélèvement sanguin à la veine temporo mandibulaire (durée : 30-45 sec.) est réalisé sur les animaux vigiles. Par ailleurs, au cours du mois suivant la chirurgie, ces animaux seront soumis à des tests métaboliques (1 test/semaine). Le premier nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements d’une goutte de sang (2µl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Le 2ième nécessitera 4 injections IP (1 inj/jour - durée 10 sec.)

Impact sur les animaux

La chirurgie stereotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou de récepteurs particulier dans des populations neuronales spécifiques. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post-chirurgicale. Différents tests métaboliques sont décrits dans ce projet: Le premier est un test de sensibilité à la ghréline (hormone de la faim) qui, pour habituer les animaux, nécessite une injection IP de NaCl0.9% quotidienne pendant jours sans aucun effet prévu. Le jour du test les animaux subiront une injection IP de ghréline qui stimulera leur appétit. Le deuxième est un test de réalimentation après un jeûne de 24H. L'effet de la mise à jeun sera la stimulation de leur appétit et une perte de poids passagère. Un troisième test est décrit, il s'agit d'un test de tolérance au glucose. Un bolus de glucose est administré par voie IP, ce qui aura pour effet l'élévation de la glycémie (taux de glucose sanguin). La glycémie est mesurée à différents temps pour évaluer la capacité à Les animaux recevront une injection stéréotaxique qui pourra provoquer une inflammation post-chirugie. La procédure pour tester la sensibilité à la ghréline nécessite l'injection quotidienne intrapéritonéale de NaCL 0.9% afin d'habituer les souris avant le jour du test. Le test de réalimentation après un jeûne prolongé nécéssite une mise à jeun des souris pendant 24H. Une diète riche gras pour créer une environement obésogène sera mis en place chez les souris traitées avec l'inhibiteur pharmacologique, ce qui peut creer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisees dans les cages. La tolérance au glucose nécessite l'injection d'un bolus de glucose qui peut entrainer un inconfort chez la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

La régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes complexes ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 340 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs tests métaboliques (avec un temps de récupération adapté pour les animaux) seront réalisées sur les mêmes cohortes de souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Les animaux sont surveillés par le personnel qualifié tous les jours. Le stress lié aux procédures nécéssitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. Aucune douleur ou souffrance n'est attendu dans la plupart des procédures expérimentales utilisées mais l'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les procédures expérimentales potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience et les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire pour les analyses biochimiques et les volumes injectés seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire. Chaque semaine, la prise de poids, la quantité de nourriture sont mesurées permettant ainsi un suivi hebdomadaire des souris. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour réduire tout inconfort ou douleur qui se développerait et des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Tout signe de douleur sera pris en charge en prenant les mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé, après avis vétérinaire. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formé spécifiquement à cet acte chirurgical.

Choix des espèces

Dans le domaine du métabolisme, la souris est un modèle animal déjà validé. D’autre part, l’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées dans lesquelles le gène codant pour la protéine CaMK1D est invalidé. Les chirurgies stéréotaxiques concernant l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux âgées de 8 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 5 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale (PE3)

200 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'un antigène et d'un adjuvant sous la peau ou dans le derme, puis des prélèvements sanguins aux oreilles sur animaux vigiles, avant un prélèvement terminal au cœur sous anesthésie, pour produire des anticorps polyclonaux destinés à la recherche ou au diagnostic. Le porteur indique que l'inoculation peut provoquer une hyperthermie, une forte inflammation locale, une ulcération ou une nécrose. Sur le remplacement, il affirme que la production d'anticorps polyclonaux ne peut être reproduite in vitro de façon satisfaisante et retient donc le lapin pour son volume sanguin et sa réponse immunitaire.

Objectifs

Produire sur lapins de grandes quantités de très bons anticorps polyclonaux spécifiques avec une haute affinité dirigés contre des protéines d'intérêt, pour des activités de recherche ou de diagnostic.

Bénéfices attendus

L'antigène est produit par le demandeur qui doit fournir des informations permettant d'évaluer une toxicité intrinsèque de la molécule injectée, et les possibles conséquences sur l'état général de la production d'anticorps contre cette molécule. En fonction des informations fournies et du risque évalué, il pourra être demandé de tester la toxicité de la molécule in vitro dans un modèle cellulaire avant de l'injecter au lapin.

Procédures

Injections sous-cutanées ou intra-dermiques sur animaux vigiles : 200 lapins. Durée, quelques secondes Prélèvement sanguin (oreilles) sur lapins vigiles : 200 animaux. Acte qui dure quelques secondes Prélèvement sanguin (cœur) sur lapins anesthésiés (acte terminal) animaux : Acte qui dure quelques minutes

Impact sur les animaux

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 72h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux). Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement sanguin terminal afin de répondre à l’objectif scientifique

Remplacement

La production d'anticorps polyclonaux dirigés contre un antigène résulte de la stimulation de différentes populations leucocytaires qui ne peut être reproduite de façon satisfaisante et efficace in vitro. Certains tests pour évaluer la toxicité d’antigène seront réalisés in vitro avant l’animal.

Réduction

Dans la très grande majorité des cas, un seul animal est nécessaire pour obtenir la quantité d'anticorps nécessaire pour les travaux scientifiques. Dans certains cas (échec de l'immunisation ou besoin de très grandes quantités d'anticorps), il peut être nécessaire d'utiliser 2 ou 3 animaux. Nous estimons que le nombre de demandes de production d'anticorps polyclonaux portera sur un total d'environ 40 animaux par an.

Raffinement

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 72h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux…). L’animal sera mis à mort si aggravation des signes clinique malgré le traitement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention, une préparation aseptique et une anesthésie locale. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le lapin est une espèce de taille intermédiaire (on peut utiliser aussi la souris, des petits ruminants ou des équidés) dont la réponse immunitaire et le volume sanguin circulant permettent d'obtenir les quantités d'anticorps nécessaires aux projets des entités de recherche Jeune adulte de 2,7 à 3 kg (âge optimal pour la réponse immune)

795 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéficientes, elles sont irradiées puis greffées avec des cellules leucémiques humaines, subissent des prélèvements de sang à la joue et des ponctions de moelle osseuse au fémur, avant d'être tuées pour analyse. Le porteur indique que la maladie peut provoquer perte de poids, baisse de mobilité et, rarement, paralysie des membres. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet de cultiver ces cellules leucémiques, trop fragiles hors d'un organisme vivant.

Objectifs

La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une forme de cancer qui touche les cellules de la moelle osseuse, qui produisent normalement les globules rouges, les plaquettes et les globules blancs. La leucémie est caractérisée par la prolifération excessive et le blocage de la maturation de ces cellules immatures. Les leucémies affectent enfants et adultes, et bien que, ces dernières décennies, de nombreux progrès ont été fait du point de vue thérapeutique, des rechutes fatales sont observées dans 20 % des cas pédiatriques ; chez l’adulte, la survie globale à 5 ans est seulement de 30-40% chez les patients de moins de 60 ans, et de 20% pour les plus de 60 ans. Un sous type particulier de cancers du sang affectant les cellules myéloïdes (les leucémies aiguës à mégacaryoblastes) sont généralement observées chez l’enfant et sont de très mauvais pronostic. Elles résultent d’une prolifération accrue des cellules à l’origine des plaquettes, bloquant ainsi leur maturation en plaquette. Il est donc essentiel de poursuivre la compréhension des mécanismes conduisant à ces pathologies pour concevoir des thérapies ciblées afin d’améliorer la survie des patients leucémiques. L’objectif de notre projet est d’identifier des régions du génome humain qui régulent l’expression de gènes favorisant les cancers. Afin de réaliser cet objectif nous utiliserons un modèle de cancers du sang affectant les cellules myéloide humaine se développant dans des souris dépourvues de système immunitaire et ne pouvant rejeter la greffe, seule façon de modéliser cette maladie.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes conduisant au cancer doit nous conduire à concevoir des thérapies ciblées. Au terme de notre projet, les résultats obtenus devraient contribuer à l’amélioration des traitements proposés aux patients.

Procédures

Nous utiliserons des souris dépourvues de système immunitaire permettant ainsi l'amplification (absence de rejet de la greffe) des cellules tumorales de patients atteints de LAM. Les souris seront irradiées avec une dose suffisamment faible pour ne pas induire leur mort mais permettant la greffe de cellules humaines (durée de l'irradiation: moins de 2 min). Ces cellules seront injectées quelques heures après l’irradiation dans la veine de la queue, aucune anesthésie ou analgésie ne sera nécessaire (durée de l'injection: 30 s). Les souris recevront un traitement antibiotique dilué dans l’eau de boisson durant les 2 semaines suivantes afin d’éviter tout risque d’infection liée à la perte de leur système immunitaire. Des échantillons de sang seront prélevés sur souris éveillée de manière bi-mensuelle dans la veine de la joue, la durée d’un prélèvement est inférieure à une minute. Ces prélèvements seront effectués pendant 3 mois et demi suivant l’injection de cellules. Le volume sanguin prélevé est faible et compatible avec une répétition espacée d’au moins deux semaines. Des prélèvements de moelle osseuse réalisés au niveau du fémur pourront être réalisés deux fois maximum à 2 semaines d’intervalle. Pour cela, une anesthésie gazeuse sera effectuée, la durée d’un prélèvement est inférieure à 5 minutes. Une analgésie est prévue afin d’éviter la douleur.

Impact sur les animaux

Une perte de poids, une réduction de la mobilité et une négligence du toilettage pourraient être observés chez les animaux lors de la progression de la leucémie. Une paralysie des membres inférieurs peut être observé dans de très rares cas. L’irradiation sublétale des animaux, conduisant à l’ablation des cellules immunitaires, peut rendre les animaux plus susceptibles aux infections. Les prélèvements sanguins itératifs et les biopsies de moelle osseuse peuvent représenter un risque hémorragique.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à différents temps et les organes liés au système immunitaire seront prélevés pour analyse.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n'existe pas à l'heure actuelle de méthode alternative permettant de cultiver les cellules leucémiques primaires de patients in vitro. En effet, ces cellules sont extrêmement fragiles et ne peuvent pas être maintenues en vie en dehors d'un organisme vivant. En outre, la culture cellulaire ne permet pas de modéliser les différentes interactions entre les cellules tumorales et l’environnement dans lequel elles prolifèrent. Ces interactions ne sont possibles que dans un organisme entier vivant afin de conserver les interactions des cellules leucémiques avec les cellules des organes environnants.

Réduction

Grâce à des analyses statistiques, nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures).

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé, afin de s’assurer du bien-être des animaux, et du bon état de leur environnement de vie (propreté des cages, disponibilité d’eau et de nourriture, enrichissements, ...etc.). De plus, un suivi clinique des souris sera également entrepris 2 fois par semaine pour détecter toutes modifications comportementales et éviter autant que possible les souffrances, douleurs et angoisses. Cela sera réalisé en s'aidant d'une grille d'évaluation du score clinique et des actions seront mises en place de manière graduée en fonction de l'apparition de signes de souffrance. L'administration d'un antalgique sera réalisée en cas de douleur légère avant l'euthanasie de l'animal si son état se dégrade soudainement. Enfin, les cages où sont maintenus les animaux feront l’objet d’un change hebdomadaire, et nous nous assurerons d’y apporter le maximum d’enrichissements (Social : les souris seront en groupe de 5 pour favoriser les interactions sociales entre elles. Matériel : bûchettes en bois, papier kraft, tunnels, ...etc.).

Choix des espèces

La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. Les souris seront des souris adultes afin de maximiser la prise de greffe comme cela a été décrit auparavant dans la littérature scientifique.

45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules de mélanome pour développer une tumeur et des métastases, puis sont tuées par ponction cardiaque sous anesthésie pour prélever tumeur et organes. Le porteur indique que la tumeur peut atteindre 1 500 mm3, seuil déclenchant l'arrêt de l'expérience. Il affirme que la formation de métastases ne peut être modélisée qu'in vivo et conclut que l'étude sur animal est inévitable.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche CPER FEDER destiné à étudier le rôle des cellules stromales mésenchymateuses et à identifier l’expression des micro-ARN (miARN) lors du développement de tumeurs métastatiques. Les métastases sont une cause majeure de décès chez les patients atteints de tumeurs malignes. Les miARN sont des petits ARN régulateurs de l'expression génique. Une modification de l’expression de ces miARN peut contribuer au développement tumoral et à la dissémination métastatique par dérégulation de l’expression de gènes impliqués dans des processus clés du cancer. Le système du complément a démontré des rôles dans la régulation de la croissance tumorale, bien que ceux-ci puissent différer selon les types de tumeurs. C3a a une fonction prépondérante de médiateur dans les phénomènes inflammatoires au sein des tissus. Le ciblage spécifique du système du complément peut être d'une grande importance et valeur dans le futur traitement des tumeurs. Nous utiliserons le modèle de tumeurs induites par l’administration sous cutané de cellules B16-F10 chez les souris C57BL/6. Ce modèle permet le développement de tumeurs primaires et de métastases dites « spontanées », ce qui correspond étroitement à celles développées par les humains. Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée et seront réalisées dans les conditions les moins stressantes possibles pour les animaux. Dans un souci permanent du bien-être animal et afin de minimiser l’emploi des animaux de laboratoire, l’évaluation de l’expression des miARN dans un contexte cancéreux sera réalisée en priorité dans des modèles in vitro. Ce projet engagera des souris dans un nombre estimé à 45 individus pour la durée que couvrira ce projet. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque lot de chaque procédure est réduit, il correspond au seuil minimal qui puisse nous permettre d’apprécier, avec nos moyens techniques et en fonction de la variabilité inter-individus, les effets désirés. Par ailleurs, l’hébergement des animaux pendant la phase d’acclimatation et pendant l’expérimentation sera faite avec enrichissement du milieu afin d’améliorer leur bien-être. A terme, nos travaux permettront d’identifier les miARN impliqués dans l’angiogenèse et annonciateurs de formation tumorale et de dissémination métastatique. Ainsi les cancers pourraient être pris en charge à un stade précoce.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront l’identification des miARN annonciateurs de développement tumorale et ainsi permettre une prise en charge plus précoce des patients atteint de cancer, ainsi que de comprendre le mécanisme et l'implication du système du complément dans la tumorigenèse.

Procédures

Induction de tumeurs métastatiques par injection de cellules B16-F10 ou B16-F10/C3a par voie sous cutanée une seule fois à J1. - Prélèvement sanguin (1mL) par ponction cardiaque après anesthésie volatile des souris.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont des douleurs légères suite aux injections IP des cellules tumorales et le développement de tumeurs métastatiques.

Devenir

Après l'injection sous cutanée, les souris seront maintenues en vie jusqu'à la fin de l'étude. Les indivisus seront mis à mort à la fin de l'étude par ponction cardiaque précédée d’une anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%), suivie d'une dislocation cervicale. Les organes prélevés seront scindés en 5 : 1/5 protéine (analyse par western blot), 1/5 ARN, 1/5 miARN (quantification, qRTPCR), 1/5 isopentane, 1/5 paraffine (analyse immunohistologique). La tumeur sera récupérée.

Remplacement

Remplacement: Nos études in vitro avec les cellules stromales mésenchymateuses pulmonaire et un modèle de cellules cancéreuses apportent quelques résultats sur les miARN impliqués dans cette pathologie. Néanmoins, ce modèle cellulaire ne suffit pas a modéliser le processus de développement tumoral dans son ensemble. La formation de métastases est un processus complexe et ne peut être modélisé que in vivo. L’étude in-vivo est inévitable pour comprendre le rôle des cellules stromales mésenchymateuses dans le développement de tumeurs métastatiques, identifier des miARN susceptibles d’intervenir dans cette pathogenèse et étudier la capacité du c3a à moduler l’expression de ces miARN et à induire une régression du développement tumoral.

Réduction

Réduction du nombre : Pour chaque condition testée, nous utiliserons un nombre minimal de souris pour avoir des résultats statistiquement exploitables. Nous utiliserons pour l’étude statistique le test one way ANOVA suivi d’un un test de Bonferroni pour comparer les trois groupes d’animaux entre eux, ainsi qu'un t-test suivi d'un test de Student.

Raffinement

Raffinement : La ponction cardiaque sera réalisée sous anesthésie volatile (isoflurane). Le prélèvement des organes se fera après la mise à mort des animaux. L’évaluation de la qualité de l’anesthésie se fera en vérifiant les 4 étapes suivantes : -l’absence de douleur et/ou de réponse réflexe en exerçant une pression au niveau des doigts de l’animal -L’immobilisation de l’animal -La relaxation musculaire -L’état d’inconscience en vérifiant les mouvements respiratoires. Les souris seront observées 3 fois par jour pendant les 10 premiers jours, puis 1 fois par jour pour le reste de l’expérimentation, dans le but de déceler le plus rapidement possible des signes cliniques critiques dus à l’expérimentation (prostration, température trop élevée, perte de poids, …). Ceci sera basé sur une grille de scoring définie. Chaque situation d’animal montrant des signes d’inconfort ou de souffrance liés ou non à l’expérience sera rapporté au vétérinaire responsable de l’animalerie pour que l’animal soit pris en charge de manière individuelle afin d’améliorer son bien-être. Si l'état ne s'améliore pas au-delà de 24h, il sera euthanasié par ponction cardiaque sous anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%), suivie d’une dislocation cervicale, puis ses différents organes seront prélevés.. De plus, si la taille de la tumeur arrive à 1500mm3 avant J30, l’expérimentation s’arrêtera dès lors, afin d’éviter des expérimentations en durée « non-nécessaires » sur les animaux. La durée de l’étude principale sera de ce fait réduite d’autant. La mesure des tumeurs se fera mécaniquement à l’aide d’un pied à coulisse Caliper. Pour respecter le principe des 3R, un nombre réduit d’animaux a été choisi.

Choix des espèces

Les C57BL/6 sont des souris robustes, et sont déjà utilisées pour la formation de tumeurs métastatiques induites par les cellules B16-F10. Souris adultes de 6 à 8 semaines