Oncologie

70 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous reçoivent une injection intracérébrale de cellules tumorales par craniotomie, et trente d'entre eux subissent une seconde chirurgie pour implanter un dispositif d'administration et une pompe osmotique. Le porteur teste une voie d'administration locale de médicament contre le glioblastome, et non une molécule, ce qu'il présente comme réalisable seulement in vivo. Il fixe comme point limite une taille de tumeur qu'il décrit comme n'induisant pas encore de souffrance perceptible.

Objectifs

Bien que l'incidence du glioblastome soit faible (~6/100000) la médiane de survie post-diagnostic est de l'ordre de 15 mois malgrè un traitement agréssif associant une chirurgie et une chimio/radiothérapie. Parmi les améliorations thérapeutiques possibles, l'utilisation d'une infusion focale à flux fixe (CED) est une option. Toutefois, ce type d'infusion est limité dans le temps et possible qu'au moment de l'exèrese. L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer l'apport d'un nouveau dispositif médical permettant de délivrer localement un médicament par une infusion multifocale à flux fixe et ceci sans contrainte de temps.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à cours terme est de proposer une approche thérapeutique innovante et modulable pour le glioblastome dont la médiane de survie reste très courte.

Procédures

Parmi les 70 animaux inclus dans cette étude, 70 recevront une injection intracerébrale de cellules tumorales. Ils subiront donc une chirurgie sous anesthèsie générale de 15-20 minutes, une incision cutanée, une craniotomie de 0.5mm de diamètre. Parmi les 70, 30 subiront une seconde chirurgie 8 jours après la première. Les gestes seront identiques à ceux réalisés précédement. 30 subiront une seconde chirurgie, 8 jours après la première, sous anesthèsie générale de 60 minutes, une incision cutanée, une craniotomie de 4mm de diamètre au niveau de la plaque pariètale, suivi par la pose du dispositif et un décollement cutané au niveau interscapulaire afin de poser une pompe osmotique. Les 10 derniers ne subiront pas de chirurgie complementaires. Tous les animaux seront suivi par IRM afin d'évaluer l'impact des thérapies mises en oeuvre sur la croissance tumorale.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont relatives aux chirurgies incluses dans le protocole. En effet, une première chirurgie consistera à injecter les cellules tumorales au travers d'un orifice de diamètre inférieur à 1mm dans le crâne du rat après incision cutanée. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale (isoflurane) avec injection sous cutanée pré-opératoire et post opératoire de buprénorphine (0,1mg/kg 0,1mg/mL Buprécare) et injection locale de lidocaine (16,2mg/mL, 100uL). La seconde chirurgie sera réalisée une semaine après la première, également sous anesthésie générale (isoflurane) avec injection sous cutanée pré-opératoire et post-opératoire de buprénorphine et injection locale de lidocaine. Cette chirurgie s’accompagnant d’une craniotomie de 4mm de diamètre et d’une tunnelisation pour la pose de la pompe osmotique, des doses supplémentaires de buprénorphine seront dispensées 6h et 18h post chirurgie. Enfin, après chaque chirurgie, les animaux seront isolés pour 24h afin d’éviter qu’ils ne se rongent mutuellement les sutures.

Devenir

En fin de procédure 1 (inoculation de cellules tumorales) tous les animaux seront conservés car impliqués dans la procédure 2. En fin de procédure 2 (evaluation du nouveau dispositif) tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Il existe de nombreux tests de toxicité de molécules sur des modèles cellulaires. Ces tests ont été réalisés et nous on permis de selectionner 2 molécules avec un potentiel thérapeutiques certains sur la lignée de glioblastome testée. Dans notre cas, nous ne cherchons pas à tester une nouvelle molécule mais une voie d'administration innovante et ceci ne peux être réalisé qu'in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum tout en maintenant une puissance statistique suffisante. en effet, une simulation en utilisant G-power montre que pour nos groupes (non traités, traités PBS avec le nouveau dispositif, traités par la molécule 1 avec le nouveau dispositif, traité en CED par la molécule 1 et traité par du PBS par CED) contenant un nombre d'individus équivalent et égal à 10, un gain de survie moyen de 2 jours pour la thérapie CED et au minimum 3 fois supérieur pour le nouveau dipositif peux être mis en evidence avec un risque alpha de 0.05 et beta 0.95.

Raffinement

Outre les conditions d'hébergement assurées par la structure (cycle jour/nuit, température, papier pour constitution de nid...) les animaux seront maintenus en normothermie pendant toutes les procédures chirurgicales. Ces procédures seront réalisées sous anesthèsie isoflurane et une injection locale au niveau de la zone d'inscision de lidocaine. Une analgésie pre et post operatoire par de la buprenorphine et également associée. De plus, le suivi réguliers par IRM de la croissance tumorale, là aussi en normothermie assurée par une couverture chauffante asservie à la temperature réctale, et le suivi lors de ces examens du rythme respiratoire, la production de données sériées permet de limiter le nombre d'individus nécessaire pour tester notre hypothèse de travail. De plus, le suivi de la masse tumorale permet d'arreter le protocole expérimental avant tous signes cliniques de souffrance de l'animal. En effet, notre expérience de ce type de modèle nous permet de fixer comme point limite une taille de tumeur de 100µL, taille qui n'induit pas de modifications comportementales traduisant une souffrance.

Choix des espèces

Les tumeurs 9L sont des tumeurs initialement produites chez le rat fisher et ne se developpent que chez cette souche immunocompétente. Les animaux utilisés seront des animaux adultes de 7-8 semaines au moment de la première chirurgie. A cet age, il est possible de poser le dispositif sur le crane de l'animal en ne touchant qu'une seule plaque pariètale. De plus, le dispositif faisant environ 3mm de hauteur, il est possible de suturer sans crèer de tension importante. Enfin, avec cette taille de rat, la pompe osmotique (environ 1cm de long et 0.4cm diametre) alimentant le dispositif une tubulure souple en polyurethane peut être placée entre les omoplates sans entraver la mobilité de la tête.

2 moutons castrés vont être utilisés puis rendus au troupeau après récupération, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux interventions chirurgicales sous sédation, pour poser puis retirer une canule ruminale temporaire, avec des prélèvements sanguins répétés. Le porteur présente ce dispositif temporaire comme une alternative aux canules permanentes portées toute la carrière de l'animal. Il ouvre son résumé en évoquant un "besoin constant d'animaux" de son établissement et qualifie le recours aux ovins d'"indispensable" pour l'étude fine de la digestion.

Objectifs

L'agriculture est depuis toujours en constante évolution. Pour l'aider dans cette mutation la recherche agronomique a initié de nombreux programmes de recherche. Auparavant orientée vers l'augmentation des performances et l'amélioration de la productivité des espèces animales élevées et destinées à produire du lait et/ou de la viande, aujourd'hui elle s'orienterait plutôt à maintenir le niveau de production des animaux (ovins, bovins...) tout en prenant plus en compte les contraintes du milieu, les risques environnementaux (production des gaz à effet de serre, polution des sols...) ou les attentes sociétales (bien être animal, qualité des produits, traçabilité de l'alimentation...). Pour répondre à une partie de ces enjeux, notre établissement utilisateur a un besoin constant d'animaux. Pour réaliser des études fines des mécanismes physiologiques d'ingestion et de la digestion des aliments chez les ruminants , les animaux modèles utilisés sont ici des moutons castrés. C'est un modèle animal de référence pour établir les valeurs de digestibilité et d’ingestibilité des aliments pour ruminants, et pour comprendre les processus digestifs afin de les modéliser. De par son caractère générique, les résultats qu’il permet d’obtenir sont le plus souvent extrapolables aux autres catégories de ruminants (bovins, caprins, brebis et agneaux). Pour certaines études, en particulier pour la compréhension des mécanismes de digestion et de mesure de la cinétique de dégradation des aliments, le recours à des animaux porteurs de canules est indispensable. L’objectif de ce projet qui durera deux ans, est de trouver une alternative à certaines méthodes invasives sur animaux en particulier les canules permanentes sur ruminants. Ici, il s’agit premièrement de concevoir une canule ruminale temporaire pour ovin avec un diamètre d’insertion dans le rumen le plus étroit possible (= 3 cm) et pouvant être retirée quelques semaines après (max : 20 semaines). La pose de la canule se fera par chirurgie mais le retrait devra être réalisé sans chirurgie supplémentaire. Le but est que ces dispositifs ne soient positionnés sur l’animal que pour la durée de l’expérimentation et non sur la carrière de l’animal tout en permettant d'étudier les mécanismes fins de la digestion. Pour cela , nous réaliserons cette expérimentation sur deux moutons adultes afin de confirmer l'ensemble des étapes de ce protocole de mise en oeuvre.

Bénéfices attendus

Pouvoir étudier les mécanismes fins de la digestion en utilisant des animaux porteurs de canules. Les animaux ne seront équipés de ces canules que pour la durée des procédures soit quelques semaines. Les animaux ne seront plus équipés de canules permanentes durant toute leur carrière.

Procédures

Les deux animaux subiront deux interventions chirurgicales avec une sédation à la xylazine : la pose de la canule durera environ 30 minutes et le retrait de la canule durera moins de 10 minutes. Les prélévements sanguins seront réalisés sur les deux moutons vigiles et chacun durera moins d'une minute entre la contention et la réalisation de la procédure. Un volume maximum de sang de 20 ml par mouton est prélevé à la jugulaire (volume de prélèvement sans conséquence néfaste pour leur santé, inférieur à 1% du volume sanguin de l'animal), au moyen d’un vacutainer. Les prélèvements sanguins sont réalisés deux fois par jour à 3 heures d'intervalles à J-1, J0, J+1 et J+2 puis une fois par jour à J+5, J+7, J+9 et J+13 le matin à la pose et au retrait de la canule. Ces prélèvements seront réalisés par du personnel qualifié, les animaux seront préalablement habitués aux manipulations et aux prélèvements, pour que ceux-ci se passent dans le calme pour ne pas biaiser les indicateurs de bien-être animal (cortisol).

Impact sur les animaux

La présence de la canule engendre une légère gêne mécanique mais qui sera réduite à l'échelle de la procédure. De plus, au moment du retrait de la canule, un léger écoulement pourrait survenir pendant quelques heures, le temps que l'orifice ne se bouche de manière mécanique.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, les animaux retourneront dans le troupeau de mâles castrés après avoir complétement récupéré.

Remplacement

Dans certains cas de figure, notamment pour l'étude des mécanismes fin de la digestion, nous ne pouvons pas utiliser de méthodes alternatives (fermenteurs artificiels). C'est pour cela que nous avons recours à des ovins dans ce projet.

Réduction

Nous avons réduit au maximum les effectifs avec seulement deux animaux utilisés. Pour vérifier toutes les étapes, nous devons les confirmer avec au moins une répétition. Il serait vraiment très difficile de tirer des conclusions robustes avec seulement un seul animal.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour le raffinement notamment les conditions d'hébergement qui seront réduites au maximum individuellement et les surfaces par animal respectent les normes en expérimentation. La durée en case individuelle devrait correspondre à la période de cicatrisation soit une quinzaine de jours. Cependant, si des problèmes persistaient de cicatrisation ou d’étanchéité de la canule, elle pourrait durer le temps de l’expérimentation soit 6 à 8 semaines pour la sécurité de l'animal mais serait réduit au maximum. De plus, lors de la pose et du retrait le protocole médicamenteux est adapté afin que l'animal souffre le moins possible. Des antiinflammatoire ainsi que des antalgiques sont administrés sur 9 jours post-opératoires pour permettre à l'animal de se remettre dans de bonnes conditions. De plus, pour vérifier que son bien être n'est pas impacté, des grilles de suivi sont mises en oeuvre deux fois par jour de J-1, J0, J1, à J2, puis une fois par jour à J5, J7, J9 et J 13 suivant les opérations et des prises de sang sont réalisées en parallèle pour vérifier l'évolution du cortisol dans le sang.

Choix des espèces

Nous étudions la digestion des ruminants et le mouton est l'un de nos modèles d'étude de ces mécanismes. C'est pour cela que nous avons choisi l'espèce ovine. Nous étudions les mécanismes de digestion d'animaux adultes et c'est pour cela que nous travaillons sur des moutons âgés d'un à deux ans.

Jusqu'à 3 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des injections de tamoxifène déclenchent chez des souris génétiquement modifiées des lésions précancéreuses de la prostate, qui peuvent évoluer vers des tumeurs volumineuses provoquant douleur abdominale et perte de poids, la mise à mort étant prévue à 2 000 mm3 de tumeur ou à 20 % de perte de poids. Les animaux sont tués à différents temps pour prélever la prostate et d'autres organes. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique des lésions et conclut à la "nécessité" d'expériences in vivo.

Objectifs

Le cancer de la prostate ( CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020. Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires à l’origine de l’agressivité des tumeurs est donc requise afin de d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate, développés au laboratoire, répliquent les mutations du gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines. Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'homme. L'objectif de ce protocole est le suivi et caractérisation des lésions précancéreuses de la prostate. Suite à l'invalidation du ou des gènes, des lésions, nommées néoplasies intraépithéliales prostatiques (PIN), se développent. L'évolution des PIN sera suivie pendant un délai suffisant à l'apparition des formes agressives. En conclusion, cette étude permettra de caractériser les mécanismes d'apparition des formes agressives du cancer de la prostate afin d’identifier des nouvelles cibles thérapeutiques et des outils diagnostiques.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de cartographier l’évolution des lésions précancéreuses et l’implication des gènes étudiés dans cette évolution. Les prélèvements de fluides (urines et sang) nous aideront à mettre en évidence des biomarqueurs du cancer de la prostate permettant un diagnostic précoce de la maladie.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections intrapéritonéales du tamoxifène réalisés au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, 100 µL du sang sera prélevé sur 20 animaux à chaque point de la cinétique ( 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 12 et 15 mois après injections du tamoxifène), un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Une injection en intra péritonéale prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris.

Impact sur les animaux

Suite à l'injection du tamoxifène, une infection peut se développer au niveau de l'abdomen de la souris dans les journées suivantes l'injection. Lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. La taille de tumeur sera donc un point limite clé(2000 mm3). Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

L’effectif demandé a été calculé afin d’obtenir les groupes des souris mutantes à différents points cinétiques de taille suffisante pour réaliser les tests statistiques de sorte à pouvoir tirer des conclusions pertinentes de nos expériences. Pour un type de souris donné et un point cinétique donné, 20 souris seront utilisées. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction de nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. En revanche, sur les points clés, des expériences supplémentaires pourront être réalisées, toujours dans la limite de 3200 souris maximum.

Raffinement

Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Après injection, les souris seront observées pour détecter les éventuels signes de douleur ou de souffrance, à savoir la posture inhabituelle, le dos vouté, le poil hérissé, les grimaces, les vocalisations. Si ces signes persistent dans la journée suivant l'injection, les souris seront sorties de l'étude. De plus, lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, elles seront observées par l'expérimentateurs et le personnel de l'animalerie d'hébergement chaque semaine afin de contrôler la taille de la prostate par palpation et l’apparence générale de la souris. Les points limites de l’expérience seront le volume de la prostate et le poids de la souris. Si le volume de la prostate est supérieur à 2000 mm3, les souris seront mises à mort et disséquées pour analyse histologique. Si la perte de poids est supérieure à 20% et/ou si la souris présente des signes de souffrance ou de détresse (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif, léthargie), la souris sera retirée de l’expérience et sacrifiée. Après chaque prélèvement sanguin, un volume équivalent au prélèvement de sérum physiologique sera injecté en sous-cutanée. De plus, le lieu de l'injection sera surveillé dans les journées suivantes afin de détecter des signes d'une éventuelle inflammation (rougeur, gonflement).

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans des gènes Pten et Trp53 le plus fréquemment mutés dans les cancers de la prostate humain pour générer nos modèles. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à l’organisme adulte. Les animaux utilisés seront adultes, les injections de tamoxifène se feront sur des jeunes adultes à partir de 8 semaines après naissance.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses puis une radiothérapie, avant des examens IRM répétés sous anesthésie avec injection d'agents de contraste, et sont tuées pour prélever le cerveau. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer titubation, léthargie, perte de poids et crises d'épilepsie, la mise à mort intervenant à 15 % de perte de poids ou à l'atteinte d'autres points limites. Il conclut que l'imagerie du petit animal vivant est un maillon "indispensable" pour mettre au point une IRM de la radionécrose transposable à la clinique.

Objectifs

La radiothérapie est une option thérapeutique qui peut engendrer des phénomènes nécrotiques et inflammatoires intenses, appelés radio-nécrose, 6 mois à 2 ans chez près de 25% des patients. Cette radio-nécrose est un effet secondaire de la radiothérapie et limite la précision de l'évaluation de la réponse tumorale à la thérapie. En effet, ces lésions dues aux radiations peuvent être confondues avec la progression tumorale, d'où le terme parfois utilisé « pseudoprogression ». A ce jour, seule l’analyse d’échantillons extraits par biopsie s’avère être totalement fiable pour différencier ces deux phénomènes. Mais la biopsie reste une intervention chirurgicale pouvant présenter certains risques pour le patient et le résultat peut s’avérer peu informatif étant donnée la petite taille de l’échantillon vis-à-vis du volume et de l’hétérogénéité tumorale. Diagnostiquer précisément le plus tôt possible une radionécrose ou une récidive est essentielle afin d’adapter au mieux le traitement. L’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une méthode de choix pour la détection de tumeurs cérébrales. Cependant, les techniques d'IRM conventionnelles ne sont toujours pas capables de distinguer la progression tumorale de la radio-nécrose, car les deux présentent la même apparence sur les images IRM. Ainsi actuellement, des séries d’examens IRM incluant l’ensemble de ces nouvelles techniques sont nécessaires pour affiner les pronostics sans pour autant atteindre 100% d’exactitude. L’actuel projet de recherche s'appuie lui sur la relaxométrie IRM. Cette technique permet de quantifier les propriétés tissulaires pour caractériser la microstructure du tissu et ainsi augmenter la spécificité de détection. De plus, pour résoudre le problème spécifique de la différenciation radio-nécrose/progression, ce projet adoptera une approche de pointe pour extraire des informations sur la microstructure du tissu au sein de chaque voxel (pixel en 3D). Ce projet vise à développer des méthodes avancées d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour permettre l'évaluation in vivo non invasive de la réponse à la radiothérapie de gliomes implantés ou de métastases cérébrales chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de cette partie du projet est la proximité et un accès facilité à la plateforme IRM pour des examens réguliers et la possibilité de suivre les animaux quotidiennement. Les bénéfices globaux de ce projet sont: 1) le modèle tumoral suivi d'une session de radiothérapie est représentatif de cas chez l’homme, donc la méthodologie IRM pourra être transférée rapidement; 2) Les données recueillies avec la nouvelle méthode IRM fourniront un point de départ solide pour a) évaluer la possibilité d'éviter les biopsies et b) évaluer plus précocement l'évolution de la maladie; 3) Les résultats de ce projet bénéficieront à long terme aux patients atteints de cancers cérébraux. En effet, nous sommes en cours d’implémentation de ces séquences de relaxométrie multi-compartiment sur une IRM clinique. De nouveaux biomarqueurs permettant de distinguer la récidive tumorale de la nécrose seront développés et mis à disposition via des techniques d'IRM rapides et robustes compatibles avec l'environnement clinique. Cela facilitera le diagnostic et permettra une prescription de traitement adapté. De plus, cela devrait réduire la nécessité d'une biopsie chirurgicale et ainsi limiter les risques pour le patient. Finalement, cette nouvelle technique IRM améliorera le confort des patients (pas d’injection d’agents de contraste, acquisitions rapides, diagnostics plus précis, technique d’imagerie inoffensive).

Procédures

Les 100 animaux seront soumis à une injection de cellules cancéreuses (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique) ou pas. Ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Les animaux seront ensuite transportés dans une autre animalerie d’hébergement, permettant un accès facilité aux instruments d’imagerie. Les animaux seront soumis à une injection d’agents de contraste IRM sous anesthésie générale à chaque examen IRM. Ces examens seront séparés d’au minimum 3 jours. En fin de suivi IRM, ils seront euthanasiés sous analgésie et anesthésie générale pour un prélèvement propre du cerveau en vue de réaliser des examens IRM post-mortem et des coupes histologiques.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux pourraient induire des effets indésirables sur le comportement de l’animal (titubation, léthargie), sur son apparence (yeux mi-clos, dos vouté), une perte de poids, et des signes neurologiques tels que la tête penchée, tremblements, crises d’épilepsie. La radionécrose tumorale ne devrait pas induire de douleur. En revanche, si une radionécrose du tissu cérébral sain intervient, celle-ci pourrait devenir douloureuse et sera détectée par des modifications du comportement ou de l’apparence physique. De plus, le transport des animaux d’un établissement utilisateur à un autre pourrait induire un stress aux animaux.

Devenir

Les examens IRM n’induisent pas de souffrance donc ces examens peuvent être répétés pour suivre l’évolution de la tumeur et de la radionécrose. Cependant, afin de confirmer la détection de la radionécrose par IRM, les animaux doivent être euthanasiés pour extraire le cerveau et réaliser des études histologiques.

Remplacement

Notre projet est à visée translationnelle. En effet, nous souhaitons développer des séquences IRM permettant un diagnostic plus précoces et fiables de la radionécrose (grâce à l’obtention d’images avec des résolutions spatiales et temporelles plus élevées, et des informations plus quantitatives). L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus.

Réduction

Les séquences IRM sont déjà développées et ont déjà été évaluées sur des souris saines. Ainsi, seulement des souris pathologiques (portant soit des gliomes soit des métastases cérébrales) seront imagées. Du fait de la non-invasivité de l’imagerie par IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum de trois jours entre chaque examen. De plus, les structures cérébrales contralatérales au gliome serviront de contrôle interne. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Pendant les chirurgies, l'utilisation d'anesthésies gazeuses, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle visuel de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Les souris portant des tumeurs ou métastases cérébrales seront étudiées jusqu’à ce que leurs poids aient diminué de 15% ou que les autres points limites soient atteints. Une grille de scorage a été instaurée pour surveiller la santé et le bien-être des animaux, comprenant des signes au niveau du comportement, de la mobilité, de la perte de poids, et de l’apparition de signes neurologiques. Si des signes de mal-être apparaissent, les animaux seront pris en charge par un analgésique. Des points limites ont aussi été instaurés, induisant une euthanasie immédiate. Les animaux seront observés une fois par jour. La fréquence d’observation passera à 2 fois par jours dès le début de la perte de poids (10%). Les souris seront hébergées dans des cages avec un environnement enrichi par des objets (bâtonnets de bois à ronger, matériaux de construction de nid, maisonnette, tubes en carton) contenant de la paille, de la nourriture et de l’eau à volonté.

Choix des espèces

Les souris C57Bl/6N et BalbC sont couramment utilisées dans la littérature, permettant de comparer nos résultats à des études précédentes. De plus, elles possèdent un système immunitaire fonctionnel permettant de mimer la pathologie humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car le développement des organes sera terminé.

671 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Elles reçoivent des greffes de cellules cancéreuses par voie sous-cutanée, intraveineuse ou intracardiaque, puis un agent anticancéreux deux fois par jour ou par pompe implantée, avec des tumeurs pouvant s'ulcérer et se nécroser, une perte de poids et des hématomes, pour évaluer une pro-drogue activée dans le microenvironnement tumoral. Le porteur suit la croissance des tumeurs par IRM, la mise à mort étant déclenchée à un score de souffrance défini. Il affirme qu'il est "indispensable" d'utiliser des animaux vivants car le système immunitaire et les tissus environnants seraient nécessaires.

Objectifs

L'agent anticancéreux que nous étudions sont des pro-drogues activables par des enzymes qui libèrent des agents toxiques. En effet, la présence d’activité enzymatique permanente est une caractéristique du microenvironnement des tumeurs. Ces enzymes actives peuvent provenir des cellules tumorales, des cellules infiltrées ou encore des cellules environnant la tumeur. L'agent anticancéreux activé par les enzymes ont un effet toxique qui permettrait de tuer plus spécifiquement les cellules cancéreuses qu’une drogue de chimiothérapie classique qui s’attaque à toute cellule en division indistinctement. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer l'effet thérapeutique du nouvel agent anticancéreux sur des modèles de tumeurs et de métastases, non seulement, pour la prévention de formation de tumeurs mais aussi pour le traitement de tumeurs déjà formées.

Bénéfices attendus

Tout d'abord, basées sur nos résultats in vitro, le traitement par le nouvel agent anticancéreux devrait être efficace sur le développement de tumeurs et de métastases. De plus, du fait de sa cible, la dissémination des cellules cancéreuses devrait être réduite, limitant le développement métastatique. Contrairement aux agents chimiothérapeutiques actuels, la toxicité induite par le nouvel agent anticancéreux devraient être ciblée aux cellules tumorales, et induire peu, voire pas du tout, de résistance. Ainsi, du fait de sa spécificité d'action, les effets secondaires obtenus lors de chimio-thérapie classique devraient être absents. Le nouvel agent anticancéreux pourrait être utilisé pour traiter de nombreux cancers solides.

Procédures

Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. 264 souris seront injectées en sous-cutané avec des cellules cancéreuses (durée de l'intervention: 10min par animal) puis traitées avec l’agent anti-cancéreux soit deux fois par jour par voie intraveineuse, intrapéritonéale, ou intra-tumorale (durée de ces injections: 2-3min par animal), soit en continu grâce à une pompe osmotique implantée en sous-cutanée. Ce traitement sera réalisé jusqu’à ce que l’effet thérapeutique soit observé. 73 souris seront injectées en intra-cardiaque avec des cellules cancéreuses (durée de l'intervention: 10min par animal) puis traitées avec l’agent anti-cancéreux soit en continu grâce à une pompe osmotique implantée en sous-cutanée, soit par des injections intraveineuses ou intra-péritonéales biquotidiennes (durée des injections: 2-3min par animal). Ce traitement sera réalisé jusqu’à ce que l’effet thérapeutique soit observé. 264 souris seront injectées en intraveineux avec des cellules cancéreuses (durée de l'intervention: 10min par animal) puis traitées avec l’agent anti-cancéreux soit en continu grâce à une pompe osmotique implantée en sous-cutanée, soit par des injections intraveineuses ou intra-péritonéales biquotidiennes, soit par des instillations biquotidiennes (durée de ces injections: 2-5min par animal). Ce traitement sera réalisé jusqu’à ce que l’effet thérapeutique soit observé. 70 souris saines seront injectées avec l’agent anti-cancéreux par voie intraveineuse ou intrapéritonéale deux fois par jour (durée de ces injections: 2-3min par animal) pendant la même durée que celle déterminée sur les souris portant des tumeurs ou métastases. Puis les animaux seront soumis à un examen IRM sous anesthésie générale toutes les semaines jusqu’à ce que l’effet thérapeutique soit observé. Lors de cet examen, une injection intraveineuse d'un agent de contraste (durée de l'injection: 1min par animal) sera réalisée.

Impact sur les animaux

Du fait de la haute spécificité de substrats des alkoxyamines, celles-ci ne devraient pas entrainer de nuisance ou d'effets secondaires. Cependant, en théorie une baisse de tension est possible due à la présence des nitroxydes. Selon notre expérience elle n’entraine jamais de séquelle ou de perte d’animaux. Les effets indésirables attendus à cause des modèles tumoraux devraient être détectables au niveau de l’apparence physique (prostration, pilo-érection, chromadacryorrhée), du comportement, de la respiration (respiration rapide/superficielle), d’alimentation (perte de poids), de température corporelle. De plus, les tumeurs sous-cutanées peuvent aussi être sources de nuisances (ulcération, nécrose, difficulté de mobilité). Les instillations intra-trachéales pourraient induire une irritation de la gorge associée à des signes d’inconfort respiratoire (dyspnée, respiration orale). Les injections intraveineuses biquotidiennes pourraient provoquer des hématomes, et une mauvaise perfusion sanguine.

Devenir

Nous souhaitons déterminer si le nouvel agent anti-cancéreux permet de réduire la croissance tumorale ou empécher la formation de métastases. Un suivi longitudinal est donc nécessaire.

Remplacement

Il est indispensable d’utiliser les animaux vivants, car nous souhaitons évaluer l'efficacité thérapeutique d'un nouvel agent anticancéreux sur des tumeurs, dont le micro-environnement inclut des enzymes actives qui proviennent souvent des cellules non tumorales qui infiltrent la tumeur ou des cellules qui entourent la tumeur. Ainsi, le système immunitaire et les tissus normaux environnants sont particulièrement nécessaires pour évaluer leur efficacité.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux à utiliser pour ce projet, des expérimentations in vitro ont été réalisées (et seront réalisées) en amont, pour étudier l'effet du nouvel agent anticancéreux sur chacune des cellules cancéreuses en culture. De plus, comme nous avons déterminé que les cellules de fibrosarcomes répondaient au traitement in vitro, nous débuterons nos expérimentations avec ces cellules. Selon les résultats sur ce modèle, le nombre d'animaux nécessaires pour déterminer la concentration optimale et la voie d'injection appropriée pourra être diminué pour les autres modèles de tumeurs primaires et métastases. En effet, nous pourrons réduire le nombre de concentrations à tester ainsi que les voies d'injection, afin de limiter le nombre d'animaux total. L'imagerie par Résonance Magnétique (IRM) permet d'imager l'animal plusieurs fois pour évaluer un traitement (ici pour suivre l’évolution de la croissance tumorale) sans avoir recours à des euthanasies à différents temps au cours du traitement pour réaliser de l'histologie. Cette méthode a été choisie car elle permet de limiter énormément le nombre d'animaux. Nous avons évalué que 3 souris par concentration d’agent anticancéreux suffiront pour déterminer si la molécule entraine un effet thérapeutique. Ensuite, 10 souris par groupe seront utilisées afin de pouvoir comparer les groupes statistiquement.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi par des objets contenant de la paille, de la nourriture et de l’eau à volonté. L'utilisation d'anesthésies gazeuses et la présence d'un tapis chauffant permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Du gel ophtalmologique sera appliqué sur les yeux afin de compenser la sécheresse oculaire lors des anesthésies. Afin d'administrer l'agent anticancéreux, nous testerons l'utilisation de pompes osmotiques implantables sous la peau de l'animal et reliées via un cathéter à la veine jugulaire. Ceci permet une administration continue des molécules, et réduira le stress de l'animal comparé à des injections quotidiennes nécessitant une contention voire une anesthésie générale. Une grille de scorage a été établie pour permettre de suivre l’état des animaux deux fois par semaine minimum. Différents critères ont été établis pour évaluer le bien-être tant au niveau de l’apparence physique, du comportement, du poids de corps, de la respiration, de la température corporelle et de signes cliniques au niveau tumoral. Chaque critère est noté sur 3. Si le score total est supérieur à 4, une prise en charge analgésique de l’animal devra être réalisée. Si le score atteint 10, l’animal sera euthanasié dans la journée, après une dernière session IRM. Les souris seront pesées juste avant les procédures de mise en place d'un modèle tumoral, puis deux fois par semaine. Lorsque une perte de poids de 10% sera mesurée (signifiant l’entrée en phase critique), les animaux seront pesés 3 fois par semaine. Lors de ces pesées, les volumes des tumeurs sous-cutanées seront mesurés grâce à un pied à coulisse. Dès les premiers signes de mal-être (score supérieur à 4), les animaux seront pris en charge par un analgésique. Si besoin, une crème sera appliquée pour désinfecter les lésions tumorales; 1 goutte dans l’oeil d’un désinfectant oculaire sera déposée 2 fois par jour en cas de besoin de soins oculaires. Du gel diet sera mis-à-disposition dans les cages dès que les animaux auront perdu 10% de leurs poids initial. Une réhydratation pourra être réalisée grâce à une injection sous-cutanée de glucose 5%. Le nombre d’animaux par cage pourra être réduit pour isoler les animaux les plus affaiblis, et un enrichissement renforcé pourra être appliqué. Des points limites ont été instaurés prenant en compte le modèle tumoral, induisant une euthanasie dans la journée après une dernière session IRM.

Choix des espèces

La souris permet de développer de nombreux modèles tumoraux, dont nous avons l’expertise. Les cellules cancéreuses d'origine murine seront injectées dans des souris possédant un système immunitaire actif. Les souris immunodéficientes seront injectées avec des cellules cancéreuses d'origine humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge jeune adulte (à partir de 10 semaines), car nous souhaitons mimer le développement d'un cancer chez l'homme adulte.