Oncologie

4 032 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du foie leur est greffée sous la peau ou induite par injection intraveineuse, puis chauffée à 43-45 °C par des nanoparticules activées au laser ou par champ magnétique, sous suivi d'imagerie. Le porteur qualifie les effets secondaires de "très limités" et renvoie l'amélioration de la prise en charge des patients au conditionnel. Il présente le recours à un "organisme entier" comme un "passage obligé" avant tout transfert vers l'humain.

Objectifs

Les cancers hépatobiliaires, en particulier le cholangiocarcinome (CCA) sont difficiles à traiter. Le développement de la nanomédecine permet d’envisager des traitements anticancéreux mieux ciblés, plus efficaces et avec de moindres effets secondaires par rapport aux traitements conventionnels. L’utilisation de nanoparticules activables à distance par un rayonnement lumineux dans le proche infrarouge permet de contrôler l’action thérapeutique à la fois dans le temps et dans l’espace. Le projet propose l’évaluation d’une thérapie anticancéreuse localisée par échauffement de nanoparticules sous rayonnement électromagnétique non ionisant, (lumière dans le proche infrarouge ou champ magnétique alternatif) en association ou non avec une immunothérapie ou une thérapie ciblée anti-EGFR. Cette évaluation sera réalisée sur un modèle murin après injection sous cutanée de cellules murines de cancer de CCA. L’échauffement de la tumeur sera modulé par la puissance du laser/champ magnétique et réduit aux zones d’accumulation des nanoparticules. On visera une hyperthermie modérée (43°C à 45°C pendant 30 min, répétée 2 ou 3 fois à 24h d’intervalle au moins) de manière à moduler thermiquement le microenvironnement tumoral et le rendre plus permissif aux chimiothérapies. L’évolution de la masse tumorale sera suivie par échographie, modalité qui est intégrée au module d’Imagerie Photoacoustique. L’imagerie permettra un suivi longitudinal de la biodistribution/dégradation/élimination de nanoparticules utilisées, en complément des caractérisations ex vivo. L’objectif final est d’identifier les nanomatériaux de meilleur potentiel thérapeutique associé une biodistribution favorable, biodégradable et sans effet indésirable à long terme.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de développer des stratégies thérapeutiques loco-régionales pour traiter le cholangiocarcinomes qui présentent une toxicité moindre en comparaison aux traitements anticancéreux systémiques. Ce projet pourrait donc permettre d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients en combinant une thérapie loco-régionale et systémique en administrant des doses plus faibles de drogues, réduisant les effets systémiques toxiques secondaires.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers du foie et à leurs traitements. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Pour cela, une première partie des animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales ectopiques, sous la peau (injection sous-cutanée sur animal vigile ou anesthésié). Une seconde partie des animaux subiront une injection hydrodynamique (injection intraveineuse animal vigile) de vecteurs plasmidiques afin d’induire une tumeur dans le foie (moins d’une minute). Les animaux seront ensuite impliqués dans différents traitements seul ou en combinaison : traitement par nanohyperthermie sous anesthésie, injection intraveineuse ou intrapéritonéale (1 à 40 minutes maximum selon les traitements). Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale (20 minutes maximum). Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet qui vise à trouver des traitements innovants du cholangiocarcinomes. Les traitements mis en œuvre devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possibles effets secondaires mais qui restent très limités (inflammation locale et toxicité hépatique et/ou biliaire).

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=4032) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Un système vivant est nécessaire pour tester des nouvelles stratégies antitumorales in vivo. C’est un passage obligé demandé par les industries pharmaceutiques ou les compagnies de valorisation (pour dépôt de brevet) avant un éventuel transfert à l’Homme. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans la croissance tumorale. L’effet antitumoral et la dégradabilité de nanoparticules utilisées in vivo seront au préalable testés et optimisés in vitro sur des modèles cellulaires 2D ou 3D ou encore dans des milieux mimant l’environnement biologique (remplacer).

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Au total ce projet impliquera 4032 souris immunocompétentes ou immunodéficiences en fonction des questions scientifiques. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. L’utilisation de cette technique d’imagerie non invasive combinée à la mutualisation de tissus pour les caractérisations ex vivo permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude (réduire).

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Ainsi, l’hébergement, les soins et l’ensemble des procédures expérimentales sur les animaux seront effectués dans le respect du bien-être animal avec la définition de points limites au-delà desquels l’expérience sera interrompue (raffiner).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : La souris est le modèle classique des expériences et études en cancérologie ; sa taille et son poids autorisent en outre d’utiliser de faibles quantités de composés cytotoxiques. La disponibilité de souches consanguines exprimant de façon stable des phénotypes immuno-supprimés permet de réaliser des xénogreffes de tumeurs humaines sans avoir recours à une suppression immunitaire iatrogénique. La disponibilité de souris non immunodéprimées permet également de réaliser des greffes syngéniques avec des cellules tumorales de la même espèce permettant ainsi d’étudier le système immunitaire et de tester des drogues anti-tumorales basées sur l’utilisation d’anticorps. Description du ou des modèle(s) : La souris Nude est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets anti-tumoraux sur des cellules humaines. Nous utiliserons la souche Athymic Nude-Foxnu. Nous utiliserons également les souris C57BL/6J pour les greffes syngéniques (pour greffer sous la peau des cellules cancéreuses murines) et pour induire une tumeur dans le foie par injection hydrodynamique de vecteurs plasmidiques dans la veine de la queue. Justification du stade : Les animaux sont utilisés au stade adulte (5-8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.

2 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'adénovirus sous anesthésie, subissent des changements de régime et des jeûnes répétés dont un jeûne intermittent de deux semaines, des injections d'insuline et une incision de la queue pour prélèvements sanguins. Cette recherche fondamentale sur le métabolisme du glucose, le diabète et la stéatose hépatique mobilise un effectif de plus de deux mille cinq cents animaux. Le porteur affirme que le modèle animal est "indispensable" pour étudier la régulation de la glycémie de manière intégrée.

Objectifs

Des perturbations du métabolisme du glucose pourraient jouer un rôle important dans des pathologies humaines comme le diabète de type 2. Ce projet nous conduit à nous focaliser sur deux cibles moléculaires. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer les contributions de ces deux cibles moléculaires et des protéines produites dépendantes de ces cibles et pouvant signalées dans d’autres tissus, au maintien des fonctions hépatiques et de l’homéostasie glycémique et lipidique.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement de l'insulinorésistance et de la stéatose hépatique. Très peu de molécules pharmacologiques sont développés pour réverser la stéatose hépatique. Nos recherches en modulant les acteurs moleculaires clefs de la voie d'utilisation du glucose

Procédures

Une partie des animaux subira une injection veineuse d'adenovirus sous anesthésie, cette injection durera par voie veineuse sera de 30 secondes maximum. Des changements de régime alimentaire seront réalisés avec des durées de 4 à 20 semaines en fonction des régimes. Nous réaliserons des tests physiologiques sur une durée de 2 heures. Pour cela après injection d'insuline ou gavage de glucose, des prélèvements de sang sur les animaux vigiles au niveau codal. Ces prélèvements se feront par une incision légère de la queue qui sera réalisée une seule fois et des prélèvements seront réalisés 7 fois pendant les 2 heures suivant cette incision. Nous réaliserons une injection d’insuline par voie intra-péritonéale. Les animaux seront mis à jeun pendant 5 heures puis seront injectées d’insuline, injection qui durera 30 secondes maximum. Nous ferons une manipulation nutritionnelle sur nos souris. Pour cela, les souris seront soit mises à jeun 24h soit mises à jeun puis renourries pendant 18h ou on ajoutera à l’alimentation des souris de l’eau glucosée pendant 24h. pour les manipulations nutritionnelles, les souris subiront un jeûne intermittent pendant 2 semaines, ainsi il y aura un cycle de jeûne et d’alimentation toutes les 24h Les souris seront anesthésiées par une injection par voie intrapéritonéale en fin d’expérience afin de réaliser les prélèvements nécessaires.

Impact sur les animaux

Pour les procédures impliquant des injections des adénovirus, l’injection par voie veineuse d’adénovirus sous anesthésie ne cause pas de douleur. Pour les procédures impliquant un changement de régime, parmi les effets indésirables, il peut y avoir une perte de poids. Pour les procédures impliquant des injections d’insuline, il peut y avoir des risques d’hypoglycémie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus et le sang pour des analyses biochimiques et moléculaires.

Remplacement

L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier la régulation de la glycémie de manière intégrée ainsi que le développement de maladies tels que la NAFLD. Par ailleurs, l'identification et la validation de cibles thérapeutiques par des traitements pharmacologiques nécessite l'utilisation d'un modèle in vivo mimant le plus fidèlement la pathologie humaine (diabète de type 2). La réalisation d'explorations fonctionnelles sur animal vigile ne peut donc pas être subsituée par des approches entièrement in vitro.

Réduction

Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux nécessaires afin de vérifier nos résultats et les valider sans que cela conduise à des répétitions inutiles. Pour cela, nous faisons en sorte, dans la mesure du possible d'exploiter au maximum nos animaux pour ne pas avoir recours à d'autres groupes expérimentaux. **Pour ce projet, nous utiliserons 2530 souris réparties sur 9 procédures. Un nombre minimum de souris sera inclus dans chaque groupe, La taille des effectifs ayant été établie grâce à un calcul de puissance pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions.

Raffinement

** Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont hébergés par 6 et l'isolement est évité. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft ou maisons en carton. Pour respecter le principe des 3R, les mêmes souris seront soumises à différents tests physiologiques et métaboliques permettant de limiter le nombre de groupes expérimentaux. Pour la procédure impliquant des injections en intraveineuse, l’injection se faisant sur animal anesthésié à l’isoflurane (1-2% isoflurane dans 100% O2), cette procédure n’engendre pas de de douleur. Le suivi de ces animaux sera suivi quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Pour les procédures impliquant un changement de statut de régime alimentaire, Le changement de régime pouvant induire une variation de poids, nous suivons le poids des souris par une pesée hebdomadaire et un suivi sur fichier excel. Toutefois, les souris seront observées par les expérimentateurs pendant toute la durée du protocole puis quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Enfin, nous surveillerons l’apparition des signes systémiques de souffrance suivant: 1) Apparence physique :0 : Normal 1 : Poils légèrement ébouriffés 2 : Poils ébouriffés, dos « vouté », yeux plissés 2) Apathie 0 : activité normale 1 : activité réduite 3 : activité nulle, apathie 3)Perte de poids 0 : Normale 1 :Perte de poids> 10% 2 :Perte de poids > 10% et 20% Pour une valeur totale égale à : 2 : l’animal sera suivi 2 fois par semaine et nous tenterons une réhydratation par injection de serum physiologique. Si le score maximal de 3 de l'un des critères est atteint ou si le score global atteint 6 l'animal sera mis à mort sur décision du porteur du projet**

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme. De plus,l'utilisation de modèles de souris transgéniques (knock-out) permet de mieux comprendre le rôle de différents gènes dans le développement de s maladies que nous étudions et que ce sont le diabète et la stéatose hépatique. A terme cela permettra de tester de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons des souris adultes à partir de 8 semaines chez lesquelles la régulation de l'homéostasie glucidique est fonctionnelle.

2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une chimiothérapie provoquant une cardiotoxicité, puis sont suivies par échocardiographie sous anesthésie, prélèvements sanguins et mesures de pression artérielle, avant mise à mort pour prélever leurs organes. Le porteur décrit une cardiotoxicité le plus souvent asymptomatique, avec de rares arythmies graves, et vise une stratégie pharmacologique de prévention. Il affirme que l'usage d'animaux vivants est "indispensable" faute de reproduire cette toxicité in vitro.

Objectifs

Certains traitements anticancéreux ont des effets cardio-toxiques et exposent les patients au risque d'insuffisance cardiaque. Nous avons démontré, in vitro et in vivo, que l’inhibition d’une protéine , impliquée dans un réflexe primitif de la faim, induit l'activation du flux autophagique dans des modèles de toxicité chronique du foie. Sur la base de ces observations, l’objectif de ce projet est de déterminer si l'inhibition de cette protéine peut prévenir ou traiter la cardio-toxicité chimio-induite chez des modèles murins appropriés.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter la cardio-toxicité induite par la chimiothérapie, qui est un facteur de risque chez les patients oncologique et qui représente un défi important pour la santé publique.

Procédures

Les injections intra-péritonéales (i.p.) ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectuées sur l’animal vigile. La durée des injections i.p. est de quelques secondes. Les souris seront isolées pour un maximum de 2 jours quand placées dans les cages calorimétriques. Les animaux seront soumis à une évaluation d’échocardiographie (3 ou 4 fois), un prélèvement sanguin (4 fois), une mesure de la pression artérielle (4 fois). La mesure de la pression artérielle (environ 20 min par mesure) et le prélèvement sanguin (quelques secondes par prélèvement) seront effectués sur animal vigile. L’examen d’échocardiographie sera effectué sur animal anesthésié (30 min par examen). L'échocardiographie et la mesure de la pression artérielle sont les méthodes de diagnostic les plus utilisées en cardiologie chez l’homme. Ces pratiques de routine ne sont pas invasives.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendu en dehors de ceux connus et causés par l’induction de la cardio-toxicité induite par la chimiothérapie. La cardiotoxicité aigue qui est induite dans ce protocole est la plupart du temps asymptomatique (altérations transitoires de la fonction systolique et des arythmies). Des manifestations symptomatiques graves mais rares (moins de 1%) peuvent apparaître sous la forme d'une tachycardie et fibrillation ventriculaire, et d'une insuffisance cardiaque aigüe.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la cardio-toxicité induite par la chimiothérapie vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2016 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie des animaux, utilisation de tapis chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines car l'âge a un impact sur la production neuronale de neurotransmetteurs et du métabolisme.

34 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés et remis dans leur troupeau. Ils subissent jusqu'à quatre séances d'IRM sous anesthésie de deux heures et demie, et cinq agneaux sont castrés pour maintenir un groupe social mixte. Le projet cartographie le cortex auditif ovin et développe des techniques de neuro-imagerie présentées comme utiles au "bien-être" des animaux non-humains d'élevage. Le porteur mobilise un argument de consommation, citant un Eurobaromètre sur le prix que les Européens accepteraient de payer, et affirme que l'étude ne peut être menée que sur l'animal vivant.

Objectifs

Les objectifs généraux de ce projet sont : 1) Fournir des connaissances fonctionnelles et structurelles fondamentales sur le système sensoriel auditif du cerveau du mouton et en particulier sur son réseau de traitement de l'information sociale. 2) Initier l'utilisation de l'IRM fonctionnelle pour étudier les capacités perceptives et cognitives d’animaux de ferme. De plus, l'objectif du premier avenant (accepté) était d'inclure un groupe supplémentaire d'ovins afin de pouvoir les entraîner dès leur plus jeune âge à rester immobiles dans l’IRM afin de permettre la réalisation de courtes séances IRM à l’état éveillé sans la contrainte de l’anesthésie. D’autre part, nous nous demandons quels sont les effets de l’anesthésie au niveau de l’activité cérébrale. Pour cela, nous envisageons de réaliser des sessions IRM sous anesthésie avec les animaux de ce groupe supplémentaire, tout en appliquant la même procédure que celle qui fait l’objet de la saisine originale.

Bénéfices attendus

Cette étude va contribuer à l'enrichissement des connaissances scientifiques en ce qui concerne les capacités perceptuelles et cognitives des ovins ainsi que les mécanismes neuronaux sous-jacents. En effet, ce projet permettra le développement de techniques de neuroimagerie cognitive afin d'explorer l'état mental de ces animaux, ce qui permettra à long terme d'obtenir une image claire des besoins nécessaires au bien-être d'une espèce ou même d'un individu. En plus d'étudier le cerveau du mouton afin de comprendre les besoins nécessaires à son bien-être, ce modèle animal est également un modèle important du cerveau humain. Les données qui seront obtenues au cours de ce projet en ce qui concerne le système auditif du mouton pourront également être utiles pour les recherches sur les pathologies qui impliquent des modifications de la perception auditive. De plus, l'IRM est une technique de neuroimagerie non invasive et la plus adaptée pour étudier l’organisation anatomique et fonctionnelle des connexions cérébrales; cette méthode ne nécessitant pas l'euthanasie de l'animal contrairement à d'autres techniques plus invasives. Enfin, l’intérêt de cet avenant est d’intégrer des agneaux à l’étude et de les entraîner dès leur plus jeune âge à rester immobiles dans l’IRM afin de permettre la réalisation de courtes séances IRM à l’état éveillé sans la contrainte de l’anesthésie. Cela aura ainsi pour but de minimiser le stress des individus lié à la procédure d’anesthésie ainsi qu’au dispositif IRM et à la présence humaine. En effet, l'entraînement, qui est basé sur un renforcement positif (= récompense), permettra une optimisation de la relation de l’animal avec le soigneur ainsi qu’une habituation au matériel nécessaire pour réaliser les séances IRM. Ainsi, dans le cadre de ce projet, le développement de protocoles dans différentes conditions (anesthésié, éveillé) permettra de réaliser des neurosciences cognitives chez l’ovin.

Procédures

IRM sous anesthésie (4 sessions max, d'une durée de 2,5h chacune) Castration des 5 agneaux du groupe entraînement (durée entre 20 et 45 min par individu : variable selon le temps de réveil)

Impact sur les animaux

Des effets indésirables peuvent apparaître notamment lors de la procédure de l’anesthésie. On peut ainsi retrouver des modifications de la fréquence cardiaque et respiratoire en lien avec cette technique. L’animal peut également avoir des difficultés à se réveiller à la suite de l’anesthésie et présenter des vomissements. Il se pourrait que l’animal soit allergique à l’anesthésie. On peut également retrouver un stress lié au transport des animaux et / ou à leur capture. Les mâles pourront également présenter des signes cliniques (perte d'appétit, décubitus prolongé) à la suite de la castration. Pour limiter ces signes cliniques, un analgésique (butorphanol) leur sera administré.

Devenir

Les animaux retournent dans leur troupeau à l'UEPAO.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les capacités de perception auditive des moutons et à développer les techniques de neurosciences cognitives capables d'étudier cet aspect et d'autres de la vie mentale des animaux. La recherche sur la vie mentale des animaux nécessite l'inclusion de l'animal dans l'expérience. Cette étude ne peut être conduite sur un autre modèle. Elle ne peut être menée que sur l’animal vivant et aucune méthode de remplacement comme une étude in vitro n’est envisageable.

Réduction

Le total de 24 individus prévus dans ce projet est le meilleur compromis entre la capacité à tester de manière fiable notre hypothèse et la minimisation du nombre d'animaux de recherche utilisés. Le choix d'utiliser l'IRMf réduit également le nombre d'animaux requis car chaque animal peut participer à plusieurs séances expérimentales (maximum 4) et sera maintenu en vie après cette étude. De plus, l'objet de cet avenant est d'inclure 10 agneaux de race Ile-de-France dans ce projet. Le choix de ces 10 animaux est un nombre nécessaire pour constituer un groupe social. Cela nous permettra ainsi d’étudier le comportement et la personnalité de chacun des individus du groupe lors de l'entraînement, et de sélectionner les ovins les plus réceptifs à ce protocole afin de pouvoir réaliser des séances IRM à l’état éveillé.

Raffinement

L’IRM est la méthode la moins invasive et la plus adaptée pour étudier l’organisation anatomique et fonctionnelle des connexions cérébrales. L'utilisation de l'IRM est un raffinement par rapport aux techniques alternatives de neurosciences plus invasives qui nécessitent l'euthanasie de l'animal. A la suite de cette étude, les animaux seront gardés en vie et seront remis dans leur troupeau. Toutes les mesures seront prises pour promouvoir le bien-être des animaux. En particulier, les moutons sont des animaux grégaires, et sont stressés lorsqu’ils sont isolés de leurs congénères. C’est pourquoi, les individus seront en permanence en compagnie d’au moins deux autres membres de leur groupe social. Cet avenant représente un raffinement supplémentaire puisqu'un protocole d’entrainement est mis en place afin d'éviter l’anesthésie des animaux lors des sessions IRM, ce qui implique l’absence des effets indésirables liés à cette technique. De plus, la castration permet de garder un groupe social mixte stable. En effet, nous avons déjà commencé le protocole d'entraînement, et des affinités entre les individus se sont créées. Cet acte chirurgical évitera ainsi la séparation des mâles et des femelles dès la puberté.

Choix des espèces

Les Européens se soucient du bien-être animal et lui accordent une importance toujours plus grande dans leurs choix de consommation - 59% sont prêts à payer un prix plus élevé pour les produits issus de systèmes de production respectueux du bien-être (Eurobaromètre 442). Il y a près de 100 millions de moutons d'élevage rien qu'en Europe. Ce projet fournira des informations sur leurs capacités cognitives et développera des techniques pour nous aider à comprendre leurs besoins en matière de bien-être, ainsi que ceux d'autres animaux d'élevage. Comme ce travail ne vise pas à mettre en évidence le développement du système auditif du mouton, les 24 individus seront tous d'âge adulte (1 à 3 ans). Cela minimise la variabilité possible de la structure et de la fonction cérébrale liée au développement et / ou au processus naturel de vieillissement. L'objet de cet avenant est d'inclure 10 ovins (5 agneaux + 5 agnelles) de race Ile-de-France qui seront âgés d'au moins 4 semaines lors de leur première session IRM sous anesthésie afin de pouvoir comparer l'activité cérébrale avec et sans anesthésie.

2400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est injectée sous la peau, puis elles reçoivent des chimiothérapies et des immunothérapies par voie intrapéritonéale avec un suivi de la tumeur pendant environ deux mois, pour tester comment compenser la perte d'un gène clé de la réponse immunitaire aux cancers du sein et colorectaux. Le porteur décrit une masse tumorale pouvant se nécroser et retient un effectif de 2400 souris qu'il juge nécessaire à une interprétation fiable. Il affirme que l'implication du système immunitaire dans le développement tumoral ne peut être étudiée qu'in vivo.

Objectifs

Les dernières années ont vu l'émergence du concept de l'activation du système immunitaire contre le cancer, qui à son tour détermine le succès à long terme des traitements anticancéreux. Nous allons étudier comment compenser la perte de fonction d’un gène clé dans l’établissement de la mort cellulaire immunogène pour restaurer l’efficacité de la chimiothérapie in vivo. Les modèles expérimentaux in vivo sont les seuls moyens d’approche possibles car la réponse immunitaire n’a pas lieu dans les modèles in vitro ou ex vivo. Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction de ce gène, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-cancéreux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction d’un gène clé dans l’établissement de la mort cellulaire immunogène, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-cancéraux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal. Nous préconisions que l’accomplissement de ce projet fournira des connaissances sur la régulation de la réponse immunitaire aux cancers pour la mise en place de stratégies thérapeutiques ciblées.

Procédures

Les animaux seront soumis a : - L’injection unique de cellules tumorales en sous cutané sur l’animal anesthésié par inhalation d’isofluorane durant moins d’une minute par animal - L’injection des traitements intra péritonéaux par contention de l’animal vigile : injection unique pour les chimiothérapies et 3 injections pour chacune des immunothérapies durant moins d’une minute par injection par animal - Une contention sur animal vigile permettant le suivi de la croissance tumorale trois fois par semaine pendant environ 2 mois durant moins de deux minutes par animal .

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis a : - Une injection sous-cutanée de cellules tumorales à l’origine du développement d’une masse tumorale entraînant potentiellement la nécrose de la tumeur. - L’injection des traitements cités par voie intrapéritonéale par contention de l’animal vigile (une unique injection pour MTX et CTX et trois injections pour les autres molécules) pouvant induire du stress de courte durée chez l’animal. L’injection de cellules tumorales sera faite sur le dos de l’animal afin de réduire les phénomènes de gêne que peut engendrer la croissance tumorale. La tumeur se développe localement et n’induit pas de métastases ou effets cliniques secondaires. Le suivi sera réalisé sur un à deux mois selon la croissance tumorale.

Devenir

Les souris seront euthanasiées dès l’atteinte des points limites préalablement définis.

Remplacement

La question scientifique ne peut être abordée qu’in vivo car il n’est pas possible d’étudier l’implication du système immunitaire sur le développement du cancer dans des systèmes in vitro.

Réduction

Nous souhaiterons effectuer cette étude sur un total de 2400 souris pour permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Notamment, les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si nous constatons que notre hypothèse n’est pas confirmée par nos résultats expérimentaux. Le modèle choisit est très bien documenté, permettant ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous utiliserons des souris commerciales transgéniques ou non, viables, fertiles, de taille normale et ne présentent pas d'anomalies physiques ou comportementales. Pour l’injection de cellules, les souris seront anesthésiées et recevront 100 µL de PBS contenant les cellules tumorales par voie sous-cutanée le 1er jour de l’expérimentation à l’aide d’une seringue de 1ml dotée d’une aiguille de 25G. Les animaux sont ensuite replacés dans leur cage en position ventrale et sont surveillés jusqu’au réveil Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et/ou tunnels en cartons). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - Les souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées dans cette étude afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses ou l’apparition de lésions cancéreuses induites, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation. Les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis. - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Nous utilisons principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce.

384 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des ratons sont séparés de leur mère trois heures par jour de J2 à J12, et des rats "démonstrateurs" reçoivent dans une patte un agent inflammatoire provoquant une douleur aiguë ou un œdème persistant deux semaines, pour mesurer par un test de transfert social de la douleur l'empathie liée à un stress néonatal. Le porteur présente ce modèle comme celui d'une prématurité humaine et indique surveiller le bien-être des animaux non-humains. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reconstitue les réseaux neuronaux de l'empathie et de la douleur.

Objectifs

Dans le cadre de l’utilisation d’un modèle animal mimiquant les conséquences d’une prématurité chez l’humain, le but du projet est d’affiner la compréhension de l’impact d’un stress de séparation maternelle précoce (SMP) sur certains processus émotionnels associés à la douleur. L’objectif du projet est donc d’évaluer chez le rat, les conséquences d’une SMP sur les interactions sociales ainsi que sur l’empathie à la douleur à l’aide du test de « transfert sociale de la douleur » qui a été validé dans la littérature comme étant un bon indicateur de l’empathie chez ce dernier.

Bénéfices attendus

Le modèle de séparation maternelle néonatale a permis de décrypter nombre de mécanismes et d’altérations du système nerveux qui sont retrouvés chez les enfants prématurés humains. Dans ce cadre, cette étude permettra de mieux comprendre l’impact d’un stress néonatal non douloureux (i.e. une séparation précoce avec la mère) sur les processus cognitifs et émotionnels associés à la douleur chez un jeune individu encore en pleine maturation durant une période critique de son développement.

Procédures

La moitié des animaux seront soumis au protocole de SMP et seront séparés de leur mère 3 heures par jour du deuxième au douzième jour postanal. Pour le test de transfert social de la douleur, les animaux « démonstrateurs » recevront une injection sur une patte arrière d’agents inflammatoires créant soit une douleur aigue soit une douleur prolongée sous anesthésie générale d’une durée maximale de 5 minutes. Des tests d’évaluation de la douleur (durée de 5 à 10min) et n’induisant pas de stress accru chez l’animal, seront effectués à la suite du test de transfert (test unique d’une durée de 45 min) puis à nouveau 1x/h pendant 4h pour un premier groupe expérimental et 1x/J pendant deux semaines en plus pour le deuxième groupe ainsi que le groupe contrôle. Le nombre total de tests de douleur pour le protocole "douleur aigüe" est de 10 tests. Pour le protocole "douleur prolongée", les animaux sont en plus testés 1 fois par jour durant deux semaines ce qui fait un total de 36 tests.

Impact sur les animaux

La séparation maternelle induit au niveau comportemental une anxiété accrue chez la mère. Les injections du premier agent inflammatoire provoquent une douleur temporaire, qui s’arrêtent spontanément au bout d’une heure, celles du second provoquent un œdème cutané dont la sévérité sera surveillée et qui se résorbe après deux semaines. Les tests d’évaluation de la douleur prévus sont courts (de 5 à 10min) et n’induisent qu’un stress mineur chez l’animal.

Devenir

A la fin de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les comportements sociaux, l'empathie et la douleur étant des processus intégrés impliquant différentes structures sensorielles, cognitives et émotionnelles, ce projet nécessite l’étude de sujets vivants dotés d’un cortex développé. Il n’existe pas encore de modèles alternatifs in silico ou in vitro capable restaurer les réseaux neuronaux impliqués dans les comportements observés.

Réduction

Le nombre d’animaux est basé sur l’expertise de l’équipe vis-à-vis des différentes procédures et prend en compte les variabilités interindividuelles) pour obtenir des résultats statistiquement significatifs lors des tests utilisés pour évaluer l’impact du stress néonatal de séparation maternelle sur le comportement de contagion à la douleur chez le rat. Le projet évaluera également les différences entre les mâles et les femelles, qui ont été démontrées pour les réponses à la douleur et dans différents modèles de stress périnataux.

Raffinement

Les animaux sont suivis quotidiennement par les zootechniciens de l’animalerie et par les expérimentateurs afin d’être alertés dès les premiers signes de dégradation du bien-être animal en portant une attention particulière à tout changement de l’état général (perte de poids supérieure à 10%, défaut de toilettage, plaie ouverte, blessure) ainsi qu'à l'état comportemental (prostration, dos arqué, réticence au déplacement, léthargie, agressivité, vocalises). Si des changements sont observés, le vétérinaire sera contacté pour prendre la décision adéquate : soins, retrait de l’animal de l’étude ou mise à mort de l’animal. Durant la séparation maternelle, les ratons sont placés sous lampes chauffantes afin d’éviter toute hypothermie. Les injections des produits inflammatoires dans la patte se font sous anesthésie gazeuse afin de limiter tout stress chez l’animal. Le poids des animaux est mesuré hebdomadairement, et quotidiennement suite aux injections. Les tests nociceptifs sont effectués après une semaine d’habituation afin de réduire le stress. L’étude portant sur la douleur, celle-ci ne pourra pas être prise en charge lors des tests comportementaux. Des points limites ont été mis en place pour éviter d’éventuelles souffrance inutiles dépassant le cadre de l’étude.

Choix des espèces

Des études précédentes ayant étant réalisées sur le rat, ce modèle animal sera conservé dans le cadre de ce projet car son comportement est bien connu. Le modèle de séparation a déjà été bien décrit et caractérisé chez cette espèce, permettant ainsi de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus le modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3e trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3e trimestre de gestation. L’étude des comportements complexes comme les comportements sociaux ou l’empathie implique que l’étude porte sur une espèce qui possèdent les fonctions et capacités cognitives nécessaire à l’expression de ces derniers, ce qui est le cas chez le rat. Afin de mesurer l’impact à long terme de cette séparation maternelle, les tests comportementaux seront ensuite effectués à l’âge adulte. Les animaux seront donc utilisés entre 2 jours et 2 mois dans cette étude.

316 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules leucémiques leur sont transplantées par voie intraveineuse, puis elles reçoivent trois injections de molécules ou d'anticorps, pour tester de nouveaux traitements de la leucémie aiguë lymphoblastique, un cancer surtout pédiatrique. Le porteur décrit un point limite tardif, l'animal cessant de s'alimenter et présentant une pâleur liée à l'aplasie avant d'être euthanasié. Il indique avoir testé les composés in vitro au préalable et affirme que les études précliniques exigent le modèle murin.

Objectifs

La leucémie est un cancer des cellules précurseurs du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération excessive des cellules appelées blastes. La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL) concerne les cellules de la lignée issue du progéniteur lymphoïde. Elle représente environ 1,5 nouveau cas pour 100000 habitants par an, soit environ 1000 nouveaux cas par an en France. Elle se déclare en majorité chez l’enfant de 2 à 5 ans, 75% des malades ont moins de 18 ans, et représente 30% des cancers de l’enfant. La LAL est une maladie hétérogène qui touche les précurseurs des lymphocytes T ou B dans respectivement 25% et 75% des cas. Nous disposons de plusieurs modèles in vitro et in vivo incluant des xénogreffes de LAL-T et LAL-B issues de patients. Malgré les améliorations du traitement des LAL, les taux de rechute, de l’ordre de 25%, restent élevés avec des chances de survie faible, inférieures à 30%. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de leucémies (culture cellulaire), nous avons identifié trois nouveaux composés qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs efficacités, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Les bénéfices attendus du projet concernent donc la découverte de nouvelles drogues et stratégies thérapeutiques dans le traitement des Leucémies Aiguës Lymphoblastiques (LAL).

Procédures

Les animaux seront soumis à des transplantations de cellules leucémiques par des injections intra-veineuses (I.V.) (une seule injection est prévue par souris, durée de 20 minutes). Après la transplantation, des injections intra-veineuses (I.V.) d’une molécule chimique ou d’un anticorps agoniste ou d’immunoliposomes (3 injections par souris sont prévues, à J+15, J+20, J+25 , durée par injection de 20 minutes). Un prélèvement de sang à partir de la veine de la queue (un seul prélèvement par souris, durée de 15-20 minutes) sera réalisé à J+35 jours après la transplantation.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des cancers (leucémies), avec une multiplication proliférative des cellules leucémiques lymphoblastiques dans la moelle osseuse, le sang et la rate des animaux. Un point limite est fixé, il correspond à un état de fatigue de l’animal qui ne s’alimente plus et qui présente une couleur pâle de la peau au niveau des oreilles et aux extrémités des pattes avants et arrières. Quand l’animal présente des signes de souffrance, n’explore plus son environnement, ne s’alimente plus, est replié sur lui-même, montre des signes d’aplasie, et couleur pâle de la peau au niveau du museau et des oreilles, cela veut dire qu’il y a une aplasie trop importante consécutive au développement de la leucémie qui a alors atteint un stade trop avancé. Dès que ce point limite est observé, l’animal sera euthanasié.

Devenir

Dès que les souris développent les symptômes de la leucémie (point limite identifié), elles seront anesthésiées avec l’Isofluran, suivi d’une mort par dislocation cervicale.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. La molécule chimique, l’agoniste et les immunoliposomes que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testé in vitro sur des méthodes alternatives ; sur des cellules primaires isolées de patients, ainsi que sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet de limiter le nombre des animaux utilisés dans ce projet.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche par : la limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour les courbes de survie, nous utiliserons des groupes de 7 souris afin d’effectuer des tests statistiques, pour les tests sur la viabilité cellulaire, nous utiliserons des groupes de 5 souris afin de réaliser des tests statistiques.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi d’améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles pour éviter le stress, nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Ces informations seront par ailleurs transmises au personnel de l’animalerie. Nous avons donc prévu la réduction de la durée de nos études précliniques dès que ce point limite est observé.

Choix des espèces

Pour qu’un nouveau traitement puisse être commercialisé, il est nécessaire de mener des études précliniques et cliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules leucémiques provenant de patients que l’on peut transplanter à des souris immunodéficientes. Quelques semaines après l’injection, les cellules leucémiques humaines sont présentes dans la moelle osseuse et la rate des souris qui constituent un modèle d’étude reproduisant la physiopathologie de cette maladie. Ces études ne peuvent se réaliser que dans le modèle murin ; Souris (Mus musculus) L’hématopoïèse et la leucémogénèse des souris (mus musculus) est celle qui se rapproche le plus de l’homme. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules hématopoïétiques saines et leucémiques.

2400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules leucémiques de patients leur sont injectées, puis elles subissent des prélèvements de sang et de moelle osseuse répétés, jusqu'à dix-huit fois sur un an, pour étudier l'hétérogénéité des leucémies aiguës myéloïdes. Le porteur affirme que l'envahissement de la moelle ne provoque pas de douleur, en se référant à l'absence d'antalgique chez les patients, et fixe un point limite à 70 % de cellules leucémiques dans le sang. Il conclut que la réponse aux traitements ne peut être validée qu'à l'échelle de l'organisme entier.

Objectifs

Les leucémies aigues myéloïdes (LAM) sont hétérogènes aussi bien sur le plan cellulaire et clinique que sur le plan de leurs réponses aux traitements. Actuellement, seules les anomalies au niveau des chromosomiques ou de l’ADN sont utilisées pour établir le pronostique et le traitement, mais il persiste une forte hétérogénéité intra-groupe. L’implication des cellules souches leucémiques (CSL), provenant de la transformation maligne de cellules souches sanguines, est de plus en plus mise en avant dans l’échappement aux traitements et dans les rechutes, du fait de leurs capacités à la fois d’autorenouvèlement et de dormance cellulaire. Toutefois, ces cellules restent difficiles à identifier du fait de l'hétérogénéité des marqueurs exprimés à leur surface. Le premier axe de notre projet, se focalise sur le rôle de cette hétérogénéité dans la mise en place de la maladie. Des modèles de LAM, réalisés par injection de cellules leucémiques de patients à des souris immunodéprimées, nous permettront de comparer les cellules cancéreuses du patient avec les cellules qui auront ainsi greffées chez la souris. Cette comparaison nous permettra d’identifier et de hiérarchiser, sur la base de leur capacité à recréer une leucémie chez l’animal, les marqueurs membranaires caractérisant les différentes sous populations leucémiques. Le second axe de ce projet porte sur l’étude de la résistance aux traitements anti leucémiques. Pour mieux évaluer celle-ci et comprendre l’implication des sous-populations cellulaires présentes au diagnostic chez le patient, nous traiterons nos modèles murins de LAM issus de cellules de patients et nous comparerons les cellules obtenues à la rémission et à la rechute des souris aux analyses et au suivi de la maladie chez le patient. Les traitements à tester seront choisi en concertation avec les services clinique et biologique de l’hôpital en fonction des risques de rechute et des anomalies génétiques présentes au diagnostic chez le patient. Enfin, en fonctions des marqueurs membranaires identifiés dans le premier axe du projet nous testeront également de nouvelles molécules afin de développer de potentiels nouveaux traitements dans les LAM.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour but d’identifier de nouveaux marqueurs présents à la surface des cellules souches leucémiques nous permettant de mieux identifier ce pool de cellules capables d’échapper au traitement et de persister chez le patient lors de la rémission, et pouvant conduire à une rechute. En effet, jusqu’à maintenant seules les anomalies chromosomiques ou de l’ADN sont utilisées pour établir le pronostique et le traitement des patients dans les LAM malgré la persistance d’une la forte hétérogénéité intragroupe. Par cette étude, nous voulons mettre en évidence que les marqueurs protéiques présents à la surface des cellules souches leucémiques (CSL) pourraient également être discriminants et apporter une meilleure stratification pronostique des patients. Il est essentiel de mieux connaitre les caractéristiques des CSL afin d’optimiser les approches thérapeutiques. C’est pourquoi, une fois ces cellules mieux identifiées nous pourront cibler leurs marqueurs membranaires pour mettre au point de nouvelles thérapies ciblées de façon à avoir une toxicité minimale sur les cellules saines du patient. Les bénéfices attendus de cette étude sont donc une meilleure stratification pronostique des patients, permettant une orientation thérapeutique optimale, ainsi qu’une meilleure connaissance des mécaniques impliqués dans la résistance aux traitements conduisant à une amélioration des traitements actuels.

Procédures

Procédure 1 : - 600 souris : injection IV des cellules sur souris vigiles en boite de contention (1-2min), puis prélèvement de sang sous anesthésie à l'isoflurane (1-2min) toutes les 3 semaines pendant 1 an (soit 18 prélèvements maximun) - 600 souris : injection IV des cellules sur souris vigiles en boite de contention (1-2min), puis prélèvement de moelle osseuse sous anesthésie à l'isoflurane (5-10min) (3 prélèvements maximun). Procédure 2 : 620 souris : injection IV des cellules sur souris vigiles en boite de contention (1-2min), puis prélèvement de sang sous anesthésie à l'isoflurane (1-2min) toutes les 3 semaines pendant 1 an (soit 18 prélèvements maximun). Procédure 3 : 417 souris : injection IV des cellules sur souris vigiles en boite de contention (1-2min), puis injection de luciférine en IP (

Impact sur les animaux

L'envahissement tumorale de la moelle osseuse induit par une LAM ne produit généralement pas de douleur. C’est pourquoi chez les patients humains aucun analgésique n’est prescrit sur cette base seule. De ce fait, nous ne prévoyons pas que les animaux utilisés dans ce projet subissent de douleur lié à cet état. Durant tout le suivit de la maladie, des prélèvements de sang ou de moelle seront réalisés sur les animaux pour évaluer le pourcentage de cellules leucémiques dans ces organes. Ces prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale et des antidouleurs seront adminitrés quand cela est nécessaire pour éviter une douleure ou un stress aux animaux. Les traitements utilisés seront issus de ce qui est réalisé chez l’Homme ou de données bibliographiques disponibles et sont bien tolérés chez l’animal. Pour les traitements pour lesquels aucunes données ne sont disponibles, des tests préliminaires sur des petits groupes d’animaux seront réalisés afin de connaitre la dose optimale à utiliser sans nuisance sur l’animal. Toutefois, afin d’éviter toute souffrance éventuelle, nous observerons les points suivants pouvant conduire à l’euthanasie de l’animal : comportement, apparence physique, perte de poids supérieure à 20%, envahissement sanguin de plus de 70% de blastes humains.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude (avant que les points limites des procédures ne soient atteints) afin de récupérer dans les organes les cellules leucémiques huamines sur lesquelles des tests génétiques et fonctionnels seront réalisés.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisés au laboratoire sur des cellules de patients atteints de LAM et sur des modèles cellulaires modifiés de LAM. Ces expériences nous ont permis d'obtenir des données sur la résistance ex vivo des cellules de patients au traitement antileucémique, par exemple et nous ont permis également d'orienter nos recherches sur certains marqueurs membranaires en particulier. Cependant le développement d’une LAM implique des mécanismes cellulaires mettant en jeu le microenvironnement de la moelle osseuse. De même la réponse au traitement et l'évaluation son efficacité ne peuvent être correctement validé qu'à l'échelle d'un organisme entier. De ce fait, l’hétérogénéité de la maladie ainsi que la réponse aux traitements ne peut être étudié sans l’apport des modèles animaux.

Réduction

Les modèles de LAM humaines à partir de cellules de patients étant déjà en place au laboratoire, le nombre d’animaux dédié aux mises au point sera considérablement réduit et concernera principalement les nouvelles molécules à tester pour lesquelles aucune données bibliographiques ne sont disponibles. Notre expérience nous permet également de savoir que les modèles murins de LAM crées à partir de lignées cellulaires donnent rarement chez l'animal des LAM dont les blastes circulent dans le sang. De ce fait, nous avons modifié nos modèles cellulaires en leur faisant exprimer un marqueur luminescent afin de suivre l’évolution de la leucémie par imagerie du vivant sans avoir à mettre à mort nos animaux ou à effectuer de prélèvements invasifs. Cela nous permettra également de mieux évaluer quand débuter les traitements afin de limiter le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Après l’injection des cellules leucémiques les souris ne présentent aucuns signes de souffrance, d’angoisse ou de douleur, toutefois elles seront surveillées dans les heures qui suivent pour s’en assurer. Sur la base de ce qui est observé chez les patients humains, nous ne prévoyons pas que les animaux subissent de douleur lié au développement de la LAM. Toutefois, afin d’éviter les signes cliniques liés à un état trop avancé de la maladie (anémie, fatigue, paralysie des membres inférieurs) nous avons fixé comme point limite à l’expérimentation un envahissement en cellules leucémiques de 70% dans le sang. En nous basant sur nos précédents travaux nous savons qu’en dessous de ce pourcentage les animaux ne subissent habituellement pas de dommages physiques liés à la maladie. Cependant, pour éviter toute souffrance de l’animal nous observerons très régulièrement les points suivants : comportement, apparence physique, perte de poids supérieure à 20%, paralysie, tumeur localisée, pouvant conduire à son euthanasie éthique. Tous les prélèvements nécessaires au suivit de la maladie se feront sur des animaux préalablement anesthésiés et une analgésie sera donné en supplément pour les prélèvements de moelle osseuse. Après chaque actes (injection ou prélèvement) les animaux seront surveillés pour vérifier qu’ils n’aient pas de souffrance lié à l’acte réalisé. Enfin, pour la partie de notre projet utilisant des modèles murins créés à partir de lignées cellulaires, nous avons choisis de modifier génétiquement nos lignées afin de réaliser le suivit de la maladie par imagerie du vivant pour éviter de réaliser des prélèvements répétés sur les animaux.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont un excellent et unique modèle pour la prise de greffe de cellules souches humaines ainsi que le développement de leucémies comparables à celles observées chez les patients. De plus, nous utilisons déjà au laboratoire cette espèce pour notre modèle de LAM humaine et connaissons donc déjà la croissance tumorale, la dissémination et les effets secondaires associés à l’implantation d’une LAM dans cette espèce. Nous injecterons les cellules leucémiques à des animaux entre 4 et 8 semaines. Après 8 semaines, l’immunité résiduelle de ces souris commence à se développer et la greffe est de mauvaise qualité.