Oncologie
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Développement chez la souris d’une nouvelle méthode contraceptive non hormonale
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Pour tester une contraception sans hormone, des femelles reçoivent dans le vagin un ovule chargé de lyral, une molécule odorante censée perturber l'orientation des spermatozoïdes, avant d'être mises à l'accouplement. 640 souris Swiss CD1, choisies parce que leurs portées dépassent souvent dix souriceaux, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une même femelle pouvant recevoir l'ovule jusqu'à trois fois, tenue dans la paume une trentaine de secondes. Le lyral étant allergisant, les souris sont observées chaque jour pendant deux à trois semaines, et celles qui feraient une réaction allergique seraient retirées de l'expérience et mises à mort par dislocation cervicale ou au CO2. Après chaque accouplement, les adultes retournent dans le pool pour d'autres accouplements et les souriceaux nés sont mis à mort immédiatement, sans que le résumé dise ce que deviennent les adultes à la fin du projet.
Objectifs
La contraception bénéficie de nombreuses méthodes. La pilule à base d'hormones qui est l'une des méthodes les plus utilisées dans notre société souffre à tort ou à raison d'une suspicion quant aux effets négatifs que l'usage répété d'hormone pourrait engendrer. Les travaux de recherche sur les récepteurs olfactifs (OR) capables de reconnaître des molécules odorantes, ont montré qu'un certain nombre d'entre eux étaient présents à la surface des spermatozoïdes de plusieurs mammifères dont l'homme et la souris. Par ailleurs il a été montré que le bourgeonal, l’un des ligands de hOR 17-4, OR exprimé à la surface des spermatozoïdes humains modifiait in vitro le chimiotactisme de ceux-ci. En parallèle, il a été montré que le récepteur olfactif MOR23 était présent à la surface des spermatozoïdes de souris et que le lyral modifiait lui aussi in vitro le leur chimiotactisme Suite à ces travaux, nous avons cherché à savoir si in vivo l'addition de lyral dans le vagin des souris modifierait leur chimiotactisme. Pour cela, nous avons émis l’hypothèse qu’une surcharge de lyral dans le vagin de souris serait de nature à perturber la reconnaissance d’un ligand naturel à découvrir et limiterait la fécondation de l'œuf. Dans une série d’expériences préliminaires nous avons de fait observé que l’introduction de lyral liquide à 0.04% (40 microlitres, 10-5 M) dans le vagin de souris perturbait la procréation : Ainsi, la copulation de 31 couples de souris SWISS CD1, n’a donné naissance qu’à 176 souriceaux (13 femelles n’ayant eu aucune progéniture) alors que tous les couples témoins (n=31) ont été productifs et amené à la naissance de 372 souriceaux (résultats non publiés). A partir de ces résultats, statistiquement significatif (test de Fischer), nous avons émis l'hypothèse qu'une molécule odorante introduite dans le vagin par un ovule pourrait être la source du développement d'une nouvelle méthode contraceptive non hormonale. Le présent projet a pour but de tester cette possibilité, ainsi le mode de l'utilisation via un ovule.
Bénéfices attendus
Les conséquences et bénéfices attendus sont à deux niveaux le premier dans le cadre de la pratique médicale, le second sur le plan de la recherche fondamentale. 1) Si le lyral introduit dans le vagin à l’aide d’un ovule diminue nettement la procréation, comme observé précédemment chez les souris ayant reçu du lyral liquide il est prévu de faire des essais cliniques d'utilisation d'ovules chargés d'un odorant reconnu par les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes humains, dans le but de développer une nouvelle méthode contraceptive sans hormone. 2) Sur le plan de la recherche fondamentale, une forte limitation de la taille des progénies confirmerait les résultats de nos expériences précédentes selon lesquels les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes ont un rôle biologique dans la fécondation de l'oeuf, ce qui n’a jamais été démontré. Cela ouvrirait la voie à la recherche de ligand(s) particuliers impliqués dans le chimiotactisme naturel des spermatozoïdes et dans la reproduction. Cela conduirait aussi à la recherche des cellules émettrices de ce ligand et plus encore permettrait d’envisager de nouvelles explications et hypothèses de travail relatifs à la stérilité de certains couples.
Procédures
L'expérimentation se limite à l'introduction d'un ovule de la taille d'un petit grain de blé dans le vagin de souris avant leur mise en accouplement. L'introduction sera réalisée manuellement et délicatement alors que la souris sera maintenue dans la paume de l'expérimentateur pendant un temps n'excédant pas 30 secondes pour limiter le stress. Le geste sera répété à une semaine d'intervalle ou plus, en cas de non copulation. La même souris femelle pouvant être utilisée jusqu’à 3 fois, si nécessaire.
Impact sur les animaux
Les expériences préliminaires que nous avons faites et qui consistaient en l'introduction directe de lyral dans l'espace vaginal de souris n'ont pas mis en évidence d'effets indésirables à court ou moyen terme chez les souris. La même dose sera utilisée dans cette expérience. L’introduction de la molécule via un ovule sera également sans effet. Aussi toutes les souris recevant un ovule (placebo ou test) seront quotidiennement observées pour noter tout changement dans leur comportement ou l'apparition de quelques symptômes qu'ils soient. Etant donné le caractère allergisant du lyral, une attention particulière sera donnée à l’apparition de démangeaisons et de conjonctivites pendant 2 à 3 semaines après introduction des ovules. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne de leur comportement afin de détecter toute gêne éventuelle, ou phénomène de nature allergisant (dermatites, conjonctivites). Si de tels problèmes étaient observés, risquant d’entrainer une douleur chez l’animal, l’expérience sera stoppée et celui-ci sera euthanasié.
Devenir
Après chaque accouplement, les souris seront remises dans le pool et utilisées pour d'autres accouplements. Les souriceaux seront immédiatement mise à mort.
Remplacement
Il est impossible de remplacer ces expérimentations chez la souris, préliminaires à des essais cliniques chez l'homme, par des tests in vitro dans la mesure où la question posée est celle de savoir si un ovule libérant dans le vagin une molécule odorante se fixant à la surface des spermatozoïdes pourrait empêcher la procréation en perturbant leur chimiotactisme en direction de l'œuf. A l’évidence, des expériences reposant sur fécondation in vitro ne permettrait pas de tester cette hypothèse.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques pertinentes et scientifiquement irréprochables afin de valider les données obtenues.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une structure agréée qui tient compte de l'éthique animale. Les accouplements seront hébergés dans une armoire ventilée afin d'éviter les conséquences olfactives de l'utilisation de la molécule odorante sur les autres animaux présents dans la pièce d'hébergement. Le reste du temps l'hébergement se fera en groupes sociaux et les animaux bénéficieront d’un environnement calme et d'une alimentation abondante. Une surveillance journalière des animaux sera réalisée pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Si des souris présentaient une réaction de nature allergisante, elles seraient immédiatement retirées de l'expérience et euthanasiées par dislocation cervicale ou par inhalation de CO2 à l'aide d'une chambre d'euthanasie. Par ailleurs, rappelons que les ovules fournis par NextPharma sont de qualité pharmaceutique, fabriqués avec des produits autorisés par la pharmacopée et ainsi sans danger par elles-mêmes.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce animale pour laquelle on a clairement identifié les récepteurs olfactifs exprimés à la surface des spermatozoïdes. Par ailleurs nous avons choisi la souris Swiss CD1 car elle est très prolifique. Les portées sont régulièrement supérieures à 10 souriceaux, ce qui facilite la recherche d'un effet négatif sur la procréation. Les souris seront utilisées dès qu'elles sont en âge de se reproduire. Les mâles sont sexuellement matures dès l'âge de 8 semaines et les femelles dès l'âge de 6 semaines.
Diabète gestationnel et épigénétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est soumise à un régime gras obésogène, toutes subissant des tests métaboliques hebdomadaires avec injections intrapéritonéales et prélèvements sanguins répétés à la queue, un bolus d'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie. Le porteur cherche à établir que le diabète gestationnel modifie par voie épigénétique l'expression des gènes hypothalamiques de la descendance, prédisposant à l'obésité. Il affirme que ces mécanismes multi-organes ne peuvent être reproduits qu'avec la souris, jugée "indispensable" faute d'échantillons humains.
Objectifs
Notre corps est optimisé pour stocker tout apport énergétique qui dépasse les besoins de l'organisme. En effet, l’évolution a permis aux humains de traverser des périodes de famine. Cependant, ce mode de fonctionnement n’est pas compatible avec notre style de vie sédentaire d'aujourd'hui. Il en résulte l'émergence de la pandémie d'obésité et de diabète, qui survient de plus en plus fréquemment dès l'enfance et l'adolescence. Bien que des études de génétique humaine à grande échelle aient été menées avec succès, l'héritabilité de traits aussi complexes reste difficile à déterminer. De plus en plus d’études scientifiques suggèrent que la suralimentation dans des conditions telles que le diabète gestationnel (DG), peut entrainer un métabolisme altéré à travers les générations. Ces mécanismes impliquent des changements héréditaires dans l'expression des gènes qui se produisent plutôt par le biais d'une régulation épigénétique altérée. Les études chez l’animal suggèrent que le stress nutritionnel affecte le développement de l'hypothalamus et prédispose la descendance à l'obésité. En effet, l'hypothalamus orchestre un ensemble complexe de processus pour réguler l'apport et la dépense énergétiques. Par conséquent, l'hyperphagie et la réduction de la satiété représentent des caractéristiques précoces chez les enfants sujets à l'obésité. Cependant, une analyse complète du profil épigénétique de l'hypothalamus dans le contexte du DG fait largement défaut jusqu'à présent. Ainsi, nous cherchons à mettre en évidence que le DG a un impact sur l'expression des gènes hypothalamiques par le biais d'une régulation épigénétique au cours du développement intra-utérin et postnatal précoce, prédisposant la descendance à un phénotype obésogène tout au long de la vie.
Bénéfices attendus
Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de diabète de type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établies. Plus important encore, la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Nous supposons que le DG a un impact sur l'expression des gènes de l'hypothalamus par le biais d'une régulation épigénétique au cours du développement intra-utérin et postnatal précoce, prédisposant la descendance à un phénotype obésogène qui dure toute la vie. Les données récentes du laboratoire avec lequel nous collaborons pour ce projet suggèrent l'existence d'un nouveau code épigénétique qui pourrait jouer un rôle majeur dans la différenciation cellulaire et le développement de maladies. Ainsi, nous sommes convaincus que ce projet permettra de mieux comprendre l'impact de la suralimentation sur la prédisposition au diabète.
Procédures
168 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids. Par ailleurs, tous les animaux (336) seront soumis à des tests métaboliques (1 test/semaine). Le test de tolérance au glucose nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements de 6 gouttes de sang (2μl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Parrallèlement, 4x 40μL de sang sont prélevés (durée 1min) à l'aide d'un capillaire pour mesurer l'insulinémie par le même site de prélèvement. Le test de sensibilité à l'insuline nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements de 6 gouttes de sang (2μl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Le traitement hormonal nécessite 2 injection IP ( durée 10 sec)
Impact sur les animaux
Une diète riche en gras pour créer une environement obésogène, le traitement hormonal pour favoriser la reproduction et le test de tolérance au glucose peuvent créer un inconfort chez les souris. La sensibilité à l'insuline nécessite l'injection d'un bolus d'insuline qui peut entrainer une hypoglycémie chez la souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leur tissus seront prélevés pour determiner le profil épigénétique.
Remplacement
La nature transitoire du diabète gestationnel (la maladie n'existe que pendant la grossesse), la rareté des échantillons de tissus humain post mortem, la cause du décès... etc rendent l'étude de ce phénomène très difficile chez l'homme. De plus, la disponibilité des échantillons humains est limitée au sang, au cordon ombilical. Pour ces raisons, les modèles animaux constituent une alternative indispensable pour étudier ces mécanismes.
Réduction
Nous utiliserons un total de 336 animaux. Le nombre d’animaux testé dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris.
Raffinement
Les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire pour les analyses biochimiques et les volumes injectés seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire. Le recours aux analgésiques et anesthésiques sera systématique pour éviter toute souffrance ou douleur chez l'animal.
Choix des espèces
L'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, pancréas (ilots de Langerhans) , muscles, tissus adipeux, intestin, cerveau) . Ces mécanismes complexes ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris. Le modèle murin ne peut donc pas être remplacé dans notre cas. De plus, la nature transitoire du DG et la rareté des échantillons de tissus en dehors du sang et du cordon ombilical rendent l'étude de ce phénomène très difficile chez l'homme. Les animaux seront soumis à une diète riche en gras dès l'âge de 5 semaines, âge idéal pour permettre une prise de poids suffisante.
Traitements ciblant EZH2 dans l’initiation et le développement de la leucémie aiguë promyélocytaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever la moelle, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 170 individus étant classés en sévère. Elles reçoivent une irradiation sublétale aux rayons X, une greffe de cellules leucémiques par voie intraveineuse, puis des traitements par acide rétinoïque et épidrogues, avec des prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur indique que la leucémie et les traitements peuvent entraîner perte de poids et dégradation de l'état, et fixe un point limite à 20 % de cellules leucémiques circulantes. Il reconnaît avoir déjà montré in vitro l'effet de l'association testée, mais affirme que le microenvironnement médullaire rend le modèle murin "nécessaire".
Objectifs
Une proportion rare de leucémies aiguës promyélocytaires (APL) présente un réarrangement chromosomique entraînant la juxtaposition des gènes RARA (récepteur de l’acide rétinoïque alpha) et PLZF (Promyelocytic leukaemia zinc finger protein), avec production d’une oncoprotéine hybride à l’origine du développement de la maladie. Dans ce cas particulier de fusion PLZF-RARA, le traitement conventionnel par l’acide rétinoïque (ATRA, qui permet une rémission dans les autres types d’APL) se heurte à une résistance des cellules leucémiques et une rechute chez les patients. Nos travaux précédents ont mis en évidence dans une lignée de leucémie myéloïde aiguë une nouvelle interaction au mécanisme original entre PLZF et EZH2 (Enhancer of Zeste Homolog 2), un facteur responsable de la réduction d'activité de nombreux gènes. Or, l'implication d'EZH2 dans le développement d'hémopathies malignes a été mise en évidence dans de nombreuses études et EZH2 est une cible thérapeutique pour laquelle des inhibiteurs sont actuellement en développement. Nous souhaiterions donc nous intéresser au rôle de cette interaction entre PLZF et EZH2 dans l'initiation et le développement de l'APL exprimant la fusion PLZF-RARA. Nous avons obtenu des résultats préliminaires in vitro encourageants, montrant que l'inhibition d'EZH2 était associée à une moindre capacité de prolifération dans une lignée cellulaire exprimant PLZF-RARA. Nous souhaitons donc tester maintenant l’effet d'inhibiteurs d'EZH2 (épidrogues) sur le développement tumoral d'APL PLZF-RARA traitées à l'acide rétinoïque (ATRA, traitement conventionnel des APL), afin de déterminer si l'association d'une épidrogue au traitement conventionnel permet de contourner la résistance et de réduire la progression tumorale.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet qu'il révèle de nouvelles pistes pour déterminer si l'association de différentes épidrogues au traitement classique par l'acide rétinoïque permet de contourner les résistances et de réduire la progression tumorale des APL.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse (prélèvement soit unique, soit hebdomadaire selon la procédure). L'anesthésie dure 2 à 3 minutes au cours desquelles le prélèvement, effectué en 10 à 20 secondes, est réalisé. Les animaux receveurs de greffe subiront une irradiation sub-léthale réalisée via une exposition des animaux aux rayons X d'environ 2 minutes. La greffe de cellules leucémiques qui s'ensuit par injection intraveineuse est réalisée sous anesthésie gazeuse. L'anesthésie dure 2 à 3 minutes au cours desquelles l'injection des cellules, effectuée en quelques secondes, est réalisée. Les animaux seront soumis à des traitements ATRA et épidrogues (durée 1 à 2 semaines, injection 3 fois par semaine ou tous les 2 jours selon la greffe), par des injections intrapéritonéales nécessitant chacune quelques secondes d'intervention sur l'animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse (prélèvement soit unique, soit hebdomadaire selon la procédure). Les animaux receveurs de greffe seront soumis à une irradiation sub-léthale et une greffe de cellules leucémiques par injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront soumis à des traitements ATRA et épidrogues (durée 1 à 2 semaines, injection 3 fois par semaine ou tous les 2 jours selon la greffe), par injections intrapéritonéales. Le développement de la maladie et les traitements étant susceptibles d’entraîner une perte de poids et une dégradation de leur état, les animaux seront soumis à une observation quotidienne et à des évaluations à l'aide de la grille de score, permettant de prévenir les effets délétères et gérer la douleur. Nous serons vigilants sur l’altération du bon fonctionnement des cellules sanguines de l'animal qui pourrait survenir du fait du développement de la leucémie, et notamment une possible baisse de l’hématocrite. C'est pourquoi nous réaliserons un suivi précoce et prédictif grâce aux appareils dédiés à l’hématologie vétérinaire de notre laboratoire, en quantifiant la proportion de cellules leucémiques dans le sang. Cette mesure nous permet, grâce à notre expérience de ce modèle, de fixer un point limite de 20% de cellules leucémiques circulantes afin de rester en-deçà de l'apparition d'une formule sanguine anormale.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures, afin de prélever les moelles qui seront regreffées et utilisées pour réaliser les analyses moléculaires et cellulaires.
Remplacement
Le but du projet est de mieux comprendre les processus de régulation de l’hématopoïèse pathologique, l'hématopoîèse étant définie comme le processus de production de toutes les cellules sanguines dans la moelle osseuse. Cette régulation implique des mécanismes intrinsèques aux cellules, mais aussi une communication cellulaire avec des facteurs microenvironnementaux de la moelle osseuse (facteurs extrinsèques). Ces deux types de mécanismes sont entièrement imbriqués du fait d’un dialogue permanent entre les cellules hématopoïétiques et leur microenvironnement. Il est donc nécessaire de replacer la cellule dans son contexte et d’avoir recours aux modèles murins. Cependant, nous avons pu récemment utiliser des modèles in vitro pour montrer les effets bénéfiques de l’association d'une épidrogue avec l’acide rétinoïque sur les cellules leucémiques. Nous souhaitons donc tester l'hypothèse d'un bénéfice de cette association in vivo, aux doses recommandées dans la littérature.
Réduction
Bien que le recours aux modèles murins soit rendu nécessaire par l’existence reconnue de mécanismes de régulation des cellules hématopoïétiques par le microenvironnement, nous limiterons au maximum le nombre d'animaux. Pour cela, nous nous baserons sur les résultats obtenus in vitro afin d'optimiser les combinaisons de drogues à tester et nous utiliserons les techniques novatrices d’analyses moléculaires à l’échelle de la cellule unique (largement optimisées et maîtrisées au sein du laboratoire) afin de pallier la problématique de l’hétérogénéité tumorale, et réduire ainsi le nombre d’animaux pour résoudre cette hétérogénéité. Notre projet nécessitera 200 souris NSG, permettant d'évaluer l'action potentiellement bénéfique d'une association d'épidrogues au traitement conventionnel par l'ATRA. Le nombre d’animaux a été optimisé grâce à notre expérience du modèle : nous avons ajusté le nombre d'animaux au minimum requis pour l'obtention du nombre de cellules suffisantes pour réaliser les analyses moléculaires, et permettant également d'avoir un échantillonnage statistiquement interprétable.
Raffinement
Le suivi du développement des pathologies se fera par des mesures cinétiques précoces et prédictives, notamment la détermination de la quantité de cellules leucémiques dans le sang par des mesures en cytométrie d'un rapporteur permettant de distinguer l'origine des cellules (celllules leucémiques PLZF-RARA ou cellules sanguines des souris NSG). Les prélèvements sont réalisés sous anesthésie gazeuse par du personnel compétent. Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 3 à 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique de ces modèles de pathologie, avec mise en place si nécessaire d’une analgésie spécifique. En fonction des scores obtenus, nous faciliterons l’accès à la nourriture en positionnant les croquettes dans le fond de la cage.
Choix des espèces
L’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers, parmi lesquels le poisson zèbre et la souris sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique et la disponibilité des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, notamment pathologique, et notre expertise dans les outils développés chez cette espèce conduisent logiquement à l'utilisation de la souris comme le modèle le plus pertinent pour les expérimentations proposées. Toutes les expérimentations seront conduites chez des souris adultes, agées de 7 à 10 semaines, âge où le système hématopoïétique et son microenvironnement sont définitivement matures, et qui correspond à une fenêtre optimale de prise de greffe des cellules leucémiques.
Croissance-bar
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
102 bars européens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Maintenus cinq mois à demi-ration, ils subissent une biométrie tous les quinze jours sous sédation puis anesthésie, avant mise à mort pour analyse de tissus, afin de mesurer l'effet de la température et de l'acidification sur leur croissance. Le porteur présente le rationnement à 50 % et les manipulations comme un stress "léger", et justifie la densité de trente-quatre poissons par bac par le caractère grégaire de l'espèce. Il affirme qu'une étude à l'échelle de l'organisme ne permet "pas" de recourir à la culture cellulaire.
Objectifs
L'objectif est d'acquérir expérimentalement des données de croissance chez un poisson d'intéret halieutique, le bar Européen, élevé dans deux conditions environnementales différentes : une condition de température (température de l'eau pompée en rade de Brest) et de pH actuels (pH 8) et une condition prédite par le Groupe d'experts intergouvernemental sur l'évolution du climat à l'horizon 2100 qui correspond à la température de l'eau pompée en rade de Brest plus 3 degrés et à un pH 7.6 (pH actuel -0.4 unités de pH). Les effets potentiels de ce scenario "horizon 2100" seront testés sur des poissons au stade juvénile alimentés à 50 % de satiété (par rapport aux tables d'alimentation utilisées en pisciculture) afin de se rapprocher des conditions pouvant être rencontrées par le poisson dans le milieu naturel. L'effet du rationnement sur la croissance des poissons pourra être étudié en interaction avec les conditions de pH et de température.
Bénéfices attendus
Les données (prise de poids, longueur) acquises alimenteront des modèles de croissances chez cette espèce et permettront ainsi de mieux prédire l'impact des facteurs environnementaux étudiés (température, acidification) sur la croissance du bar Européen. Ces données seront utiles afin de mieux évaluer l'impact du changement global sur la dynamique et les stocks de poissons.
Procédures
Afin de limiter le stress lié à la manipulation, les poissons seront, lors de chaque biométrie, sédatés dans leur bac dorigine (environ 5 minutes) puis anesthésiés (environ 5 à 10 minutes dépendant de chaque poisson) pour être pesés (sur balance) et mesurés. La pesée est effectuée sur un poisson lorsqu'il n'est plus réactif au touché. La durée de la pesée et de la prise de longueur n'excede pas 30 secondes (30s/poisson x 10 biométries = 5 min/poisson pendant toute l’expérience). Ils sont ensuite disposés dans un bac de réveil (environ 10 minutes) puis transférés à l'aide d'un seau dans leur bac d'origine. Pour chaque poisson, l'ensemble des interventions pour une biométrie, de la sedation à la remise dans le bassin d'origine, dure environ 20 minutes. L'ensemble de ces intreventions se fait sous anesthésie et tous les poissons d'un même bassin sont anesthésiés en même temps. La nuisance légère générée durant la biométrie permettra d'en réaliser une tous les 15 jours (pratique réalisée communément à cette fréquence dans la structure expérimentale).
Impact sur les animaux
Le rationnement à 50% (avec un aliment aquacole commercial) représente un léger stress pour les poissons sur la durée de 5 mois. La croissance sera moindre par rapport aux conditions standards. La nuisance est donc considérée comme légère sur l'ensemble de la procédure. La manipulation pour les biométries entraine un stress très léger. 30s/poisson x 10 biométries = 5 min/poisson pendant toute l’expérience.
Devenir
Les poissons seront mis à mort à l'issue de la procédure. Des paramètres physiologiques seront analysés sur des tissus prélevés post mortem.
Remplacement
Cette étude vise à étudier l'impact de facteurs environnementaux sur les performances de croissance du bar. Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser l'impact de différents facteurs à l'échelle de l'organisme, il n’est pas possible de recourir à des méthodes de substitution telles que la culture cellulaire par exemple.
Réduction
Le bar juvénile est un animal grégaire et le nombre d'animaux par bac (34) répond tout d'abord à cette contrainte. Le nombre de poissons tient donc compte de la densité minimale d’animaux requise pour permettre aux animaux d’exprimer les meilleurs répertoires physiologiques et comportementaux possibles. De plus, le nombre de poissons a été réduit à son minimum et défini en fonction du seuil de la pertinence scientifique et statistique. Les analyses statistiques reposeront sur des modèles mixtes non linéaires de type logistique (effets aléatoires des individus et des bacs), modèles appropriés pour comparer les croissances individuelles de 102 poissons répartis dans chacune des 2 conditions par biométrie bi mensuelle pendant 5 mois.
Raffinement
Afin de limiter le stress lié à la manipulation, les poissons seront, lors de chaque biométrie, légèrement sédatés (poissons restent vigiles mais calmes) dans leur bac afin de limiter le stress de la pêche, puis anesthésié. Pêchés avec une épuisette, les animaux seront ensuite placés sur un linge humide pour être pesés (sur balance) et mesurés. La durée de la pesée et de la prise de longueur sont réduites au minimum (moins de 30 secondes). Ils sont ensuite disposés dans un bac de réveil permettant un réveil progressif sans stress. Une fois que les mouvements respiratoires ainsi que l'équilibre sont retrouvés par les poissons, c'est à dire le début de la phase de réveil, ceux-ci seront délicatement transférés à l'aide d'un seau dans leur bac d'origine. L'anesthésie réalisée pour les biométries nécéssite une mise à jeun des animaux 24 heures avant. Cette mise à jeun est necessaire pour prévenir les régurgitations et une dégradation de la qualité de l’eau du seau d’anesthésiant.
Choix des espèces
Le bar est une espèce de poisson marin d'intérêts halieutique, aquacole et écologique. La communauté scientifique s'intéresse à mieux prédire l'impact du changement global sur cette espèce sur laquelle des outils de modélisation de croissance et de dynamique des populations sont en développement. L'expérimentation sera réalisée sur des poissons issus de géniteurs exposés depuis plusieurs années à des pH 8 et 7.6. Les poissons sont des juvéniles (non matures sexuellement) âgés de 15 mois pèsent en moyenne 150 grammes. Ce stade de développement est particulièrement pertinent pour notre étude puisque c'est à ce stade de vie que la croissance des animaux est la plus importante (doublement du poids en 4-5mois), ce qui devrait nous permettre de détecter plus facilement des différences statistiquement significatives entre les deux conditions.
Modèles de cancerologie expérimentale par cellules de carcinome colique pour l’évaluation de nouvelles thérapeutiques par imagerie in vivo
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit un cancer colorectal par chirurgie ou par injection, puis elles subissent jusqu'à deux imageries par semaine pendant neuf semaines sous anesthésie, jusqu'à cinq traitements hebdomadaires pendant six semaines et des prélèvements sanguins en sous-mandibulaire sur animal vigile. Le porteur indique que les tumeurs sous-cutanées, coliques et péritonéales peuvent provoquer des difficultés de locomotion, des diarrhées et des occlusions intestinales. Il affirme que l'étude des tumeurs et métastases ne peut pas être modélisée in vitro et qu'aucune autre méthode n'apporterait un niveau d'information équivalent.
Objectifs
Le cancer colorectal représente un défi majeur de santé publique en raison de sa gravité et de l’augmentation croissante des cas nouvellement diagnostiqués en France et à travers le monde. Malgré des avancées significatives en termes de survie grâce aux chimiothérapies à base d’anticorps thérapeutiques, certains patients ne répondent pas ou peu aux traitements. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies afin d’améliorer l’efficacité antitumorale et de lutter contre les phénomènes de résistance.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’étudier par imagerie in vivo des modèles de cancer colorectal à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments.
Procédures
Induction de cancer colorectal : 1 acte par animal soit par chirurgie (15min max d’intervention sous anesthésie générale) soit sans chirurgie : injection intrapéritonéale (quelques secondes), injection sous cutanée (quelques secondes sous anesthésie générale), injection par endoscopie (5-10min sous anesthésie générale) Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 9 semaines sous anesthésie générale. Traitements : au maximum 5 traitements par semaine pendant 6 semaines par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse Prélevement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire volume maximal de 130μL( en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours) pour une souris de 25g .
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus pour les animaux sont liés au développement de foyers tumoraux au niveau sous-cutané ainsi qu’au niveau du colon et des viscères. Une difficulté de locomotion peut éventuellement s'installer lorsque la tumeur sous cutanée évolue et des diarrhées ou occlusions intestinales peuvent apparaître lors de l’évolution des tumeurs du colon ou des métastases péritonéales. La définition de points limites, le suivi quotidien, les pesées ainsi que la grille de scoring nous permettront d’anticiper toute douleur ou souffrance qui seraient induites. Nous n’attendons pas de douleur ou d’intolérance liées aux composés tests.
Devenir
Toutes les souris seront mise à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.
Remplacement
L'étude de tumeurs ou métastases résulte de l’interaction de nombreux types cellulaires et ne peut pas être modélisée in vitro. Aucune autre méthode expérimentale ne serait en mesure d’apporter un niveau équivalent d’information que la procédure expérimentale impliquant l’utilisation d’animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans toutefois compromettre les objectifs. Les groupes témoins seront regroupés lorsque cela sera possible. La mise en oeuvre de l'imagerie (bioluminescence et échographie) permettra de suivre le même animal au cours du temps ce qui permet de réduire significativement leur nombre.
Raffinement
Les méthodes d'imagerie mises en oeuvre sont non invasives et les actes réalisés sous anesthésie ce qui limite la douleur et le stress infligé au cours de l’expérimentation. Par ailleurs, les souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des cages disposant d’un environnement enrichi et en accord avec les directives européennes. L'induction des modèles tumoraux sera réalisée sous anesthésie générale. Durant les actes de chirurgie, la douleur sera également prise en charge par l'utilisation d'antalgiques (paracétamol) la veille et 24h post opératoire et par l’administration d'anti inflammatoire (tolfédine) le jour et 24h post opératoire. Des grilles de scoring avec les points limites prédictifs seront mis en place et le personnel examinera les animaux quotidiennement afin d'anticiper la souffrance de l'animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Par ailleurs il existe des souris immunodéficientes bien adaptées pour les implantations de cellules d'origine humaine. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
Interactions métaboliques entre glioblastome et neurones “GLIONEUROMET” 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
144 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Porteuses d'un glioblastome, elles reçoivent une perfusion de substrats marqués au carbone 13 destinée à mesurer les échanges métaboliques, avant prélèvement du cerveau pour analyse par spectroscopie. Le porteur indique que le modèle tumoral peut entraîner perte de poids, hérissement du poil, baisse d'activité et prostration, et formule l'hypothèse que des cannabinoïdes réduiraient le lien métabolique entre cellules tumorales et neurones. Il reconnaît l'existence de co-cultures glioblastome-neurones mais affirme qu'un "organisme entier" est requis pour son approche translationnelle.
Objectifs
Le glioblastome est une tumeur cérébrale qui touche les astrocytes (les cellules de soutien du cerveau). Cette maladie est rare ; cependant son mauvais pronostic représente un problème de santé publique majeur. En effet, après traitement, le risque de récidive est très élevé. Les cellules tumorales migrent et envahissent les tissus avoisinants et forment des foyers tumoraux secondaires. Le lien métabolique entre les astrocytes et les neurones est très fort. L’hypothèse du projet est que la relation métabolique entre les cellules du glioblastome (astrocytes devenus tumoraux) et les neurones pourrait être impliquée dans l’invasion tumorale : les neurones pourraient aider au développement tumoral en stimulant les cellules du glioblastome. L’objectif global de ce projet est de décrypter les principales voies du métabolisme reliant les cellules du glioblastome et les neurones. L’inhibition de ce lien métabolique pourrait représenter une piste thérapeutique de choix. Les cannabinoïdes pourraient inhiber ce lien entre cellules du glioblastomes et neurones et donc inhiber l'invasion tumorale.
Bénéfices attendus
En dépit des traitements thérapeutiques, les cellules tumorales du glioblastome (cellules dérivées des astrocytes, cellules de soutien du cerveau) migrent et envahissent les tissus avoisinants pour former des foyers tumoraux secondaires, associés à un mauvais pronostic. Il existe un lien métabolique très fort entre les astrocytes et les neurones ; dans le cadre du glioblastome, les neurones pourraient aider au développement tumoral en stimulant les cellules du glioblastome. Le projet vise à évaluer les effets d’une diminution du lien entre cellules tumorales et neurones, sur l’invasion tumorale. Le bénéfice attendu est une réduction de la capacité invasive des cellules tumorales. La réduction de ce lien entre cellules tumorales et neurones par les cannabinoïdes pourrait représenter une stratégie thérapeutique complémentaire pour contrer les récidives de l'invasion tumorale, après le traitement.
Procédures
Perfusion de substrats marqués au carbone 13 pour permettre la mesure des échanges métaboliqies. 1 fois / 1 heure. Prélèvement du cerveau sur animaux préalablement mis à mort.
Impact sur les animaux
Le modèle utilisé est un modèle de glioblastome et un certain nombre d’événements indésirables pourrait survenir au cours des expérimentations : une perte de poids, un hérissement du poil, une diminution de l’activité, une prostration.
Devenir
Le cerveau des animaux doit être prélevés pour être analysé par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire.
Remplacement
Des modèles de co-culture (glioblastomes / neurones) existent, cependant, ces modèles s’affranchissent de la (patho)physiologie de l’organisme entier. Le but final de notre projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester les effets de la modulation du métabolisme énergétique entre les cellules du glyoblastome et les neurones dans les capacités invasives et métastatiques des cellules tumorales, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.
Réduction
Une réduction du nombre d’animaux est rendue possible par l’utilisation de l'imagerie et la spectroscopie par résonance magnétique qui sont des techniques d’investigation non invasives et permet donc une réduction du nombre d’animaux nécessaires à l’étude. De plus un seul hémisphère cérébral est touché ainsi, chaque animal peut être son propre témoin. Ceci permet de réduire fortement le nombre d’animaux nécessaire pour distinguer de façon statistiquement significative deux populations.
Raffinement
Les nuisances sur le bien-être animal seront minimisées par la mise en place de diverses procédures : utilisation d'analgésiques en cas de douleurs obervées, pesées régulières des animaux pour détecter toute perte de poids. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et ou la personne en charge de l'expérimentation. Lors de ces observations, la capacité de l’animal à s’alimenter, son comportement et sa vivacité, l’état du pelage seront évalués. Un échange quotidien entre le zootechnicien et l’expérimentateur permettront une intervention et une prise de décision rapide en cas de souffrance constatée.
Choix des espèces
La souris est utilisée depuis plusieurs années pour les études du métabolisme dans notre laboratoire, ainsi nous disposons déjà de nombreux groupes témoins permettant les comparaisons et limitant ainsi de refaire tous les témoins. De plus, l'utilisation de l'espèce souris permet d'utiliser des animaux génétiquement modifiés adapté à l’implantation de xenogreffes (cellules tumorales P3). La capacité de ces souris à ne pas initier de rejet permettra aussi de diminuer le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 3 et 6 mois), le métabolisme cérébral étant différent à des stades plus précoces.
Synchronie et sélection sexuelle chez la lamproie de Planer
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
60 lamproies de Planer vont être utilisées dans des procédures classées en gravité légère, capturées par pêche à l'électricité puis mesurées et sexées sous anesthésie. Quarante d'entre elles reçoivent un marquage par injection d'élastomère coloré sous anesthésie et sont maintenues en aquarium jusqu'à leur mort, l'espèce étant semelpare et mourant quelques jours après la reproduction, tandis que les vingt individus surnuméraires sont relâchés en rivière avant la reproduction. Le porteur décrit une étude sur l'effet de la synchronie de reproduction sur la sélection sexuelle et la diversité génétique, dont les résultats doivent alimenter un modèle théorique sur le changement climatique. Il affirme que le remplacement par une autre espèce n'est "pas envisagé" au motif que les comportements reproducteurs sont spécifiques.
Objectifs
L'objectif du projet est de tester l'effet de la synchronie de reproduction (le fait que tous les individus se reproduisent au même moment ou non) sur l'intensité de la sélection sexuelle et la diversité génétique au sein d'une population de lamproie de Planer. Au niveau théorique, une forte synchronie de reproduction au sein d'une population est censée limiter la capacité des individus les plus compétitifs à monopoliser des partenaires sexuels, ce qui devrait permettre la reproduction d'individus moins compétitifs. Cette participation plus équilibrée à la reproduction devrait conduire à une diversité génétique accrue. Pour des espèces dont la maturation sexuelle est fortement liée à la température, les changements climatiques (printemps plus précoce, pics de chaleur plus marqués) peuvent influencer la synchronie de la reproduction. Chez les lamproies, alors que la saison de reproduction d'une population peut s'étendre sur un mois ou plus, la période d'activité sexuelle au niveau individuel est très brève : 2-3 jours pour les femelles, 7-10 jours pour les mâles. Cet écart important entre la durée maximale de reproduction de la population et la durée individuelle d'activité offre un potentiel de contraction de la saison de reproduction, et rend pertinent le test de l'effet de la synchronie sur le système d'appariement de cette espèce. Les connaissances acquises lors de cette expérience contribueront à une meilleure prédiction de l'effet du changement climatique sur cette espèce de lamproie qui est représentative des autres espèces de lamproies, dont certaines sont menacées.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu est une meilleure compréhension de l'effet de la synchronie, potentiellement induite par le changement climatique, sur le système d'appariement et la diversité génétique au sein d'une population. Les résultats obtenus seront synthétisé dans un modèle théorique ayant pour objectif de prédire l'effet du changement climatique sur l'évolution de traits potentiellement sous sélection sexuelle. En effet, le changement climatique a potentiellement des effets plus subtils que la simple mortalité des individus soumis à des température trop élevées. Comprendre ces mécanismes plus subtils permet de mettre en avant la susceptibilité face au changement climatique d'espèces dont la mortalité n'augmente pas forcément beaucoup avec la température.
Procédures
60 individus seront soumis à la capture par pêche à l'électricité en milieu naturel (exposition de quelques secondes à un champ électrique) et à la biométrie (détermination du sexe, mesure de la longueur corporelle, pesée) sous anesthésie. Parmi eux, 40 individus subiront un marquage par injection d'élastomère coloré à la base de la nageoire dorsale, sous anesthésie (3 minutes entre le début de l'anesthésie et le réveil). Ces mêmes 40 individus seront maintenus en aquarium aménagé pour observation de la reproduction, jusqu'à leur mort naturelle (au maximum un mois).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sur les animaux concernent essentiellement l'exposition à l'électricité lors de la pêche, le marquage et la biométrie sous anesthésie et le maintien dans un aquarium lors de la reproduction.
Devenir
20 individus sur les 60 qui auront été capturés seront replacés en milieu naturel à l'issue de la biométrie. Ces individus surnuméraires permettront de choisir la composition phénotypique (sexe, longueur, poids) la plus homogène entre les deux lots expérimentaux. Ils seront relâchés avant la reproduction, pour qu'ils puissent se reproduire en milieu naturel. Les 40 individus répartis dans les deux lots expérimentaux mourront dans l'aquarium d'observation à l'issue de leur période de reproduction, les lamproies étant semelpares, donc mourrant naturellement quelques heures à quelques jours après leur dernier accouplement.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet de recherche sur l'impact des changements environnementaux sur les systèmes d'appariement des lamproies, nous combinons des approches de modélisation théorique, d'expérimentation et d'observation en milieu naturel. Les résultats d'expérimentation et les observation en milieu naturel sont nécessaires pour paramétrer les modèles servant à prédire l'impact des changements environnementaux sur les populations. Ainsi avec une expérience impliquant 60 individus (en fait, 40 pour l'observation du comportement) et deux niveaux de synchronie, et des données de terrain reliant les conditions météorologiques à la synchronie de la reproduction, nous alimenterons un modèle qui explorera l'effet des changements environnementaux sur la reproduction des population. Les comportements reproducteurs étant spécifiques, le remplacement par une autre espèce n'est pas envisagé.
Réduction
Alors que la synchronie est un phénomène quantitatif continu, nous réduisons le nombre d'individus impliqués en limitant le plan d'expérience à deux niveaux de synchronie. Pour chaque niveau, nous avons besoin de plusieurs mâles et de plusieurs femelles puisque c'est la reproduction qui est étudiée, et en particulier la sélection sexuelle, impliquant choix de partenaire et compétition entre individus. Chez les lamproies de Planer, les accouplements se font sur des nids regroupant entre 2 et 40 individus, où le choix et la compétition s'exercent. Former des groupes de 10 mâles et 10 femelles reconstitue ainsi une densité telle qu'observée sur le terrain, et devrait fournir des données réalistes sur les comportements reproducteurs. L'expérience durant pendant toute la période de reproduction, nous pourrons observer la totalité des accouplements réalisés par les individus (plusieurs dizaines par individu), ce qui fournira une grande quantité de données avec un nombre réduit d'individus.
Raffinement
En milieu naturel, les lamproies de Planer se reproduisent dans des cours d'eau étroits sur lesquels elles se déplacent assez peu. Par ailleurs, elles ne s'alimentent pas et investissement tant dans la reproduction qu'elles en meurent. Le raffinement du dispositif expérimental consiste donc essentiellement à reproduire l'habitat de reproduction, sur une section d'aquarium de 10 x 1m, comportant du substrat de reproduction et des abris, et alimenté en circuit ouvert avec de l'eau de la rivière, dont les caractéristiques physico-chimiques (T°, pH, oxygène dissout nitrates) seront suivies en continu. En amont, le marquage et la biométrie seront réalisés sous anesthésie (30mg/L de benzocaïne) selon une procédure prenant environ 3 minutes (anesthésie+marquage+réveil) et n'impliquant pas de mortalité ou comportement anormal après le réveil.
Choix des espèces
Alors que la saison de reproduction d'une population de lamproie peut s'étendre sur un mois ou plus, la période d'activité sexuelle au niveau individuel est très brève : 2-3 jours pour les femelles, 7-10 jours pour les mâles. Cet écart important entre la durée maximale de reproduction de la population et la durée individuelle d'activité offre un potentiel de contraction de la saison de reproduction, et rend pertinent le test de l'effet de la synchronie sur le système d'appariement de cette espèce. Les individus utilisés seront adultes car c'est à ce stade qu'on peut observer les comportements de reproduction.
Etablissement et maintien d’une banque de xénogreffes de tumeurs humaines sur souris immunodéficientes.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
15 105 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Elles reçoivent des greffes de tumeurs humaines, parfois sur l'organe d'origine, ainsi que des ovariectomies, castrations ou injections intracardiaques, pour entretenir une banque de tumeurs et tester des anticancéreux. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer gêne respiratoire, occlusion intestinale, ascite ou exophtalmie selon la localisation, et reconnaît n'avoir mis en œuvre aucun test statistique. Il qualifie le modèle vivant intégré d'"indispensable" faute d'alternative pour ces cancers.
Objectifs
Les xénogreffes résultent de la greffe chez la souris de fragments tumoraux de patients obtenus suite à un prélèvement chirurgical»). Ces xénogreffes sont actuellement considérés comme le modèle tumoral le plus proche des tumeurs des patients et permettent la réalisation d’études biologiques et pharmacologiques dont le potentiel prédictif clinique est très élevé. Ainsi elles constituent un outil essentiel pour étudier la biologie des cancers humains et pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments ou encore de nouvelles combinaisons ou posologies de médicaments. Elles permettent également dans certains essais cliniques, une aide à la prescription pour le clinicien quand il a été possible de montrer l’efficacité d’une molécule sur la xénogreffe issue de la tumeur du patient. Ce caractère prédictif dépend toutefois de la possibilité de sélectionner les xénogreffes appropriées et donc d’avoir pu constituer des ensembles représentatifs de la diversité des tumeurs de patients. Cela nécessite le développement d’un grand nombre de modèles tumoraux différents pour une même pathologie. De même, certaines études biologiques nécessitent d’une quantité importante de matériel tumoral, à l’état frais, et ne seraient pas réalisables sans le passage en xénogreffe. Une banque de PDX maintenue sur souris constitue donc une source importante de matériel tumoral à l’état frais, sans les limitations des prélèvements issus des patients. Notre laboratoire a déjà développé un nombre important de modèles de différents types tumoraux (sein, poumon, côlon, mélanome, rétinoblastome, ovaire, lymphomes,…), notre objectif est donc de : - Maintenir les modèles pertinents existants comme source de matériel tumoral nécessaire pour les études biologiques et pharmacologiques - Obtenir de nouveaux modèles (tumeurs ou sous-types tumoraux) pour lesquels il existe un besoin et un rationnel scientifique ou clinique - Développer des modèles de métastases - Développer des modèles résistants pour comprendre les phénomènes de résistance aux traitements et les moyens de les contourner
Bénéfices attendus
Les xénogreffes issues des tumeurs patientes constituent un modèle préclinique cliniquement pertinent, dont les applications sont nombreuses, en recherche fondamentale et translationnelle. En recherche fondamentale, elles permettent d’étudier la biologie des cancers humains sans les limitations associées aux prélèvements issus des patients (matériel en quantité insuffisante, difficultés logistiques ou d’accès aux prélèvements, etc.), car elles constituent une source de matériel tumoral humain illimité, pouvant être conditionnée de façon différente selon les applications (à l’état frais, congelé, fixé, dissocié en single cell, etc.). Pour la recherche pharmacologique, le développement exponentiel de thérapies ciblées et individualisées dans le cancer ces dernières années a rendu nécessaire la mise au point de modèles précliniques représentatifs de la diversité et la complexité de la pathologie cancéreuse observée chez les patients. Les xénogreffes d’origine humaine constituent aujourd’hui l’outil d’analyse pharmacologique le plus proche de la clinique. Ces nouveaux modèles permettent de sélectionner les meilleurs composés anti-tumoraux : optimisation des modalités thérapeutiques, prédiction des effets du médicament, évaluation de l’effet sur la croissance locale et la dissémination métastatique, identification de marqueurs de réponse ou de résistance au traitement Par ailleurs, l'évaluation préclinique est une étape importante et obligatoire dans le développement d'un médicament avant son utilisation clinique. Ces expériences pharmacologiques sont possibles grâce au maintien des tumeurs sur souris, comme source de matériel tumoral.
Procédures
La greffe de matériel tumoral sera faite dans la majorité des cas en sous cutané. Des souris supplémentaires sont greffées au niveau de leur site d’origine ou bien autre site qui par l’absence de système immunitaire permet d’améliorer la prise tumorale Ces greffes seront réalisées1 fois / animal et sous anesthésie ; durée d’anesthésie chimique
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors des procédures chirurgicales seront celles liées à l’incision de la peau ou du péritoine. L’utilisation d’anesthésique et d’analgésique permet de prendre en charge ces douleurs. Lors des anesthésies, une baisse de température corporelle est observée chez la souris ; pour éviter la baisse de température, les animaux sont placés sous lampe chauffante et tapis chauffant. Les injections de cellules ou l’administration de molécules par voie orale ou par injection ne provoquent pas de douleurs chez les animaux au-delà de l’injection elle-même Par ailleurs, la croissance des tumeurs surtout quand elles sont greffées au niveau de leur site d’origine pourraient provoquer une perte de poids et aussi une gêne pour se déplacer juste après la greffe. L’alimentation gélifiée ajouté dans la cage et la réhydratation aident à diminuer l’inconfort des animaux. Les gênes causées par le développement des tumeurs orthotopiques ou bien apparition des métastases peuvent être : - gêne respiratoire par le développement des tumeurs au niveau des poumons - Diarrhée, perte de poids plus de 72h ou occlusion intestinale pour les tumeurs de colon, - apparition d’ascite pour les tumeurs de l’ovaire - difficulté à se déplacer pour les greffes au niveau de l’os et au niveau de la glande mammaire - exophtalmie pour les tumeurs de l’œil - Difficultés de déplacement ou boitillement avec ou sans déformation du genou pour les tumeurs intra-osseuses
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures pour des prélèvements post-mortem
Remplacement
l'utilisation des animaux se justifie par le fait que la tumeur interagit avec son environnement pour se développer qu'elle soit placée en sous- cutanée ou dans une localisation proche de son site originel (vascularisation, stroma…). Un modèle vivant intégré est donc indispensable pour étudier les interactions entre la tumeur et ses organes cibles mais également avec l’organisme dans sa totalité. Ces modèles vont nous permettre d'étudier le développement de la maladie en essayant de mimer et comprendre leur mécanisme oncogénique dans des modèles orthotopiques. Par ailleurs, nous pourrons également explorer et valider l'efficacité de nouvelles thérapies dans des modèles sous-cutanés rares voire inexistants pour certains types de cancers ou des modèles orthotopiques particuliers, le plus proche de clinique. Il n'e'xiste donc pas de méthode alternative capable de répondre à la question scientifique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit à son strict minimum, notamment grâce au calcul du taux de prise du modèle établi qui permet de ne greffer que le nombre d’animaux nécessaires au maintien de la xénogreffe. Par ailleurs, nous recherchons continuellement à améliorer nos techniques de congélation/décongélation des tumeurs pour éviter de garder des animaux greffés en continue pour le maintien de modèles non utilisés. A noter que pour l’apprentissage des nouveaux gestes expérimentaux, le personnel sera formé d’abord sur les animaux euthanasiés et une fois le geste maîtrisé, leur formation est complétée sur les souris en vie. Pour cette étape, afin de réduire le nombre d’animaux et après l’avis favorable du vétérinaire, nous utiliserons les animaux greffés par ailleurs et dont les tumeurs n’ont pas poussé. Aucun test statistique n’a été mis en œuvre
Raffinement
Les différentes procédures seront mises en œuvre de façon à engendrer le minimum de contraintes et de douleur aux animaux : utilisation d’anesthésique et d’analgésiques systématique lors des chirurgies, addition d’alimentation hydraté en post-opératoire, hydratation supplémentaire de l’animal si perte de poids ou difficulté à se déplacer après chirurgie ; Les animaux seront surveillés le jour de la chirurgie pour les greffes en SC et interscapulaires (90% des greffes) et pendant 24h pour les ovariectomies, les castrations, les greffes autres que les SC et interscapulaires. sous-capsule rénales et l’ injection des cellules en intracardiaque. Par la suite, les animaux sont surveillés 1 fois par semaine par le personnel dédié. Par ailleurs, sauf exception, les greffes sont programmées et réalisées au plus tard le jeudi matin. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de définir les points-limite.
Choix des espèces
Choix de l’espèce « Souris » c’est le modèle in vivo d’un mammifère dont le profil pharmacologique permet une utilisation préclinique Choix de la lignée murine : nécessité d’un déficit immunitaire pour éviter le rejet de la xénogreffe d’origine humaine par la souris. Différentes souches sont utilisées en fonction des types et sous-types tumoraux pour favoriser la prise et la croissance des modèles de xénogreffes La greffe a lieu entre 5 à 11 semaines pour que les souris aient fini leur croissance mais suffisamment tôt pour que la tumeur greffée puisse prendre sur les animaux car l’immunodéficience peut diminuer avec l’âge. Les animaux à cet âge supportent également mieux l’anesthésie, la chirurgie et les traitements.
Pose et retrait d’une canule ruminale temporaire pour bovin
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
2 bovins vont être utilisés puis rendus au troupeau après récupération, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit deux chirurgies sous anesthésie générale pour poser puis retirer une canule dans le rumen, ainsi que jusqu'à vingt-six prélèvements sanguins, pour mettre au point une canule temporaire présentée comme moins invasive que les canules permanentes. Le porteur indique une possible gêne mécanique pendant la cicatrisation et un léger écoulement au retrait. Il revendique un "besoin constant d'animaux" pour la recherche agronomique et affirme ne pas pouvoir remplacer le bovin par un fermenteur artificiel.
Objectifs
L'agriculture est depuis toujours en constante évolution. Pour l'aider dans cette mutation la recherche agronomique a initié de nombreux programmes de recherche. Auparavant orientée vers l'augmentation des performances et l'amélioration de la productivité des espèces animales élevées et destinées à produire du lait et/ou de la viande, aujourd'hui elle s'orienterait plutôt à maintenir le niveau de production des animaux (ovins, bovins...) tout en prenant plus en compte les contraintes du milieu, les risques environnementaux (production des GES, pollution des sols...) ou les attentes sociétales (bien-être animal, qualité des produits, traçabilité de l'alimentation...). Pour répondre à une partie de ces enjeux, notre établissement utilisateur a un besoin constant d'animaux. Pour réaliser des études fines des mécanismes physiologiques d'ingestion et de la digestion des aliments chez les ruminants, les animaux modèles utilisés sont ici des bovins. C'est un modèle animal de référence pour établir les valeurs de digestibilité et d’ingestibilité des aliments pour ruminants, et pour comprendre les processus digestifs afin de les modéliser. De par son caractère générique, les résultats qu’il permet d’obtenir sont le plus souvent extrapolables aux autres catégories de ruminants (ovins, caprins, brebis et agneaux). Pour certaines études, en particulier pour la compréhension des mécanismes de digestion et de mesure de la cinétique de dégradation des aliments, le recours à des animaux porteurs de canules est indispensable. L’objectif de ce projet est de trouver une alternative à certaines méthodes invasives sur animaux en particulier les canules permanentes sur ruminants. Ici, il s’agit premièrement de concevoir une canule ruminale temporaire pour bovin avec un diamètre d’insertion dans le rumen le plus étroit possible (= 3 cm, diamètre interne = 1.5 cm, réalisé en plastique afin d’être peu dense et donc le plus léger possible pour éviter une gêne de l’animal) et pouvant être retirée quelques semaines après (max : 24 semaines). La pose de la canule se fera par chirurgie mais le retrait devra être réalisé sans chirurgie supplémentaire. Le but est que ces dispositifs ne soient positionnés sur l’animal que pour la durée de l’expérimentation et non sur la carrière de l’animal tout en permettant d'étudier les mécanismes fins de la digestion.
Bénéfices attendus
Pouvoir étudier les mécanismes fins de la digestion en utilisant des animaux porteurs de canules. Les animaux ne seront équipés de ces canules que pour la durée des procédures, soit quelques semaines. Les animaux ne seront plus équipés de canules permanentes durant toute leur carrière.
Procédures
Les deux animaux subiront deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale : la pose de la canule durera environ 30 minutes et le retrait de la canule durera moins de 10 minutes. Des prélévements sanguins par voie caudale (13, si besoin au maxium 26) seront réalisés sur les deux bovins vigiles et chacun durera moins d'une minute entre la contention et la réalisation de la procédure.
Impact sur les animaux
Il est possible d’avoir une possible gêne mécanique de la canule au niveau des faisceaux musculaires le temps de la cicatrisation des tissus. Par conséquent la gêne occasionnée est temporaire. De plus, au moment du retrait de la canule, un léger écoulement pourrait survenir pendant quelques heures, le temps que l'orifice ne se ferme naturellement de manière mécanique.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, les 2 vaches retourneront dans le troupeau après avoir complétement récupérées.
Remplacement
Dans certains cas de figure, notamment pour l'étude des mécanismes fin de la digestion, nous ne pouvons pas utiliser de méthodes alternatives (fermenteurs artificiels). C'est pour cela que nous avons recours à des bovins dans ce projet.
Réduction
Nous avons réduit au maximum les effectifs avec seulement deux animaux utilisés. Pour vérifier toutes les étapes, nous devons les confirmer avec au moins une répétition. Il serait vraiment très difficile de tirer des conclusions robustes avec seulement un seul animal.
Raffinement
Tout est mis en œuvre pour le raffinement notamment les conditions d'hébergement qui seront réduites au maximum individuellement et les surfaces par animal respectent les normes en expérimentation. De plus, lors de la pose et du retrait le protocole médicamenteux est adapté afin que l'animal souffre le moins possible, pour cela des antiinflammatoires ainsi que des antalgiques sont administrés sur 9 jours post opératoires pour permettre à l'animal de se remettre dans de bonnes conditions. Pour vérifier que son bien être n'est pas impacté, des grilles comportementales seront mises en oeuvre (au moment de la pose et du retrait de la canule temporaire) deux fois par jour de J-1, J0, J1, à J2, puis une fois par jour à J3, J6, J8, J10 et J13, ce qui permettra d'adapter si besoin le protocole de prise en charge de la douleur (analgésie et/ou anti-inflammatoire). Elles comportent des critères relatifs aux comportements (changements de comportements, postures antalgiques, etc.), des paramètres zootechniques (ingestion, etc.) et physiologiques (température rectale, fréquences cardiaque et respiratoire, etc.), et à l’aspect des cicatrices. Des prises de sang sont réalisées en parallèle des grilles comportementales pour vérifier l'évolution d'une hormone indicatrice du stress (cortisol sanguin) et des protéines de l’inflammation (Haptoglobine et interleukines) pour déceler si l'animal souffre des procédures réalisées.
Choix des espèces
Nous étudions la digestion des ruminants et le bovin est l'un des modèles d'études de ces mécanismes. C'est pour cela que nous avons choisi l'espèce bovine. Il s’agit de mettre au point de nouvelles approches chirurgicales moins invasives que la pose de canules permanentes ruminales, pour pouvoir étudier in vivo la digestion et le métabolisme des nutriments absorbés par l’animal et les réponses de l’animal. Nous étudions les mécanismes de digestion d'animaux qui peuvent être utilisées à différents stades physiologiques : vaches en production ou taries. Le stade de lactation important peu pour cet essai.
Facteurs impliqués dans la leucémogenèse B
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
585 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules ou sont suivies dix à douze mois pour laisser survenir une leucémie qui se manifeste par des tumeurs palpables, pour analyser quatre facteurs de la leucémogenèse B. Le porteur indique que les tumeurs peuvent gêner les déplacements et prévoit une mise à mort avant que la tumeur ne dépasse une taille définie. Il affirme que ces processus ne peuvent être étudiés dans des lignées cellulaires et conclut que la génétique connue de la souris "impose" son choix.
Objectifs
Les cellules B jouent un rôle crucial dans notre système immunitaire grâce notamment à leur capacité à produire des anticorps. Dans certains contextes encore mal compris, de rares cellules B peuvent devenir cancéreuses. Ce processus pathologique peut survenir à différents stades du développement des cellules B. En général, la leucémie touche des cellules B aux stades précoces ou immatures de leur développement, alors que les lymphomes ou myélome ciblent des cellules B plus matures. Malgré d’intenses efforts et d’importantes avancées, les mécanismes et les facteurs qui déclenchent le processus tumoral à des stades déterminés du développement des cellules B et favorisent l’expansion des rares cellules cancéreuses initiales, ou au contraire leur blocage, restent obscurs. Ceci est en grande partie dû à l’absence de modèles animaux appropriés qui miment la situation chez l’Humain. Notre projet est à visée biomédicale et a pour objectif d’analyser le rôle de 4 facteurs, connus pour jouer un rôle important dans le développement des cellules B, dans la survenue de la leucémie. Ces 4 facteurs seront étudiés dans un modèle de leucémie chez la souris. Nos travaux relèvent de la recherche publique et sont réalisés au sein d'une unité mixte de recherche.
Bénéfices attendus
Le projet a pour objectif de comprendre le rôle de 4 facteurs dans la prolifération tumorale, ou au contraire dans son inhibition, au cours de la leucémie B. A court et moyen termes, la réalisation du projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes en jeu lors de la prolifération tumorale. Mais au-delà de cet aspect fondamental, le projet a des implications pour la santé humaine dans la mesure où la leucémie B reste un problème de santé majeur, en particulier en raison des problèmes récurrents de rémission observés chez les patients, chez qui les conséquences sont souvent fatales. Cette étude devrait donc apporter une contribution originale et importante aux efforts déployés par différentes équipes pour la compréhension des mécanismes de la leucémogenèse en particulier et des différents cancers touchant les cellules B en général (lymphome, myélome, etc). A plus long terme, les résultats obtenus devraient ouvrir la voie à des approches thérapeutiques, notamment par des criblages pharmacologiques et des essais d’immunothérapie, ciblant les facteurs qui se révéleront les plus prometteurs.
Procédures
Dans une procédure, les souris subiront une injection de cellules et d’un suivi de la survenue de la leucémie. A la fin de la procédure, les souris seront mises à mort et certains de leurs organes prélevés pour analyse. Dans une deuxième procédure, aucune intervention n’est prévue. Les souris seront suivies pendant 10-12 mois pour vérifier la survenue de la leucémie, qui se manifeste par l’apparition de tumeurs d’abord palpables à la main lors des examens réguliers, puis visibles à l’œil nu. A la fin de la procédure, les souris seront euthanasiées et certains de leurs organes prélevés pour analyse.
Impact sur les animaux
Deux types de nuisance ou d’effets indésirables sont attendus dans le cas du protocole rapide : l’injection intraveineuse est relativement douloureuse pour les souris. L’injection se fera au niveau des queues des souris. Les souris seront d’abord mises sous anesthésie gazeuse (anesthésie générale). Une anesthésie locale sera en plus réalisée en appliquant une pommade sur la zone de piqure. Par ailleurs, en cas de survenue de leucémie, l’apparition de tumeurs peut gêner le mouvement des souris (voir point 3 : Raffinement). Dans le protocole standard, aucune injection n’est prévue et les nuisances ou effets indésirables sont ceux liés à l’apparition des tumeurs, i.e., mobilité réduite. Dans tous les cas, nous adopterons en plus des critères généraux d’arrêt par rapport à la souffrance (arrêt d’alimentation, amaigrissement, poil hérissé, prostration durable) un critère lié à la taille de la tumeur (< 5 mm). Avant ce point limite, les souris seront mises à mort pour analyse.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour analyse.
Remplacement
La nature des travaux que nous menons, et qui concernent la physio-pathologie du développement des cellules B, impose le choix de la souris dans la mesure où sa génétique est bien connue. En effet, les processus développementaux que nous étudions ne peuvent être abordés dans leur complexité physio-pathologique (développement, interactions avec d’autres molécules et cellules, vieillissement, etc) dans des lignées cellulaires ou d’autres systèmes in vitro. Néanmoins, aussi souvent que possible, dans le respect du principe de remplacement, nous utilisons des lignées cellulaires ou d’autres systèmes de culture cellulaire. Enfin, notre démarche inclut également la responsabilisation de tous les membres de l’équipe amenés à faire de l’expérimentation animale grâce notamment à des formations spécifiques et au strict respect des règles en vigueur.
Réduction
Dans toute notre démarche, de l’hébergement des souris à l’expérimentation, nous nous faisons un devoir de respecter la règle des 3R (Réduction, Remplacement, Raffinement). En étroite interaction avec les animalier(e)s, le nombre des souris est réduit au strict nécessaire permettant de réaliser nos expériences en tenant compte de la reproductibilité et de la significativité statistique. Ci-dessous, nous présentons le nombre de souris prévues dans les 2 cas de figures : 1) succès du protocole rapide, 2) échec du protocole rapide, impliquant le recours au protocole standard. A noter que les nombres totaux de souris sont donnés pour la durée globale du projet. En pratique, les expériences seront échelonnées dans le temps et conditionnées par les résultats de l’étude pilote. 1. Succès du protocole rapide : Dans un premier temps, nous procèderons à une étude pilote dans laquelle nous nous focaliserons sur un seul facteur (sur la base des données de la littérature). Nous utiliserons donc 3 lignées de souris : une pouvant développer à terme la leucémie, une correspond au facteur cible (et contrôle négatif), et une qui permettra l’étude de l’effet du facteur étudié sur la survenue de la leucémie (amplification ou inhibition) (45 souris au total). En cas de succès de l’étude pilote, l’étude défintive, réalisée une fois, sera étendue aux 4 facteurs. Dans ce cas le nombre de souris prévu (incluant tous les contrôles) est de 540 souris. 2. échec du protocole rapide : En cas d’échec de l’étude pilote, nous adopterons une procédure consistant en un suivi à long terme des lignées. Dans ce cas, le nombre total de souris est de 360 souris, dont la moitié sera hébérgée en zone stérile et l’autre moitié en quarantaine.
Raffinement
Le raffinement inclut d’un côté les conditions d’élevage et d’hébergement qui sont optimisées par les animalier(e)s (nombre de souris ne dépassant pas 5/cage, inclusion de différents objets dans les cages, nourriture au sol en cas de mobilité réduite, etc), et d’un autre côté le choix des méthodologies induisant le moins de souffrance. Notre souci premier dans ce contexte est la prévention de souffrances inutiles, incluant notamment l’observation régulière tous les 2 jours, grille de scoring (établie par la SBEA, structure du bien-être animal), respect des nouvelles règlementations mises en place, etc. Pour ce qui est de la grille de scoring, elle est basée sur 3 critères majeurs : I. Aspect (état corporel, état du pelage et de la peau, écoulement, yeux, bouche) II. Fonctions corporelles (surtout respiration) III. Comportement (interaction sociale, posture et mobilité, comportements indésirables) La grille comporte une échelle de 0 à 3 à renseigner pour chaque souris à chaque observation : 0 (normal), 1 (légère altération), 2 (altération forte), 3 (altération très forte). Le score final se décline comme suit : Score total de 0-3: Normal Score total de 4-7: Observer attentivement, envisager l'utilisation d'un antalgique Score total de 8-11: Souffrance, prévoir un mode de soulagement et observer régulièrement. Demander un 2ème avis. Considérer l'euthanasie Score total de 12-15: Souffrance sévère. Fin de la procèdure par l'euthanasie de l'animal (sachant que la procédure est impérativement arrêtée lorque le total de point atteint 12).
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle d'étude est justifié à plusieurs titres : 1) sa génétique est bien connue permettant une certaine souplesse dans le choix du fond génétique approprié aux questions posées, 2) il existe de nombreuses lignées mutantes permettant des analyses génétiques fines, 3) le fonctionnement de son système immunitaire est relativement bien connu, 4) son ontogénie est bien connue de sorte que les lymphocytes B peuvent être prélevés à des stades précis du développement, 5) il existe une grande panoplie d'anticorps spécifiques et de banques de séquences très utiles à nos travaux et projets.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
184 souris vont être utilisées, 120 tuées à l'issue et 64 réutilisées ou écartées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues prédiabétiques par un régime riche en graisses, elles subissent des gavages quotidiens pendant quatre semaines et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec coupure de la queue et injections, pour évaluer des bactéries et un métabolite comme futur complément alimentaire. Le porteur indique un stress lié à l'isolement en cage individuelle et aux contentions répétées, et fixe une perte de poids de 20 % comme point limite. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne simule les interactions entre organes et conclut au recours à la souris.
Objectifs
Des résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire ont mis en évidence un effet anti-hyperglycémiant de souches bactériennes commensales du groupe Streptococcus salivarius inactivées par la chaleur, et d’un métabolite dérivé de la sérine (sécrété par les bactéries et les plantes) dans un modèle murin de prédiabète (définit pas une glycémie à jeun > 1.26g/L) induit par un régime riche en graisse. L’objectif de notre projet est de déterminer les mécanismes par lesquels ces souches bactériennes naturellement présentes dans l’intestin et ce métabolite exercent cet effet anti-hyperglycémiant dans un modèle de souris pré-diabètique . Le prédiabète désigne une glycémie, c'est-à-dire un taux de sucre dans le sang, plus élevée que la normale. Il est réversible s’il est traité avant son évolution vers le diabète qui lui est un état irréversible. Pour ce faire, plusieurs souches bactériennes ainsi que ce métabolite dérivé de la sérine seront administrées à un modèle de souris rendues prédiabétiques via un régime riche en graisse.
Bénéfices attendus
L’objectif final de ces recherches est de déterminer si les bactéries commensales étudiées et le métabolite bactérien dérivé de la sérine permettent la réversion du prédiabète c’est à dire de réduire l’intolérance au glucose et l’insulino-résistance induites par des régimes déséquilibrés. Si tel est le cas, ceux-ci pourraient servir de traitements pour prévenir le développement du diabète de type 2 chez l’homme. En effet, ce projet de maturation vise à developper un complément alimentaire, pour l’homme, à partir des bactéries et/ou de ce métabolite.
Procédures
Les animaux seront soumis à une contention régulière nécessaire lors des gavages quotidiens (quelques secondes) sur une période de 4 semaines et au cours des tests de tolérance au glucose et de tolérance à l’insuline. Pour ces deux tests (réalisés deux fois sur chaque animaux) les souris subiront une petite coupure à l’extrémité de la queue (incision : 1 seconde) et massage de la queue pour récupérer la goutte de sang (quelques secondes) et à une piqûre (5 secondes) lors de l’injection de l’insuline en intrapéritonéal . Un prélèvement de sang à la veine submandibulaire sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure 2 avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 10-15 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress de par leur placement en cage individuelle tout au long de la procédure et à un stress au cours de la contention nécessaire lors des gavages, des prélèvements et des injections quotidiens sur une période de 4 semaines D’après les résultats préliminaires du laboratoire, le gavage des souris avec ces différents composés tests, n’induit pas de perte de poids ni d’effets négatifs sur les souris. La prise de poids associée au régime riche en graisses et la période de jeune necessaire au test de tolérance oral au glucose (OGTT) et au test de tolérance à l'insuline (ITT) génèreront des stress faibles à modérés.
Devenir
En procédure 1 environ 64 souris non répondeuses au régime seront euthanasiées ou mutualisées et 120 souris seront utilisées pour la procédure 2. A la fin de la procédure 2 les 120 souris seront euthanasiées pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les interactions inter-organes impliqués dans le contrôle de l’homéostasie glucidique d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données phénotypiques (poids, prise alimentaire) et biologiques obtenues à partir du sang (glycémie), des tissus endocrines (stimulation de la sécrétion d’insuline) et intestinaux (tissus producteurs d’incrétine) ainsi que des organes impliqués dans la régulation de cette homéostasie glucidique (foie et muscle).
Réduction
Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, nous estimons que ce nombre est nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, un bâton à ronger et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront surveillés deux fois par semaine (surveillance visuelle) au moment de la mesure du poids et le prise alimenaire mesurée (par pesée de l’aliment) une fois par semaine. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de trois jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limite entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie . Au moment du test de tolérance oral au glucose (OGTT) et du test de tolérance à l'insuline (ITT), les animaux seront placés dans la salle d’expérimentation (differente de celle d’élevage) 1h avant le test afin de limiter le stress dû à un environnement nouveau.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal et ce travail fait suite à des travaux conduits depuis 2018 sur ce modèle. Nous avons choisi de travailler sur des animauxde 8-12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé et car nos données préliminaires ont été réalisées sur des animaux du même âge.
Création de lignées transgéniques murines pour des gènes impliqués dans l’infertilité humaine
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
960 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et 90 réutilisées, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Les femelles reçoivent des stimulations hormonales puis sont tuées pour prélever leurs ovocytes, les mâles subissent une vasectomie chirurgicale et les femelles pseudo-gestantes une réimplantation embryonnaire, pour créer des lignées reproduisant des mutations liées à l'infertilité humaine. Le porteur indique que la préhension, les chirurgies et la mise à mort génèrent du stress et que les lignées au phénotype dommageable seront euthanasiées. Il affirme qu'aucune culture in vitro ne permet d'obtenir des gamètes matures et conclut au recours à la souris.
Objectifs
L'infertilité touche 186 millions de personnes dans le monde (48 millions de couple) et représente donc un problème de santé majeur. Cette infertilité peut etre causée par une déficience au niveau des gamètes aussi bien chez l'homme que chez la femme. Trouver les gènes causals impliqués dans cette infertilité est donc une nécessité afin de pouvoir mieux comprendre leurs mécanismes d'action et proposer des thérapies. L'étude de cohortes de patient(e)s infertiles permet de pointer des gènes potentiellements impliqués. L'objectif de notre étude est donc de générer des animaux déficients pour ces gènes ou reproduisant les mutations identifées afin de valider les gènes candidats.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de générer des souris déficientes pour les gènes identifiés par séquencage exomique des cohortes de patient(e)s infertiles et donc de valider les gènes candidats. A court terme, les gènes pourront être utilisés comme facteurs diagnostiques. A plus long terme, selon le phénotype occassionné, une thérapie ciblée pourra être proposée au patient.
Procédures
Injection pour les stimulations hormonales (2 par souris femelles). Chirurgie sur les males pour la vasectomisation (30 minutes par souris, une chirurgie par souris). Chirurgie pour la réimplantation embryonnaire dans les femelles pseudo-gestantes (20 minutes par souris, 1 par souris).
Impact sur les animaux
Stress au moment de la préhension pour les injections et pour la mise à mort. Stress engendré par la chirurgie, meme si réalisée sous analgésie et anesthésie. Les males vasectomisés et les femelles réimplantées pourront perdre du poids et une inflammation pourra apparaitre au niveau de la plaie.
Devenir
La récupération des gamètes pour l'injection intra-cytoplasmiques de sperme nécessite la mise à mort des femelles. Après vasectomisation, les males sont utilisés pendant plusieurs mois. Suite à l'implantation embryonnaire, les souris pseudo-gestantes donnent naissance aux petits avant d'etre mises à mort ou gardés en vie pour allaitement ou test par les utilisateurs. Si des animaux présentent un phénotype dommageable, nous déciderons soit d'euthanasier la lignée.
Remplacement
L'étude de la fertilité nécessite l'utilisation d'animaux reproduisant les phénotypes observés chez l'homme. Il est donc compliqué de les remplacer. Il n'existe aucun système de culture in vitro permettant d'obtenir des gamètes matures et fécondables (femelle) ou fécondantes (male).
Réduction
Les gamètes femelles utilisées pour l'injection intra-cytoplasmique de spermatozoide sont récupérées suite à la stimulation hormonale des souris, ce qui permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, et donc de réduire le nombre de souris femelles. les males vasectomisés seront utilisés pour générer des femelles peudo-gestantes pendant 1 an.
Raffinement
Les souris seront placées en conditions de température régulée, nourriture et eau ad libitum. Les animaux seront maintenus le moins de temps possible afin d'injecter les hormones nécessaires à la stimulation ovarienne et aux injections d'analgésiant/anesthésiant. La mise à mort des animaux sera effectuée dans une pièce différente de celle de l'hébergement. La chirurgie des mâles est réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Les femelles ont leurs ovocytes prélevés après euthanasie. Suite à la chirurgie, en cas d'inflammation de la plaie, un traitement antibiotique sera mis en place.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour générer des animaux transgéniques. Les souris femelles seront utilisées dès 3 semaines pré-puberts et pas au delà de 12 semaines pour la récupération d'ovocytes. En effet, après 12 semaines, les souris répondent moins bien à la stimuation hormonale et le nombre d'ovocytes récoltés décroit. Les femelles pseudo-gestantes devront avoir eu une portée avant utilisation, donc entre 5 et 12 semaines. Les souris males seront vasectomisés à maturité sexuelle vers 9-10 semaines.