Oncologie

1 039 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie, des nouveau-nés placés avec leurs mères dans un caisson à 75 % d'oxygène, d'autres recevant un agent provoquant une hypertension ou une toxine bactérienne, subissent des injections de virus puis des tests d'apprentissage et de mémoire. Le projet fondamental étudie le rôle du gène Trim47 dans l'atteinte des petits vaisseaux du cerveau. Le porteur affirme que la physiologie complexe des vaisseaux ne peut être reproduite in vitro de façon satisfaisante.

Objectifs

Les récents progrès obtenus en imagerie par résonance magnétique (IRM) ont permis de mettre en évidence des images anormales au niveau du cerveau chez des patients atteints de maladies neurodégenératives : on parle de taches blanches ou de zones d’hyper-signal de la substance blanche. Ceci est le résultat de processus de démyélinisation ou de destruction de la myéline. Ces zones d’hyper-signal de la substance blanche sont associées à un risque accru de dysfonctionnement cognitif et moteur, de démence, de dépression et d’accident vasculaire cérébral. Le développement de ces lésions tissulaires seraient dues à une atteinte des petits vaisseaux cérébraux profonds. Malgré une héritabilité importante, peu de loci génétiques ont été identifiés. Une récente étude génétique a permis l’identification d’un nouveau gène de susceptibilité. Nous voulons dans ce projet fondamental comprendre le rôle de ce gène dans les pathologies neuro dégenératives en utilisant des modèles murins génétiques.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies neurodégenératives présentant des démences vasculaires augmente constamment avec le vieillissement de la population. Les études réalisées à partir de cohorte de patients atteints de troubles de démence ont permis d’identifier des marqueurs génétiques. Il est nécessaire maintenant de comprendre le rôle de ces gènes. La combinaison de modèles murins génétiques et de modèles pathologiques permet d’accroître cette connaissance. Identifier les mécanismes impliqués dans ces altérations du fonctionnement des petits vaisseaux cérébraux constitue aujourd'hui un véritable enjeu de santé publique pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Nous développerons plusieurs modèles pathologiques chez la souris afin de créer (1) un stress hypoxique (modèle d’hypoxie néonatales) (2) un stress d’hypertension systémique (3) stress inflammatoires du cerveau. Nous analyserons les conséquences sur les troubles de comportement, et l’apparition des marqueurs de dégénérescences neuronales et vasculaires. Le modèle d’hypoxie néonatales : Nombre d’animaux : 700. Des souriceaux nouveaux-nés 7 jours après leur naissance ainsi que leurs mères sont mis dans un caisson à 75 % d’oxygène. A P12, les souris retournent à une atmosphère normale avant d’être euthanasiées. Modèle d’hypertension artérielle systémique et trouble cognitif : Nombre d’animaux : 115. Les animaux auront : injection de virus en retroorbitaire sous anesthésie gaseuse, puis 2 semaines après, une implantation en sous cutanée de pompe diffusant un agent hypertenseur sous anesthésie gaseuse puis 3 semaines après ils seront analysés chaque jour pour l’apprentissage d’une tache pendant 5 jours. Une analyse de flux cérébral sera faite sous anesthésie avant euthanasie. Modèle de stress inflammatoires : Nombre d’animaux : 224. Les souris adultes (2 mois) auront : une injection de virus en retroorbitaire sous anesthésie gaseuse. Après 2 semaines, les souris seront inclues pour l’apprentissage d’une tache pendant 5 jours. Puis elles seront injectées avec une solution de toxine bactérienne à faible dose par voie intra péritonéale pendant 5 jours successifs. 6 heures après chaque injection elles seront soumises dans le test de mémoire. Elles seront euthanasiées à la fin du protocole soit pour une analyse histologique des tissus après une perfusion intracardiaque soit pour analyse moléculaire après dislocation. Un ensemble de souris suivront le meme protocole mais sous un régime supplémenté avec t-butylhydroquinone (tBHQ) (1% W/W) (agent anti oxydant) 2 semaines avant le protocole et maintenu pendant tout le protocole inflammatoire.

Impact sur les animaux

Le modèle d’hypoxie néonatale : Les altérations du comportement pourront apparaître entrainant un arrêt de l’expérience : 1/ Altération du comportement de la mère : ne se nourrit plus ; ne bouge plus ; délaisse et ne nourrit plus la portée ; les nouveaux nés sont dispersés dans la cage. 2/ Altération du comportement des nouveaux-nés : immobilité, arrêt de l’allaitement, exclusion du nid par la mère. Le stress inflammatoire : Les complications aigues pourront être l’apparition d’un syndrôme inflammatoire aigu. Cela entraine un arret de la mobilité de l’animal, une prostration, une altération de son apparence avec des poils ébouriffés et une diminution significative de la prise alimentaire. Modèle d’hypertension : les complications aigues pourront être des accidents cérébro vasculaires (l'animal montre des changements de mobilité, souvent déplacement en cercle) ou des infarctus cardiaques (animal reste prostré peu vigile).

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce protocole seront ensuite euthanasiés. Tous les animaux sont euthanasiés pour des prélèvements de sang et et de tissus pour des analyses post mortem.

Remplacement

Ce projet sera réalisé en utilisant des modèles murins qui reproduisent des lésions neuropathologiques avec atteintes des petits vaisseaux du cerveau décrites dans les maladies neurovasculaires, ainsi que les signes cliniques associés à ces maladies, comme les déficits d’apprentissage et de mémoire. L'intégrité vasculaire dépend d'interactions multiples entre différents types cellulaires. Il est encore très difficile d'appréhender in vitro les interactions entre le tissu environnant et les réseaux tridimentionnels des vaisseaux et les altérations du phénotype vasculaire sur la fonction d'un organe (notamment le cerveau). L'expérimentation in vivo en association avec l'utilisation de souris transgéniques délétées spécifiquement dans certain tissu (endothélium...) permet de différencier l'action spécifique de chaque type cellulaire dans le tissu et fournit des informations de mécanismes physiopathologiques impossible à obtenir in vitro. Pour réduire le nombre des animaux aucune expérience déjà publiée n'est reproduite et lorsque cela est possible les études conceptuelles sont réalisées in vitro sur des cellules en culture avant d'être testé in vivo. Cependant la physiologie des vaisseaux est complexe, met en jeu des interactions mutiples entre les composants de la paroi vasculaire et le sang qui ne peuvent pas être reproduites in vitro de façon satisfaisante.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à partir des expériences préliminaires qui ont permis d’identifier le nombre minimum d’animaux à utiliser par groupe pour permettre une analyse des résultats statistiquement significative. Pour réduire le nombre d'animaux, les animaux seront inclus dans plusieurs protocoles expérimentaux (tests de comportement, suivi des pressions systémiques et flux sanguin cérébral puis euthanasie pour analyse histologique

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions limitant au maximum le stress et la douleur. Ils sont élevés en groupe dans des cages ventilées maintenant une atmosphère saine. Des jouets de carton sont mis à disposition des animaux dans leur cage pour enrichir leur environnement, leur permettre de ronger et de se cacher. Les litières sont dépoussiérées et additionnés de cubes de coton leur permettant de construire des nids. Les opérations chirurgicales sont réalisées sur couverture chauffante, sous anesthésie gazeuse et en présence d’un antalgique. Après chirurgie nous plaçons dans la cage des souris des sachets de nourritures enrichie et hydratée. Les animaux sont surveillés par la visite quotidienne du zootechnicien. En cas de problème de santé des animaux, l'expérimentateur est immédiatement alerté. Il prendra la décision de la mise à mort en fonction de la grille "observation-Action" en annexe.

Choix des espèces

La souris a été choisie en raison de l'existence de souris transgéniques dont les gènes d'intérêt ont été mutés. C 'est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire à de forte ressemblance avec celui décrit chez l'homme. Les animaux seront utilisés au stade suivant : - Post natal : Le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR) est un modèle bien caractérisé qui récapitule les caractéristiques de la rétinopathie chez le prématuré. La souris est une espèce nidicole dont la rétine est immature à la naissance à terme. C’est donc un bon modèle pour le suivi de la maturation rétinienne depuis le début de l'exposition à des stress oxydatifs exogènes par des niveaux élevés d'oxygène (comme modèle de la rétinopathie du prématuré humain induite par l’oxygène). Le protocole consiste à introduire des souriceaux nouveaux-nés 7 jours après leur naissance (P7) dans un caisson où l’atmosphère est contrôlée à 75 % d’oxygène pendant 5 jours puis de les replacer en atmosphère à 21% d'oxygène. -Pour la mise en reproduction, tous les animaux seront utilisés au stade adulte soit plus de 8 semaines chez la souris. - toutes les autres expériences (stress inflammatoire, HTA) seront réalisées sur des animaux adultes (2 mois à 6 mois) car la maturation du système vasculaire au niveau du cerveau se fait dans les premier mois en post natal. Pour ne pas avoir de biais dans l’analyse des résultats, nous devons tester des animaux qui ont un réseau vasculaire mature.

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle pharmacologique d'épilepsie infantile, elles subissent une chirurgie de 45 minutes pour implanter des électrodes d'électroencéphalogramme, restent isolées en cage individuelle et donnent des prélèvements de sang. Le projet teste si le jeûne intermittent réduit les crises et permet de baisser les doses de médicaments antiépileptiques. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative aux animaux pour évaluer un modèle épileptique.

Objectifs

Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime riche en protéine et gras, et faible en sucres, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 1 modèle pharmacologique d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Ce modèle présente des crises dites "absence atypiques", retrouvées chez des pathologies infantiles graves telle que le syndrome de Dravet ou Lennox-Gastaut. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique, en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications qui accompagnent le régime IF.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.

Procédures

Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que deux prélèvements sanguins. L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement. Les animaux implantés avec des connecteurs pour enregistrement EEG courent le risque de se les arracher mutuellement. Ils sont donc isolés en cage individuelles pour la durée du protocole et seront surveillé deux fois par jour. Ils auront un enrichissement spécifique (sizzle, nid en carton, coton), ils seront en contact visuel et olfactif avec les congénères et seront manipulés régulièrement.

Impact sur les animaux

Le régime du jêune intermittent ou intermittent fasting (IF) a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que le modèle d'épilepsie que nous utilisons n'induit pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui induisent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant , dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.

Remplacement

Il n'existe d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.

Réduction

Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).

Raffinement

Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille de carton, igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques afin d'intervenir si besoin.

Choix des espèces

L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur le modèle d'épilepsie utilisé.

4 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections de tamoxifène pour inactiver un gène, des gavages répétés de vitamine D, et une partie est castrée, avec amputation d'une phalange pour l'identification. Le projet étudie le rôle de la vitamine D dans la progression des tumeurs de la prostate et la résistance à la chimiothérapie, les retombées pour les patients restant au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la formation des lésions précancéreuses et conclut que l'expérimentation in vivo est "nécessaire".

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent. Les traitements actuellement utilisé en clinique inhibent les voies de signalisation et/ou la production d'androgènes et sont couplés à la chimiothérapie (i.e. docetaxel). Ces traitements induisent des resistances, ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine de nombreux effets indésirables. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires impliqués dans la la progression des tumeurs et dans la resistance aux traitements est donc requise afin de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. La forme active de la vitamine D ((calcitriol, VitD) est une hormone qui joue un rôle clé dans la régulation de l’homéostasie calcique, et dont les effets sont relayés par son récepteur VDR. La vitD possède des activités anticancéreuses, et des données cliniques indiquent que des patients avec des tumeurs prostatiques et déficients en vitamine D ont une espérance de vie inférieure à ceux ayant des niveaux de vitamine D suffisants. De plus, nos récents résultats indiquent que la vitamine D permet de lever les résistances au Docetaxel, la chimiothérapie classiquement utilisé en clinique. Ces résultats indiquent que les voies de signalisation de la vitamine D jouent un rôle clé dans l'évolution de la pathologie et la résistance aux traitements, mais les mécanismes restent mal connus. En tirant profit du modèle murin récapitulant la pathologie humaine, les objectifs de ce projet sont: de générer et caractériser des souris ayant une inactivation de VDR dans les cellules épithéliales prostatiques et de déterminer l'effet de la vitamine D sur l'efficacité de chimiothérapies de type alcaloide.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de cartographier l’évolution des lésions précancéreuses et l’implication des voies de signalisation de la vitamine D dans cette évolution ainsi que de déterminer son rôle dans la résistance aux traitements actuels.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections intrapéritonéales du tamoxifène (15 sec par administration) réalisées au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance) afin d'inactiver le gène. Certains animaux seront gavés (15 administrations, 15 sec par administration) et d'autres recevront une administration intra-péritonéale supplémentaire (15 sec par administration) . Parmis ces lots, certaines souris seront castrées (5-10 min par souris) ou subiront la même anesthésie et incision, mais sans enlever les organes (5-10 min par souris) . Les souris qui seront utilisées pour les analyses de cytométries en flux seront traitées avec un marqueur permettant de déterminer la prolifération des cellules (2 injections intrapéritonéales , 15 sec par administration). Une prise de sang juste avant la mise à mort sera réalisée (15 sec par souris).

Impact sur les animaux

Les injections par voie intra-péritonéale pour inactiver les gènes ou administrer du docetaxel, et les administrations par gavage seront réalisées par des personnes agrémentées et aguerries et n'induiront aucune nuissance. L'orchidectomie est une opération rapide qui est bien maitrisée au laboratoire. Après l'inactivation des gènes, l'évolution des lésions prostatiques sera monitorées mais d'après nos expériences, aucun inconfort majeur n'a été observé.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Afin d’obtenir des résultats significatifs avec une bonne puissance, nous aurons besoin de 20 animaux par groupe. Le nombre d’animaux sera de 4960 souris maximum.

Raffinement

L'expertise du laboratoire dans l'étude de l'évolution des lésions précancéreuses prostatiques permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées (i.e. points critiques étroitement surveillés). Pour l'identification, le nombre d’amputations sera limité à une seule phalange par patte et ne compromettra pas la préhension fine del’animal. Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement. Après injection par voie intra-péritonéale en alternée, une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’injection pour éliminer tout risque d’infection (rougeur ou présence de pus au site d’injection). Si les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestes (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et mis à mort. En pré-opératoire, une analgésie en injection intrapéritonéale est faite avant l’anesthésie des souris. En post-opératoire, une analgésie est réalisée. Nous surveillerons les animaux par inspection et palpation abdominale, en cas de rougeur ou de voussure, une infection pourra être supposée et une surveillance rapprochée sera effectuée. Lors des gavages succesifs avec la vitamine D, de la nourriture en gel sera proposée pour éviter une diminution de l'alimentation suite à l'irritation de l'oeosophage.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin récapitule de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. Enfin, les activités de la vitamine D chez la souris sont similaires à celles chez l'homme. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de cancer de la prostate (CaP) afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris auront un fond génétique enrichi C57BL/6. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 17 mois après la naissance, la prostate n'étant mature qu'après puberté. Les injections de tamoxifène se feront sur des jeunes adultes à partir de 8 semaines après naissance.

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien de vitamine D pendant trois jours puis une charge calcique, subissent un jeûne pouvant atteindre 18 heures et un isolement en cage métabolique, avant une prise de sang terminale. Le porteur reconnaît que les gavages peuvent irriter l'œsophage et que le jeûne et l'isolement sont sources de stress. L'objectif est de "mettre en place" un test de charge calcique chez la souris, les animaux étant ensuite tués pour analyser les tissus.

Objectifs

L'homéostasie calcique est un réseau finement régulé impliquant de nombreux organes (i.e. glandes parathyroides, intestin, rein, os). Dans de nombreuses pathologies, dont beaucoup sont encore idiopathiques, les patients pédiatriques ou adultes présentent des hypercalcémies et des hypercalciuries. Ces patients partagent un tableau clinique similaire : des niveaux circulants de vitamine D élevés et ceux d'hormone parathyroidienne effondré. L'ensemble de ces résultats indiquent que bien que la cause ne soit pas toujours connue, les symptômes sont liés à une augmentation des niveaux de vitamine D. Le diagnostique ainsi que l'effet des traitements se basent principalement sur les dosages biochimiques urinaires et sanguins suite à une charge calcique. Le diagnostique ainsi que l'effet des traitements se basent principalement sur les dosages biochimiques urinaires et sanguins suite à une charge calcique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un protocole de charge calcique chez la souris sauvage pour déterminer les niveaux de calcium urinaire, et de déterminer les effets de bolus de vitamine D sur ce paramètre.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet se basent sur la mise au point d'un paramètre clinique pertinent pour déterminer les effets de mutations chez la souris et également l'effet de nouvelles options thérapeutiques. Les résultats obtenus permettront d'améliorer l'évaluation clinique des hyperabsorptions calciques et des hypercalciuries et d'ameliorer le diagnostique et la prise en charge clinique des patients.

Procédures

1 administration par jour de vitamine D par gavage (15 sec par administration) pendant 3 jours, puis une administration unique par gavage de solution calcique, et une prise de sang terminale (30 sec). Une mise à jeun de 18H maximum et une mise en cage métabolique pendant 4H.

Impact sur les animaux

D'après nos travaux précédents, le régime de vitamine D administré n'induit pas de nuisances ni de souffrance aux animaux. L'expérience de charge calcique est classiquement réalisée chez les jeunes enfants chez l'humain, et aucun effet indésirable n'a été rapporté. Les gavages réalisés peuvent induire une irritation de l'oesophage et l'isolement dans les cages métaboliques ainsi que le jeun peuvent entrainer un stress.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour étudier les effets sur les tissus.

Remplacement

L'homéostasie phospho-calcique implique un réseau finement régulé impliquant les glandes parathyroides, l'intestin, les reins et les os. Aucune méthode alternative n'est disponible en raison de la compléxicité de ce réseau qui ne permet pas d'étudier les conséquences d'une dysfonction dans des systèmes cellulaires. La souris est un organisme modèle pour l'étude de l'homéostasie calcique, les paramètres biochimiques sanguins et urinaires étant similaires à ceux chez l'Homme.

Réduction

L'expertise du laboratoire dans le phénotypage des souris a permis de déterminer que 12 animaux est le nombre d'animaux optimal afin d'obtenir des résultats avec une puissance statistique supérieure à 80%.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupe afin de préserver les interactions sociales, dans des cages agrémentées avec un nid. Si une souris présente des difficultés pour se nourrir suite à une irritation de l'oesophage induite par les gavages, de la nourriture en gelée sera placée dans le fond de la cage. Les autres points limites sont un pelage terne ou hérissé, un ecoulement lacrymal, l'immobilité, ou une baisse de la température corporelle. Dans ce cas, des mesures appropriées seront prises en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

L'homéostasie calcique est finement régulée par de nombreuses hormones dont la vitamine D. De nombreuses études réalisées chez la souris ont mis en évidence les mécanismes fins régulant les niveaux de calcium sériques et urinaires, et leurs similitudes avec ceux chez l'Homme. Le diagnostique de ce type de pathologie peut se faire soit chez l'enfant ou chez le jeune adulte. Ainsi la moitié des animaux sera utilisé à l'age de 5-6 semaines, l'équivalent du jeune enfant, et entre 12-15 semaines l'équivalent du jeune adulte.

1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire des épilepsies-absence, elles subissent la pose chirurgicale d'un implant crânien d'enregistrement (EEG) de 45 minutes et des prélèvements sanguins, pour tester si un jeûne intermittent réduit les crises. Le porteur indique que ces crises ne sont ni douloureuses ni convulsives et classe la procédure en modéré à cause de la chirurgie et des prélèvements. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal pour évaluer un modèle épileptique.

Objectifs

Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime cétogène riche en protéines et gras, et faible en carbohydrates, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 2 modèles d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique (ex. ethosuximide, valproate), en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications métaboliques, physiologiques et transcriptomiques qui accompagnent le régime IF.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.

Procédures

Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que des prélèvements sanguins à un mois minimum d'interval (voir chronogramme en annexe). L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement.

Impact sur les animaux

Le régime IF a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que les modèles d'épilepsie que nous utilisons n'induisent pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui provoquent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant EEG, dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.

Remplacement

Il n'existe pas d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.

Réduction

Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).

Raffinement

Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.

Choix des espèces

L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Nous utilisons les animaux à partir de 6 semaines car c'est l'âge à laquelle les crises d'absence commencent à se manifester. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur nos modèles génétiquement modifiés.

1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des vecteurs viraux ciblant le tissu adipeux, par injection intrapéritonéale ou par chirurgie, certaines étant rendues lipodystrophiques par le tamoxifène ou obèses par un régime gras, puis subissent échographies, mesures de glycémie et tests de tolérance mensuels. Le porteur indique que la chirurgie comporte un risque d'infection et que les prélèvements répétés à la queue causent une douleur légère. Il affirme qu'une validation in vivo est "indispensable" pour observer les réponses physiologiques intégrées, les cibles ayant été identifiées en culture cellulaire.

Objectifs

L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que des altérations de la fonction du tissu gras dit tissus adipeux jouent un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. En effet, chez l'obèse, le tissus adipeux a dépassé sa capacité de stocker du gras, et ce gras va aller se déposer dans différents organes comme le coeur et le foie. Le tissu gras est composé de cellules spécialisées appelées les adipocytes. Notre équipe cherche à décrire les mécanismes qui font qu'un adipocyte en bonne santé devient malade. Au cours de ces 10 dernières années, nous avons identifié plusieurs cibles moléculaires impliquées dans la bonne santé des adipocytes. Afin de moduler l’expression de ces cibles dans le tissu adipeux (TA) nous collaborons avec une équipe américaine qui a développé des vecteurs viraux spécifiques du tissu adipeux.

Bénéfices attendus

Le premier but de ce projet est de tester si les vecteurs viraux spécifiques du TA sont des bons moyens pour exprimer des protéines d’intérêt dans le TA dans une visée thérapeutique. D'autre part, plusieurs travaux s'intéresse à des structures qui se trouve dans les adipocytes et qui participe à la comunication intra cellules. Ces structures sont des points de contact entre deux organelles cellulaires majeurs, les mitochondries et le réticulum endoplasmique. Ces structures sont appellées les MAM. Nous émettons l'hypothése que ces structures sont noeuds de comunications importants qui contôlent l'état de santé des adipocytes. Ainsi, le deuxième but est de savoir si la modulation des MAM peut être une cible thérapeutique contre les dysfonction métaboliques associées à l’obésité.

Procédures

La lipodystrophie partielle est induite par 5 jours d’injection intrapéritonéale d'un agent pharmaceutique, le tamoxiféne. Pour les souris HFD nous commençons à nourrir des C57bl6 avec un régime gras à l’âge de 8 semaines. Nous nourrissons les souris pendant 1 mois puis nous démarrons les interventions génétiques. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, 100 µl d’une solution d’AAV sera injectée en intrapéritonéal. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, l’injection se fait directement dans le dépôt par une chirurgie. Cette procédure a lieu1 fois pendant et dure 20 minutes Les analyses d’échographie se font sous anesthésie 1 fois par mois pendant 20 minutes La mesure de glycémie requiert 3 microlitres de sang par mois. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. L'administration du glucose se fait par voie orale (gavage), celle de l'insuline par injection intra-péritonéale.

Impact sur les animaux

Pour l'induction de la lipodystrophie partielle, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour les souris HDFD, le régime gras entraîne une prise de poids mais n’a pas d’effet néfaste sur le bien être des souris. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, la chirurgie comporte un risque du fait des infections possibles. Pour les test de tolérance, les prélèvements multiples à la queue entraine une douleur légère. L'administration du glucose par gavage oral qui entrainne un léger stress sur les souris.

Devenir

Les animaux sont mis à mort afin de prélever les tissus sur lesquels les analyses moléculaires seront réalisés. Ces analyses sont l'objectif premier du projet et nous permettrons d'établir le rôle physiopathologique des acteurs étudiés.

Remplacement

Le but de notre projet est de valider l’importance de certains acteurs protéiques dans le maintien de la bonne santé du tissu adipeux et de la bonne santé métabolique de l’animal au niveau systémique. Ces cibles ont été identifiées in vitro et ce travail est parallèle à des études cellulaires complémentaires. Cependant, une validation in vivo est indispensable, notamment pour l’étude des conséquences de la modulation de l’état du tissu adipeux sur la santé cardiométabolique. Les cibles testées ici ont toutes étaient identifier par des expériences réalisées sur des lignées de cellules. La solidité de l’hypothèse du rôle des MAMs dans le tissu adipeux est actuellement tester dans des lignées cellulaires. Les expériences proposées ici interviennent à un moment ou le rationnel est solide et ou nos expériences chez l’animal sont indispensables pour observer l’effet de nos interventions dans les adipocytes matures et les réponses physiologiques intégrées.

Réduction

Le projet préconise l’utilisation d’un nombre total de 1120 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utiliserons des tests non paramétriques de Mann and whitney pour tester la valeur statistique de nos données.

Raffinement

Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate. De plus, nos interventions chirurgicales se feront avec des anesthésiques, des analgésiques et en condition de stérilité. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, qui réduise la douleur. Nous utilisons des sondes de gavages en polypropylène qui réduise la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en terme de points limites gradés et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne (week-end) compris permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.

Choix des espèces

Les 3 modèles murins utilisés sont bien maîtrisés au laboratoire et ont été largement étudiés. Notamment, ces modèles permettent d’étudier les conséquences de la dysfonction adipocytaires sur d’autres paramètres généraux de santé comme la sensibilité à l’insuline et la fonction cardiaque. Un modèle animal intégré est le seul moyen de tester ces éléments. Pour les BSCL2K0, nous utiliserons des souris de 8 semaines, âge auquel elles sont déjà sévèrement lipodystrophiques. Pour les iATSKO, nous utiliserons des souris de 8 semaines lors de l’induction de la délétion par le tamoxifène en accord avec nos résultats précédents. Pour les souris HFD, des souris sauvages seront mises sous régime gras à l’âge de 8 semaines.