Oncologie

1 664 souris génétiquement modifiées, privées d'un à trois facteurs dans le foie, vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est nourrie quinze semaines avec un régime hypercalorique jusqu'à développer diabète et accumulation de graisse dans le foie, l'autre suivie un an avec des tests de glycémie répétés. Toutes sont tuées pour prélever sang et organes. Le projet étudie la coopération entre facteurs de transcription du métabolisme, présentés comme des cibles thérapeutiques contre les maladies liées à l'obésité.

Objectifs

L’obésité est en constante augmentation et représente un facteur de risque majeur pour le diabète de type 2 et d’autres maladies telles que la stéatose hépatique métabolique. Le foie est un organe majeur pour la régulation de l’homéostasie énergétique et contrôle de nombreuses fonctions métaboliques et des réponses inflammatoires. De nombreuses fonctions hépatiques sont assurées par des facteurs de transcription qui coopèrent pour réguler l’expression de gènes. La dérégulation de ces processus est l’un des mécanismes observés lors du diabète de type 2 et de la stéatose. Dans ce projet, nous souhaitons étudier les rôles respectifs et les coopérations potentielles entre plusieurs facteurs de transcription dans la régulation du métabolisme en condition physiologique et dans l’obésité induite par l’alimentation. Nous disposons au laboratoire de souris spécifiquement délétées pour un ou plusieurs facteurs de transcription dans les hépatocytes. Ces animaux, hébergés pour certains d'entre eux à thermoneutralité, seront soit nourris avec un régime standard et suivis au cours du temps, soit nourris avec un régime hypercalorique pendant 15 semaines. Les effets seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer les rôles spécifiques ainsi que les potentielles interactions ou redondances entre différents facteurs de transcription impliqués dans la régulation du métabolisme hépatique, en condition physiologique et physiopathologique.Les facteurs de transcription étudiés sont des cibles thérapeutiques de choix pour le traitement des maladies métaboliques associées à l’obésité et il existe actuellement un intérêt croissant pour le développement de molécules ciblant simultanément plusieurs de ces facteurs. Les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.

Procédures

Des groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard et suivis pendant 1 an (512 animaux). D’autres groupes, hébergés à thermoneutralité, seront nourris à volonté avec un régime standard ou hypercalorique pendant 15 semaines (1152 animaux). -pesées hebdomadaires - 6 mesures de la glycémie (tous les 2 mois sur 1 année) pour 512 animaux à partir d’une goutte de sang . La mesure ne nécessite pas de contention et prend moins de 5 secondes. - 2 mesures de la glycémie pour 1152 animaux - 3 tests de tolérance au glucose et 3 tests de tolérance à l’insuline sur une année pour 512 animaux, consistant en 6h de jeûne, suivi d'une mesure de la glycémie (temps 0) puis administration orale de glucose ou injection d'insuline prenant moins de 30 secondes, puis de mesures de la glycémie toutes les 15 min pendant 2 h (6 prélèvements de moins de 5 secondes). - 1 test de tolérance au glucose et 1 test de tolérance à l’insuline sur 1152 animaux - un dernier prélèvement sanguin avant la fin de l’étude pour tous les animaux

Impact sur les animaux

Les animaux nourris avec le régime hypercalorique vont progressivement prendre du poids associé à des perturbations métaboliques progressives telles que le développement d’un diabète (hyperglycémie, intolérance au glucose, résistance à l’insuline) et d’une stéatose (accumulation de lipides dans le foie). Ces altérations s’installent de manière progressive sur plusieurs semaines et correspondent à une nuisance d’intensité modérée, sans altération brutale de l’état général des animaux. La piqûre pour obtenir la goutte de sang peut entraîner une douleur ponctuelle de faible intensité (quelques secondes), sans effet persistant. Le dernier prélèvement de sang peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et une brève douleur d’intensité très modérée. L'administration de glucose ou d'insuline peut également entraîner un stress de quelques minutes lié essentiellement à la contention. Lorsqu'il est réalisé par du personnel expérimenté, ce geste n'entraîne pas de douleur significative ni de complication.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Des méthodes alternatives utilisant des cellules de foie par exemple pourraientt être envisagées. Néanmoins, le métabolisme énergétique est un processus complexe qui met en jeu des interactions entre plusieurs organes (foie, tissu adipeux, intestin, muscle, cerveau) qui sont difficiles à reproduire avec des cellules en culture. L’utilisation d'un organisme vivant, dans lequel tous les organes fonctionnent ensemble, est donc nécessaire. De plus, l’utilisation de souris transgéniques rend possible la délétion d’une protéine d’intérêt dans un organe spécifique pour étudier son rôle et il est possible d’induire une obésité chez la souris grâce à un régime hypercalorique.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). L’hébergement à thermo-neutralité permet de limiter le stress dû au froid. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons les consommations alimentaire et hydrique. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Les modèles utilisés dans ce projet (délétés pour 1, 2 ou 3 protéines dans le foie) existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

Exposées au froid à 5 degrés, soumises à des mesures répétées de température rectale et à un régime gras pendant seize semaines, 736 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines passent 48 heures isolées en cage métabolique, d'autres reçoivent des injections quotidiennes puis un prélèvement de sang juste avant la mise à mort. Toutes sont tuées pour prélever organes et sang. L'objectif est de savoir si une protéine des cellules graisseuses contrôle la combustion des graisses, piste avancée contre l'obésité.

Objectifs

Il existe dans notre organisme deux grands types de cellules graisseuses appelées adipocytes : les adipocytes blancs qui stockent les graisses que nous mangeons et les adipocytes bruns et beiges qui brulent ces graisses. L'activation de ces adipocytes bruleurs de graisse contribue au maintien de la température corporelle lors d'une exposition au froid et permet de dissiper l'excédent calorique après un repas. Ainsi favoriser la fonction de ces adipocytes bruleurs de graisse diminuerait la prise de poids. Nous avons récemment découvert que ces adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse expriment en grande quantité d'un canal ionique donc l’activation est contrôlée par des forces mécaniques qui s'excersent sur les cellules. Elle fait partie de la famille des protéines dites mécano-sensible. L'objectif de ce projet est de déterminer si cette protéine mécano-sensible contrôle la capacité des adipocytes bruns et beiges à bruler des graisses lors de l'exposition au froid et après la prise d'un repas et si elle joue un rôle dans ces adipocytes pour moduler le développement de l’obésité induite par un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

L'ensemble des expériences décrites dans ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de cette protéine mécano-sensible dans les mécanismes d'activation des adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse et ainsi pourrait permettre de proposer cette protéine comme une future cible pour des médicaments visant à augmenter la fonction et/ou le nombre de ces adipocytes bruleurs de graisse. Cela permettra de favoriser la dépense énergétique et de réduire la masse grasse et ainsi lutter contre l’obésité et ses complications métaboliques comme le diabète de type 2 ou les maladies cardiovasculaires.

Procédures

Les souris (48) seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines. La masse maigre et la masse grasse sera mesurée sur des souris vigiles (96) par un appareil à raisonnance magnetique nucléaire (RMN) qui est une procédure non invasive un peu comme un scanner, la mesure dure 2 min/souris. Pour les mesures en cage métabolique, les souris (96) seront en hébergement individuel pendant 48 h. Des souris vigiles (96) seront soumises à 3 tests d’explorations métaboliques nécessitant une injection intrapéritonéale par test. Pour ces 3 tests, ces souris seront soumises à 7 prélèvements d’une goutte sang d'environ 1µl (soit environ 7µL de sang prélevé par test) pour mesurer la glycémie. Le prélevement nécessitera de faire une petite incision sur la queue de la souris au début du test. Les tests seront espacés de 2 semaines. Des souris vigiles recevront une injection intrapéritonéale pendant 7 jours d'un composé activant le tissu adipeux brun (144 souris) ou de NaCl en contrôle (144 souris). A la fin de certaines procédures, des souris (448) seront immédiatement mise à mort après un prélevement d'un volume de sang d'environ 200 µl à la veine temporale. Pour les experiences à thermoneutralité, des souris (144 souris) seront hébergées à 30 °C pendant 5 semaines maximimum. Des souris seront hébérgées à 5°C pendant 6h (192 souris) ou 10 jours (80 souris) et seront pour ces durées soit en hébergement individuel (5°C 6h) soit 2 dans la cage (5 °C 10 jours) afin d’éviter ou de limiter le comportement de thermorégulation sociale qui consiste au regroupement d’animaux les uns contre les autres afin de se réchauffer, comportement qui pourrait fausser les résultats de la mesure de la variation de température corporelle par mesure de la température rectale. Une mesure de la température rectale sera faite sur des souris vigiles (352 souris) comme dans l'espèce humaine à l'aide d'un thermomètre dont la sonde à un diamètre adapté à la souris pour une insertion sans trop d'inconfort dans son anus. 7 mesures espacées d'1h seront faites sur les souris hébérgées à 5°C pendant 6h et 1 mesure par jour sera faite sur les souris hébérgées à 5°C pendant 10 jours. 2 mesures espacées de 10 j seront faites sur des souris hébergées à 21 C °(80 souris).

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales sur animaux vigile entrainent une douleur légère et de courte durée. Le prélevement d'une goutte de sang lors des tests d'exploration métabolique necessite de faire une petite incision à la queue au debut du test qui peut engendrer une légère douleur de courte durée. Le prélevement de sang à la veine temporale immédiatement avant la mise à mort entraine une douleur de courte durée car une piqure avec une aiguille de 20-23G est réalisée pour provoquer le saignement. La mesure de la masse grasse/maigre nécessite une contention de l’animal d’environ 2 minutes, pouvant induire un stress modéré et transitoire. La mesure de la dépense energétique en cage métabolique nécessite que les souris soient en hébergement individuel pouvant induire un stress modéré qui sera atténué par une periode d'adaptation. Lors de l'exposition au froid la mesure de la température rectale s’effectue à l’aide d’une sonde de petit diamètre mais son insertion dans l'anus de la souris vigile peut être inconfortable pour l’animal et donc susceptible de générer un stress supplémentaire en plus de celui lié à la contention. L'exposition au froid dans les conditions que nous utiliserons induit un stress modéré et une baisse d'environ 2 °C de la température corporelle mais sans entrainer d'hypothermie sevère car les souris comme tous les animaux à sang chaud (homéothermes) sont capables de mettre en jeux différents processus pour maitenir leur température corporelle interne stable, dans certaines limites, indépendamment de la température extérieure. Nous surveillerons cependant ces souris pour détecter tous signes d'hypothermie sévère comme une perte du réflexe de redressement, une prostration ou une léthargie et une température réctale inférieure à 32°C.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer des organes et du sang pour différentes analyses moléculaires

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement nous avons fait des études sur des cellules d'adipocytaires brunes et nous avons ainsi montré que Piezo1 est fortement exprimé dans ces adipocytes et nos expériences cellulaires suggèrent que Piezo1 contrôle la capacité des adipocytes thermogéniques à bruler des calories et pourrait donc impacter la prise de poids. Les mécanismes du developpement d'une prise de poids excessive lors de l’obésité sont complexes faisant intervenir un dialogue entre plusieurs organes. Il n’est pas possible pour l’instant d’utiliser des systèmes cellulaires reproduisant cette complexité biologique. Il nous est donc nécessaire maintenant d’étudier le rôle de cette proteine mécano-sensible Piezo1 dans les adipocytes bruns et beiges au sein d’un organisme entier car aucune méthode alternative n’existe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer des animaux en excès. Les protocoles utilisés sont bien maitrisés par les participants au projet . Cette expertise permet de définir pour chaque procédure un nombre d’animaux minimum pour obtenir des résultats reproductibles et fiables. Nous avons utilisé un logiciel dédié pour calculer le nombre d'animaux minimum nécessaire permettant d'avoir un effet statistiquement signficatif en utilisant des données préliminaires qui permettent de prendre en compte la variabilité de l'effet étudié.

Raffinement

Nous avons généré des souris avec une invalidation de la protéine étudiée restreinte au adipocytes bruns et beiges pour limiter le risque d'apparition d'un phénotype dommageable. L'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un maximum de 4-5 souris/cage sur des portoirs ventilés. L’isolement de souris sera évité hormis pour un temps limité pour les études en cage métabolique et pour l'exposition au froid. L'environnement est amélioré pour minimiser le stress (igloo, tige de coton, L'observation quotidienne des animaux permettra d'identifier rapidement des souris souffrantes et de prendre les mesures correctives nécessaires en fonction des points limites définis adaptés à chaque procédure. Une grille d'observation avec conduite à tenir a été mise en place afin de prendre les mesures appropriées. Nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux pour les différentes procédures mais dans l’éventualité d’apparitions de points limites définis, les mesures retenues seront mises en oeuvre (isolement de l'animale pour soins si blessure pas trop grave avec application de solutions antiseptiques, mise à mort si blessure importante ou signes de souffrance ou hypothermie ou perte de poids sévère).

Choix des espèces

L'utilisation de souris se justifie par le fait que cette espèce a beaucoup d'adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse qui contribuent à la dépense énergétique et à la capacité d'adaptation au froid. Les souris sont donc un modèle de choix pour identifier de nouvelles protéines régulant la fonction de ces adipocytes et la dépense énergétique. Cette espèce est aussi très utilisée dans les études sur le développement de l'obésité et de ses complications métaboliques car lorsque des souris adultes mais relativement jeunes (age 7-8 semaines) sont nourries avec un régime riche en lipide, elles deviennent rapidement obèses. Ce temps relativement court par rapport à d'autres espèces permet d'étudier facilement l'impact de modifications génétiques ou de composés pharmacologiques sur l'obésité. L'obésité des souris est assez proche de celle de l'homme permettant de tirer des informations pertinentes pour l'obésité humaine. Enfin, la souris est l'espèce de mammifère de choix pour réaliser des modifications génétiques (surexpression ou invalidation d'une protéine, globale ou ciblée dans un tissu). Les animaux seront étudiés au stade adulte (âge 12-23 semaines selon les procédures).

Après une à deux craniotomies de deux heures, 440 souris subissent des auto-microstimulations du circuit de la récompense pendant trois semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet étudie comment le cerveau apprend à rechercher des récompenses et adapte ses décisions. Les chirurgies peuvent provoquer douleurs et infections aux sutures, la stimulation des troubles locomoteurs. Le porteur annonce des tests comportementaux sur trois semaines sans préciser lesquels, et les cerveaux sont prélevés après mise à mort.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre comment le cerveau apprend à rechercher des récompenses et à adapter ses décisions en fonction de l’expérience. Il s’intéresse à la manière dont les régions impliquées dans la motivation et la réflexion travaillent ensemble pour guider nos comportements. En étudiant ces interactions, ce travail vise à mieux comprendre comment nous planifions nos actions, changeons de stratégie et nous adaptons aux situations nouvelles.

Bénéfices attendus

Ce projet nous apportera des informations concernant le rôle des structures cibles du système de la récompense dans les comportements de prise de décision et d’apprentissage d’association.

Procédures

Les souris seront soumises à un maximum de 2 opérations chirurgicales sous anesthésie (de durée de 2h maximum chacune). Le temps de récupération entre 2 chirurgies sera de 4 semaines (220 souris seront soumises à 1 opération et un maximum de 220 souris seront soumises à 2 opérations). Les animaux passeront ensuite des tests comportementaux pendant 3 semaines environ, (10 minutes par jour pour chaque animal) où ils recevront des auto-microstimulations du circuit de la récompense (au maximum 440 animaux seront donc étudiés). Des enregistrements in vivo pourront aussi être mis en place pour étudier l'activité des neurones pendant le comportement. Enfin, une modulation de leur activité neuronale pourra être effectuée pendant le test comportemental.

Impact sur les animaux

Les animaux qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures (modérée, quelques jours). Certaines infections au niveau des sutures pourraient éventuellement survenir (moderée, quelques jours). Certains effets indésirables liés à la microstimulation électrique ou modulation des neurones peuvent survenir et troubler l'activité locomotrice (modérée, pendnat quelques minutes).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issue de toutes les procédures pour permettre le prélèvement des cerveaux à des fins d’études histologiques.

Remplacement

Notre projet vise à étudier la complexité́ du comportement de la souris. Le découplage et la corrélation entre comportement et neurophysiologie est aussi une composante majeure de ce projet. Cette étude n’est donc réalisable que sur des animaux vigiles.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec les tests statistiques adaptés. Les procédures ont été conçues pour qu'une même souris puisse participer à un maximum d'expériences, limitant ainsi le recours à de nouveaux animaux pour chaque expérimentation.

Raffinement

Ces protocoles sont conçus pour minimiser l’inconfort et garantir le bien-être des animaux tout en assurant des conditions optimales pour l’étude scientifique. Les animaux sont régulièrement manipulés pour réduire leur anxiété lors des tests de comportements. Enfin, afin de définir des points limites précoces permettant la mise en œuvre rapide de mesures adaptées en cas de douleur ou de mal-être, une grille de suivi graduée sera utilisée.

Choix des espèces

Le système dopaminergique mesocorticolimbique des rongeurs est relativement bien conservé par rapport à l’Homme, anatomiquement et fonctionnellement. Ce n’est pas le cas chez les invertébrés, poissons et oiseaux. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d’autres modèles. Des modèles de mammifères (rat, singe) ne se justifient pas non plus car les outils génétiques nécessaires pour disséquer les mécanismes sous-jacents n’existent pas chez ces espèces. Les modèles rongeurs sont donc des modèles de choix pour l’étude du comportement et de ses bases physiologiques, et présentent des mécanismes cognitifs complexes et une grande rapidité d’adaptation. Les animaux utilisés seront à l'âge jeune adulte. En effet, la procédure de stéréotaxie nécessite d’utiliser des animaux dont la croissance du crâne est stabilisée, et le stade adulte permet l'analyse de régions neuronales mâtures.

Dépourvues de système immunitaire et irradiées, 2 580 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. On leur injecte des cellules d'une leucémie humaine de mauvais pronostic, puis on suit la maladie par prélèvements de sang et de moelle osseuse, jusqu'à quinze fois. Le développement de la leucémie provoque fatigue, douleurs et baisse de mobilité. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit l'auto-renouvellement des cellules souches leucémiques, qui exige des greffes en série chez l'animal.

Objectifs

Les hémopathies à cellules dendritiques plasmocytoïdes (pDC) sont divisées en deux principales entités : la leucémie à pDC (LpDC) et les leucémies aiguës myéloïdes avec excès de pDC (LAM-pDC). La LpDC est une maladie de mauvais pronostic : seulement 17 % des patients, tout traitement confondu, sont encore en vie après 5 ans et des rechutes sont observées dans 75 % des cas. Les LAM-pDC semblent être associées à un pronostic plus défavorable que les LAM sans excès de pDC, avec des taux de survie globale et sans rechute plus faibles décrits dans la littérature. En hématologie, de façon générale, il est décrit l’existence de cellules initiatrices de la leucémie (aussi appelées cellules souches leucémiques) qui sont capables de générer la maladie in vivo dans des modèles de souris dépourvues de système immunitaire. La présence de ces cellules est associée à un pronostic péjoratif chez les patients, avec des rechutes et une résistance au traitement plus fréquentes lorsqu’elles sont retrouvées en excès. A ce jour, les cellules souches leucémiques ne sont pas décrites dans ces deux hémopathies. Les objectifs du projet sont donc d’étudier les capacités de génération de la leucémie de différentes fractions cellulaires d’intérêt contenues dans des échantillons de LpDC ou de LAM-pDC. Le but de ces expérimentations est de mettre en évidence une population initiatrice de la leucémie afin de la caractériser pour pouvoir la cibler sur le plan biologique et thérapeutique chez les patients atteints de ces leucémies. Dans une deuxième partie du projet, les modèles mis en place par la sélection de populations cellulaires particulières permettront d’évaluer l’efficacité chez les animaux de thérapies mises en place et déjà évaluées en culture cellulaire par l’équipe, ainsi que d’autres thérapies déjà disponibles sur le marché, afin d’ouvrir de nouvelles perspectives dans le traitement de ces hémopathies.

Bénéfices attendus

Plusieurs bénéfices sont attendus à la suite de ce projet : - La mise en évidence de nouvelles populations cellulaires à l’origine du développement des hémopathies à pDC dans un but de les mettre en évidence sur le plan biologique au diagnostic et, éventuellement, à la rechute - La mise en évidence de nouvelles voies biologiques et/ou biomarqueurs permettant de proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques ou le développement de nouveaux médicaments - La compréhension des mécanismes biologiques sous-tendant la résistance aux traitements et la rechute chez les patients atteints d’hémopathies à pDC La validation de l’efficacité et l’évaluation de la toxicité de nouvelles approches thérapeutiques développées dans l’équipe avant d’envisager un passage chez l’être humain

Procédures

Les animaux seront irradiés le jour précédant l’injection des cellules leucémiques (1 fois, moins de 5 minutes). L’injection des cellules leucémiques sera réalisée en intra-veineux (1 fois, environ 1 minute par animal). L’injection de thérapies à évaluer sera réalisée en intra-veineux (1 fois, environ 1 minute). Le suivi de l’apparition de la leucémie sera réalisé par prélèvement de sang veineux périphérique au niveau de la veine faciale après anesthésie gazeuse (animal endormi, moins d’1 minute, 1 fois par mois et de façon plus rapprochée en cas de signes cliniques ou de suivi du taux de cellules leucémiques, en respectant un délai d’une semaine entre deux prélèvements, sans que cela dépasse 15 prélèvements durant le temps de suivi de l’animal). Le cas échéant, le suivi pourra être réalisé par prélèvement médullaire après anesthésie gazeuse et analgésie (animal endormi, environ 5 minutes, 1 fois dans la vie de l’animal au maximum, en cas de signes cliniques et en l’absence de détection dans le sang périphérique de la leucémie). Pour les animaux ayant reçu une lignée cellulaire dont le suivi peut être réalisé par imagerie, une injection de produit de traçage sera réalisée après analgésie (moins d’1 minute, au maximum 1 fois par semaine) suivi par une anesthésie gazeuse pour le placement dans l’appareil d’imagerie (animal endormi, environ 5 minutes, au maximum 1 fois par semaine).

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés n'ont pas de système immunitaire ce qui entraîne un risque accru d’infections s’ils sont exposés à un environnement non contrôlé. Les animaux issus d’élevage en dehors de notre établissement utilisateur subiront une période de stress en lien avec le changement de lieu d’hébergement. L’injection des cellules leucémiques chez les animaux entraînera l’apparition des maladies chez ceux-ci. Le développement des leucémies pourra provoquer un inconfort chez la souris, avec une diminution de la mobilité, une fatigue ou des douleurs. L’injection de ces mêmes cellules ou des thérapies à évaluer, par voie intra-veineuse, pourra être à l’origine d’une douleur au point d’injection ou d’un saignement bref. Les pesées régulières et les manipulations associées pourront également entraîner un stress modéré mais de courte durée. Les prélèvements veineux sanguins périphériques, réalisés au niveau mandibulaire, seront à l’origine d’une douleur modérée et éventuellement d’un hématome. De la même manière, les prélèvements de moelle osseuse réalisés au niveau de l’os fémoral pourront être à l’origine d’une douleur et d’un inconfort en lien avec un hématome pouvant gêner la locomotion de façon brève et résolutive. L’injection du produit de traçage qui sera réalisée chez les animaux suivis par imagerie pourra provoquer une douleur ou un inconfort dans les suites de l’injection.

Devenir

Pour les deux procédures, les réponses aux objectifs scientifiques doivent être apportées par le prélèvement et l'étude des organes (moelle osseuse et rate en particulier). Les animaux seront donc mis à mort sans possibilité d’intégrer un autre projet.

Remplacement

La partie du projet évaluant les capacités d’initiation de la leucémie de différentes populations cellulaires nécessite l’utilisation d’animaux pour valider fonctionnellement cette capacité, en particulier la souris. Il n’existe à l’heure actuelle aucun autre modèle animal validé et utilisable dans les leucémies permettant d’évaluer de façon précise ces propriétés. De plus, il n’existe pas de modèles robustes utilisables en culture cellulaire (in vitro) permettant de reproduire ce qui est observé chez la souris de façon fiable avec ce type d’hémopathies (survie faible des cellules leucémiques, absence de modèles en trois dimensions ou autres disponibles pour reproduire de façon fiable l’environnement leucémique). Les capacités d’auto-renouvèlement des cellules souches devant être mises en évidence par des greffes en série, il n’est, là non plus, pas possible de se passer de l’utilisation d’animaux. Concernant la partie évaluant l’efficacité de thérapies anti-leucémiques, des expériences in vitro avec des résultats encourageants ont déjà été réalisées mais ces modèles ne permettent pas, à l’heure actuelle, d’évaluer l’ensemble des paramètres que l’on retrouve dans les modèles animaux. Ainsi, des modèles animaux sont nécessaires afin de se rapprocher au mieux des conditions que l’on retrouve chez l’être humain et d'espérer un emploi des thérapies à évaluer pour traiter les patients.

Réduction

Pour chaque expérimentation nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaires pour observer un effet significatif sur le plan statistique sans avoir recours à des animaux en excès. Pour calculer le nombre d’animaux par lot, nous nous basons sur des résultats d’expériences que nous avons réalisées précédemment sur ces modèles ainsi que sur des données de la littérature où sont réalisées des expériences similaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe afin de respecter leur caractère social, sans dépasser la limite recommandée d’individus par cages en termes de surface au sol. L’hébergement des animaux dépourvus de système immunitaire est réalisé dans des cages stériles avec de la nourriture, de la litière et de l’eau stériles, entreposées dans des portoirs ventilés permettant de les protéger de l’environnement extérieur. L'environnement d'hébergement est contrôlé en termes de température, d’hygrométrie et respecte des cycles jour/nuit réguliers. Pour leur bien-être, l’eau et la nourriture sont accessibles aisément et à volonté. Afin de leur permettre d’exprimer leur comportement physiologique (fouissage, nidification) une litière abondante ainsi que des matériaux spécifiques seront mis en place. Un enrichissement structural (tunnel en carton, pot en verre) sera également proposé afin d’éviter l’apparition de comportements stéréotypés. Une évaluation au minimum hebdomadaire du poids et de l’état de santé global à l’aide d’échelles spécifiques sera réalisée afin de détecter toute altération de l’état général des animaux. Les procédures expérimentales potentiellement douloureuses seront encadrées par une anesthésie et/ou une analgésie le cas échéant. L’apparition d’une potentielle douleur en lien avec les procédures expérimentales sera appréciée par une échelle d’évaluation de la douleur. Lorsque cela sera possible, des techniques d’imagerie seront privilégiées pour le suivi de la maladie à la place de prélèvements sanguins ou de moelle osseuse. Toutes les expérimentations seront réalisées sous poste de sécurité microbiologique afin d’éviter l’infection des animaux par des pathogènes environnants. Enfin, des points limites seront mis en place, prenant en compte plusieurs paramètres tels que la perte de poids, l’état du pelage ainsi que la capacité de locomotion. Ces points limites permettront, lorsqu’ils sont atteints, de mettre à mort immédiatement les animaux.

Choix des espèces

La communauté scientifique privilégie l’utilisation de modèles murins pour l’étude des cellules souches leucémiques et pour l’évaluation de la réponse aux traitements. Les résultats obtenus chez la souris dans l’étude des processus hématopoïétiques pathologiques sont souvent extrapolables à l’être humain avec de nombreuses données issus de modèles animaux ayant abouti à de véritables stratégies de suivi de la maladie et de choix thérapeutiques. Les souris permettent aussi l’accès à des modèles modifiés génétiquement, pour ne plus avoir de système immunitaire, nécessaires au déroulement de notre projet. Les animaux utilisés seront des souris âgées de 6 à 12 semaines au maximum car il s’agit de la période du développement la plus optimale pour la génération d’une leucémie à partir d’échantillons de patients atteints de leucémies. De plus, l’utilisation de souris plus âgées n’est pas recommandée car certains échantillons de patients atteints de leucémie sont associés à un développement lent de la maladie (parfois plus d’un an) ce qui ne permet pas d’avoir une période d’expérimentation assez longue pour exploiter des résultats avec ces animaux.

52 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Dès le sevrage, elles reçoivent un régime pauvre en protéines pendant cinq semaines pour modéliser la malnutrition infantile, avec contentions quotidiennes, frottis vaginaux et un test au glucose comprenant six heures de jeûne, une incision de la queue et plusieurs prélèvements de sang. Le projet cherche à savoir si l'énergie dépensée pour maintenir la température du corps module la réponse au manque de protéines. Les retombées annoncées pour les 150 millions d'enfants malnutris restent lointaines, la mise à mort servant à prélever muscle et graisses.

Objectifs

La malnutrition chez l’enfant est un problème majeur de santé publique dans le monde. Elle peut avoir des conséquences durables sur la croissance, le métabolisme (la manière dont le corps utilise l’énergie) et la puberté. Des études suggèrent que les garçons pourraient être plus touchés que les filles. Dans nos travaux précédents chez la souris, nous avons observé qu’un régime pauvre en protéines affecte davantage la croissance et le métabolisme des jeunes mâles, tandis qu’il retarde surtout la puberté chez les femelles. Ces résultats indiquent que, lorsqu’il manque de nutriments, l’organisme doit répartir son énergie entre plusieurs fonctions essentielles : grandir, maintenir son métabolisme et assurer la reproduction. Cette répartition semble différer selon le sexe. Nous avons montré que, chez les jeunes mâles, l’énergie consacrée à la reproduction joue un rôle limité dans ces effets. En revanche, une part importante de l’énergie pourrait être utilisée pour maintenir la température corporelle. L’objectif de ce projet est de comprendre si l’énergie associée au maintien de la température corporelle influence la façon dont l’organisme gère un manque de protéines, en particulier pendant la période juvénile, lorsque la croissance et la puberté demandent aussi beaucoup d’énergie. Nous mesurerons les effets d’un régime pauvre en protéines sur la croissance et sur certains paramètres du métabolisme, dans des conditions adaptées aux besoins physiologiques des souris. Ce projet permettra de mieux comprendre comment la nutrition au début de la vie peut influencer le risque ultérieur de troubles métaboliques et reproductifs, en tenant compte des différences entre sexes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’organisme répartit son énergie en cas de manque de protéines pendant l’enfance, notamment l’énergie utilisée pour maintenir la température du corps, et comment ces mécanismes peuvent différer entre les sexes. La malnutrition infantile touche malheureusement encore 150 millions d’enfants de moins de 5 ans à travers le monde. Ces connaissances aideront à mieux comprendre le fonctionnement du corps des jeunes en situation de malnutrition et pourraient, à plus long terme, contribuer à identifier de nouvelles pistes de prévention ou d’amélioration de la prise en charge en santé humaine.

Procédures

52 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 5 semaines. Toutes les souris seront mesurées avec une règle chaque semaine sous anesthésie générale (3 minutes) puis pesées (< 1 min) entre 21 et 56 jours. Certaines souris subiront des contentions manuelles, tous les jours à partir de 21 jours (< 1 min par contention) pour détecter la puberté. Chez certaines femelles, un frottis vaginal sera réalisé quotidiennement à partir de cette détection et jusqu’à 56 jours (15 sec de contention). A 56 jours, les souris seront anesthésiées (3 minutes), et subiront un prélèvement sanguin (20 sec). Toutes les souris subiront un test permettant d’évaluer la réponse de chaque individu à un sucre (glucose), et seront donc soumises à : 6 heures de jeûne, introduction orale de glucose (10 sec), incision à la queue (1 sec), 7 prélèvements d’une petite goutte de sang et 3 prélèvements supplémentaires de quelques gouttes (durée totale de prélèvement < 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les pesées, mesures et frottis vaginaux hebdomadaires induisent un stress modéré lié à la contention, ainsi qu’un inconfort transitoire. Ces manipulations sont associées à un stress transitoire lié à la contention. Les prélèvements de petites gouttes de sang à la queue impliquent une incision d’environ 1 mm et un recueil répété des gouttes, provoquant une douleur légère à chaque point temporel. Le jeûne de 6 heures induit un stress modéré. L’introduction orale est source d’inconfort et peut entraîner un risque de fausse route ou d’irritation œsophagienne.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt.

Remplacement

Cette recherche vise à comprendre comment l’organisme dans son ensemble réagit à différents régimes alimentaires, en particulier en cas de manque de protéines. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative (comme des cultures de cellules en laboratoire) capable de reproduire la complexité d’un organisme entier, où plusieurs organes interagissent en permanence pour réguler l’état nutritionnel. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire pour répondre à ces questions. La souris a été choisie car elle constitue un modèle bien établi en recherche en nutrition et permet d’étudier de façon fiable les effets d’une carence en protéines dans des conditions proches de la physiologie. L’objectif étant d’analyser des mécanismes à l’échelle de plusieurs organes, ainsi qu’au niveau moléculaire, ce type d’étude ne peut pas être réalisé chez l’être humain.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire tout en garantissant des résultats fiables. Le nombre d’animaux par groupe (14 mâles et 12 femelles) a été déterminé grâce à un calcul statistique précis, afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant la validité scientifique des conclusions. Ce calcul s’appuie sur les paramètres les plus variables entre les individus. Les analyses permettront de comparer les effets de l’alimentation, du sexe et d’autres paramètres biologiques. Enfin, pour éviter d’avoir recours à de nouveaux animaux dans de futurs projets, différents organes pouvant être utiles à d’autres recherches (comme le muscle ou les graisses) seront prélevés à la fin de l’étude et conservés pour d’éventuelles analyses ultérieures.

Raffinement

L’étude ne débutera que chez des animaux suffisamment développés, pesant plus de 7 g au moment du sevrage. Leur croissance (taille et poids) sera suivie chaque semaine de manière individuelle. Pour faciliter l’alimentation des plus jeunes, la nourriture sera placée directement dans la litière afin qu’elle soit facilement accessible. La quantité de nourriture consommée sera également surveillée pour s’assurer de leur bon état général. Des seuils d’alerte seront définis à l’avance : si un animal les atteint, il sera retiré immédiatement de l’étude pour éviter toute souffrance. Le régime pauvre en protéines et les méthodes utilisées sont déjà bien maîtrisés au laboratoire et ne provoquent pas de signes de souffrance. Les mesures finales, ainsi que le prélèvement nécessaire, seront effectuées sous anesthésie pour garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris, un animal omnivore comme l’humain, est couramment utilisée pour les recherches en nutrition. Son microbiote est bien connu et de nombreux outils scientifiques existent déjà, ce qui en fait un modèle préclinique idéal pour comprendre le fonctionnement de l’organisme lors de changements alimentaires. Les animaux seront suivis pendant 5 semaines après le sevrage, c’est-à-dire de 3 à 8 semaines d’âge. Le but du projet est de comprendre comment la production de chaleur par l’organisme oriente la réponse à un manque de protéines dans l’alimentation. Il est important de commencer l’étude dès le sevrage, car c’est le stade où la croissance et la reproduction se mettent en place chez la souris.