Oncologie

640 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous anesthésie, jusqu'à quarante mesures de la tumeur et jusqu'à trente administrations de chimiothérapie et d'immunothérapie, avant d'être tuée pour analyse des organes. Le projet cherche à valider une protéine comme cible pour rendre l'immunothérapie plus efficace contre le cancer. Les groupes de seize animaux sont justifiés par la robustesse statistique, le bénéfice pour les patients restant une perspective générale.

Objectifs

Ce projet vise à étudier l’effet de l’activation ou de l’inhibition d’un mécanisme biologique impliqué dans le développement des tumeurs et dans le fonctionnement du système immunitaire, dans un modèle murin. Des résultats préalables montrent que l’inhibition de ce mécanisme ralentit la croissance des tumeurs lorsque les défenses immunitaires de l’organisme sont fonctionnelles, ce qui suggère une interaction entre ce mécanisme et le système immunitaire. Cette modulation est également associée à des changements dans l’activité de certaines cellules immunitaires présentes dans la tumeur. L’objectif principal est d’évaluer les effets de cette modulation, seule ou en association avec des traitements anti-tumoraux de référence, dans des conditions où l’activité de ces cellules immunitaires est diminuée. Cela permettra de préciser leur rôle dans le contrôle de la croissance tumorale. Plus largement, ce projet vise à mieux comprendre comment ce mécanisme biologique influence les défenses immunitaires contre les tumeurs et l’efficacité des traitements.

Bénéfices attendus

Dans le monde, le cancer est la deuxième cause de décès, avec près de 10 millions de morts chaque année. Pour lutter contre cette maladie, les traitements les plus couramment utilisés sont la chimiothérapie et la radiothérapie. Ces thérapies agissent directement sur les cellules cancéreuses pour les détruire. Toutefois, elles peuvent parfois provoquer des effets secondaires importants et ne sont pas toujours efficaces chez tous les patients. L’immunothérapie représente une approche différente : elle vise à stimuler le système immunitaire du patient afin qu’il reconnaisse et élimine lui-même les cellules cancéreuses. Ces dernières années, cette stratégie a connu de grandes avancées et a permis des succès encourageants. Cependant, l’immunothérapie ne fonctionne pas encore pour tous les types de cancer, et nous ne comprenons pas toujours pourquoi certains patients ne répondent pas à ce traitement. Ce projet de recherche permettra de valider de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’améliorer l’efficacité de l’immunothérapie.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale (moins de trois minutes par animal, 1 fois). Toutes les souris vigiles seront soumises à l’évaluation de la croissance tumorale par une méthode non invasive (5 minutes par animal, 2 fois par semaine, 40 fois maximum). Toutes les souris seront soumises à des traitements anti-tumoraux administrés sur animaux vigiles (moins d’une minute par souris par administration). Une administration unique de chimiothérapie sera réalisée en début de traitement. Les traitements immunologiques seront ensuite administrés selon les schémas suivants : une administration quotidienne pendant 6 jours consécutifs, puis une administration hebdomadaire, ou une administration hebdomadaire seule selon les groupes expérimentaux. Le nombre total d’administrations ne dépassera pas 30 par animal. A la fin des expériences, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L’induction tumorale peut conduire à des effets indésirables et peut induire une gêne chez l’animal. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et de la détresse respiratoire. Les traitements de chimio- et immuno-thérapie peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et un risque de péritonite associé aux administrations fréquentes. Les sites d’injections peuvent s’infecter. La manipulation et la contention des animaux peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert une induction tumorale, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude consiste à évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement stimulant le système immunitaire dans un contexte de thérapie anti-cancéreuse. Notre protéine cible a été identifiée grâce à une étude de transcriptomique. Nous souhaitions évaluer notre hypothèse in vivo car il n’y a pas d’autres modèles pour pouvoir étudier l’efficacité de l’immuno-stimulation et ses mécanismes vu sa complexité.

Réduction

Pour la réalisation de ce projet, des groupes de seize souris (huit femelles et huit mâles) seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés pour un total de 640 animaux. Nous appliquerons des tests statistiques appropriés pour comparer l’effet étudié entre les groupes, les croissances tumorales et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger et tunnels en cartons). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées, dans une pièce dédiée distincte de la zone d’hébergement des animaux. Toutes les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants, etc...). Aucune médication supplémentaire ne sera administrée au cours des expériences, car les effets secondaires sur le système immunitaire pourraient interférer avec les résultats.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons: - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. La souris présente l’avantage de disposer de nombreux modèles génétiquement modifiés permettant d’analyser de façon spécifique le rôle de certains mécanismes biologiques dans les processus étudiés. Cette disponibilité constitue un élément déterminant pour répondre aux objectifs du projet. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de six semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire efficient.

2 232 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, réparties en groupes d'âge de deux à dix-neuf mois. Chacune subit gavages, injections dans le muscle de la cuisse, tests d'effort et prélèvements sanguins, certaines étant transportées entre deux établissements, pour étudier le lien entre la graisse intramusculaire et le métabolisme du muscle. Les retombées pour la santé humaine, fragilité musculaire liée à l'âge ou à l'obésité, sont annoncées "à plus long terme". Le porteur reconnaît qu'aucun calcul de puissance n'a été possible et que l'effectif repose sur ses habitudes expérimentales.

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 2 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux établissements utilisateurs (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.

Les souris sont mises à mort dès l'apparition des signes tumoraux, "avant leur mort naturelle", après irradiation, injections répétées et prélèvements sanguins. 828 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever organes et cellules. Le modèle vise à reproduire un lymphome agressif, le lymphome diffus à grandes cellules B, et à tester de nouvelles thérapies. L'effectif de 828 animaux repose sur la gestion externe de l'élevage et des "statistiques prédictives", sans calcul de puissance détaillé dans le résumé.

Objectifs

Le lymphome est le cancer du sang le plus fréquent et le sixième cancer le plus fréquent au monde. Le lymphome diffus à grandes cellules B est une forme agressive de lymphome, représentant 30 à 40 % des cas. Le traitement actuel du lymphome diffus à grandes cellules B repose sur la chimiothérapie ou la greffe de moelle osseuse ; cependant, environ 40 % des patients cessent de répondre au traitement (rechute) ou n’y répondent pas (maladie réfractaire), ce qui a généralement des conséquences fatales. Il est donc urgent de trouver des traitements plus efficaces pour ces lymphomes. À l’heure actuelle, il n’existe pas de modèles expérimentaux reproduisant fidèlement le lymphome diffus à grandes cellules B. L’objectif de ce projet est de générer des lymphomes à l’aide d’un nouveau modèle murin permettant de suivre l’initiation et la progression de la maladie. Ce modèle nous permettra d’étudier les causes du développement du lymphome et sera également utilisé pour des applications précliniques, notamment pour tester l’efficacité de nouvelles thérapies contre ces lymphomes agressifs.

Bénéfices attendus

Nous allons générer des informations importantes sur les gènes et les voies de signalisation impliquées dans l'apparition et la progression du lymphome diffus à grandes cellules B, actuellement inconnus. De plus, ces modèles nous permettront de réaliser des études précliniques, afin d'identifier de nouvelles façons d'activer et de stimuler le système immunitaire de l'hôte, et de tester de nouvelles thérapies afin d'améliorer les traitements contre les cancers du sang.

Procédures

Les souris qui développeront des lymphomes seront suivies. Elles seront manipulées deux fois par semaine pour être pesées et observer les signes de formation tumorale : perte de poids, diminution de l’activité, posture voûtée, pelage ébouriffé, hypertrophie des ganglions lymphatiques, changements de comportement pour mettre à mort les souris avant leur mort « naturelle ». Des prélèvements tissulaires seront effectués afin de déterminer les causes de la formation tumorale et de constituer une biobanque. Certaines souris recevront une injection d’une minute pour être immunisées (toutes les 3 semaines, jusqu’à 8 injections). Certaines souris subiront une déplétion de la moelle osseuse par irradiation une seule fois, ce qui peut engendrer une détresse et une agitation. Ils recevront ensuite une injection d'une minute pour transférer des cellules de moelle osseuse, et une prise de sang sera effectuée 3 et 6 semaines plus tard pour vérifier la reconstitution de la moelle osseuse. Et certaines souris recevront le traitement par injection ou par voie orale quotidiennement pendant 4 semaines maximum. Des prélèvements sanguins seront effectués sur les souris au début et à la fin du traitement afin d'analyser leur numération sanguine. Types d’interventions : - Contentions pour pesées et mesures : durée = 5 secondes / nombre = 30 max - Administration par gavage sur animal vigile : durée = 1 minute / nombre = 20 max - Administration par injection sur animal vigile : durée = 30 secondes / nombre = 28 max - Prélèvement sanguin : durée = 1 minute / nombre = 4 - Irradiation : durée 10min / nombre = 1

Impact sur les animaux

Les symptômes associés au lymphome comprennent : perte ou prise de poids, respiration rapide, pelage ébouriffé, posture voûtée et/ou mouvements lents. De plus, la manipulation des souris lors de la surveillance, de l’irradiation ou des injections peut induire du stress. Une inflammation peut également survenir au point d’injection. Les injections et les prélèvements sanguins provoquent aussi du stress et une légère douleur passagère.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux en fin de procédure nécessaire pour la récupération des organes et la récupération des cellules pour leur étude ultérieure.

Remplacement

Compte tenu de la complexité du processus impliqué dans la formation des lymphomes, résoudre ce problème uniquement par l’analyse in vitro n’est pas suffisant et l’utilisation de modèles animaux est essentielle. Par conséquent, pour l’instant, aucune méthode alternative ne permet de remplacer complètement le modèle murin dans notre étude. Cependant, les résultats obtenus à partir de nos expérimentations permettront de développer un protocole in vitro qui pourrait à terme remplacer partiellement les modèles animaux.

Réduction

L'élevage sera géré en externe, et nous permettra de limiter le nombre de croisements au minimum afin d'obtenir le bon nombre de souris nécessaire à ce projet. Nous utiliserons des souris mâles et femelles puisque le lymphome affecte les deux sexes. Nous utiliserons des statistiques prédictives pour établir la constitution des groupes. De plus, les cellules tumorales excédentaires récoltées sur des souris mises à mort seront congelées pour créer une banque de tumeurs, afin de minimiser le nombre de souris nécessaires pour fournir du matériel pour de futures expériences.

Raffinement

Nous avons établi une grille d'évaluation avec des seuils précoces adaptés pour détecter les lymphomes suffisamment tôt afin de réduire au maximum la souffrance animale tout en conservant une rigueur scientifique. Cela comprend une surveillance accrue lors de l'observation de changements de poids, de mouvements, d'apparence physique et de comportement ; et arrêter l'expérience lorsque les symptômes du lymphome apparaissent. De plus, si les souris présentent des égratignures ou des blessures, nous utiliserons une solution d'iode pour désinfecter la zone. Et si les souris présentent des signes de détresse suite à toute intervention, nous renforcerons la surveillance.

Choix des espèces

Les souris sont les espèces les plus utilisées pour étudier la formation et le développement des lymphomes en raison de la flexibilité nécessaire pour effectuer des manipulations génétiques (souches avec des gènes désactivés) et de la possibilité de tester l'agressivité de la maladie par le transfert de cellules malignes et pré-malignes dans des souris réceptrices. Ils ont également un cycle de vie court et se reproduisent facilement. Pour les expériences de développement du lymphome, les souris seront âgées jusqu'à l'âge de 8 mois, correspondant à la période de latence de cette maladie d'après nos études précédentes. Pour les expériences de transfert cellulaire, des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines sont utilisées comme souris receveuses.

Pour mettre au point une imagerie de longue durée des tumeurs chez le poisson zèbre adulte, 70 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Porteurs de mélanomes sur la tête, le dos ou le flanc, ils sont anesthésiés, immobilisés dans l'agarose et intubés jusqu'à 24 heures d'affilée pour l'observation au microscope. Le porteur indique surveiller des signes de mal-être liés aux tumeurs, nage modifiée, respiration accélérée ou apathie, et appliquer des points limites précoces. Tous sont tués à l'issue, le résumé précisant que des animaux susceptibles de développer des tumeurs "ne peuvent être replacés ou adoptés".

Objectifs

Le cancer est la première cause de mortalité en France. Malgré des progrès thérapeutiques importants au cours des 20 dernières années, le taux de survie à 5 ans des patients atteints de tumeurs solides agressives, comme le mélanome, demeure faible. Une compréhension approfondie des mécanismes de progression tumorale est nécessaire pour concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'implication du microenvironnement tumoral, c’est-à-dire tout ce qui entoure les cellules cancéreuses au sein de la tumeur, est de plus en plus reconnu comme un acteur essentiel de la progression. L'interaction dynamique entre les cellules tumorales et des cellules saines voisines comme les cellules des vaisseaux sanguins, est très importante pour la croissance, l'invasion locale et la dissémination des cellules tumorales. Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle qui reproduise suffisamment fidèlement les vaisseaux sanguins en 3D pour visualiser leurs interactions avec les cellules tumorales en dehors d’un animal. Le poisson zèbre est un modèle vertébré fiable pour étudier le développement du mélanome car il reproduit l'environnement des tumeurs humaines. De plus, des lignées fluorescentes permettent de marquer certaines cellules saines présentes dans les tumeurs, comme les vaisseaux sanguins. Cependant, à l’heure actuelle, peu de laboratoires dans le monde ont développé des protocoles d’imagerie en temps réel dans des poissons zèbres adultes. L’objectif de ce projet est de mettre au point un protocole d’imagerie de longue durée par microscopie dans des tumeurs primaires chez des poissons zèbres adultes possédant des vaisseaux sanguins fluorescents, permettant ainsi l’observation en temps réel des interactions entre cellules tumorales et cellules des vaisseaux dans leur environnement naturel.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre d’établir une base technique robuste pour documenter les interactions dynamiques entre les cellules tumorales et les cellules saines voisines, en temps réel et dans un organisme vivant, révélant ainsi des informations uniques sur les mécanismes de développement des cancers. Une meilleure compréhension de ces interactions pourrait mener à la conception de nouvelles stratégies de lutte contre les cancers et au développement de traitements innovants.

Procédures

Les poissons seront mis à jeun pendant les 4 heures précédant la procédure puis pendant toute la durée de la procédure (24h maximum). Lors de l’optimisation de l’anesthésie de longue durée, les poissons seront anesthésiés, immobilisés avec de l’agarose dans une chambre spécialement conçue et imprimée en 3D et recevront en continu de l’eau contenant de l’anesthésique et de l’oxygène dissous par un tube placé dans leur bouche pendant une période allant jusqu’à 24 heures. Pour l’optimisation de l’imagerie en temps réel dans des mélanomes primaires, des poissons zèbres adultes développant des tumeurs sur la tête, le dos ou le flanc seront sélectionnés un par un, anesthésiés, immobilisés, intubés et imagés pendant une période allant jusqu’à 24 heures. Après optimisation de tous les paramètres, un groupe de poissons portant des tumeurs sur la tête, le dos ou le flanc sera imagé suivant le protocole établi puis réveillé pour s’assurer que la procédure n’entraine pas de dommages aux poissons. Ils seront surveillés pendant une semaine. A l’issue des procédures, les poissons seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Les poissons seront mis à jeun pendant les 4 heures précédant la procédure puis pendant toute la durée de la procédure (24h maximum), ce qui pourrait leur causer un léger stress. La manipulation des poissons en vue de leur anesthésie peut induire un stress supplémentaire. La mise en place de la tubulure pourrait causer des dommages au niveau de la bouche du poisson. D’éventuels effets négatifs de l’illumination laser au cours de l’imagerie pourraient se traduire par une dégradation de la morphologie des cellules ou de l’organisation du tissu. Certains animaux peuvent présenter lors des observations hebdomadaires des signes de stress ou de mal-être dus au développement de tumeurs. Les signes les plus précoces et les plus légers comprennent des modifications de la nage, une respiration accélérée passagère ou une apathie. L’anesthésie de longue durée pourrait entrainer une oxygénation insuffisante des organes et une diminution du tonus musculaire. Ces effets indésirables se manifesteraient après le réveil par une respiration accélérée prolongée ou une incapacité à maintenir sa position dans la colonne d’eau.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. En effet, les animaux susceptibles de développer des tumeurs ne peuvent être replacés ou adoptés.

Remplacement

Le modèle animal est indispensable à la réalisation de ce projet, car il n’existe actuellement aucun modèle in vitro permettant d’étudier, sur de longues périodes et dans un contexte physiologiquement pertinent, les interactions dynamiques entre les cellules cancéreuses et les cellules de leur microenvironnement tumoral. Des systèmes de culture complexes en 3D tels que des modèles de peau humaine reconstruite, dans lesquels sont co-cultivés cellules cancéreuses et différents types cellulaires du microenvironnement tumoral, pourraient permettre certaines analyses mécanistiques ; cependant, ils ne peuvent à l’heure actuelle reproduire la complexité chimique, biologique et physique d’un organisme vivant pour étudier le comportement des cellules dans un environnement physiologique.

Réduction

L’imagerie en temps réel permet d'observer des phénomènes localisés et furtifs tels que l'interaction entre une cellule tumorale et une cellule des vaisseaux sanguins dont la détection par simple dissection nécessiterait un nombre extrêmement élevé d'animaux. Ainsi, ce projet participe à la réduction du nombre d'animaux à utiliser pour pouvoir répondre à la question biologique du rôle des interactions dynamiques entre cellules dans le développement des cancers. Il est possible que l’optimisation de chaque paramètre nécessite moins de poissons que prévu. De plus, si l’optimisation des paramètres d’imagerie requiert moins de 10 poissons portant des tumeurs, les poissons suivants seront utilisés pour la validation finale du protocole. Afin de réduire le nombre de poissons utilisés, le protocole d’imagerie sera optimisé en utilisant un seul type de mélanome et une seule lignée de poissons présentant des vaisseaux sanguins fluorescents.

Raffinement

Le mal-être éventuel associé au développement de tumeurs peut être prévenu par une surveillance attentive des animaux et l’application de points limites définis suffisamment précoces, facilités par notre connaissance du modèle. L’utilisation de poissons transparents permet de détecter plus tôt l’apparition des tumeurs par inspection visuelle. De plus, la microscopie ne permettant d'observer qu'une minuscule épaisseur de tissu, nous pourrons utiliser des tumeurs de très petite taille, ce qui préviendra toute souffrance éventuelle liée au développement des tumeurs. La mise à jeun pendant les 4 heures précédant l’immobilisation permettra d’éviter les déjections et une éventuelle régurgitation et d’augmenter le confort du poisson. Le stress éventuel de l’immobilisation, du positionnement de la tubulure, puis de l’imagerie sera réduit par le recours à une anesthésie générale ajustée tout au long de la procédure. La solution anesthésique sera oxygénée en permanence à l’aide d’une pierre à air, maintenue à une température de 28 degrés et remplacée toutes les 4 heures pour garder le poisson dans ses conditions de confort. Dans un souci de raffinement, des petits crustacés seront données aux poissons une fois par jour en plus de leur régime alimentaire normal pour préserver leurs instincts prédateurs, enrichir leur milieu et répartir la nourriture dans toute la colonne d’eau.

Choix des espèces

Le poisson zèbre représente un organisme modèle particulièrement adapté aux manipulations génétiques et à l’imagerie pour l’étude du cancer. Les gènes impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'homme et le poisson et il existe de très bons outils pour reproduire les altérations génétiques trouvées dans les tumeurs humaines dans les poissons adultes. C’est ainsi qu’ont été générés des modèles très fiables de mélanome dans le poisson zèbre. De plus, plusieurs lignées avec différents types cellulaires marqués par fluorescence sont disponibles ce qui rend possible l'imagerie en temps réel. Des espèces d'animaux invertébrés pourraient être envisagées mais leurs organes diffèrent considérablement de ceux de l’homme, ce qui limite leur utilité pour l’étude du cancer. Le poisson représente une bonne alternative à la souris à la fois parce qu'il offre d'excellentes possibilités de manipulation génétique et parce qu’il présente des capacités inégalées pour l’imagerie en temps réel. Dans ce projet, les poissons seront utilisés du stade une cellule pour microinjection (hors DAP) jusqu'à l'imagerie sur l'adulte qui sera réalisée entre 12 et 52 semaines en fonction de la vitesse d'apparition des tumeurs.

Pour étudier l'effet de la rigidité des tissus sur des cellules immunitaires liées au cancer, 432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une matrice de collagène implantée par chirurgie, refermée par des agrafes, puis un prélèvement de sang terminal. Le porteur minimise l'inconfort, qu'il attribue à l'incision et aux agrafes plutôt qu'au collagène. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le comportement des macrophages dans un organisme entier et juge le modèle animal "indispensable".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de discerner, dans un modèle murin, l'impact de la pression mécanique sur la transition des monocytes en macrophages. Les macrophages constituent une population abondante de cellules immunitaires dans le cancer, associée à un mauvais pronostic pour les patients ; cependant, les facteurs précis qui régulent la fonction des macrophages dans le cancer sont mal compris. De nombreuses études ont identifié que le cancer induit une fibrose générale dans le microenvironnement tumoral, ce qui augmente la rigidité des tissus. L'impact de la rigidité tissulaire sur la fonction des macrophages est un aspect fondamental de la compréhension de l'immunologie tumorale. Pour mieux comprendre cet aspect, nous visons à : 1) établir un modèle murin de fibrose. 2) contourner la différenciation des macrophages pro-fibrotiques. 3) Appliquer nos observations obtenues sur les macrophages pro-fibrotiques et sur la fibrose associée au cancer. L’objectif 3 sera atteint en traduisant nos résultats en données générées précédemment à partir des modèles de cancer en laboratoire.

Bénéfices attendus

Les objectifs de ce projet sont de déterminer, dans un modèle murin, l’impact de la pression mécanique sur la transition des monocytes en macrophages. Les macrophages représentent une population abondante de cellules immunitaires au sein du microenvironnement tumoral et sont souvent associés à un pronostic défavorable chez les patients atteints de cancer. Cependant, les facteurs précis qui régulent leur fonction dans ce contexte restent mal compris. De nombreuses études ont mis en évidence que les tumeurs induisent une fibrose marquée dans leur microenvironnement, augmentant ainsi la rigidité des tissus. L’influence de cette rigidité tissulaire sur la fonction et la polarisation des macrophages constitue un aspect fondamental de la compréhension de l’immunologie tumorale. Afin d’explorer ce mécanisme, nous poursuivons les objectifs suivants : 1. Établir un modèle de fibrose afin de reproduire les conditions de rigidité mécanique observées dans les tissus tumoraux. 2. Identifier les voies de signalisation impliquées dans la différenciation des macrophages pro-fibrotiques et explorer les moyens de contourner cette polarisation. 3. Appliquer les observations obtenues sur la différenciation macrophagique et la fibrose à des modèles tumoraux déjà établis au laboratoire. L’objectif final est de mieux comprendre la diversité fonctionnelle (hétérogénéité) des macrophages et les mécanismes biomécaniques qui influencent leur phénotype et leur rôle dans des environnements rigides, tels que les tissus tumoraux. Ces connaissances pourraient, à terme, ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques, en ciblant la signalisation mécanique pour moduler la fonction macrophagique dans le cancer.

Procédures

Implantation chirurgicale d’une matrice de collagène sous anesthésie générale avec analgésie, durée 10 minutes, une fois. Prélèvement de sang sous anesthésie générale terminale, durée 5 minutes, une fois.

Impact sur les animaux

À la suite de la procédure chirurgicale, les souris pourront ressentir une douleur modérée et transitoire. Tout inconfort proviendra de la chirurgie elle-même et des agrafes utilisées pour refermer l’incision cutanée, et non du collagène injecté. Le collagène est de petite taille et très fin, et n’affectera pas la santé des souris.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en œuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans un microenvironnement rigide dans toute sa complexité. En particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux régimes et traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste donc indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le comportement des macrophages dans un microenvironnement rigide soumis à différentes conditions en interaction avec le microenvironnement. Enfin, notre projet offre des perspectives thérapeutiques qui justifient aussi la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme. Pour réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables.

Réduction

Nous avons pris en compte de multiples facteurs qui nous permettent de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour répondre aux questions scientifiques sous-jacentes. Le nombre d'animaux analysés dans les groupes expérimentaux est maintenu aussi bas que possible afin de pouvoir tirer des conclusions valables et significatives des expériences proposées, il a été déterminé par calcul de puissance. En outre, pour répondre à nos questions scientifiques, nous utiliserons des méthodes qui maximisent les connaissances acquises à partir de chaque animal. En outre, nous planifierons et exécuterons les expériences de manière à de combiner le plus grand nombre possible de tissus d'intérêt et de groupes de contrôle. Grâce à ces stratégies, nous visons à réduire le nombre d'animaux au minimum, tout en garantissant des résultats scientifiquement pertinents.

Raffinement

Les animaux disposeront d’une période d’acclimatation suffisante avant le début des procédures, incluant une familiarisation avec les expérimentateurs. Afin de réduire le stress lié à la manipulation, des méthodes raffinées seront employées . Des examens cliniques quotidiens seront effectués par l'équipe de recherche, et la fréquence des observations sera augmentée en cas de signes d’inconfort. Les procédures seront réalisées dans un environnement propre ou stérile, avec des mesures adaptées pour prévenir les infections post-opératoires. Une anesthésie et/ou une analgésie appropriée sera administrée chaque fois que nécessaire afin de minimiser la douleur et la détresse. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. En effet, selon la littérature, les modèles murins sont utilisés dans les études de différentiation des cellules, le cancer et la fibrose. De plus, notre modèle murin (souris invalidées pour le gène d'intérêt) a déjà été validé dans des publications précédentes. Animaux à maturité sexuelle, entre 6 et 12 semaines du fait de la population de patients..