Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Effet d’une modification du gène auts2a sur les mécanismes moléculaires et comportementaux transmis à la descendance chez le médaka
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
160 médakas vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Les poissons, dont le gène auts2a est modifié par CRISPR, sont isolés huit heures pour des tests comportementaux d'apprentissage, puis tués par surdose d'anesthésique. Le porteur étudie la transmission à la descendance d'effets liés à ce gène qu'il dit impliqué dans plusieurs pathologies humaines dont l'autisme. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative à l'animal vivant pour observer des réponses comportementales issues d'une fécondation naturelle.
Objectifs
Des températures suboptimales lors de la période de reproduction ont montré une baisse de l’expression maternelle d’un gène, auts2a, impliqué dans de nombreuses neuropathologies humaines : Trouble du spectre autistique, schizophrénie, Retard mental, etc … . Ce projet vise à comprendre les mécanismes moléculaires des stades précoces du développement embryonnaire qui entrainent des modifications des phénotypes comportementaux chez une espèce de poisson modèle, le médaka (Oryzias latipes). Par une approche d’édition de génome (CRISPR/Cas9) nous réaliserons deux lignées de médaka n’exprimant pas la protéine auts2a, ce qui nous permettra de réaliser des phénotypages comportementaux et moléculaires.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les effets intergénérationnels de stress parentaux, par exemple thermiques liés au réchauffement climatique, sur les comportements adaptatifs de la descendance chez des poissons d'élevage. L'identification du rôle clé joué par le gène auts2 dans cette transmission chez un poisson modèle contribuera à renforcer les connaissances scientifiques sur la transmission maternelle et/ou paternelle de ce gène impliqué dans de nombreuses pathologies humaines.
Procédures
Les animaux seront isolés pendant 8h afin de s'habituer à un nouvel environnement (nous déterminerons ainsi leurs capacités d'apprentissage des caractéristiques nouvelles de cet environnement). Cet isolement entraîne un stress modéré pour le médaka puisque son activité de nage redevient régulière et le poisson remonte en surface (indicateur d'absence de stress) après moins d'une heure.
Impact sur les animaux
Les phénotypes entraînés par la mutation n’induisent pas de souffrance et ne sont donc pas dommageables pour l’animal (il s’agit essentiellement de modifications des réponses émotionnelles et cognitives bénignes).
Devenir
Mise à mort selon la réglementation en vigueur pour l'espèce (surdose d'anesthésie)
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation des animaux dans cette expérimentation car nous recherchons précisément des mécanismes intervenant pendant une fécondation naturelle perturbée par la modification ou l’absence d’une protéine impliquée dans le neurodéveloppement ainsi que les réponses comportementales des poissons (vivants donc) issus de cette fécondation.
Réduction
Concernant les tests comportementaux, nous comparerons 4 génotypes différents, avec un nombre équitable de femelles et de mâles par génotype, ce qui nécessite un minimum de 20 poissons (10 femelles et 10 mâles) par génotype pour réaliser des tests statistiques robustes.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les manipulations des animaux seront réalisées le plus rapidement possible pour limiter le stress. Pour les tests comportementaux, les conditions environnementales seront les mêmes qu’en condition d’élevage hormis un isolement obligatoire pour l’analyse du comportement. Il n’y aura aucune procédure douloureuse. A la fin des tests, ils seront euthanasiés selon la procédure de mise à mort réglementaire.
Choix des espèces
L’analyse de l’expression du transcriptome à différents stades de développement embryonnaire est rendue possible par les spécificités biologiques du médaka. En effet, Il produit une trentaine d’œufs de manière quotidienne, ce qui permet un grand échantillonnage. Son développement embryonnaire est plus lent que celui du zebrafish (9 jours contre 2 jours), ce qui permet une meilleure précision lors de l’étude et l’observation du développement des œufs (qui sont translucides). De plus, le médaka ne possède que le paralogue auts2a (comme l’homme) tandis que le zebrafish possède les paralogues auts2a et auts2b (dont on ne connaît pas la fonction). Les injections auront lieu sur des œufs au stade 1 cellule (15 minutes après leur fécondation) et seront issus de poissons matures de souche sauvage. Les études comportementales porteront sur des poissons âgés entre 3 et 5 mois. Avant 2 mois les médakas montrent une activité plus importante et une grande variabilité inter-individuelle et avant 3 mois leur phénotype adulte n’est pas atteint ce qui rend leur détection par le logiciel ethovision XT plus difficile (la couleur des médakas s’assombrissant avec le temps).
Détection externe des marques d’alizarine chez l’anguille européenne (Anguilla anguilla)
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
750 civelles d'anguille européenne, espèce menacée, vont être utilisées dans des procédures classées en gravité légère, marquées par immersion dans une solution d'alizarine après un choc osmotique. À l'issue de la stabulation, 390 individus sont tués pour mesurer l'intensité de la fluorescence au microscope, les 360 restants étant relâchés sur les sites de repeuplement. Le porteur vise une lecture externe du marquage qui permettrait, à terme, d'évaluer le repeuplement sans tuer d'individus. Il affirme que le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette recherche menée sur la civelle.
Objectifs
Dans le cadre du plan de gestion de l’anguille, des opérations de captures de civelles en estuaire et de repeuplement des fleuves côtiers sont réalisées chaque année. L’évaluation de cette pratique est basée sur une technique de marquage de masse des civelles à l’alizarine Red S, un colorant fluorochrome qui génère une marque détectable durablement dans les structures calcifiées, notamment dans les otolithes, concrétions de l’oreille interne. La détection de la marque fluorescente requiert le sacrifice d’un échantillon d’individus capturés dans le milieu naturel, afin de déterminer la contribution de l’alevinage dans la population d’anguilles. La possibilité d’une détection externe des marques fluorescentes sur des civelles a été démontrée dans la littérature à partir d’un autre marqueur fluorescent, mais pas avec l’alizarine Red S. Des tests préliminaires réalisés selon le protocole de marquage couramment employé ont montré la présence de marques légères dans la mâchoire et les nageoires des civelles, mais souvent de courte durée. L’objectif de la présente étude est la mise au point d’un protocole de marquage à l’alizarine Red S, permettant spécifiquement une détection externe et durable des marques fluorescentes, qui pourrait à termes permettre l’évaluation de la contribution de l’alevinage, sans sacrifice d’individus.
Bénéfices attendus
La lecture externe des marques permettrait en premier lieu une simplification du protocole de détection, et ouvrirait d’autre part des perspectives intéressantes vers de la détection des marques sur animaux vivants, permettant notamment de ne plus sacrifier d’individus, réduire le temps de lecture et d’augmenter la taille de l’échantillon analysé.
Procédures
Marquage par immersion dans une solution de marqueur fluorescent. 2 types de marquage par balnéation seront testées : - Balnéation Longue : Balnéation des poissons dans 20L de solution d’Alizarine Red S à la concentration de 150 mg/l pendant 3h (lot n°1) ou 9h (lot n°2). - Balnéation Courte : Un choc osmotique est préalablement réalisé afin de favoriser l’assimilation rapide du marqueur fluorescent pendant 3.5 minutes puis une balnéation de 10 minutes dans 2L de solution d’alizarine à 1000ppm (lot n°3) ou 2000ppm (lot n°4).
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables potentiels sur les animaux concernent le transport après capture, le marquage et le maintien en captivité. Toutefois, ces effets peuvent être considérés comme légers au vu de l’expérience des opérateurs dans le transport et le marquage des civelles, communément réalisés dans le cadre des transferts de civelle destinées au repeuplement.
Devenir
Transport, marquage puis stabulation de 750 civelles. A l'issue de la stabulation (3e et dernière procédure), mise à mort de 390 individus et replacement en liberté du restant des individus encore en vie. La mise à mort se justifie pour pouvoir mesurer précisément l’intensité de la fluorescence à l’aide d’un microscope à épifluorescence et d’un dispositif de détection portatif et mettre au point une procédure de lecture.
Remplacement
Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette expérience de recherche de fluorescence externe qui implique de travailler nécessairement sur la civelle.
Réduction
L’effectif prévu (50 individus / lot) tient compte de la mortalité attendue en milieu contrôlé au stade civelle (maximum 25-30% avec le traitement BL3 ). A l’issue des 60 jours, un minimum de 30 individus par lot doit être analysé, sauf pour les témoins pour lesquels 10 individus par lot seront analysés (12*30 + 30 = 390 individus) en raison de la faible variabilité au sein de ce lot de référence non marqué. Ainsi 90 individus par traitement et 30 témoins seront analysés pour la fluorescence, afin de prendre en compte la diversité des stades pigmentaires dans l’échantillon (pouvant influer sur la détection de fluorescence) et la variabilité inter-individuelle de la fluorescence, potentiellement importante si l’on se réfère à d’autres études sur la rétention des marquages fluorescents. Les individus non analysés seront relâchés dans le milieu naturel sur les sites de repeuplement (au maximum 360 individus).
Raffinement
Les mésocosmes seront enrichis à l’aide de flottangs tout au long de l’expérience, dispositifs permettant aux civelles de s’abriter. Des daphnies seront ensemencées pour leur alimentation. La concentration en déchets du métabolisme azoté sera contrôlée chaque semaine, la concentration en oxygène sera également contrôlée quotidiennement. Des changements d’eau seront réalisés si besoin. Toutefois cela ne devrait pas être nécessaire vu la très faible densité d’individus dans le volume d’eau.
Choix des espèces
L’anguille est une espèce menacée au niveau européen, qui fait l’objet d’un plan de conservation à l’échelle nationale. L’évaluation des pratiques de repeuplement par une méthode de détection externe non létale représente un fort enjeu pour la gestion future. Les animaux seront utilisés au stade civelle car c'est le stade utilisé en France pour réaliser les opérations de repeuplement d'anguille.
Suivi de l’abondance du rat brun (Rattus norvegicus) dans l’Eurométropole de Strasbourg et évaluation du risque zoonotique
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
2120 rats bruns vont être utilisés, dont environ 2000 relâchés et 120 tués sous anesthésie sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal est piégé pendant moins de dix heures puis manipulé sous sédation, l'échantillon tué servant à évaluer l'état sanitaire et le risque de maladies transmissibles à l'humain. Le porteur présente le rat brun comme l'espèce invasive causant le plus de dommages à l'humain et vise à orienter la gestion urbaine de ces populations. Il affirme qu'il n'est pas possible de remplacer l'espèce par un modèle mathématique ou in vitro.
Objectifs
Le rat brun est aujourd’hui considéré comme l’espèce invasive causant le plus de dommages à l’espèce humaine. En effet, le rat peut être le réservoir et le vecteur de maladies zoonotiques, c’est-à-dire transmissibles à l’humain, dont certaines sont mortelles. Les pathogènes transmissibles à l’humain sont des bactéries (Leptospira interrogans, Yersina pestis, Rickettsia typhi, Bartonella elizabethae, Streptobacillus moniliformis, Salmonella enteritidis, etc.), des virus (hantavirus, arénavirus, cow-pox, etc.), des parasites (Angiostrongylus cantonensis, Capillaria hepatica, Toxoplasma gondii, Trichinella spiralis, etc.) et la teigne (Trichophyton mentagrophytes). De plus, le rat brun dégrade l’habitat et les ressources alimentaires de l’humain, ce qui engendre un coût économique significatif. En conséquence, cette espèce fait l’objet de plans de destruction dans plusieurs métropoles. Or la plupart des études souligne l’inefficacité des campagnes d’éradication qui entraînent la concentration des rats sur certains sites, favorisant ainsi même la propagation des pathogènes et accroissant le risque pour l’humain. Une meilleure connaissance de la biologie et de l’écologie de ces animaux en fonction de l’habitat urbain et des usages des citadins, devrait permettre d’améliorer le succès de ces mesures, voire de s’en affranchir en proposant des solutions de cohabitation sans risque pour la santé humaine ni conséquences économiques. Dans cet objectif, notre projet propose d’estimer le niveau de populations de rat brun au sein de l’Eurométropole de Strasbourg, d’évaluer l’état sanitaire des animaux et de mesurer s’il existe un risque zoonotique.
Bénéfices attendus
Les objectifs de notre étude sont 1/ de connaître l’état des populations de rats à Strasbourg et 2/ le risque zoonotique qu’elles représentent, afin 3/ de fournir des mesures de préconisations aux gestionnaires et citadins en matière de gestion de l’espèce et de son environnement. Nous escomptons donc des effets positifs de notre étude sur l’environnement en réduisant la présence de l’espèce à Strasbourg par une amélioration des usages, et par conséquent sur les activités économiques, de loisir, et la santé animale et humaine. Un autre objectif est bien sûr scientifique au travers de la valorisation des résultats obtenus dans des journaux scientifiques et conférences, notamment au sein de la Zone Atelier Environnementale Urbaine de Strasbourg et en lien avec les mots clés de la section 52 du CNRS à laquelle appartient le porteur du projet.
Procédures
Les animaux seront capturés ce qui va induire un stress, puis anesthésiés par injection sous-cutanée. Ils ne subiront pas d'intervention à l'état vigile et aucune procédure chirurgicale. La durée de capture est inférieure à 10 heures dans un piège. La durée de la manipulation de l'animal vigile est inférieure à 30 secondes.
Impact sur les animaux
Le seul effet indésirable sur les animaux est un stress lié à la capture et à l'injection de l'anesthésique. Les animaux seront manipulés sous sédation.
Devenir
Les animaux seront relâchés dans leur habitat. Un échantillon de la population sera euthanasié (60 à 120 rats).
Remplacement
L'étude porte sur l'abondance de rattus norvegicus en ville et le risque zoonotique lié à cette espèce, il n'est donc pas possible de remplacer cette espèce par une autre ni par des modèles mathématiques ou in vitro.
Réduction
La souffrance infligée aux animaux sera réduite au maximum : - grâce à des contrôles fréquents des pièges (plusieurs fois par jour), afin de limiter le temps de captivité - en réalisant toutes les manipulations sous anesthésie
Raffinement
Les animaux auront de la nourriture hydratée à disposition dans les pièges. Le temps de captivité sera réduit au maximum. Ils seront relâchés immédiatement après les mesures à leur point de capture.
Choix des espèces
Il s'agit d'étudier l'abondance de cette espèce à Strasbourg au regard de sa pullulation récente et du risque zoonotique qu'elle représente. Au stade adulte uniquement, pour avoir un état sanitaire complet des populations adultes
Infection urinaire à Escherichia coli, contaminant alimentaire et carcinogénicité chez le rat
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
520 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit l'induction d'une infection urinaire par sondage de l'urètre sous anesthésie, répétée une fois, puis un traitement par l'eau de boisson pendant douze semaines associant une mycotoxine et un carcinogène. Il indique que l'infection provoque un inconfort et qu'une perte de poids supérieure à 20 % entraînerait la sortie de l'animal du protocole. Il affirme que le recours à l'animal est "irremplaçable", l'interaction entre plusieurs organes ne pouvant selon lui être modélisée in vitro.
Objectifs
Nous sommes constamment exposés à une multitude de contaminants chimiques ou toxines biologiques, qui même à faible doses peuvent affecter notre santé, par exemple en provoquant le cancer. La plupart des recherches examinent l'effet de ces contaminants ou toxines une par une, mais rarement en combinaison. Dans ce projet, nous étudierons si la combinaison d'une toxine produite par une bactérie pathogène et d'un contaminant naturel des aliments, une mycotoxine, pourrait provoquer un cancer de la vessie. L'une des infections les plus courantes est l'infection urinaire causée par Escherichia coli. Ce microbe produit des toxines qui peuvent endommager notre ADN et induire des mutations cancérigènes. Une femme sur deux est touchée par cette infection au cours de sa vie. Des études antérieures ont montré que les personnes souffrant de ce type d'infection ont tendance à avoir plus de cancers de la vessie. Nous sommes aussi fréquemment exposés à des toxines prédentes dans l'alimentation, comme celle produite par des moisissures qui poussent sur les céréales: une mycotoxine appelée déoxynivalénol ou DON. Le DON est éliminé par notre corps dans l'urine. On trouve des traces de DON dans 40 à 98% des Européens, c'est donc un contaminant très fréquent. On sait que lorsqu'ils sont ensemble, DON et Escherichia coli induisent encore plus de dommages à notre ADN. Est-ce que manger un aliment contaminé par le DON tout en ayant une infection urinaire pourrait endommager nos cellules et favoriser le cancer de la vessie?
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous répondrons à cette question en étudiant si la combinaison du deoxynivalenol et de l’infection avec Escherichia coli induisent des lésions cancéreuses à long terme. Si nous confirmons qu'ensemble ils peuvent conduire au cancer de la vessie, nous alerterons les médecins et les régulateurs, pour éventuellement modifier la façon de traiter les infections de la vessie et pour diminuer les quantités tolérables de DON dans nos aliments.
Procédures
Une infection urinaire sera induite chez les animaux par injection via leur urèthre, avec une sonde, sous anesthésie générale. Le sondage et l'injection sont effectués par une personne expérimentée, en 1 minute environ. L'injection est répétée une fois sur chaque animal une heure après la première (pour garantir l'infection). Le suivi des animaux est ensuite effectué par des prélèvement d'urine quotidiennement, sur animal vigile avec une simple contention manuelle. Le traitement des animaux avec le contaminant alimentaire et le carconogène urinaire est effectué par l'eau de boisson, sans intervention, pendant 12 semaines. Ces produits ne montrent pas d'effet sur la prise de boisson aux doses utilisées.
Impact sur les animaux
Les traitements avec le contaminant alimentaire et le carcinogène urinaire ne sont pas connus pour induire de la douleur. Les infection urinaires induisent de l'inconfort au niveau de l'aine, mais aucun autre signe clinique est attendu.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l'issu de l'expérience afin de prélever les tissus qui seront analysés. La technique d'euthanasie est la même que celle utilisée chez les vétérinaires.
Remplacement
Remplacer : des études ont été préalablement conduites sur des cellules en culture permettant d’élucider comment agissent les toxines produites par les UPEC sur les cellules eucaryotes. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ou tube à essai ne permet d’évaluer les répercussions à long terme de cette bactérie et ses toxines sur la vessie. Une veille scientifique sera mise en œuvre pour identifier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.
Réduction
Réduire : Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux strictement nécessaire pour chaque expérience. Le nombre maximum de rats envidagé est de 520 animaux. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (poids, nombre de bactéries, prélèvements d’urine, de tissus et de sang lors du sacrifice) pour réduire le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Raffiner : Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur. Une perte de poids (non attendue) supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Pour les protocoles où la douleur ne peut pas être prise en charge par des analgésiques, une observation accrue et des critères d’arrêt plus stricts seront mis en place.
Choix des espèces
L'utilisation de méthode alternative in vitro a été préalablement réalisée pour démontrer l'impact des différentes toxines et métabolites sur la cellule eucaryote en culture. Cependant, le recours à l'animal est irremplaçable car les objectifs sont i) de découvrir les rôles des toxines bactériennes produites pendant l'infection urinaire et le cancer de l'urothélium, ii) de déterminer le lieu et la cinétique de production de ces toxines dans le tissu de la vessie et iii) de mesurer les effets des facteurs alimentaires sur leur production lors de l'infection urinaire. Étant donné que les infections urinaires sont des infections ascendantes impliquant plusieurs organes, que la production de toxines bactériennes peut être affectée par les réponses de l'hôte à différents endroits dans l'organisme, cette interaction complexe ne peut pas être modélisée in vitro.
La lactation comme période de reprogrammation du système métabolique et endocrine de la descendance exposée in utero à une hyperglycémie maternelle.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 748 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mères subissent une manipulation nutritionnelle, des traites manuelles de lait et des tests de tolérance au glucose, tandis que leur descendance est soumise à des tests comportementaux, des prélèvements sanguins et une chirurgie avec pose d'un cathéter à la jugulaire pouvant durer trois heures. Le porteur indique que les petits sont tués à différents stades, de huit à deux cent soixante jours, pour prélever leurs organes. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne rend compte de la mise en place du diabète de type 2 chez la descendance.
Objectifs
Le diabète gestationnel (DG), (8% des naissances en France), serait à l’origine du diabète de type 2 (DT2) chez 47% des patients âgés de 10-22 ans. Cette intolérance au glucose, transmise de génération en génération, contribuerait à l’explosion épidémique de la prévalence du DT2 dans le monde. Quelques études récentes montrent que, chez des enfants de 7 ans, exposés à une hyperglycémie maternelle in utero, la durée d’allaitement exclusif est inversement corrélée aux teneurs circulantes en hémoglobine glyquée (marqueur du DT2). Cependant, ces données épidémiologiques, parfois contradictoires, ne prouvent pas que la composition du lait maternel impacte le risque métabolique de la descendance. Nous émettons l’hypothèse que la lactation pourrait avoir un impact sur le devenir métabolique de la descendance soumise in utero à une hyperglycémie maternelle qui pourrait s’expliquer en partie par des adaptations du métabolisme maternel et de la composition du lait. Nous avons préalablement montré dans des modèles rongeurs de programmation métabolique avec adoptions croisées, que la descendance mâle présentait des changements différents dans leur sensibilité à l’insuline à l’âge adulte selon que la descendance avait été allaitée par des rates maintenues en sous- ou sur-nutrition calorique durant la période périnatale. Ces changements étaient associés à des compositions spécifiques des laits maternels. Ce projet vise donc à caractériser : 1) la composition du lait maternel dans un modèle rongeur d’hyperglycémie maternelle durant la gestation suite à une manipulation nutritionnelle (mimant le DG chez la femme avec un retour post-partum à la glycémie pré-gravide), en lien avec les adaptations métaboliques des 3 organes clés du contrôle hormonal de la lactation que sont le placenta, le pancréas et la glande mammaire, 2) le devenir métabolique (insulino-sensibilité) de la descendance mâle et femelle jeune et adulte en réponse à des compositions de lait de mères DG ou normo-glycémiques (adoptions croisées) ou encore à des supplémentations postnatales en composés bioactifs du lait maternel identifiés dans le lait humain DG. La contribution du DG dans la prévalence des pathologies cardio-vasculaires à l’âge adulte, et neurodéveloppementales pendant l’enfance sera également explorée dans ce projet.
Bénéfices attendus
L’enjeu global de ce projet est d’évaluer l’impact de l’allaitement maternel sur le devenir métabolique de l’enfant soumis in utero à un DG. Le modèle expérimental nutritionnel de DG avec adoptions croisées va permettre d’étudier le rôle de la composition du lait maternel dans la programmation endocrino-métabolique de la descendance. L’objectif in fine est de tester la capacité de composants bioactifs du lait humain à (re)programmer la sensibilité à l’insuline de la descendance soumise in utero à une hyperglycémie. Cette étude permettrait de prendre en compte ces biomarqueurs dans l’élaboration des formulations infantiles et des recommandations nutritionnelles destinées aux femmes enceintes et allaitantes, dans un contexte de diabète.
Procédures
Les rates seront soumises à une manipulation nutritionnelle durant la gestation et la lactation, à 4 prélèvements manuels de lait (30 minutes) et/ou 4 tests de tolérance orale au glucose (120 minutes) selon les lots de rates (procédures expérimentales 1 ou 2). Leur descendance sera soumise à 4 tests de comportement (3 tests avec séquence de 10-15 minutes et 1 test avec une séquence de 1 heure), des prélèvements sanguins, une mesure de masse grasse par ostéodensitométrie (1 heure), 2 tests de tolérance orale au glucose (120 minutes), une intervention chirurgicale (un clamp euglycémique/hyperinsulinémique avec pose d’un cathéter à la jugulaire et des prélèvements de sang à la veine caudale, durée 180 minutes) sur 260 jours de vie.
Impact sur les animaux
Les prélèvements de sang répétés à la queue peuvent occasionner une douleur de classe légère due l'apparition d'une croûte. La cicatrisation qui fait suite à la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire peut être gênante pour l'animal. La traite régulière de lait chez les mères peut engendrer une irritation des mamelles. Le gavage oral peut induire très exceptionnellement une fausse route.
Devenir
Les animaux sont gardés en vie d'une procédure à l'autre ou sont mis à mort à différents stades de développement (de J8 à J260) afin de prélèver les organes d'intérêt.
Remplacement
Tous les animaux utilisés pour ce projet proviennent d’élevages reconnus et sont nés en captivité. Il n’existe pas encore de méthode alternative (modélisations, modèles in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques dans la mise en place du diabète de type 2 chez la descendance en lien avec un diabète gestationnel (DG) et ceci, d’autant plus, que ce projet requiert un modèle d’étude de supplémentation nutritionnelle postnatale avec adoptions croisées pour mieux comprendre l’impact de la fenêtre de lactation sur cette programmation.
Réduction
Pour répondre au principe de réduction sans compromettre l’obtention de résultats statistiquement significatifs, nous utiliserons autant que possible le même animal (suivi longitudinal de la glycémie et l’insulinémie). L’effectif retenu de n=8 mâles et 8 femelles par groupe d’adoption représente un minimum nécessaire pour évaluer statistiquement une intervention nutritionnelle, prenant en compte le facteur sexe, avec une variabilité interindividuelle importante. Ce projet prévoit donc l’utilisation au maximum de 1332 individus sur une durée de 5 ans avec 372 rates Sprague-Dawley gestantes et allaitantes, 960 petits, mâles et femelles. Selon les résultats obtenus dans la première procédure expérimentale, le nombre de mères gestantes pourra être réduit dans la suivante. De même, si une différence d'effets selon le sexe est observée dans le suivi des descendants, la supplémenation postnatale ne sera mise en œuvre que sur la moitié des effectifs de ratons prévus.
Raffinement
Dans un souci de raffinement les animaux seront hébergés au moins 2 par cage pour le suivi de la descendance DG (sauf pour les périodes de gestation et de lactation des mères, où les mères seront seules avec leur portée après la mise-bas jusqu’au sevrage). Leur milieu de vie sera enrichi avec un tunnel et des frisottis leur permettant de faire leur nid, et de jouer. Aucune souffrance n’est attendue lors des manipulations nutritionnelles prévues : les rates en régime hypercalorique 1 semaine avant la conception et jusqu’à la fin de la gestation (4 semaines) ou jusqu’à la fin de la lactation (7 semaines) ne présentent pas d’obésité. Les animaux seront suivis par un personnel compétent dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale et manipulés quotidiennement (jeux, manipulations, caresses…) afin de réduire au maximum douleur et détresse et leur assurer un bien-être, en particulier après les chirurgies pour s’assurer de leur parfaite récupération. Les prélèvements de sang seront réalisés avec l’usage d’analgésiques afin de contrôler la douleur et dans des conditions d’asepsie nécessaires pour assurer des résultats reproductibles. Lors des prélèvements de lait, les rates seront anesthésiées et disposées sur un tapis chauffant. Pour les animaux, l’évaluation de la douleur sera faite à l’aide d’observations physiologiques (poids), comportementales (consommation de nourriture, fuite ou défense de l’animal à la manipulation, activité) et en fonction de l’apparence de l’animal (poil, posture). Lors des interventions chirurgicales, les animaux seront anesthésiés après avoir reçu un antalgique qui agira pendant et après l’opération. Jusqu’au réveil et au-delà, les animaux seront surveillés et une grille comportementale pour chaque animal sera complétée avec des points limites à partir desquels les animaux seront pris en charges pour supprimer leur souffrance avec des injections d’antalgiques ou seront mis à mort si cette souffrance est trop importante.
Choix des espèces
Le rat est un excellent modèle d’étude de la nutrition périnatale en raison de sa petite taille (permettant d'augmenter les effectifs et donc de diminuer la variance des mesures), et de sa rapidité de croissance et de reproduction, permettant de réaliser des protocoles expérimentaux en beaucoup moins de temps. Contrairement à l’espèce souris, l’espèce rat (en particulier la souche Sprague Dawley choisie) présente des grandes qualités maternelles, permettant de mener à bien cette stratégie expérimentale avec des adoptions croisées en limitant notamment les risques de cannibalisme et d’abandon lors des adoptions, et limite sa prise de poids sous régime calorique, permettant de s’affranchir du paramètre obésité dans cette étude. Enfin, le volume de lait collecté par rate fournira un matériel suffisant pour réaliser nos analyses individuelles de phénotypage du lait maternel de rate contrairement à la souris. Des femelles gestantes âgés de 8 semaines et de souche Sprague Dawley seront commandées. Ces femelles auront été soumises à un régime chow (CTL) ou HFHS, 1 semaine avant l’accouplement, chez le fournisseur d’animaux à qui nous aurons fourni l’aliment. A leur arrivée, les femelles seront en cage individuelle pendant la gestation et la lactation. Les rates utilisées pour les prélèvements de lait seront mises à mort en fin de procédure expérimentale N°1. Dans la procédure expérimentale N°2, 96 portées de 8 ratons (4 mâles et 4 femelles par mère adoptive, issus de mères biologiques différentes) seront constituées afin d’avoir au final 16 ratons (8 mâles et 8 femelles) par groupe d’adoption et par âge (6 temps). Ces groupes seront suivies durant la lactation (J8, J14), au sevrage à J21), au stade jeune (2 mois) et à long terme (âge adulte, 4 mois, sous régime standard et sous challenge hyper-énergétique durant 20 semaines).
Utiliser la pharmacothérapie pour prévenir et traiter les neurofibromes cutanés dans la neurofibromatose de type 1
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des molécules par gavage une à deux fois par jour, cinq jours par semaine pendant deux mois, avec des prélèvements de sang à la queue et des photographies de la peau sous anesthésie. Le porteur affirme que les neurofibromes cutanés ne sont pas douloureux et qu'aucune des procédures n'est douloureuse. Il indique qu'à sa connaissance aucun autre modèle animal ni système in vitro ne reproduit le développement de ces tumeurs liées à la neurofibromatose de type 1.
Objectifs
Le but de ce projet est d’utiliser la lignée NF1-KO,et d'identifier de nouvelles molécules qui régressent le développement des neurofibromes cutanés (NFc) dans la neurofibromatose de type 1. La neurofibromatose de type 1 (NF1) est une maladie génétique due à des mutations du gène NF1 codant pour la neurofibromine, régulateur négatif des fonctions cellulaires importantes telles que la prolifération, la différenciation, la survie et le métabolisme des cellules. Tous les patients NF1 développent des NFc, tumeurs bénignes au niveau des terminaisons nerveuses dont le nombre peut atteindre des milliers. A part leur exérèse chirurgicale, ce qui n’est pas possible quand leur nombre est élevé, il n’existe aucun traitement permettant de prévenir ou faire régresser leur développement. Nous avons développé le modèle de souris (NF1-KO), dans leque le gène NF1 est inactivé et qui récapitule le développement des NFc et qui est à l’origine des découvertes de premier plan concernant les mécanismes responsables de leur développement. Ce modèle vient d’être utilisé par notre équipe avec succès pour réaliser des essais précliniques des molécules candidates afin de prévenir/régresser le développement des NFc. Recemment nous avons développé deux versions du modèle, appelées curatif et préventif. Le modèle curatif consiste à traiter les animaux NF1-KO présentant des nombreux NFc afin d’identifier les molécules capables de régresser/bloquer leur développement. Le modèle préventif consiste à traiter les animaux mutants juste avant l’apparition des tumeurs afin d’éliminer les cellules à l’origine des NFc et de prévenir leur développement. Dans cette étude, c'est le modèle curatif qui sera utilisé.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de : (i) valider le protocole d'analyse qualitative et quantitative de l'efficacité des nouvelles molécules à regresser le développement des NFc. Ce protocole sera par la suite proposé à la communauté scientifique afin de tester les nouvelles molécules dans les mêmes conditions pour pouvoir comparer les résultats, (ii) définir l'efficacité des molécules testées seules ou en combinaison à regresser le développement des NFc (iii) identifier des éventuels effets secondaires liés au traitement.
Procédures
Administration (1 à 2 x/jour, 5 jours/semaine pendant 2 mois) des molécules par gavage sur animaux NF1-KO. Cette procédure ne nécessite pas l'anesthésie des animaux et sera réalisé par le personnel expérimenté. Il faut environ 1 min de contention de l'animal pour l'adminstration par gavage. La prélévement de sang se fera au niveau de la queue sur animaux non anesthésiés. La peau du dos des animaux sera photographiée sous une loupe à épifluorescence et sous anesthésie générale (AG). L'AG est de moins de 5min par souris ( rasage, epilation et prise de photos)
Impact sur les animaux
Récemment, deux études similaires ont été réalisées par notre équipe sans pour autant d'observer des effets indésirables pendant et à la fin du traitement. Les NFc ne sont pas douloureux et aucun effet indésirable n'a été observé liée à leur présence sur plus de 500 animaux NF1-KO. L'administration des nouvelles molécules peut provoquer des effets indésirables. Toutefois, les molécules testées dans ce projet ont déjà fait objet des études toxicologiques et ont été, ou sont, testés dans la cadre des études cliniques. Pour définir la gamme des concentrations des molécules nous nous sommes basées sur des données disponibles chez l'homme. Toutefois, en cas de présence d’effets nuisibles, le traitement sera modifié ou suspendu et si l’effet persiste, l’animal sera mis a mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la fin de la procédure 2 & 3. La peau des animaux sera prélevée puis analyser afin d'evaluer l'efficacité des molécules testées.
Remplacement
A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des NFc.
Réduction
Nous avons récemment réalisé une étude similaire d’administration systémique et topique d’un autre inhibiteur, qui a permis d'optimiser le protocole de traitement des souris et d’analyse des résultats. Ce travail nous a également permis de définir le nombre minimum d’animaux à traiter afin de réaliser les analyses décrites dans les procédures 2 et 3 et d’obtenir des résultats statistiquement valides. Enfin, la présence des nombreux neurofibromes dans 100% des animaux mutants cela permet de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Aucune des procédures utilisées pour administration des molécules et suivi des animaux n’est douloureuse et ne nécessite l’utilisation des traitements anti-douleurs. Lors de précédente étude (1 mois de traitement) nous n’avons observé aucun effet indésirable sur la perte du poids et le comportement des animaux. Le gavage sera effectué par le personnel expérimenté, qui a déjà réalisé ce type de traitements.
Choix des espèces
A notre conaissance, Il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des NFc. Nous utiliseront les souris NF1-KO males agés d'environ 4 moiscar dans notre modèle les NFc se developpent autour de 4 mois uniquement chez des males.
Développement d’un nouveau système de régulation génique contrôlé par la nutrition. Application à un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
318 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie sous anesthésie pour l'implantation de métastases hépatiques, puis des injections, des séances d'imagerie et une ponction cardiaque terminale. Le porteur indique que les effets indésirables attendus tiennent à la croissance des tumeurs et affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour tenir compte de la physiologie de l'organisme complet. Le projet vise à valider chez la souris un système de régulation d'un gène par la nutrition avant un éventuel transfert à l'humain.
Objectifs
ll est nécessaire de valider notre système de régulation génique par la nutrition dans un modèle de pathologie pour pouvoir envisager des tests cliniques chez l'homme. Nous avons choisi le modèle des métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC), pour son intérêt médical, sa faisabilité et son transfert rapide en médecine humaine. En effet, le foie est le site privilégié des métastases du cancer colorectal puisqu'il concerne 50% des patients, avec seulement 25% de survivants à 5 ans. Par ailleurs, notre voie de régulation est très réactive dans le foie. Nous avons ainsi choisi d’utiliser ce système de régulation génique dans un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC) par induction contrôlée du gène apoptotique TRAIL.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons maintenant valider notre approche de régulation génique par la nutrition dans un modèle animal pour le traitement d’une pathologie de façon à pouvoir rapidement transférer cette technologie à l’homme. Nous avons choisi d’utiliser ce système de régulation génique par la nutrition dans un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC) par induction contrôlée du gène apoptotique TRAIL.
Procédures
Les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie gazeuse pour implanter les métastases hépatiques (Procédure 1, 30 min par souris). Cette procédure inclut également une injection en sous-cutané d'un analgésique sur animal vigile (10 à 15 min avant la chirurgie). Un agent de contraste sera injectée en intra-péritonéal sur animal vigile avant anesthésie gazeuse pour évaluation de l'expression génique par imagerie optique 2 fois par semaine (Procédure 2, 15 min par souris). L'expression génique sera induite par une injection d'un plasmide porteur du gène d'intéret dans la veine de la queue au début de l'expérimentation, sur animal vigile (Procédure 3, 10 min par souris). Un anticorps sera injecté en intra-péritonéal sur animal vigile une fois par semaine (Procédure 5, 1 min par souris). Du sang sera prélevé chez ces souris, 2 fois au cours de l'expérimentation esur animal vigile (Procédure 6, 2 min par souris) et à la fin de l'expérimentation par ponction intra-cardiaque sous anesthésie gazeuse (Procédure 7, 2min par souris).
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n'est attendu concernant les procédures d'injection d'agents de contrastes ou de plasmides ou d'anticorps dans ce modèle. Les effets indérisables potentiels attendus sont liés à la croissance des métastases tumorales. Le suivi quotidien des animaux permettra de réagir rapidement en cas de signe d'inconfort et/ou de souffrance pour l'animal.
Devenir
Les animaux seront réutilisés pour les procédures 1 à 6. A l'issue de la procédure 7 les animaux seront anesthésiés par anesthésie gazeuse à l'isoflurane puis sacrifiés par ponction cardiaque.
Remplacement
De nombreuses expériences préliminaires réalisées in vitro ont permis de tester l'efficacité de notre stratégie. Ces expériences ont permis dans un premier temps d'éviter d'expérimenter sur des souris. Pour la suite de notre étude, le recours à l'animal est indispensable afin de prendre en compte la physiologie à l'échelle de l'organisme complet.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque expérience est calculé au minimum en fonction du test statistique retenu. Cependant, étant donné l'hétérogénéité inter-animal notamment pour le développement des métastases hépatiques, il s'avère indispensable de répéter les expériences.
Raffinement
Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition tube plastique rouge et/ou bille métallique). Pour chaque expérience, des points limites (perte de poids, prise alimentaire, comportement...) seront définis et des groupes "contrôles" adaptés au protocole seront constitués. Si un animal présentait un état douloureux inacceptable ou des signes de mal-être important, il sera examiné par un responsable de la mise en œuvre du projet, et si nécessaire, anesthésié puis euthanasié. Par ailleurs, nous suivrons l'évolution des métastases de façon non invasive par imagerie in vivo.
Choix des espèces
La souris est l'animal de référence dans ce type d'étude. Les souris utilisées dans ce projet sont de fond génétique C57 Bl/6. Des souris mâles jeunes adultes de 3-4 mois sont utilisées pour le modèle murin de MHCC. Stade adulte (3-4 mois) afin de s’affranchir des effets liés au développement de l’animal ou par la suite de ceux liés au vieillissement.
Intérêt des régimes mixtes herbe verte + ensilage de maïs pour accroître l’efficience azotée des vaches laitières et réduire les pertes d’azote vers l’environnement
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
5 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis éventuellement réintégrées au troupeau non expérimental. Hébergées en stabulation entravée pendant quinze semaines, elles subissent des prélèvements sanguins et des prélèvements répétés de jus de rumen par une canule, avec collectes totales d'urine et de fèces sur cinq jours par période. Le porteur indique que certains régimes peuvent réduire l'ingestion et la production laitière. Il affirme qu'aucune autre approche ne peut remplacer la vache pour étudier les flux d'azote, notamment au sein du rumen.
Objectifs
Dans l’objectif d’atteindre la multi-performance, les élevages laitiers doivent mieux valoriser les ressources alimentaires, notamment celles non consommables par l’homme, comme les fourrages, distribués frais ou conservés. Les conséquences de ces associations de fourrages conservés et pâturés (ou distribués en affouragement vert) sur les performances animales, la possibilité de réduire les intrants, l’efficience d’utilisation de l’azote et la composition des effluents doivent être approfondies. Cet essai aura pour but de suivre les variations de flux d’azote à l’échelle de la vache laitière lorsque celle-ci est nourrie avec des rations associant herbe fraiche et ensilage de maïs selon des proportions variables. Il sera réalisé à l'auge afin de pouvoir mesurer précisément les flux d'azote (ingéré et excrété) à l'échelle individuelle et de la journée. Cinq traitements expérimentaux seront comparés : un traitement à base d’une ration mélangée d’ensilage de maïs et de tourteau de soja en proportion 85/15, 3 traitements permettant l'ajout progressif d’herbe verte à cette même ration mélangée maïs-soja, à hauteur de 25, 50 et 75% d’herbe verte, et 1 traitement à base d’herbe verte seule.
Bénéfices attendus
L’influence des traitements sur la composition des effluents (urine seule, fèces seuls, lisiers reconstitués) sera évaluée afin d’estimer les pertes d’azote vers l’environnement, potentiel source de pollution, et le potentiel d’émission de NH3. Le suivi en cinétique des paramètres fermentaires dans le rumen (ammoniac, acides gras volatiles, pH), et de la caractérisation de l'activité fermentaire du rumen (dégradation d'un aliment témoin permettront de caractériser les conséquences de ces stratégies d'alimentation sur la dynamique des fermentations, la digestibilité de l'azote et la valeur protéique réelle des rations étudiées.
Procédures
Cet essai concerne des animaux vigiles qui seront hébergés en stabulation entravée, durant 15 semaines (3 semaines de mesures de référence, puis 4 périodes de 3 semaines). Les vaches seront nourries à volonté et traitent 2 fois par jour. Des échantillons de lait seront prélevés à la traite (10 traites par semaine). Lors des mesures de bilan ingestion-excrétion d’azote, des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine caudale, à raison de 4 par périodes (soit 16 au total), chaque prélèvement de sang durant 5 minutes maximum (nettoyage de la peau et prélèvement de sang). Des collectes totales d’urine et de fèces seront aussi réalisés pendant 5 jours consécutifs par période, en continu. Des mesures de l’activité fermentaire du rumen seront aussi réalisées, avec les prélèvements en cinétique de jus de rumen par la canule à raison de 10 prélèvements par période, de 5 minutes maximum chacun répartis sur 1 journée (soit 40 prélèvements au total), ainsi que des mesures de dégradabilité in sacco avec incubation de coques de soja dans le rumen sur une période de 24h, 1 fois par période (soit 4 fois au total, 5 minutes de pose et de retrait des sachets dans le rumen).
Impact sur les animaux
Il est possible que certains des régimes étudiés entrainent une baisse des quantités d'aliments ingérées et donc une baisse de production laitière. Quantifier les effets de ces régimes sur l’ingestion et la production des animaux est un des objectifs de l’essai. Toutefois ces cinq traitements sont des rations pratiquées en élevage qui ne devraient pas entrainer de conséquences néfastes sur la santé des animaux.
Devenir
Suite à l’estimation de l’état général des animaux en fin d’essai, la décision pourra être prise par le responsable de l'installation de réintégrer ces vaches dans le troupeau non expérimental. Si une alerte au niveau de l’état général d’un animal le justifiait, la cellule bien-être (SBEA) et le vétérinaire seraient consultés.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux par une autre approche pour cet essai car le but est d’étudier les flux d'azote à l'échelle de la vache, incluant des mécanismes de recyclage/mobilisation notamment au sein du rumen et par la salive.
Réduction
Le schéma expérimental en carré latin ainsi que l'analyse statistique des données permettront de répondre aux objectifs scientifiques tout en limitant le nombre de vaches à 5 dans ce projet. L’utilisation d’un carré latin permet que chaque animal soit son propre témoin, pour ainsi réduire le plus possible le nombre de vaches tout en gardant une puissance statistique suffisante pour montrer les effets des traitements expérimentaux. L'utilisation d'analyses de variance permettra de tester l'influence du facteur "proportions d’herbe verte" sur les variables de production (ingestion, production laitière...) et de flux d'azote (azote ingéré, azote excrété dans le lait, l'urine, les fèces) en corrigeant des effets "vache" et "période".
Raffinement
Les animaux seront élevés et suivis conformément aux règles d’élevage et de bonnes pratiques en place dans l’élevage. Un suivi régulier du comportement des animaux sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou de douleur. Les animaliers chargés du suivi ont tous une solide formation en élevage laitier et sont sensibilisés à la douleur animale. Le suivi régulier par le vétérinaire sanitaire assure également la bonne santé des animaux. Des points limites adaptés ont été définis afin d’éviter au maximum toute forme de souffrance des animaux. En cas de problèmes détectés, les animaux seront isolés et soignés selon les prescriptions du vétérinaire. Les régimes testés, classiques, n'induiront a priori aucune douleur ou souffrance.
Choix des espèces
Les vaches laitières utilisées seront de race Prim’Holstein. Pour diffuser les résultats, la race Prim’Holstein, qui est la race la plus répandue dans le monde en bovin lait, est la race appropriée.
Etude du déplacement des truites porteuses de larves de moule perlière
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
200 truites sauvages vont être capturées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchées après intervention. Le porteur décrit une capture par pêche électrique suivie de l'insertion chirurgicale d'une marque dans la cavité abdominale sous anesthésie, une seule fois par animal. Il indique que tous les poissons sont remis à l'eau après contrôle sanitaire et récupération complète de l'anesthésie. L'objectif affiché est de suivre les déplacements de truites porteuses de larves de moule perlière entre un bief et un cours d'eau.
Objectifs
Le tronçon de cours d’eau et son bief, objet de l’étude, abrite la plus importante population de moules perlières du bassin versant. Les différentes études conduites sur le site montrent que la population de moules perlières est vieillissante, pas ou très peu renouvelée, et pourrait disparaitre à moyen terme (une vingtaine d’années). Les observations régulières de glochidies (stade larvaire enkysté des larves de moules) sur les branchies de truite confirment cependant la reproduction des moules sur le bief mais celle-ci ne présume pas de l'accomplissement du cycle biologique de l'espèce au-delà de ce stade, notamment de la réussite du développement benthique des jeunes moules. En effet, les très rares observations de juvéniles pourraient indiquer la très faible survie de ces individus, pour des raisons qui restent encore à préciser (colmatage des substrats…). Le cours d’eau à proximité du bief pourrait présenter des habitats de meilleur qualité pour les moules que ceux du bief, du fait notamment du moindre colmatage des fonds. Les études piscicoles ont montré par ailleurs une densité de truites relativement faible dans le bief si on la compare à celle du cours d’eau principal. Sur ces constats, la question se pose de l’interaction de la population de moule du bief entre les deux milieux : que deviennent les glochidies produites par les moules du bief une fois fixées sur les truites ; parviennent-elles, au moins pour une partie, à rejoindre le cours d’eau et disséminer ainsi l’espèce depuis le bief ? Répondre à ces interrogations et caractériser le rôle éventuel du bief comme « réservoir biologique », pour la population de moule perlière, nécessite de comprendre le déplacement des truites porteuses des glochidies entre les deux milieux aquatiques.
Bénéfices attendus
Comprendre et mesurer les déplacements des truites entre le bief et le cours d'eau qui l’alimente et caractériser le rôle du bief comme « réservoir biologique » pour la population de moule perlière, c’est-à-dire comme milieu (« hot spot » de biodiversité) à partir duquel l’espèce pourrait se disséminer dans la rivière et participer ainsi à accroitre sa population.
Procédures
Capture de poissons sauvages par pêche électrique puis insertion chirurgicale, sous anesthésie générale, de marques semi actives, de type Pit-Tag, dans la cavité péritonéale (temps d'intervention 10 minutes maximum). Une seule opération de ce type est effectuée par animal.
Impact sur les animaux
Insertion de marques PIT-tags dans la cavité péritonéale des truites, suite à anesthésie générale et incision (temps d'intervention 10 minutes maximum). Une seule opération de ce type est effectuée par animal, le déplacement de ce dernier, ou son bien-être n'est pas modifié par la présence de la marque. Toutes les précautions sont prises lors de l'intervention chirurgicale pour limiter le risque d'infection. En ce qui concerne les opérations d’échantillonnage par pêche électrique, ces dernières sont mises en œuvre par du personnel formé, elles sont encadrées et réglementées par arrêté préfectoral. Toutes les dispositions sont prises pour assurer la sécurité des personnes (port des EPI, utilisation du matériel certifié) et limiter au maximum le risque de blessures ou de dommages vertébraux sur les poissons (réglage des appareils en fonction de la conductivité et de la température de l’eau). Le ratio taille (poids) de la marque / taille (poids) de l'individu sera évidemment respecté en utilisant des transpondeurs de type « Pit-tag » de tailles 12, 13 et 23 mm adaptées à la taille et au poids des poissons marqués (le poids du Pit-tag ne devant pas dépasser 2% du poids de l’individu). Dans notre cas la taille minimum des poissons marqués sera de 100 mm et la taille maximale de 250 mm. Les poids respectifs des individus iront de 30 g à 350 g.
Devenir
Le but de cette étude étant de connaitre les déplacements des truites porteuses de glochidies de moule dans le temps, tous les animaux capturés temporairement pour les besoins de marquage seront relâchés immédiatement après l’intervention.
Remplacement
La capture et le marquage in situ d’un certain nombre d’individus de truite sont rendus nécessaires pour les besoins de l'étude. S’agissant d’une expérimentation en milieu naturel sur des espèces sauvages (truite et moule perlière), il n’est pas envisageable de réaliser cette étude in vitro ou en conditions contrôlées avec des poissons d’élevage qui ne reproduiraient pas le comportement des poissons sauvages.
Réduction
La taille de l'échantillon doit être suffisante pour dégager des résultats fiables et statistiquement interprétables. Le test statistique paramétrique dit U de Mann-Whitney sera utilisé afin de vérifier l’hypothèse de sélectivité de franchissement des obstacles en fonction de la taille des individus, ainsi que des tests non paramétriques (AFC ou ACP)). Les opérations de marquages prévoient un objectif d’une centaine de truites par an pendant 2 ans, soit 200 truites sur la durée totale de l’étude. Cette taille de l’échantillon (tailles des populations de truite estimées à environ 300 individus dans le bief et plusieurs milliers dans le cours d'eau à proximité du bief) sera suffisante pour répondre nos interrogations quant au déplacement de l’espèce porteuse de glochidies de moule entre le bief et le cours d’eau.
Raffinement
Toutes les manipulations se feront sous anesthésie par du personnel qualifié sur le site d’étude. L'ensemble des poissons ne sera remis à l'eau qu’après contrôle de l’état sanitaire (absence de lésions) et récupération totale de l’anesthésie. Les points limites (comportement du poisson lors de l’anesthésie, pigmentation anormale liée au choc électrique) sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la souffrance de l’animal et exclure des individus avant intervention chirurgicale le cas échéant. Suite aux recommandations du vétérinaire-référent, l’anesthésie sera réalisée par balnéation dans une solution de benzocaïne Benzoak®avec une posologie de 25mg/L. Compte tenu du caractère nouveau de l’emploi de cette molécule dans nos procédures, si nous constatons sur les 10 premiers poissons que la mise en place de ce nouveau protocole d’anesthésie est difficilement maitrisable, nous reviendrons à un protocole initial, utilisé jusqu’alors et maitrisé, via la balnéation dans une solution d’iso eugénol Aqui-S à 8mg/L sur le reste de notre procédure.
Choix des espèces
La truite commune, (Salmo trutta fario) est l'espèce cible de l'étude à travers son rôle de poisson hôte pour la moule perlière (Margaritifera margaritifera). Ce sont bien les truites qui seront capturées et marquées pour être suivies dans leurs déplacement entre les milieux aquatiques (bief et cours d’eau). Les moules ne feront pas l’objet de manipulation et seront simplement comptées à leur stade larvaire fixé sur les branchies de la truite. Nos suivis antérieurs sur le site d’étude ont montré que les stades juvéniles immatures de truite étaient en majorité parasités par les larves de moule (54% de truitelles d’un an et 38% de truites sub-adultes), ces cohortes étant numériquement dominantes dans le milieu aquatique au moment de la reproduction estivale des moules. Ce sont donc ces stades de développement des truites qui seront majoritairement marqués.
Mise au point et caractérisation de greffes de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour la mise en place de nouveaux modèles d’études précliniques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de trente minutes sous anesthésie pour l'injection de cellules tumorales dans l'hypophyse, puis des prélèvements sanguins hebdomadaires et un prélèvement terminal. Le porteur indique que les tumeurs peuvent, comme chez l'humain, provoquer une compression intracrânienne, des maux de tête et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision, mais estime que le suivi hormonal évitera ces stades avancés. Il affirme ne pas pouvoir remplacer le modèle murin par des approches in vitro et présente cette greffe intra-hypophysaire comme plus représentative que la greffe sous-cutanée.
Objectifs
Les tumeurs hypophysaires humaines ont une incidence élevée (1 personne/1500). Ces tumeurs bien que bénignes provoquent des maux de tête, des troubles visuels et peuvent être invasives dans certains cas. Elles répondent mal aux traitements thérapeutiques, il est donc indispensable de trouver de nouvelles molécules pouvant limiter leur développement. Malgré leur fréquence importante chez l’homme, il existe peu d’outils d’étude pour caractériser le comportement de ces tumeurs, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et tester de nouveaux traitements cliniques. Leur étude est donc tributaire de modèles précliniques qui soient représentatifs des tumeurs hypophysaires humaines. Bien que le nombre de lignées tumorales soit limité et la mise en culture de cellules dérivées de tumeur soit délicate, la greffe de ces différents modèles sous la peau des souris constitue actuellement la seule possibilité de modèle préclinique pour mettre au point et valider de nouveaux traitements thérapeutiques. Les greffes sous-cutanées sont toutefois peu représentatives du contexte intracrânien dans lequel se développent et évoluent ces lésions tumorales chez l’Homme. Notre projet vise donc à tester la faisabilité et à développer un modèle expérimental de greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour disposer de modèles précliniques relevant qui permettront : i) d’étudier le comportement et la biologie de différentes lignées et cellules tumorales hypophysaires dans leur environnement naturel de développement et ii) de valider de nouveaux modèles précliniques pour évaluer l’effet de drogues thérapeutiques qui sont actuellement uniquement testées in vitro. La mise en place et la validation de ces nouveaux modèles de greffes intra-hypophysaires seront réalisées par le biais d’une micro-injection automatisée dans l’hypophyse de souris sur des animaux profondément endormis. Nous avons identifié les coordonnées d’injection dans l’hypophyse sur une cohortes d’animaux de réforme déjà morts. Notre projet visera à confirmer que ces coordonnées sont adaptées et ne varient pas si elles sont utilisées pour des injections sur animaux anesthésiés. Nous testerons ensuite l’efficacité de prise de greffe des 5 lignées tumorales hypophysaires de rongeurs disponible mais également de 20 suspensions cellulaires issues de tumeurs humaines issues de 2 sous types tumoraux. Les tumeurs seront collectées pour étude et mises en culture pour établir de nouveaux outils cellulaires
Bénéfices attendus
Notre projet vise à développer de nouveaux modèles précliniques pour l’étude biologique et le développement d’outils thérapeutiques dédiés aux atteintes tumorales de la glande hypophysaire. Il devrait permettre de mieux comprendre la complexité de ces tumeurs particulièrement fréquentes dans la population (1 cas / 1500) et mieux saisir l’impact de leur niche environnementale naturelle (i.e. l’hypophyse antérieure) sur leur comportement et leur évolution. Notre projet devrait également permettre d’engendrer de nouvelles lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche et ainsi limiter à long terme l’usage de modèles animaux.
Procédures
Lors de l’injection des cellules tumorales dans leur hypophyse, les animaux subiront une chirurgie de 30 minutes maximum sous anesthésie générale et sous analgésie. Cette acte n’aura lieu qu’une fois. Un prélèvement de sang sera ensuite réalisé sur ces animaux chaque semaine afin d’identifier toute augmentation d’hormone qui pourrait suggérer un développement tumoral. Une variation trop importante (supérieur à 35% ) des concentrations circulantes d’hormones mesurées avant la greffe conduirait alors à un arrêt immédiat de l’expérimentation. Un prélèvement terminal de sang sera réalisé à la fin de chaque procédure, il sera cependant réalisé sous anesthésie profonde avant leur mise à mort finale.
Impact sur les animaux
Un acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie pour injecter les cellules dans l’hypophyse. La greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse entrainera le développement de lésions tumorales intracrânienne. Ces lésions pourront comme chez l’homme entrainer une compression intracrânienne, conduisant à des maux de têtes et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision. Grâce au suivi des hormones produites par ces tumeurs, les souris ne devraient toutefois jamais atteindre ces stades tumoraux avancés qui sont fréquemment retrouvés chez l’homme et sont déclencheurs d’une chirurgie. Après injection, un prélèvement sanguin de 50 à 100uL sera également réalisé chaque semaine par une ponction à la veine caudale sous contention chez les animaux greffés afin d’assurer le suivi de la progression tumorale par un dosage hormonal. L’utilisation d’un ciment biologique pour colmater le site d’injection ne devrait pas entrainer de gêne.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procedures experiemntales réalisées. Nous procéderons à un prélèvement sanguin final qui servira à réaliser des dosages d’hormones et de molécules secrétées par les lésions cancéreuses. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les tumeurs collectées post-mortem, Des analyses histologiques et moléculaires complémentaires permettront d’exploiter au mieux nos résultats. Les tumeurs collectées derivé de patients seront également mise en culture pour générer de nouveaux outils cellulaires qui nous permettront de travailler in vitro et limiter ainsi nos besoins d’expérimentation sur l’animal.
Remplacement
Les modèles de greffes tumorales dans les tissus où se développent naturellement les tumeurs greffées représentent actuellement les modèles précliniques les plus convaincants, car ils permettent d’étudier le comportement des cellules tumorales (pousse tumorale, remodelage du microenvironnement, réponse à certains traitements, …) dans leur environnement cellulaire natif. En raison de la nature complexe de la recherche proposée, qui vise à évaluer la prise de greffe et l’impact de l’environnement hypophysaire sain sur la progression tumorale de cellules injectées, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro.
Réduction
Afin de nous conformer à la règle de réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre le taux de succès de nos greffes et l’obtention d’un nombre suffisant de tumeurs dont nous pourrions étudier les caractéristiques moléculaires. Afin de limiter l’utilisation d’animaux, nous avons au préalable mis au point toute notre procédure d’injections sur des animaux morts de réforme. Dans le cadre des travaux proposés, 9 souris par sexe devraient nous permettre d’aboutir à l’obtention de 7 tumeurs dont les traits moléculaires pourront être étudiés et comparés entre eux. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale ni de test statistique, notre procédure se limitant à la mise au point d’un nouveau modèle préclinique. La greffe de 400 souris au maximum sur 5 ans nous permettra de confirmer la faisabilité et la reproductibilité de nos modèles de greffes de lignées cellulaires et étudier la prise éventuelle de plusieurs greffes humaines parmi les injections des cellules issues des 20 tumeurs humaines qui seront utilisées.
Raffinement
Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, comportement erratique, altération des constantes hormonales, …). L’identification de ces signes entrainerait alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Le suivi individuel des animaux permettra également de mieux saisir : i) la reproductibilité des greffes réalisées et ii) d’évaluer le nombre d’animaux statistiquement nécessaires qui devront être étudiés en cas de test de molécules thérapeutiques à venir. Les analyses post-mortem que nous réaliserons sur le matériel biologique collecté nous permettrons de valider l’intérêt de ce modèle en comparaison des greffes sous-cutanées et de dériver d’éventuels nouveaux modèles cellulaires de lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche.
Choix des espèces
Le modèle de souris Rag2KO, possède un système immunitaire appauvri. Il s’agit d’un modèle indispensable pour greffer du tissu humain ou des lignées rongeurs de fonds génétiques mixtes afin qu'il n'y ait pas de rejet du greffon. Le modèle Rag2KO est de plus un modèle réceptif aux lignées choisies et aux tumeurs humaines hypophysaires que nous avons déjà pu greffer avec succès en sous-cutané. Nous y avons mis au point les coordonnées stéréotaxiques pour cibler l’hypophyse. Il est donc idéal pour les greffes dans l’hypophyse que nous souhaitons faire et il nous permettra également l’étude du microenvironnement et de l’interaction entre la tumeur et son environnement. Les protocoles d’injection seront réalisés sur des souris âgées de 12 à 16 semaines. Ce sont à ces âges que nous avons validé nos 70% d’efficacité d’injection avec les coordonnées définies.
Effets d’une exposition maternelle et/ou développementale à de faibles doses d’un pesticide contenant du manganèse, chez la souris C57bl6J mâle et femelle. Caractérisation des altérations métaboliques dans le foie et le tissu hématopoïétique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Exposées via leur mère au maneb, un pesticide contenant du manganèse, puis pour certaines à un régime gras et sucré, elles subissent perçage des oreilles, gavages d'huile, injections de glucose ou d'insuline et prélèvements de sang à la queue, avant un prélèvement terminal à l'œil. Le porteur affirme que ces actes ne développent pas d'anxiété chez l'animal. Il revendique l'étude sur l'"animal entier" et présente le projet comme apportant des preuves pour réduire l'usage des pesticides.
Objectifs
L’exposition des travailleurs agricoles aux fongicides utilisés pour lutter contre la présence des champignons parasites des fruits et légumes a des effets négatifs en santé humaine. Ainsi, des études préliminaires indirectes suggèrent que le foie et la moelle osseuse (site de production des cellules du sang) sont des tissus cibles en particulier des fongicides contenant du manganèse comme le maneb à des doses compatibles avec une exposition environnementale. Or, en fin de vie fœtale, le foie qui est initialement un organe hématopoïétique (site de fabrication des globules rouges) va acquérir les fonctions retrouvées à l’âge adulte comme des fonctions nutritionnelles (régulations du métabolisme des glucides, des lipides) et antitoxiques (polluants, médicaments). Ces fonctions sont essentielles à la vie. Elles permettent la régulation de la glycémie (taux de sucre dans le sang), la détoxification des polluants et médicaments et elles s’opposent au stockage de lipides appelé stéatose hépatique. Les objectifs sont de démontrer par des preuves directes sur l’animal entier (1) si le foie est une cible du maneb tout au long du développement depuis la vie fœtale jusqu’au stade adulte ; (2) si une exposition à doses faibles pendant la vie fœtale va modifier la fonction hématopoïétique du foie fœtal et l’acquisition des fonctions dites « adultes »; (3) si une exposition au maneb prédispose à la prise de poids et aggrave la stéatose hépatique lorsque les souris sont nourries avec un régime riche en graisses et en sucre à l’âge adulte pour mimer le régime appelé « Western-diet »; (4) Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles afin de déterminer s’il existe des effets dépendants du sexe. Un total de 342 souris seront nécessaires pour ce projet. Chaque souris sera suivie individuellement afin de collecter un maximum de données biologiques et limiter la quantité totale de souris pour l’obtention de données statistiques fiables et interprétables.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’identifier si l’obésité, les maladies hépatiques liées à l’obésité ou si certaines maladies du sang pourraient être la conséquence d’une exposition au maneb en particulier pendant la vie fœtale. En effet, les doses utilisées dans ce projet sont compatibles avec une exposition environnementale. La réalisation de ce projet pourra avoir de fortes implications en termes de recommandations notamment pour les femmes en âge de procréer et pour la sécurité des marchés alimentaires. Ce projet fournira des arguments et des preuves scientifiques aux autorités politiques pour soutenir la réduction de l'utilisation massive des pesticides contenant du manganèse comme le maneb, dans le monde, et notamment dans les mélanges extemporanés de pesticides appelés « bouillies » qui font l’objet d’une règlementation.
Procédures
Les interventions sont nutritionnelles (exposition au maneb par l’alimentation et exposition à un régime riche en graisses et en sucres, classiquement appelé Western diet). Les interventions incluent des prélèvements sur des animaux vigiles (éveillés) après une mise à jeun de courte durée (6 heures). Il s’agit de prélèvements de sang à la queue et du prélèvement terminal à l’œil (après dépôt d’un analgésique). Cela permet de suivre l’état métabolique de la souris comme le taux de sucre dans le sang ou d’insuline ou des lipides en réponse à une injection soit de glucose (sucre), d’insuline ou un gavage d’huile alimentaire ait été réalisé. La durée totale des tests est de moins de 90 minutes (5 prélèvements pour dosage de la glycémie ou du taux d’insuline) et de moins de 4 heures (4 prélèvements pour dosage des lipides). Chaque prélèvement en lui-même dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont de classe légère (procédure 3) ou modérée (procédures 1 et 2). La présence de maneb dans le régime alimentaire est très faible et ne devrait pas perturber la prise alimentaire. La quantité de nourriture contaminée proposée aux souris correspond à la dose sans effet toxique. De même, le régime riche en graisses et en sucres est bien accepté des souris. La souris étant un animal nocturne, la mise à jeun (limitée à 6 heures entre 7h30 et 1 3h30) n’a pas de conséquence sur l'état général, les biberons d’eau n’étant pas enlevés. Les autres nuisances incluent le perçage des oreilles, les gavages d’huile, les injections de glucose ou d’insuline et l'incision très fine au niveau de la queue à l’aide d’un scalpel, ou le prélèvement rétro-orbital après dépôt d’un analgésique. Enfin, les animaux sont anesthésiés avant la mise à mort. Ces actes sont pratiqués par du personnel compétent et ne développent pas d’anxiété chez l’animal.
Devenir
Tous mis à mort en raison des prélèvements d’organes réalisés sur tous les animaux expérimentés
Remplacement
La réalisation de ce projet vise à étudier les conséquences d’une exposition maternelle au fongicide maneb sur le développement des souris jusqu’à l’âge adulte. Ce projet vise aussi à étudier l’effet aggravant d’une exposition maternelle au maneb sur le développement des maladies liées à l’obésité. Enfin, ce projet vise à étudier la transition fonctionnelle du foie dans le fœtus exposé via la mère au maneb en comparaison de fœtus issus de mères non exposées. En conséquence, ce projet implique trop de mécanismes susceptibles d’interagir en même temps, les conséquences sont très nombreuses et ne peuvent donc pas être étudiées autrement que sur l’animal entier. Enfin, la dépendance avec le sexe est un paramètre également difficilement analysable autrement que sur l’animal entier.
Réduction
Le projet est original au sens où il n’a encore jamais été mené. Le nombre de souris est calculé au plus juste pour obtenir des résultats exploitables et tirer des conclusions qui puissent faire poids auprès des évaluateurs du risque pour diminuer l’utilisation des pesticides en France et en dehors de la France. Au total sur les 5 années, le nombre d’animaux sera de 342 animaux
Raffinement
Pendant toute la durée des études, les souris sont surveillées individuellement 3 fois par semaine pour les souris adultes et au moins 5 fois lissés sur la semaine entière au moment de la gestation, la mise-bas et l’allaitement. Du coton est déposé dans la cage pour que la femelle puisse faire son nid et maintenir au chaud sa portée. Les études sont réalisées dans une pièce au calme. Une surveillance accrue sera réalisée chez les mères allaitantes n’ayant pas développé un comportement maternel. Dans ce cas, les petits de la cage seront déplacés dans des cages d’adoption après les avoir mouillés avec de l’urine des petits de la cage naturelle pour qu’ils soient acceptés par la mère d’adoption. Le test métabolique de sensibilité à l’insuline consiste à vérifier que le taux de sucre dans le sang diminue bien après une injection d'insuline; sinon , on parle de résistance à l'insuline. Lors de la réalisation de ce test, il peut arriver qu’une souris soit en hypoglycémie (baisse trop importante du taux de sucre dans le sang). Dans ces conditions, une injection de glucose est immédiatement réalisée et la souris est installée dans du coton supplémentaire pour éviter l’hypothermie (froid). Un analgésique (anti-douleur) est utilisé pour permettre le prélèvement sanguin à l’œil sans souffrance et les animaux sont anesthésiés avant la mise à mort.
Choix des espèces
La souris a de nombreuses caractéristiques « proches » de celles de l’homme. Le projet vise à étudier les effets nocifs liés à l’exposition au maneb dans un modèle souris, en particulier lorsque l’exposition a lieu pendant la période maternelle, une période de haute sensibilité aux polluants. Cela nécessite d’étudier à la fois les fœtus en réponse précoce à l’exposition et les individus une fois devenus adultes, à la fois les mâles et les femelles. Les souris utilisées répondent très bien aux régimes dits obésogènes qui sont riches en graisses et en sucres au sens où les souris vont prendre du poids en les consommant et présenter un certain nombre de désordres métaboliques retrouvés chez l’homme et liés à l’obésité comme le stockage de lipides dans le foie (stéatose hépatique). Or, obésité et stéatose touchent aujourd’hui 20% de la population en France (plus de 35% aux US) ; ce qui en fait aujourd’hui des problèmes majeurs de Santé Publique.
Effet d’un régime cétogène sur le métabolisme cérébral chez le rat EU1/2 (porteur)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque semaine, un prélèvement d'urine les isole une nuit de 14 à 16 heures dans une cage sans litière ni enrichissement, situation que le porteur décrit lui-même comme probablement aversive. Après six semaines de régime cétogène, ils sont anesthésiés pour un prélèvement de liquide céphalorachidien et d'organes ou pour un enregistrement intracérébral de 4 à 6 heures, sans réveil. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de recourir à l'animal vivant, le remplacement in vitro étant selon lui impossible actuellement.
Objectifs
Le métabolisme cérébral s’adapte à la nutrition, ce qui peut avoir des conséquences considérables sur la santé mentale et les maladies neurologiques. Par exemple, les effets bénéfiques du jeûne ont été reconnus dès l’antiquité, notamment sur l’épilepsie. Le jeûne peut être remplacé par des régimes moins contraignants comme le régime cétogène, riche en graisses et appauvri en protéines et en sucres. Ce régime est caractérisé par un apport calorique diminué et une augmentation plasmatique de corps cétoniques, un état interne appelé cétose. Les effets bénéfiques de la cétose s’étendent au-delà de l’épilepsie, à un large ensemble de problématiques comme un meilleur vieillissement, une augmentation de l’espérance de vie et une protection contre les maladies neuro-dégénératives comme les maladies de Parkinson ou d’Alzheimer. Ce projet testera l’hypothèse selon laquelle l’administration de corps cétonique chez des patients ou chez des animaux pourrait constituer une stratégie neuroprotectrice, notamment après un accident vasculaire cérébral ou un traumatisme crânien. Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer l’effet neuroprotecteur du régime cétogène. D’abord, une modulation de la fonction mitochondriale combinée à une augmentation d’enzymes antioxydantes qui pourraient diminuer le stress oxydant des neurones et des cellules gliales. Ensuite un changement de l’équilibre entre neurotransmetteurs excitateurs et inhibiteurs en faveur de l’inhibition pourrait expliquer une diminution de l’excitabilité des réseaux neuronaux et une amélioration de la fréquence et de la sévérité des crises d’épilepsie.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ce projet permettra de mieux comprendre les effets métaboliques du régime cétogène à la fois sous l’angle des concentrations basales de métabolites, et de façon dynamique, au cours d’une épreuve métabolique modélisée par une dépolarisation corticale envahissante. Cette approche permettra de comprendre dans quelle mesure le régime cétogène affecte le fonctionnement basal du cerveau ainsi que sa capacité à répondre à une stimulation. Elle permettra aussi de tester pour la première fois in vivo l’hypothèse selon laquelle le régime cétogène diminue la disponibilité des neurotransmetteurs excitateurs comme le glutamate et le stress oxydant, représenté ici par le monoxyde d’azote. L’ensemble des connaissances obtenues au cours de ce projet permettra de d’évaluer si le régime cétogène ou la cétose en général peut représenter un état neuroprotecteur et dans quelle mesure induire cet état chez des patients cérébrolésés peut améliorer leur évolution clinique.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements d'urine une fois par semaine pendant sept semaines. Ce prélèvement dure une nuit au cours de laquelle l'animal est isolé sans enrichissement. A la fin des six semaines de régime alimentaire contrôlé, les animaux seront anesthésiés pour prélèvement de liquide céphalorachidien et d'organes ou pour une expérience de monitorage intracérébral durant entre 4h et 6h.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à six semaines de régime cétogène. Ce régime permet d’induire un état de cétose sans restreindre l’accès à la nourriture et ses effets indésirables sont limités. Toutes les semaines, un prélèvement d’urine sera réalisé. Pour cela, les animaux seront placés seuls dans une cage à métabolisme. Ce dispositif ne comporte pas de litière ni d’enrichissement et permet de récupérer l’urine par un système de gouttière. Le recueil d’urine se fera au cours de la nuit, ce qui représente une période d’isolement de 14-16h qui sera probablement perçue par l’animal comme une situation aversive. A la fin des six semaines de régime cétogène, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane après administration de buprénorphine pour l’analgésie dans le but de prélever le liquide céphalorachidien ou pour effectuer une expérience de monitorage intracérébral pendant 4h à 6h. Les animaux n’étant pas réveillés, les effets indésirables des expériences sont minimes.
Devenir
La survie de l'animal n'est pas compatible avec le prélèvement d'organes ou avec les enregistrements intracérébraux sous anesthésie prévus dans le projet.
Remplacement
Le régime cétogène induit des adaptations lentes du métabolisme au cours des six semaines suivant le changement de régime alimentaire. Ces adaptations impliquent l’ensemble de l’organisme : intestins, foies, pancreas, circulation sanguine, reins, cerveau. Il est donc nécessaire d’avoir recours à l’animal vivant pour étudier ce phénomène. Le remplacement par des approches in vitro n’est pas possible actuellement.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour permettre des analyses statistiques fiables. Au cours de ce projet, les analyses statistiques consisteront à comparer les données obtenues dans le groupe d’animaux soumis au régime cétogène à celles obtenues chez des animaux nourris normalement. Des tests de t de Student seront appliqués après une analyse de normalité par le test de shapiro-Wilk. Dans le cas d’échantillons de données non normales, des tests de Mann-Whitney seront pratiqués. Les effectifs sont calculés sur la base de 8 animaux par groupe. Pour les expériences de monitoring intracérébral, des analyses statistiques seront pratiqués dès que six animaux auront été enregistrés. S’ils sont significatifs ou si des calculs de taille d’échantillon par des test beta révèlent qu’aucune différence claire n’apparaît, les expériences seront interrompues sans utiliser l’effectif annoncé au départ, ce qui peut réduire l’effectif.
Raffinement
Tout au long de ce projet, les animaux seront hébergés par paires dans des cages enrichies avec des matériaux de nidification et des baguettes de bois à ronger, afin d’améliorer leur bien-être général. La période d’isolement nécessaire aux prélèvements d’urine est restreinte à une nuit par semaine pendant six semaines et une nuit d’habituation, ce qui minimisera l’inconfort lié à la procédure. De plus, les animaux auront été entrainés à rester dans les cages à métabolisme une fois avant le début du régime cétogène. Toute la phase de prélèvement et d’enregistrements intracérébraux est prévue sous anesthésie après analgésie par la buprénorphine, ce qui réduit le stress ou la douleur à un niveau minimal. Tout au long du projet, l'état général de l'animal sera évalué grâce à une grille de score et des interactions régulières avec la cellule bien-être et la vétérinaire référente permettront éventuellement d’intégrer des mesures supplémentaires permettant d’améliorer le confort des animaux, par exemple l'administration d'analgésique (carprofène, ou Rimadyl 5 mg/kg) en cas de douleur avérée, ou adminsitration de nourriture ramollie en cas de perte de poids.
Choix des espèces
La plupart des études sur les effets du régime cétogène ont été effectuées chez le rongeur, qui représente le modèle animal de prédilection dans ce domaine. Par rapport à la souris, le rat présente une taille plus importante et un volume cérébral plus grand. Les volumes de liquide céphalorachidien et d'urine seront plus facilement récoltés chez le rat que chez la souris.