Oncologie

930 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies avec pose de fibres optiques et de cathéter gastrique, puis des tests de comportement, de métabolisme du glucose et de calorimétrie, pour étudier le rôle d'une structure du cerveau dans la régulation de l'appétit. Le porteur indique que le port des fibres et du cathéter induit un stress initial et une mobilité réduite, et qu'une fuite gastrique entraîne la mise à mort immédiate. Il affirme que l'étude, fondée sur la physiologie intégrée, ne peut être menée in vitro ni sur des invertébrés.

Objectifs

La régulation de l’homéostasie énergétique est un processus physiologique capitale et extrêmement conservé. Le contrôle de cette régulation repose sur la capacité du cerveau à intégrer de multiples signaux indiquant les états nutritionnels/énergétiques de l'organisme, et à mettre en place des réponses appropriées. Les dysfonctionnements de ce contrôle peuvent conduire à une pléthore de troubles alimentaires (surpoids, obésité). Même si l'hypothalamus a été désigné comme le régulateur principal de l'équilibre énergétique, d'autres circuits ont été récemment identifiés. Parmi les structures extra-hypothalamiques, le noyau paraventriculaire du thalamus (PVT) apparaît comme un centre critique car il joue un rôle essentiel dans le relais bidirectionnel des informations du tronc cérébral vers des structures telles que l'amygdale, le striatum ventral, le cortex préfrontal et l'hypothalamus. Le PVT est principalement composé de neurones glutamatergiques. Un nombre croissant d’évidences indique un rôle clé des neurones PVT dans le contrôle des comportements liés à la nourriture. Cependant, ces études se sont principalement concentrées sur l'alimentation sans tenir compte des composantes énergétiques et métaboliques de ce comportement complexe ni de l'hétérogénéité des types cellulaires des neurones PVT. Il est intéressant de noter qu'une sous-population neuronale du PVT exprime les récepteurs D2 de la dopamine, fournissant un outil pour discriminer les sous-types cellulaires du PVT. On ignore encore si et comment les neurones exprimant les D2R peuvent moduler les adaptations homéostatiques, l'équilibre énergétique et les comportements liés à la prise alimentaire. Les objectifs de ce projet sont : 1. Disséquer la contribution des neurones PVTD2R dans la régulation de la prise alimentaire et le métabolisme énergétique. 2. Étudier les propriétés électrophysiologiques des neurones PVTD2R 3. Étudier le rôle des projections des neurones PVTD2R 4. Comprendre la dynamique de l’activité des neurones PVTD2R

Bénéfices attendus

Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes des maladaptations physiopathologiques. Malgré les progrès et les efforts, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. La prise alimentaire et la régulation de l’homéostasie énergétique ont souvent été étudiées sous l’angle d’une implication et dysfonctionnement de l’hypothalamus. Cependant, d’autres structures extra-hypothalamiques jouent aussi un rôle clé dans ces processus. Nos résultats préliminaires indiquent que le noyau paraventriculaire du thalamus PVT aurait un rôle central dans la régulation de la prise alimentaire et du métabolisme énergétique. Le projet ThalHOME vise à établir un nouveau cadre conceptuel qui voit dans les neurones D2R du PVT une population centrale pour la régulation des processus physiologiques et physiopathologiques sous-jacents au développement du syndrome métabolique. Nous sommes convaincus que la mise en lumière des aspects intégratifs de la physiopathologie du PVT dans la surconsommation alimentaire sera essentielle pour élaborer et accélérer les stratégies préventives et thérapeutiques. En outre, à long terme, les stratégies virales utilisées par ThalHOME pourraient être plus facilement adaptées et transposées aux troubles humains que les procédures chirurgicales invasives actuellement utilisées en thérapie (sleeve gastrectomie, bypass gastrique).

Procédures

Les animaux seront soumis : -pour 7 lots à une chirurgie (1j), puis après une période de repos, à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles seront fait sur deux de ces lots. -pour 2 lots à deux chirurgies qui se feront en une ou deux fois en fonction du bien être de la souris et de sa capacité à supporter une anesthésie longue. Si cela doit se faire en deux fois les souris auront une phase de repos de 10-15j minimum avant la deuxième anesthésie. Après une période de repos de deux semaines minimum, les lots seront soumis à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles seront fait sur un de ces deux lots.

Impact sur les animaux

Le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress; de même pour le cathéter gastrique. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres/cathéters étant légèrs, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrements et de perfusions. Le cathéter peut également se déloger de l'estomac, se qui provoque une fuite gastrique en intrapéritonéale. L'animal sera mis à mort immédiatement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et la régulation de la récompense alimentaire.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles). Selon les dessins expérimentaux et les nombres de variables (groupes; temps; régimes; comportements) nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Par rapport aux nombres d'échantillons nous utiliserons principalement des tests paramétriques et si nécessaire des tests nonparamétriques.

Raffinement

Le soin apporté aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, batons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale qui sont peu développées ou absentes dans d’autres modèles. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux soient stables.

100 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un défaut osseux est créé de part et d'autre de la mandibule sous anesthésie, suivi d'imageries avec injection rétro-orbitaire de produit de contraste, avant une mise à mort au CO2, pour mettre au point un modèle d'implantation de biomatériaux. Le porteur qualifie les douleurs post-opératoires de modérées pendant 48 à 72 heures, avec hématomes et fracture mandibulaire. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et que le recours au modèle in vivo est "indispensable".

Objectifs

La sphère cranio-faciale est particulièrement exposée aux pertes osseuses d'origine traumatique, tumorale, infectieuse ou congénitale, dans lesquelles le défaut de tissu osseux implique des reconstructions complexes. Actuellement, des substituts osseux synthétiques ou biologiques sont développés et nécessite des modèles de défauts osseux pour les valider chez l'animal. Le modèle cranio-facial le plus répandu est celui situé dans la calvaria des souris et des rats. Ces modèles, très utiles pour étudier la réparation osseuse sont néanmoins limités, l’os mandibulaire étant soumis à des contraintes mécaniques fortes. La nécessité de tester des substituts osseux dans des environnements le plus proche de la réalité est indispensable en recherche pré-clinique. Ce projet vise à mettre au point un modèle de défaut osseux mandibulaire chez le rat permettant de tester différents biomatériaux et répondre aux exigences de réduction et de remplacement avant d’envisager de le tester sur de plus gros animaux (lapin ou brebis). Ce modèle permettra ainsi de tester des biomatériaux d'intérêt pour une future application clinique chez les patients souffrant de pertes osseuses de grandes étendues.

Bénéfices attendus

Ce projet est un projet de recherche fondamentale pré-cliniques en ingénierie osseuse cranio-faciale. La stratégie proposée ici va bien au-delà de l'état actuel de l'art avec le développement d'un dispositif adaptable unique pour chaque patient. Le matériau sera dessiné puis imprimé en 3D pour correspondre aux dimensions exactes du défaut. Il devra posséder des propriétés mécaniques comparables à celles de la mandibule d'origine, permettant ainsi la pose d'un implant dentaire pour restaurer la mastication. En parallèle, la partie interne sera adaptée pour favoriser son intégration tissulaire par l'ajout d'une matrice de collagène cellularisé. Ce projet vise à proposer une solution optimisée et centrée sur le patient pour restaurer les défauts osseux orofaciaux, notamment ceux de la mandibule. Il s'attaque à un problème de santé majeur par le biais d'une stratégie d'ingénierie tissulaire innovante combinant la science des matériaux, la bio-ingénierie et les études précliniques, avec des avantages prévisibles tant pour les patients que pour le système de santé et la société dans son ensemble. En outre, l’utilisation d’un modèle de défaut mandibulaire chez le rat permettra de mettre au point différentes étapes d’analyse d’ingénierie osseuse en restant chez le petit animal pour respecter au maximum le principe des 3R.

Procédures

Procédure 1 : Etape 1 : Imagerie non invasive sous AG (10min) Etape 2 : Réalisation d'un défaut osseux mandibulaire bilatérale sous AG, (30min), Etape 3 : Imagerie scanner sous AG avec injection rétro-orbitaire de produit de contraste (1min injection, 10min scanner) et mise à mort par inhalation progressive de CO2 dans un système dédié (4min induction et 3min de repos). Procédure 2 : Etape 1 : Réalisation d'un défaut osseux mandibulaire bilatérale sous AG, avec insertion d’un matériau lors de cette étape (30 à 40min) Etape 2 : Imagerie scanner sous AG avec injection rétro-orbitaire de produit de contraste (1min injection, 10min scanner) et mise à mort par inhalation progressive de CO2 dans un système dédié (4min induction et 3min de repos).

Impact sur les animaux

Un stress lié au anesthésie lors des imageries. Les douleurs post opératoires sont considérées "modérées" pendant 48 à 72h (hématomes, fracture mandibulaire).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

La régénération osseuse présente une biologie complexe impliquant la participation et l’intéraction de différents types cellulaires. Ces processus complexes ne peuvent être mimés en utilisant uniquement des cultures in vitro ou des modèles informatiques. La mise au point d’un modèle in vivo de défaut osseux mandibulaire chez le rat permettra de sélectionner les biomatériaux adéquats dans un défaut osseux de ce type avant de passer à un modèle de défaut osseux chez le gros animal qui sera plus proche de l’homme notamment par la présence d’os spongieux (ex le lapin et la chèvre). Il n’existe à ce jour aucune méthode alternative.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit grâce à l’utilisation de l’imagerie en amont des chirurgies pour vérifier sa faisablité (hauteur/largeur osseuse disponible, édification des racines des molaires de rats, situation du canal incisif). Les biomatériaux utilisés seront tous validés préalablement par des tests in vitro pour vérifier leur biocompatibilité cellulaire. Le nombre d'animaux par groupe et par temps d'analyse (6) est justifié en fonction de nos objectifs de mise au point et permettra une étude adéquate sur le plan statistique. Compte tenu des publications relatant ce modèle mandibulaire, un effectif de 6 sujets par groupe et par temps d’analyse est indispensable. Au vu de 3 temps d’analyse histologique prédictible cela fait 18 animaux par groupe que nous augmentons à 20 par groupe pour tenir compte d’éventuelle exclusion d’animaux. Sur 3 ans un nombre maximum de 100 rats seront utilisés, des études par imagerie longitudinale seront effectuées à différents temps afin de réduire au maximum le nombre d’animaux par temps d’analyse. Une veille bibliographique sera systématiquement effectuée pour éviter toute expérience redondante.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation d’anesthésie générale (Kétamine/xylasine) en IP, l’utilisation d’une anesthésie locale (SC), (Lidocaïne sans épinéphrine et bupivacaïne) et d’analgésique (Buprénorphine) adaptée durant les procédures avec une médication systématique en per et également post-opératoire 72h, et l’établissement de points limites adéquats. Une nourriture en poudre sera donnée la semaine suivant la chirurgie pour prévenir au mieux tout risque de douleur et de fracture. Une surveillance biquotidienne des animaux sera effectuée les premières 72h puis quotidienne. Les conditions d’élevage sont présentes pour le bien-être animal de façon à réduire le stress et l’anxiété dans un environnent enrichi au sein de groupes sociaux de 3 individus, avant et après les procédures.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de laboratoire appropriée et classiquement utilisée pour l’étude du tissu osseux. Il permet une faisabilité technique et la biologie de leur tissu osseux est proche de celle de l’homme avec notamment la présence du périoste. Notre laboratoire possède une expertise sur l’étude du tissu osseux du rat. La taille de sa mandibule permet d’y envisager un défaut critique de 4 à 5mm dans l’angle mandibulaire, ce qui n’est pas possible chez la souris, la mandibule étant trop petite. Les animaux seront étudiés entre 5 semaines de vie et 3 mois post chirurgie, les animaux étant alors des jeunes adultes, le potentiel de réparation osseuse y est optimal. Les mâles seront étudiés pour plus de standardisation inter-animal afin de s'affranchir de tout biais lié à l'incidence hormonal oestrogénique variable des femelles. L'âge idéal de ces chirurgies sera validé grâce au suivi par scanner pour sélectionner les rats ayant une taille de la mandibule adéquate. Nous bénéficions d’une animalerie d’élevage au sein du laboratoire.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 60 femelles gestantes subissent une laparotomie et l'électroporation de chaque embryon in utero par un capillaire de verre, et leurs souriceaux reçoivent des injections cérébrales et sous-cutanées avant d'être tués, certains par décapitation, pour étudier le rôle d'un gène dans le développement du cortex. Le porteur indique que la plaie abdominale peut s'infecter, entraînant l'euthanasie de la mère. Il affirme que la complexité de l'environnement cortical rend l'étude impossible in vitro.

Objectifs

Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Un grand nombre de gènes y ont été reliés. Notre objectif est de comprendre les rôles de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies. Nous avons identifié des mutations chez plusieurs patients (7 familles) avec des troubles du neurodéveloppement. Tous ont des anomalies de développement du corps calleux, jonction entre hémisphères droit et gauche, formée par les axones des neurones corticaux callosaux. Nous avons fait une étude fonctionnelle chez une souris qui porte une mutation qui nous permet d'invalider le gène étudié. Lorsque les neurones de cette souris n'ont pas ce gène (ni la protéine), leur développement n'est pas modifié, mais ils ont des difficulté à former des jonctions avec les neurones de l'autre hémisphère du cerveau. La partie du cerveau touchée s'appelle le corps calleux. La protéine que nous étudions étant impliquée dans la régulation de la dynamique du réseau de microtubules, nous voulons tester si son rôle sur les microtubules est déterminant pour la survie des neurones callosaux. Nous proposons ici de réaliser des expériences de sauvetage qui consistent à injecter un agent stabilisateur des microtubules, Epothilone B, disponible sur le marché. Les étapes majeures de la formation du corps calleux étant l’initiation (P2) et la phase terminale (P4) et l’invasion (P8) par les axones du cortex contralatéral et le branchement des axones à P21, nous prévoyons 4 stades d’étude.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de comprendre la fonction d’une protéine impliquée dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquelles la déplétion de cette protéine conduit à des troubles du neurodéveloppement. Ce projet aura des retombées directes pour le patient. En effet, si les résultats sont ceux atendus, c’est-à-dire le sauvetage du phénotpe de neurodégénérescence par l’Epothilone B, ceci va ouvrir des perpectives de traitement pour les patients portant une mutation dans le gène étudié mais aussi toutes autres maladies lièes à des perturbations du réseau de microtubules.

Procédures

Les 60 femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, durée 1 à 10 sec). Cette chirugie dure moins de 45 min. Elles seront par la suite placées dans des cages isolées avec leur portée jusquà la mise à mort des souriceaux. Les souriceaux vont subir une injection de 1 à 10 sec dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (E15.5). A leur naissance ils seront injectés en sous cutané avec une solution saline contenant ou non la molécule à tester une fois à P0 pour ceux étudiés à P2 et P4, une fois à P0 et une fois à P7 ceux étudiés à P8, une fois à P0, une fois à P7 et enfin une à P14 ceux étudiés à P21 . Chaque injection sous cutanée dure 1 à 5 sec. Les souriceaux étudiés à P2, P4 et P8 seront mis à mort par décapitation, ceux étudiés à P21 recevront une injetion intra-péritonéale d’anesthésique (5 sec) puis seront perfusés au PBS puis PFA sous anesthésie profonde

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, durée 1 à 10 sec).Elles seront par la suite placées dans des cages isolées. La plaie abdominale est susceptible de s'infecter, elle sera surveillée et la souris euthanasiée en cas d'infection. Les souriceaux vont subir une injectionde 1 à 10 sec dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (E15.5). A leur naissance ils seront injectés en sous cutané avec une solution saline contenant ou non la molécule à tester une fois à P0 pour ceux étudiés à P2 et P4, une fois à P0 et une fois à P7 ceux étudiés à P8, une fois à P0, une fois à P7 et enfin une à P14 ceux étudiés à P21 .Chaque injection sous cutanée dure 1 à 5 sec. Le site d'injection sera surveillé pour détecter tout signe d'infection. Les souriceaux étudiés à P2, P4 et P8 seront mis à mort par décapitation, ceux étudiés à P21 recevront une injetion intra-péritonéale d’anesthésique ( 5sec)puis seront perfusés au PBS puis PFA sous anesthésie profonde.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Après la PE1, les femelles gestantes sont herbergées jusqu’au sacrifice des nouveau-nés. Après la PE2, les nouveaux-nés sont herbergés entre 2 et 8 jours en ce qui concerne les stades P2, P4 et P8, puis sacrifiés par decapitation. Pour le stade P21, une perfusion intracardiaque, procédure classée sans réveil, est prévue.

Remplacement

L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cortical qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération du gène étudié sur le développement embryonnaire cortical. Il s’agit ici de réaliser des expériences de sauvetage du phénotype de neurodégénérescence que nous avons caractérisé précédemment dans le cadre d'un projet antérieur . Par ailleurs, de telles expériences ont été réalisées par un autre groupe français, justifiant la pertinence de notre approche et la faisabilité dans le modèle souris.

Réduction

La bonne maitrise de cette chirurgie acquise par l’équipe tout au long de ces dernière années permet d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons (70-80%) ce qui limite fortement le nombre de femelles gestantes manipulées. Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, aucune nouvelle expérience ne sera effectuée avant qu’une analyse complète des précédentes ne soit réalisée. Nous envisageons d’utiliser le test statistique de Student afin d’évaluer la survie cellulaire et la santé des neurones invalidés pour le gène étudié entre condition contrôle et traitées Epothilone B en analysant la croissance axonale (36 animaux P2) le corps calleux (36 animaux P4) ; les branchements ipsilatéraux (36 animaux P8) et les branchements controlatéraux (36 animaux P21). Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés et d’éviter le cannibalisme des souris de fond bl6, nous avons adapté nos croisements et croisons des mâles hétérozygotes bl6 avec des souris F1 hétérozygotes 129Sv/Fas (50% 129Sv/Pas – 50% C57bl6). Ce type de croisement est utilisé en routine pour ces expériences sur le corps calleux et a montré une baisse notable du cannibalisme.

Raffinement

Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Durant l’expérimentation les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse et leurs yeux sont protégés de la deshydrartation par de l’ocrygel. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’isoflurane. Un anti-inflammatoire non-stéroïdien, la metacam, est injecté avant l’opération par voie sous-cutanée. La metacam est également ajoutée au biberon jusqu’à la mise bas (6mg/L dans l’eau de boisson). L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent et s’abreuvent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés deux fois par jour pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections postchirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement par dislocation cervicale et les embryons sortis de leur sac et décapités.

Choix des espèces

La technique d’électroporation dans le cerveau a été mise au point chez la souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par animal rend cette méthode efficace. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neuro-développementales chez l’homme. Femelles adultes gestantes de 15,5 jours, stade auquel les neurones d’intérêt (neurones callosaux) sont générés. L’electroporation des embryons à ce stade permettra d’invalider WDR47 uniquement dans ces neurones et de suivre leur développement grâce à un marqueur fluorescent. Etant donné que les étapes majeures de la formation du corps calleux sont la croissance des axones, le passage dans l’autre hémisphère et la phase terminale de l’invasion par les axones du cortex contralatéral à P2, P4 et à P8 respectivement et le branchement des axones à P21, nous prévoyons 4 stades afin d’évaluer comment le traitement EpothiloneB protège les neurones contre la perte de la fonction de WDR47

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris transgéniques exprimant deux onco-protéines du papillomavirus reçoivent un allergène cutané, une exposition aux UV ou des mesures d'oreille sous brève anesthésie, pour étudier l'effet de ces protéines sur le système immunitaire. Le porteur indique que l'application de l'allergène ne génère pas de douleur apparente et que les doses d'UV sont contrôlées pour éviter des lésions cutanées. Il affirme que le développement d'une réponse immunitaire est trop complexe pour être étudié in vitro.

Objectifs

Le cancer de la peau de type non-mélanome (Non-Melanoma Skin Cancer, NMSC) est la forme de cancer la plus répandue dans le monde et particulièrement chez les populations adultes à peau claire. Le développement de nouvelles stratégies pour lutter contre l’apparition de ce type de cancer reste un enjeu sociétal mondial, le nombre de cas détectés par an étant en constante augmentation. Parmi les facteurs de risques majeurs impliqués dans le développement de ce cancer, il a déjà été démontré une coopération entre les rayons ultraviolets et l’infection par les papillomavirus humains cutanés (HPV). L’objectif de ce projet est donc d’étudier l’impact de 2 onco-protéines du virus HPV sur l'immuno-surveillance tumorale et plus globalement, sur les réponses immunitaires. Pour cela, des souris transgéniques exprimant ces onco-protéines au niveau de la peau seront comparées à des souris sauvages contrôles. Leur réponse immunitaire sera étudiée dans un modèle d’hypersensibilité de contact induite par l'application d'un allergène sur la peau, car il reproduit bien le phénomène d'inflammation locale généré suite à une exposition aux UVs. Ce modèle est bien établi et couramment utilisé dans la littérature.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à approfondir les connaissances sur les mécanismes de la coopération entre les UVs et une infection par un papillomavirus dans le développement de cancers cutanés. A terme, la mise en évidence des mécanismes immunitaires qui sont dérégulés dans ce contexte pourrait mener à l’identification de cibles thérapeutiques pour le développement de traitement prophylactiques face à ces cancers.

Procédures

_Application d’un allergène sur la peau. Cette procédure concerne 560 animaux. Parmi eux, 220 animaux subiront une application unique, 340 animaux subiront 2 applications espacées de 5 jours. La durée nécessaire pour cette intervention est de 3 minutes par souris environ. _Mesure quotidienne de l'oreille, sous brève anesthésie, pendant 3 jours consécutifs. Cette procédure concerne 220 animaux, et sa durée est d'environ 3 minutes par souris. _Exposition de la peau aux UVs. Cette procédure concerne 80 animaux, qui seront exposés à une faible dose d’UVs quotidiennement pendant 4 jours consécutifs. Sa durée est de 2 minutes par souris environ.

Impact sur les animaux

L'application épicutanée d'un allergène chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente. Cette procédure peut conduire les souris à se gratter, mais il n'a jamais été observé de signe excessif de grattage dans ce modèle. Concernant les expositions aux UVs, elles sont réalisées à faible dose, et cette dernière est bien contrôlée de manière à ne pas induire de lésions cutanées chez l'animal. Il est à noter que les onco-protéines exprimées par les souris transgéniques utilisées dans ce projet peuvent conduire au développement de tumeurs cutanées uniquement en coopération avec les UVs, si ces souris sont exposées à des doses croissantes et pendant de longues périodes (plus de 20 semaines). Les expériences d'exposition aux UVs qui seront réalisées dans ce projet ayant une durée maximale de 18 jours, les animaux transgéniques n'ont pas de risques de développer des tumeurs. En résumé, les effets indésirables attendus dans ce projet sont donc le stress généré par le contact avec l’expérimentateur, et une réaction inflammatoire locale et modérée au niveau du site d’exposition aux UVs ou à l'allergène.

Devenir

A l’issue de ces procédures, les animaux seront mis à mort de manière à récolter les tissus ou organes étudiés. Cela permettra de réaliser ex vivo une analyse fine de la réponse immunitaire développée chez ces animaux, à l’échelle moléculaire et cellulaire.

Remplacement

Le papillomavirus humain est impliqué dans le développement de tumeurs épithéliales bénignes et malignes. L’influence des protéines du papillomavirus ne peut être visible que dans un épithélium complet, étant capable de se différencier (habitat naturel du papillomavirus). De plus, le développement d’une réponse immunitaire est un phénomène biologique très complexe impliquant une collaboration étroite de l’ensemble des cellules immunitaires, ainsi qu’une forte influence de l’environnement, rendant impossible son étude par des tests in vitro.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base d'expériences précédentes ainsi que sur la littérature scientifique, et a été réduit au maximum sans mettre en péril l'interprétation statistique des résultats. Ainsi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximal d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. Toutefois, le nombre d’animaux nécessaire pourra être diminué en fonction des résultats obtenus.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. L’observation des animaux sera effectuée quotidiennement et une grande importance sera accordée à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non.

Choix des espèces

Parmi les différentes espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l’animal le plus adapté pour l'étude de mécanismes immunologiques. De plus, ce modèle permet d’utiliser des animaux génétiquement modifiés n'existant que dans cette espèce. Le modèle murin utilisé correspond ainsi au seul modèle connu pour étudier les effets des papillomavirus cutanés sur le système immunitaire. Enfin, ce modèle étant couramment employé, cela permettra de discuter les résultats obtenus à la lumière des données existantes dans la littérature. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 8 semaines à 12 semaines. Le système immunitaire doit être mature et non vieillissant.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe tumorale sous-cutanée, puis des agents anticancéreux par injection intrapéritonéale ou péritumorale, pour tester une technologie de délivrance locale prolongée dans le mélanome. Le porteur affirme n'attendre aucune toxicité systémique et renvoie les applications cliniques à un brevet et à des essais futurs. Il conclut que la preuve de concept ne peut s'établir que sur des modèles précliniques proches de la tumeur humaine et qualifie cette étape d'"incontournable".

Objectifs

L’apparition de nouvelles molécules anticancéreuses durant ces 10 dernières années a conduit à une révolution dans le traitement de certains cancers, en particulier le mélanome. Cependant seule une fraction des patients (30% à 50%) montrent une réponse efficace et durable au traitement et nombre d’entre eux sont obligés de stopper le traitement à cause d’effets secondaires sévères, surtout lorsque plusieurs molécules sont combinées et administrées au patient. Il y a donc une urgence pour comprendre les mécanismes de résistances aux thérapies actuelles et mettre en évidence de nouveaux protocoles thérapeutiques avec une toxicité plus faible et une tolérance maximale. Ce projet vise en particulier à démontrer une meilleure tolérance et une meilleure efficacité de traitements combinés montrant des effets secondaires sévères aux doses efficaces. Nous utiliserons une nouvelle technologie, nommée BEPO, pour administrer des molécules en solution ou en suspension localement sur le site tumoral permettant une diffusion lente des médicaments. Nous éviterons de ce fait les effets indésirables observés lorsque ces molécules sont injectées par voie classique intraveineuse. Cette technologie a fait ses preuves dans des modèles de maladies inflammatoires (polyarthrite rhumatoïdes) et l’objectif principal de ce projet et d’établir une preuve de concept de l’efficacité de ce procédé dans le modèle de tumeur solide de mélanome cutané pourlequel nous avons une grande expertise. Ce nouveau mode d’administration ouvrira de nombreuses possibilités en thérapie anti-cancéreuse et constituera une véritable avancée dans l’administration des agents anti-cancéreux. D’autre part la diffusion lente et continue des drogues au voisinage de la tumeur augmentera l’efficacité thérapeutique, nous permettant de tendre vers des rémissions totales plus fréquentes. L’idée, à travers les modèles d’études précliniques décrits dans ce projet, est de rapidement mettre en œuvre de tels protocoles chez les patients.

Bénéfices attendus

Le but de notre projet est double: i) améliorer l’efficacité des médicaments antitumoraux en administrant plusieurs molécules en même temps, en une dose unique et avec une diffusion de longue durée sur le site de la tumeur ii) éliminer les effets secondaires souvent sévères de ces médicaments lorsqu’ils sont administrés de manières répétées par voie intraveineuse. En effet la délivrance locale évitera d’endommager les tissus sains, ce qui se passe en général lorsque les agents anticancéreux sont inoculés par voie intraveineuse et ce qui explique la majeure partie de leur toxicité et parfois pousse à l’arrêt du traitement. Le partenariat que l’on développe dans le cadre de ce projet nous permettra de rapidement breveter ce concept et d’envisager des applications cliniques dans la mesure où nous aurons validé les effets sur les deux modèles précliniques proposés dans ce projet. Nous sommes également en collaboration avec des cliniciens désireux de démarrer des essais cliniques utilisant ces thérapies inovantes capables d'améliorer grandement le confort des patients au cours du traitement et surtout d'augmenter leur chance de guerison sans récidive.

Procédures

L’ensemble des animaux de cette étude (1600 souris) seront greffés une fois en sous cutané (15 secondes/souris, contention comprise). Pour la procédure n°1, en plus de la greffe sous-cutanée, la moitié des animaux (260 souris) recevra les différents agents thérapeutiques en injection intrapéritonéale (10 secondes/souris, contention comprise), l’autre moitié (260 souris) recevra ces mêmes agents thérapeutiques sous formulation BEPO en injection péritumorale (10 secondes/souris, contention comprise). Pour les procédures suivantes n°2 et 3 les lots validés dans la procédure n°1 recevront la ou les molécules sous formulation BEPO en injection péritumorale (10 secondes/souris, contention comprise). Aucun prélèvement n'est prévu sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Il n’y aura aucun effet indésirable de toxicité systémique de ces drogues comme on pourrait s’y attendre en injection conventionnelle. Des preuves de concepts de ce mode d'administration ont été établies sur des pathologies inflammatoires (polyarthrite) et montrent notamment que ce procédé n’engendre aucun rejet ni effet secondaire avec une tolérance maximale chez la souris. Les effets indésirables attendus sont ceux inhérents à la croissance des tumeurs et le suivi quotidien des animaux nous permettra de procéder à l’euthanasie de tout animal atteignant un des points limites décrit ci-après.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, soit parce qu'ils ont atteint le point limite de volume tumoral, soit pour prélever la tumeur afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments.

Remplacement

La preuve de concept de ce nouveau mode de délivrance d’agents anticancéreux revêt une importance capitale dans le cadre du développement de nouveaux modes d’administrations de combinaisons thérapeutiques en clinique. Cette preuve de concept ne peut s’établir que sur de véritables modèles précliniques dans un contexte de tumeur solide similaire à celui que l’on trouve chez l’homme. Seuls les deux modèles proposés très proches des deux grands groupes de patients atteints de mélanome cutané, nous permettront non seulement de mesurer l’efficacité de nos traitements sur la croissance tumorale mais aussi de valider ce nouveau mode d’administration très innovant et d’étudier les mécanismes de la mise en place d’une réponse immunitaire anti-tumorale pour un contrôle durable de la pathologie. L'obtention de tels résultats est une étape incontournable si on veut démarrer par la suite des essais cliniques chez l'homme avec ce nouveau procédé. A ce stade du projet il n’est donc plus possible de substituer l’animal à un modèle in vitro qui ne peut pas retranscrire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules tumorales pour tester nos combinaisons thérapeutiques et surtout pour valider ce nouveau mode d’administration.

Réduction

Le nombre d’animaux sera au maximum de 1600 souris sur 4 ans, nous permettant d’évaluer de manière exhaustive les effets physiologiques (effets anti-tumoraux, croissance tumorale et survie) mais aussi mécanistiques (implication du système immunitaire et composantes cellulaires et moléculaires associées) de nos combinaisons thérapeutiques. Les molécules et combinaisons utilisées le seront de manière séquentielle ce qui implique que lorsque nous aurons des effets significatifs sur un protocole nous nous focaliserons sur celui-ci et ne testerons pas les autres molécules. D’autre part le projet est dessiné dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux dans le cheminement expérimental proposé, dans la mesure où la validation d’une étape donnera le feu vert à l’étape suivante uniquement si les résultats attendus sont statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux par groupe expérimental a été évalué de manière à obtenir une significativité statistique de nos résultats afin de valider ou d’invalider notre procédure. L’expertise et le recul que nous avons au laboratoire sur le modèle de mélanome mais également sur d’autres modèles de tumeurs solides nous permettra de limiter le nombre d’animaux à son strict minimum . Grace à notre maîtrise et à notre connaissance des gestes de greffe ou d’administration en sous-cutané, nous éviterons ainsi les artefacts et les pertes liées à l’expérimentateur.

Raffinement

Les animaux seront hébergés (5 par cage d'une superficie de 500cm2) à 20-24°C, 30-50% d'hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l'eau de boisson sont fournies ad libitum. Le milieu est enrichi par une litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et une ouate coton pour le confort des animaux. Le comportement sera observé quotidiennement pour détecter tout signe de stress. La prostration, les difficultés respiratoires, l'agressivité et l'isolement sont tous des critères d’arrêt conduisant à l'euthanasie des animaux avant la fin du protocole. Si nécessaire un animal agressif pourra être isolé des autres mais pour une durée maximale de 5 jours. Des souris femelles sont utilisées dans nos protocoles expérimentaux afin de réduire le risque d’agressivité et d’isolement. Un suivi de l’apparition d’autres signes cliniques sera effectué au cours de l’expérience. Ils seront reportés sur une fiche de suivi clinique. Dans les conditions expérimentales définies, les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. Les différentes molécules seront utilisées en administration locale en une seule administration dans un composé permettant leur diffusion dans le temps, permettant d’éviter tout effet secondaire et d’éviter des administrations répétées. Même si l'ensemble de nos procédures sur lesquelles nous avons du recul ne devrait pas le nécessiter, l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires pourra être utilisée. Au cours de nos expériences antérieures, nous n’avons jamais observé de signe de prostration, de diarrhée ou de déshydratation induite par les greffes de cellules de mélanome. Notre pratique vise à réduire le plus possible les contacts avec les animaux pour limiter les contentions et le stress qui y est associé. Les signes listés ci-dessous feront l’objet d’une attention particulière lors de nos visites journalières: - le volume tumoral et l’ulcération de la tumeur (observation de la tumeur et mesure) - l’absence d'hydratation ou de prise de nourriture (observation de l’état général) - la gêne de la locomotion (observation du déplacement dans la cage) - l’isolement par rapport aux autres animaux, le dos vouté, les yeux enfoncés, la respiration saccadée, des diarrhées (observation du comportement de l’animal).

Choix des espèces

L'espèce murine C57Bl/6 utilisée dans notre étude est la plus relevante pour atteindre les objectifs fixés et tester les effets de nos thérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale afin de mettre en évidence les effets de nos molécules sur le long-terme. Ces souris C57Bl/6 dont le système immunitaire est fonctionnel sont greffées avec des cellules tumorales murines de même fond génétique . Nous avons déjà obtenus l'ensemble des données préliminaires à l'origine de ce projet sur ce modèle et devont continuer avec le même modèle pour une cohérence des résultats. L'âge des animaux utilisés dans cette étude est de 7 à 8 semaines, âge où l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une forte homogénéité, et âge ou le système immunitaire est complètement fonctionnel.

32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de cellules tumorales dans l'hypophyse, puis trois séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour étudier la propagation d'un adénome hypophysaire et tester un médicament candidat. Le porteur indique que la croissance tumorale peut entraîner une perte de poids et une altération de l'état général. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable", des cultures cellulaires ayant servi en amont sans pouvoir le remplacer.

Objectifs

L’objectif de notre projet est double. Il d’agit d’une part de suivre l’évolution de ces tumeurs afin de les caractériser et de comprendre les mécanismes de propagations dans les tissus cérébraux. D’autre part, nous évaluerons également l’efficacité thérapeutique d’un médicament candidat (la Sitagliptine) sur la base de la taille de la tumeur mesurée de façon non invasive par IRM. En effet, parmi toutes les modalités d'imagerie permettant d'étudier de manière non invasive les tissus, l'IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) est l'une des plus prometteuses : elle est capable de fournir des images à haute résolution du cerveau, qui permettent ainsi une mesure précise des altérations des structures cérébrales et des tumeurs en elles-mêmes. Dans ce projet, un suivi longitudinal sera effectué par IRM, ce qui permettra de caractériser la vitesse de propagation des cellules tumorales à travers les tissus environnants et d’évaluer la sensibilité des différentes structures péri-hypophysaires. Afin d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de la tumorigenèse hypophysaire et ceux à l’origine de l’invasion des structures cérébrales adjacentes par des cellules hypophysaires, nous souhaitons étudier le comportement de cellules hypophysaires sur-exprimant les gènes d’intérêt in vivo. L’utilisation de modèles animaux dans l’étude des mécanismes de dissémination tumorale est nécessaire pour reproduire au mieux le microenvironnement tumoral humain.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de la survenue d’une tumeur hypophysaire et ceux à l’origine de sa propagation vers les structures cérébrales adjacentes. En plus des connaissances fondamentales sur la croissance tumorale de ce type de tumeurs, un des bénéfices majeurs du projet est l’évaluation de l’effet thérapeutique d’un médicament candidat. La substance active du médicament évalué ici est la Sitagliptine qui est déjà connue et commercialisée : elle est administrée à l'homme depuis longtemps sans effet secondaire significatif ainsi qu’à l’animal. A court terme, les résultats pourront être valorisés sous forme de publication scientifique qui bénéficieront à l’ensemble de la communauté scientifique travaillant sur ce type de tumeurs cérébrales. A plus long terme, les connaissances acquises, en particulier sur le candidat médicament, permettront d’envisager son utilisation dans des études cliniques.

Procédures

Injection intra-hypophysaire de cellules tumorales (durée) Ce geste sera réalisé dans le laboratoire de l’équipe partenaire pour lequel une saisine a déjà été validée. Tous les animaux impliqués dans cette procédure ne subiront qu’une seule chirurgie au cours de leur vie. Caractérisation par IRM 14 jours après l’injection des cellules tumorales, les animaux seront imagés par IRM. Les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane (3%) dans une boite à induction afin d’être positionnés dans le cadre stéréotaxique compatible avec l’IRM. Une fois positionné dans le cadre stéréotaxique, l’animal sera positionné dans l’aimant pour réaliser l’acquisition des images. 3 sessions d’IRM seront réalisées à J+14, J+28 et J+49 après injection des cellules tumorales. La durée totale de l’examen IRM est de 30min. Prélèvements à la veine saphène Les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane pour effectuer le prélèvement de sang (durée) à la veine saphène. 3 sessions de prélèvements seront réalisées à J+10, J+35 et J+56 après injection des cellules tumorales. Traitement médicamenteux La moitié des animaux sera traitée par un médicament candidat luttant contre la propagation tumorale. Ce traitement sera administré quotidiennement par ajout dans l’eau de boisson et ce durant toute la durée de l’hébergement. Perfusion intracardiaque L’euthanasie interviendra à J+56 après injection des cellules tumorales ou du PBS (durée). Juste après le dernier examen IRM, et avant leur réveil, les animaux seront euthanasiés par administration de pentobarbital (Exagon 1ml/kg, soit 400mg/kg de pentobarbital) afin de préparer les tissus en vue d’utilisation pour des analyses post-mortem.

Impact sur les animaux

La nuisance principale attendue dans ce projet est liée à la croissance tumorale. En effet, la croissance des tumeurs hypophysaires est susceptible d’entrainer une perte de poids des animaux et une altération de l’état général. Pour prendre cela en compte, l’état des animaux sera surveillé quotidiennement et l’ensemble des signes associés au développement tumoral attendu chez les animaux sera surveillé de manière hebdomadaire. Concernant l’administration du médicament, nous n’attendons pas d’effet secondaire particulier car la substance active est déjà bien connue et a déjà été administrée à l’homme comme à l’animal sans effet secondaire notoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux pour l’étude du développement tumoral et pour l’étude d’un inhibiteur pharmacologique est indispensable. - Des cultures cellulaires ont également déjà été utilisées en parallèle pour étudier la migration et l’invasion des cellules traitées ou non par les inhibiteurs pharmacologiques ce qui permet de limiter le nombre d’animaux. Seules les cibles ayant déjà prouvées leur efficacité sur des cultures cellulaires sont étudiées in vivo. - Seule l’utilisation de modèles animaux in vivo mimant le plus fidèlement le microenvironnement tumoral permettra d’étudier de manière spécifique le rôle des voix de signalisation étudiées dans la croissance tumorale et dans la migration des cellules tumorales vers les structures cérébrales adjacentes. - Seule l’utilisation de modèles animaux vivant permettra de confirmer le rôle inhibiteur des molécules sur la croissance tumorale et de mimer la maladie tumorale humaine.

Réduction

Dans une première étude, nous avons utilisé des groupes de 6 animaux par condition expérimentale. Nous avions estimé que c’était un nombre raisonnable au vue de la reproductibilité du modèle tumoral mis en place. Le nombre d’animaux par groupe avait été déterminé en utilisant un calcul de puissance statistique. Pour comparer les 2 groupes de rats (traités vs non-traités), nous avons utilisé un test non-paramétrique de Mann-Whitney. Dans le cas des mesures répétées (comparaison de la croissance tumorale ou du poids corporel dans le temps), des ANOVA à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats ont été utilisés. Rétrospectivement, nous pouvons utiliser la différence observée lors de la première étude (N=6) pour améliorer le calcul de puissance statistique (logiciel G-Power et la formule de Cohen d = (M2 - M1) ⁄ SD, avec M1 et M2 les moyennes des volumes tumoraux des deux groupes et SD la déviation standard). Les études précédentes ont déterminé une moyenne de volume tumoraux, 0.1213 +/- 0.077 cm3 et 0.031 +/- 0.03 cm3 respectivement. Nous obtenons donc une valeur de d=1.52 selon la formule de Cohen. Avec un risque alpha de 5% et une puissance de 95%, nous obtenons N = 11 par groupe, soit 5 animaux supplémentaires par groupe. Afin de s’affranchir d’éventuelles pertes lors de la chirurgie, il est préférable d’ajouter 2 animaux par groupe soit N=13 par groupe.

Raffinement

Une acclimatation de 7 jours sera respectée à l’arrivée dans notre animalerie. Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées à leur taille (2 par cage, portoirs ventilés, environnement à température contrôlée, cycle diurne-nocturne de 12h, eau et nourriture fournies ad libitum). Un examen quotidien sera effectué par les zootechniciens, sous la supervision permanente du vétérinaire. Un environnement enrichi par un système de nidification périssable et renouvelé à chaque changement de cage sera fourni, selon nos procédures standards. - Les examens IRM et les prélèvements de sang à la veine saphène seront réalisés sous anesthésie isoflurane avec soutien thermique et suivi de la fréquence respiratoires et de la température de l’animal. - Nous utilisons un scoring quotidien pour surveiller le,bien être animal. 5 composantes seront évaluées : apparence (qualité du poil, propreté des yeux et du nez), posture, mobilité, comportement et signes cliniques. Si necessaire nous demanderons conseil auprès de notre vétérinaire pour envisager la mise en place ou la poursuite d’un traitement analgésique Si un point limite est atteint l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Pour des raisons immunologiques, des rats seront utilisés pour l’injection des cellules hypophysaires de rats (GH3). L’apparition d’un phénotype tumoral chez les rates après injection de cellules GH3 a déjà été observée par le passé . Ce choix d’utiliser une injection dans l’hypophyse repose sur la création d’un modèle fidèle de tumeur hypophysaire mimant le microenvironnement tumoral et permettant d’étudier de manière plus spécifique l’envahissement des structures cérébrales adjacentes. Par ailleurs, les rats sont adaptés pour étudier le cerveau car leur petite taille permet de les examiner dans des scanners IRM performants. De plus, nous disposons d’une antenne IRM spécifique pour cerveau de rat, ce qui permet de diminuer le temps d’acquisition et donc les durées d’anesthésie des animaux. Tous les rats arriveront dans notre animalerie à l’âge de 9 semaines. La procédure expérimentale débutera après 1 semaine d’acclimatation. L'utilisation de rats au stade de 9 semaines correspond à la maturité sexuelle des animaux afin d'obtenir un environnement oestrogenique favorable au développement de la tumeur.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris, rendue obèse par un régime hypercalorique, subit l'implantation chirurgicale de canules dans le bulbe olfactif et l'hypothalamus, opération d'une quarantaine de minutes qui peut provoquer un saignement du crâne, puis des prélèvements sanguins sur animal vigile. Le porteur reconnaît que certaines souris supportent mal l'anesthésie et que la chirurgie peut entraîner douleur et difficultés de récupération. Il affirme que ces expériences ne peuvent se faire in vitro car elles requièrent l'observation de paramètres sanguins.

Objectifs

>>>Contexte. La prévalence de l’obésité est en constante augmentation au niveau mondial. Elle résulte d’un déséquilibre entre les apports (alimentation) et les dépenses (exercice physique) d’énergie. Une des complications majeures dans l'obésité est l'apparition d'un diabète de type 2 qui conduit à un taux de glucose dans le sang (glycémie) trop important, ou hyperglycémie chronique, par une altération de la secrétion et/ou de l'effet de l'hormone pancréatique hypoglycémiante, l'insuline. Le GLP-1 (pour glucagon-like peptide-1) est une incrétine, une hormone intestinale qui stimule la sécrétion d'insuline pancréatique lorsque la glycémie est élevée, après un repas notamment. Les analogues du GLP-1 sont commercialisés afin d'aider les patients diabétiques à réguler leur glycémie. Cependant, les mécanismes d'action du GLP-1 sur le cerveau sont très mal connus. Au laboratoire, nous avons montré que l'action du GLP-1 sur son récepteur dans le BO a pour conséquence d’améliorer la tolérance au glucose de souris rendues obèses par une alimentation hyperlipidique. Il s'agit donc d'un effet protecteur très prometteur à étudier. Ceci est d'autant plus intéressant que le BO est une structure cérébrale qui permet de donner des indications sensorielles sur la toxicité ou l'aspect agréable des aliments et qu'un mauvais fonctionnement du BO a été décrit chez le patient obèse. >>>Objectifs. Dans ce projet, nous voulons donc caractériser le rôle de la voie neuronale entre le BO et l'hypothalamus dans la régulation bénéfique de la glycémie chez les souris obèses. L'hypothalamus est une structure-clé de la régulation du métabolisme énergétique, qui permettrait l'augmentation d'insuline plasmatique en périphérie par l’activation de la voie GLP-1 dans le BO. Pour vérifier l'hypothèse d'un passage du signal engendré par le GLP-1 dans le BO vers le pancréas via l'hypothalamus, nous proposons d'injecter de la bicuculline par une canule placée à demeure dans le noyau paraventriculaire et ainsi en empêcher l'activation. Le PVN est le noyau de sortie de l'hypothalamus et module les neurones sympathiques prégangliaux de la moëlle épinière qui projettent sur le pancréas. Si la bicuculline bloque l'action bénéfique de l'injection du GLP-1 dans le BO, alors nous aurons démontré que l'hypothalamus est la structure cérébrale intermédiaire permettant un relais avec la périphérie dans la régulation de l'insuline. >> Nombre total de souris: 48 (24 souris obèses et 24 témoins).

Bénéfices attendus

Jusqu'à présent, les expériences publiées afin de démontrer que les mécanismes d'action bénéfique du GLP-1 sur les problèmes de régulation glycémie et de la prise alimentaire chez les souris obèses et diabétiques passeraient uniquement par une action sur l'hypothalamus n'ont pas été concluantes et les recherches sont portées sur l'identification de nouvelles structures cérébrales permettant cet effet. Il est en fait apparu qu'il existe un réseau de structures cérébrales complexes sensibles au GLP-1 et qui permet cette régulation de la glycémie. Nous avons précédemment exploré et montré la possiblité de la participation du BO dans ce réseau, une structure impliquée à la fois dans le codage cérébral des informations olfactives et la régulation de l'homéostasie glucidique. Ce projet permettra de mieux comprendre les effets du GLP-1 et de ses analogues sur le système nerveux central, et notamment sur le système olfactif. Il est tout à fait possible que dans le futur le GLP-1 puisse être délivré au patient par voie intranasale, de façon totalement non invasive contrairement aux piqures répétées, comme l'insuline, qui est depuis récemment utilisée par cette nouvelle voie d'injection.

Procédures

Le cumul des cinq expériences qui sont effectuées dans chaque procédure les classent toutes en une classe de sévérité modérée. En particulier, trois expériences requièrent une procédure chirrugicale et des prélévements sur animaux vigiles >>> Expérience 2 (toutes procédures): chirurgie. Les 48 souris seront implantées avec des canules dans le bulbe olfactif et l'hypothalamus. Chaque chirurgie dure une quarantaine de minutes. >>> Expérience 4 (procédure 1 et 2, 24 souris): prélévements sanguins mineurs chez la souris vigile en vue d'un test de tolérance au glucose. Le prélévement se fait en quelques secondes après avoir effectué une petite coupure sur le bout de la queue. >>> Expérience 5 (toutes procédures, 48 souris): Réponse insulinémique de la phase céphalique (Cephalic phase insulin release: CPIR). Pour mesurer le taux d'insuline dans le sang, deux prélévements sanguins de faible volume seront effectués au bout de la queue.

Impact sur les animaux

Pour chaque procédure, des nuisances sont possibles et une approche bioéthique est adaptée pour les prévenir, les diminuer et les éliminer si possibles. Pour l'expérience 1 (procédure 1 et 3) de régime hypercalorique, nous n'avons pas de nuisance attendue. Nous n'avons jamais observé de problèmes de souris ne voulant pas se nourrir avec une nourriture hyperlipidique. De plus, le surpoids induit chez les souris sous régime hyperlipidique n'entrave pas leur locomotion. Pour l'expérience 2 dans toutes les préocédures, qui consiste en une chirurgie pour installer les canules d'injection dans le BO et le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus, des souris peuvent mal supporter l'anesthésie et la chirurgie peut entrainer un saignement important au niveau du crâne de l'animal et entrainer douleur et problème de récupération. Pour les tests métaboliques, OGTT (expérience 4, procédure 1 et 2) et ITT (expérience 4, procédure 3 et 4) des problèmes de volume sanguin prélevé peuvent survenir et pertuber l'animal dans sa récupération.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les souris seront mises à mort. 3 souris de chaque procédure seront perfusées au paraformaldéhyde 4% après une injection de pentobarbital en overdose afin de vérifier l'emplacement des canules par immunohistochimie de coupes cérébrales.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet visant à étudier le rôle de l'incrétine GLP-1 sur le cerveau et sur la glycémie, nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres sanguins. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de la glycémie et de la prise alimentaire. Même si chez les poissons il existe des équivalents de certains groupes de neurones des mammifères, nous ne disposons pas de modèle d'obésité dans cette espèce, qui se nourrit de façon très différente par rapport aux mammifères. Enfin, nos modèles murins, à savoir les souris C57BL6 mâles rendues obèses par régime hypercalorique, sont très bien caractérisées au niveau métabolique depuis plusieurs dizaines d'années dans plusieurs laboratoires, dont le nôtre.

Réduction

La réduction du nombre d'animaux utilisés est fortement liée à la puissance statistique qui pourra montrer l'effet recherché, ici si nous pouvons bloquer l'effet du GLP-1 bulbaire par l'injection de bicuculline dans l'hypothalamus. Ceci nous permettra de définir la voie cérébrale impliquée dans la régulation de la glycémie à partir du bulbe olfactif. L'ensemble des expériences réalisées au laboratoire ont montré qu'un nombre maximal 12 individus doit être engagé par groupe. Ce nombre permet de compenser des exclusions éventuelles de souris qui ne répondent pas aux tests pharmacologiques ou métaboliques. Nous aboutissons ainsi toujours à un nombre minimum de 8 souris nécessaires à la puissance statistique de nos comparaisons. De plus, ce projet bénéficiera du développement de 2 projets antécédents qui nous ont permis de déterminer les doses de GLP-1 dans le bulbe et de bicuculline dans l'hypothalamus. Il n'y aura donc pas d'animaux engagés dans la recherche d'un effet dose/réponse de ces agents pharmacologiques. De plus, l'implantation de canules à demeure pour injecter le GLP-1 dans le bulbe olfactif et la bicuculline dans le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus chez la souris vigile permet d'utiliser chaque souris comme sa propre témoin et de réduire grandement le nombre de souris qui aurait été nécessaire par une approche pharmacologique aigüe: nous effectuerons différentes expérimentations sur des mêmes groupes de souris tant que celles-ci se révèlent non invasives, non douloureuses, non stressantes pour l’animal. Tests statistiques: vérification de la normalité de la distribution par un test de Shapiro-Milk. Si la distribution suit la loi normale, comparaison intragroupe sous différentes injections par un test d'ANOVA, sinon par un test de Kruskal-Wallis (et tests posthoc adaptés si nécessaires).

Raffinement

Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Les animaux seront examinés individuellement tous les jours par le personnel de l'animalerie. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

La souris C57BL6 représente une souche murine adéquate comme modèle d'étude du récepteur du GLP-1 dans le bulbe olfactif chez les souris obèses versus des souris contrôles. Elle a notamment été utilisée pour les études précédentes sur l'action des incrétines dans le système nerveux central. De plus, elle a un système olfactif développé propice à l'étude du bulbe olfactif. Enfin, nous avons l'expertise depuis plusieurs années i) du régime hypercalorique rendant les souris progressivement obèses ii) de l'implantation de canule dans le BO chez la souris anesthésiée et de la surveillance postchirurgicale iii) du suivi du bien-être de l'animal après injection. Pour rendre les souris obèses, une alimentation hypercalorique leur est fournie: à partir de 3 mois de cette alimentation, elles présentent un poids allant jusqu'à 10 ou 15 grammes supérieures aux souris sous régime standard. Comme le régime commence à 6 semaines d'âge, les souris qui seront injectées et testés métaboliquement auront donc au moins 4 mois, ce qui correspond à un âge adulte chez la souris.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris NSG immunodéficientes reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines puis des injections hebdomadaires de lymphocytes T, une grosseur tumorale se développant dans le flanc. Les animaux sont tués pour des analyses post-mortem, ou plus tôt si trois signes cliniques notables ou un signe sévère apparaissent. Le porteur reconnaît que davantage d'animaux par lot serait préférable statistiquement mais retient cinq souris pour des raisons éthiques, et affirme que les cellules tumorales se comportent différemment in vitro et in vivo.

Objectifs

L’immunothérapie, devenue une thérapie de référence pour certains cancers métastatiques, consiste à améliorer les mécanismes de défenses spécifiques du patient pour éliminer la tumeur. Parmi les différentes stratégies, l'immunothérapie passive par transfert adoptif repose sur l’administration à un patient de cellules du système immunitaire reconnaissant un antigène tumoral spécifiquement exprimé par les cellules à éliminer. Des essais cliniques d’injection de lymphocytes ont déjà été réalisés et, s’ils ont montré une bonne tolérance, ils ont eu une efficacité anti-tumorale encore trop limitée. Ce programme de recherche préclinique vise à évaluer la faisabilité et l’efficacité thérapeutique, dans le traitement des cancers, de nouvelles approches d’immunothérapie passive par transfert adoptif de différents types d’effecteurs lymphocytaires T anti-tumoraux. Afin que cette étude soit la plus représentative possible de la pathologie humaine, un modèle de développement de xénogreffes de cellules tumorales et d’administration d’effecteurs lymphocytaires T humains optimisés sera établi dans les souris immunodéficientes NOD-SCID-IL-2Rγ [NSG]. Compte-tenu de la diversité importante des cancers, les différentes stratégies thérapeutiques pourront être testées dans deux modèles de cancers humains hautement immunogènes : le mélanome et le cancer colorectal. Les effecteurs lymphocytaires T humains utilisés seront des : - lymphocytes T cytotoxiques spécifiques d'antigènes tumoraux. - lymphocytes T modifiés génétiquement pour inactiver l'expression des gènes codant pour des Immune Checkpoint (IC), dont les ligands sont exprimés par les cellules tumorales préalablement injectées.

Bénéfices attendus

En conclusion, l’objectif principal de ce programme est d’obtenir, à l’aide de modèles "in vivo", des preuves de concept précliniques pouvant justifier la mise en place d’immunothérapies par transfert adoptif de lymphocytes T cytotoxiques optimisés par modification génétique visant à inactiver un ou plusieurs IC, dans le traitement des cancers. En fonction des données de faisabilité et d’efficacité obtenues, ces travaux pourront aussi permettre de prioriser le ciblage de certains de ces IC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée de 50µL de tampon PBS stérile (avec ou sans cellules) dans le flanc à J0 dans chaque procédure. Dans les procédures 2, 3 et 4, les animaux seront également soumis à des injections hebdomadaires (à partir de J7) en intraveineuse de 100µL de PBS stérile (avec sous sans cellules) pendant 3 semaines. Ces injections en elles-mêmes sont de l’ordre de la minute. La procédure d’injection des cellules tumorales dans le flanc sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4%/air comprimé pour induction puis 2%/air comprimé pour le maintien).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis aux nuisances ou effets indésirables suivants : - une douleur intrisèque à l’injection (piqûre) dans le flanc, de cellules dans un volume donné (50 à 100µL) de tampon phosphate salin. - un refroidissement des souris lors de l’anesthésie gazeuse. - le développement d’une grosseur tumorale dans le flanc est attendu.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le protocole seront mis à mort, car des études ex-vivo seront effectuées à partir de prélèvements post-mortem effectués sur les animaux.

Remplacement

Remplacement : Les paramètres observés dans cette étude ne peuvent pas à ce jour être remplacés par des procédures "in vitro". L'évaluation chez l'homme du bénéfice thérapeutique de l’administration d’effecteurs immunitaires, nécessite le développement d'études précliniques permettant de vérifier la faisabilité de ces thérapies et de détecter la survenue de premiers effets secondaires délétères. Concernant l’immunothérapie anti-tumorale, il est établi que les cellules tumorales se comportent différemment "in vitro" et "in vivo", en terme de croissance, de résistance à la lyse et de capacité à instaurer un environnement délétère pour le système immunitaire. Notre étude permet d'évaluer l'efficacité du traitement proposé en conditions physiologiques (notamment en termes de migration de lymphocytes T injectés sur le site tumoral), et de définir les modalités optimales d’administration des effecteurs lymphocytaires. Compte-tenu de la difficulté de mise en place d’essais cliniques et de recrutement de patients éligibles, il paraît clair que les informations obtenues suite à ces travaux précliniques, couplées aux données obtenues "in vitro", auront une importance capitale lors du transfert en clinique.

Réduction

Réduction : Le nombre d'animaux a été réduit à des lots de 5 souris et les résultats seront analysés statistiquement par des tests de comparaison : test de Wilcoxon ou Mann -Whitney. D'un point de vue statistique, l'utilisation de plus d'animaux par lot semble préférable mais d'un point de vue éthique, le nombre d'animaux utilisé est réduit au minimum. Plusieurs études publiées dans notre domaine de recherche avec des modèles animaux similaires décrivent l'utilisation de 5 animaux par lot.

Raffinement

Raffinement : Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées (groupe de 5 souris par cage maximum), avec enrichissement (frisottis et/ou dôme) et accès libre à l’eau et à la nourriture. De façon à diminuer le stress, les différentes procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l'étude avec une évaluation des signaux généraux (visite 3 fois par semaine en présence d’un signe clinique notable et visite quotidienne s’il y a présence de signes cliniques notables (cf annexe « gestion de la douleur »)). De plus, en présence de trois signes notables ou un signe sévère : les animaux seront mis à mort, après une anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4%/air comprimé) par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Les souris sont des modèles d'étude pertinents, notamment en immunothérapie anti-tumorale, de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement, ...). Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de sujets immunodéficients (évite le rejet de greffe) tels que les souris NSG qui sont dépourvues de lymphocytes T, B et de cellules NK. Ces souris permettent la croissance de nombreuses lignées tumorales humaines et l'utilisation d'effecteurs T d'origine humaine. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6-10 semaines) pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux, facilitant non seulement le geste lié aux greffes de cellules tumorales et de lymphocytes T mais renforçant aussi la pertinence des effets thérapeutiques (transfert clinique chez des patients adultes).