Oncologie

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un mélanome à métastases pulmonaires, elles reçoivent des injections intraveineuses, des inoculations intranasales d'un parasite et des prises de sang, pour identifier les cellules immunitaires impliquées dans la réponse antitumorale. Le porteur indique que la tumeur pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires et que la mort survient rapidement après l'apparition des symptômes, la mise à mort étant planifiée juste avant. Il reconnaît qu'une approche in vitro a été développée en amont mais affirme qu'elle ne reproduit pas un modèle de régulation complexe.

Objectifs

Les premiers résultats publiés montrent que l’injection intratumorale de tachyzoïtes de Neospora caninum et de N. caninum modifiés pour sécréter de l’IL15 permet le contrôle du développement d’une tumeur sous-cutanée solide EG-7 par action oncolytique, induction d’une forte réponse immunitaire et reprogrammation de l’environnement tumoral. De même, l’efficacité de N. caninum dans un modèle murin de mélanome à métastases pulmonaires (B16F10) a été démontrée par voie sous-cutanée, intraveineuse et intranasale avec une très bonne protection antitumorale induite par voie intraveineuse et intranasale. Le modèle de mélanome à métastases pulmonaires est à la fois un modèle plus relevant d’un point de vue clinique humaine puisqu’il s’agit d’un cancer contre lequel nous avons besoin de développer de nouvelles approches thérapeutiques efficaces, mais aussi un modèle nous permettant d’étudier la réponse antitumorale induite par N. caninum dans un modèle métastatique. La réponse antitumorale induite par N. caninum dans ce modèle a été caractérisée, il nous faut maintenant déterminer si les populations cellulaires qui sont recrutées dans les poumons des souris traitées sont indispensables à la réponse antitumorale et de confirmer ainsi leur rôle. Le rôle des populations cellulaires présentes dans les poumons sera étudié par déplétion locale de ces dernières (n=420souris).

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet nous pourrons identifier les cellules immunitaires dont le rôle est primordial dans la réponse antitumorale induite par N. caninum. En effet, si nous observons un développement tumoral après traitement par N. caninum chez les souris ayant une population cellulaire déplétée, nous pourrons conclure que le rôle de cette population cellulaire est primordial dans la réponse antitumorale. En plus de déterminer quelles populations cellulaires sont impliquées dans la réponse antitumorale, nous pourrons aussi déterminer dans quelle mesure elles sont impliquées.

Procédures

Lot témoin non traité : 1 injection intraveineuse (1 minute), 4 prises de sang (30 secondes). Lots déplétés 1 à 5 (n=20) : 1 injection intraveineuse (1 minute), 2 inoculations intranasales (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes). Lots déplétés 6 à 10 (n=20) : 2 injections intraveineuses (1 minute), 1 inoculation intranasale (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes). Lots contrôles 1 à 5 (n=20) : 1 injection intraveineuse (1 minute), 2 inoculations intranasales (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes). Lots contrôles 6 à 10 (n=20) : 2 injections intraveineuses (1 minute), 1 inoculation intranasale (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes).

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur au niveau pulmonaire peut induire chez la souris une souffrance due à une difficulté respiratoire. Les effets indésirables pouvant apparaitre sont : - Signes cliniques modérés : Agitation/Agressivité, Hypomobilité/hyporéactivité, stéréotypies, Poil piqué, Coloration anormale de la peau, Flacidité musculaire généralisée, Gonflement abdominal, Zone ano-génitale souillée, Perte de poids inférieure à 15% (en tenant compte de la masse tumorale), Diminution/absence de prise de nourriture. - Signes cliniques : Akinésie, Tremblements généralisés, Convulsions, Persistance du pli cutané, Voussure du dos/dos cambré, Difficultés respiratoires, Perte de poids supérieure à 15% (en tenant compte de la masse tumorale), Absence de prise de nourriture> à 2 jours. L’apparition des symptômes précède de peu l’apparition des points limites et la mort de l’animal, qui surviennent rapidement (généralement en deux à trois jours). Dès l’apparition des symptômes sur l’une des souris du lot contrôle, l’ensemble des animaux des animaux sera mis à mort pour éviter toute souffrance inutile. Si les points limites cités précédemment sont atteints, les animaux seront mis à mort sans délai. D’après notre expérience, le développement de la tumeur sans traitement devrait conduire à l’apparition des symptômes cités précédemment vers J30 et conduira à la mise à mort des animaux sans délai. Ce délai d’apparition des symptômes est pris en compte lors du développement du protocole expérimental et la mise à mort des animaux est planifiée pour être réalisée quelques jours avant l’apparition des premiers symptômes pour éviter toute souffrance aux animaux.

Devenir

Afin de pouvoir étudier la réponse immunitaire induite par N. caninum lors du traitement des nodules pulmonaires et de déterminer l’impact de l’absence d’une population cellulaire spécifique sur cette réponse immunitaire, nous devons mettre à mort les animaux pour collecter les poumons et étudier la réponse locale dans cet organe. Il n’existe à ce jour aucune méthode nous permettant de nous affranchir de la mise à mort des animaux.

Remplacement

Une approche in vitro a été développée en amont afin de valider notre hypothèse de travail et l’utilisation des composés sur des cellules immunitaires impliquées dans le contrôle de la tumeur mais cela ne reproduit pas un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques (disponibles sur Anastats.fr) garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature. L’étude statistique des résultats sera réalisée avec le test non paramétrique Kruskall-Wallis pour l’étude des réponses immunitaires humorale (titre en anticorps) et cellulaire (dosage de cytokines) ainsi que pour l’étude du développement tumoral.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les normes réglementaires, en animalerie A2 à raison de 5 souris maximum par cage sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique des points limites.

Choix des espèces

Les souches de souris immunocompétentes sont adaptées à la greffe de cellules tumorales syngéniques présentant le même fond génétique que la souche de souris utilisée. Dans le cadre de précédentes études chez la souris, l’utilisation de protozoaires en tant que thérapie antitumorale a montré des résultats probants. Adulte. Il n’y pas la nécessité d’utiliser des animaux plus jeunes ou gestants.

4 790 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés dans leur cerveau par stéréotaxie, sur des embryons via une laparotomie de la mère, sur des nouveau-nés ou sur des adultes, avant des tests comportementaux non précisés puis la mise à mort par exsanguination. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer une douleur modérée et que les nouveau-nés atteignant un point limite sont mis à mort par décapitation avant quinze jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité du tissu et que l'étude ne peut être menée qu'in vivo.

Objectifs

Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du XIXe siècle, le cerveau a été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal, les cellules et signaux immunitaires systémiques ou encore le cycle jour/nuit. Parallèlement, les zones barrières du cerveau, comme les méninges et les plexus choroïdes, ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes. Les plexus choroïdes constituent la barrière sang-fluide céphalorachidien, l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Ils sont situés dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacents à des zones impliquées dans la neurogenèse. D'un point de vue structurel, les plexus choroïdes sont composés d'un réseau de capillaires sanguins fenêtrés entourés d'une monocouche de cellules épithéliales et peuplés entre les deux par une grande variété de cellules immunitaires. Les principaux rôles physiologiques des plexus choroïdes sont la production de liquide céphalorachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, ainsi que la production et le passage contrôlé du sang au cerveau de diverses molécules de signalisation, notamment des hormones et des facteurs neurotrophiques. Les molécules sécrétées par les plexus choroïdes façonnent l'activité du cerveau, par exemple en modulant la neurogenèse et la fonction des cellules immunitaires microgliales localisées dans le cerveau, ce qui rend les plexus choroïdes cruciaux pour l'homéostasie du cerveau. Des travaux antérieurs et d’autres travaux préliminaires ont montré que le niveau d’expression de certains gènes exprimés par l’épithélium des plexus choroïdes varient en fonction de l’âge et notamment au cours du vieillissement, et en réponse aux variations environnementales telles que celles du microbiote et du cycle circadien. Notre but est de mieux comprendre comment ces facteurs influent sur la biologie des plexus choroïdes et la fonction du cerveau.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra l’identification des facteurs produits par les plexus choroïdes et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité neuronale en fonction de l’âge, depuis la naissance et au cours du vieillissement, en fonction des facteurs environnementaux que représentent les variations de la composition du microbiote et celles du cycle circadien. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que constitue les plexus choroïdes et qui reste encore très peu étudiée et d’identifier de nouveaux mécanismes via lesquels les plexus choroïdes modulent la fonction du cerveau. A terme, ce projet pourrait permettre la mise au point d’immunothérapie afin de mieux lutter notamment contre les maladies dégénératives associées au vieillissement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : - soit une laparotomie sur femelle gestante (durée de la procédure : 45 min à 1h), - soit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau par stéréotaxie (durée de la procédure : incluse dans la durée de la laparotomie quand réalisée sur embryons, 5 à 10 min sur nouveau-nés, 30 min à 1h sur adulte). 12 jours (dans le cas des nouveau-nés injectés à la période embryonnaire) à 12 semaines (adultes) après chirurgie, les animaux seront mis à mort par exsanguination sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux adultes auront été avant mise à mort (4 à 8 semaines après chirurgie) impliqués dans des tests de comportement non invasifs.

Impact sur les animaux

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par une injection de buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. De la lidocaïne sera appliquée sur les zones à inciser. De l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie. Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Devenir

Les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les géniteurs qui n’auront pas subi de chirurgie (procédures 1 et 2) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 après 6 mois de reproduction. Les femelles gestantes qui auront subi une laparotomie (procédure 1) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 au moment de la séparation avec les nouveau-nés P6 ou P21. La mise à mort des souris auxquelles auront été injectés les vecteurs viraux (procédure 2) aura lieu par perfusion de PBS (exsanguination) sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de prélever les tissus nettoyés du sang et à analyser post-mortem. Si un animal atteint les points limites définis, il sera mis à mort par exposition croissante en CO2 (jeunes de plus de 15 jours et adultes) ou par décapitation (nouveau-nés de moins de 15 jours).

Remplacement

Notre but est d’étudier comment les cellules situées au niveau des plexus choroïdes, agissent sur le cerveau, en condition physiologique, au cours du développement, du vieillissement et en réponse aux variations de composition du microbiote et du cycle circadien. Les plexus choroïdes sont un tissu composé d’un endothélium fenêtré, de cellules épithéliales, de cellules de type neuronal, de cellules mésenchymateuses et de cellules immunitaires. Les cellules immunitaires du système périphérique pourraient induire l’expression de facteurs produits par les cellules des plexus choroïdes qui pourraient eux-mêmes moduler l’activité neuronale du cerveau. Il n’existe aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité́ d’un organisme ou d’un tissu avec ses composantes endothéliale, épithéliale, neuronale, mésenchymateuse et immunitaire. De plus, nous étudions la physiologie des plexus choroïdes en fonction de l’âge et des variations des facteurs environnementaux tels que le microbiote et le cycle circadien, ce qui ne peut être étudié qu’in vivo.

Réduction

Nous souhaitons étudier les gènes des plexus choroïdes et du cerveau qui auront montré par une précédente approche transcriptomique des différences d’expression considérables en fonction des paramètres comparés. Les quantités d’animaux utilisées pour mener à bien notre projet sont établies en tenant compte de notre précédente expérience et de tests statistiques (test ANOVA, source SHADE). Les 4 plexus choroïdes d’un animal doivent être groupés pour pouvoir réaliser une analyse moléculaire ou transcriptomique sur ces petits tissus. Seuls 10 microlitres de liquide céphalo-rachidien peuvent être prélevés à partir du cerveau d’une souris, ce qui ne permet qu’un seul type d’analyse. Les analyses moléculaires du liquide céphalo-rachidien, des plexus choroïdes et des zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les mêmes animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (adultes). Nous prévoyons pour chaque groupe, 4 animaux par analyse. Le sexe des animaux pouvant influer sur les phénotypes observés, des mâles et femelles seront inclus (ratio 1/1). Des triplicatas d’expérience seront réalisés pour permettre l’obtention de résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 3 groupes comparés (P6, P21 et adultes) : les effectifs proposés (36 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.07 (effets considérables à extrêmes). - 2 groupes comparés (adultes jeunes et âgés) : les effectifs proposés (24 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.65 (effets très forts à considérables). - 6 groupes comparés (4h cycle fixe et 2h cycle perturbé) : les effectifs proposés (72 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.85 (effets très forts à considérables). - 4 groupes comparés (P21 et adultes, conventionnels et axéniques) : les effectifs proposés (48 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.97 (effets considérables à extrêmes). Ces résultats nous permettront d’identifier les différences majeures dans la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau en fonction de l’âge, du microbiote et du cycle circadien, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant et quelques heures après leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par des administrations d’analgésiques (buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur ; lidocaïne appliquée sur les zones à inciser ; de l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie). Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives et notamment des maladies dégénératives car de nombreuses lignées sont disponibles, invalidées pour de nombreux gènes d'intérêt et/ou génétiquement manipulable après injection de vecteurs viraux. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproductions facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. Il est aisé d’en manipuler le microbiote. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le phénotype induit par les vecteurs viraux n’est analysable qu’au minimum 10 jours après injection. Afin d’étudier comment la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau évoluent avec l’âge, nous injecterons les vecteurs viraux à des souris embryonnaires afin d’en étudier les effets chez les souris : (i) âgées de 6 jours, stade important avec la mise en place du système immunitaire et de nombreuses variations métaboliques en réponse à l’allaitement maternel, (ii) âgées de 21 jours qui correspond à la période du sevrage avec d’importantes variations métaboliques et du microbiote qui devient mature, (iii) adultes, âgées de 7 à 12 semaines, qui seront notre point de référence physiologique. De la même manière, nous étudierons les effets du microbiote en injectant les vecteurs viraux à des souris âgées de 3-4 jours afin d’en étudier les effets lorsqu’elles auront 21 jours ou qu’elles seront adultes et les effets du vieillissement en injectant les vecteurs viraux à des souris adultes jeunes de 7 à 12 semaines et âgées de 10 à 20 mois.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Âgées d'une semaine à vingt-quatre mois, elles subissent des prélèvements de sang deux fois par mois et des injections intrapéritonéales, pour étudier le vieillissement des vaisseaux sanguins. Le porteur présente les manipulations lors des prises de sang et des injections comme les seuls effets indésirables. Les rubriques réduction et raffinement reprennent mot pour mot le texte de la rubrique remplacement, sans mesure propre à chacune, avant mise à mort de toutes les souris pour analyser leurs tissus.

Objectifs

Dans ce projet, nous souhaitons 1/ caractériser l’endothélium vasculaire vieillissant 2/ explorer le rôle de médiateurs lipidiques sur le vieillissement vasculaire. Le vieillissement de la population est un enjeu majeur du XXIe siècle. Il s’accompagne d’une augmentation de la fréquence de maladies telles que le cancer et les maladies cardiovasculaires. Ces dernières sont la principale cause de mortalité dans le monde, majoritairement causé par un dysfonctionnement du système vasculaire (vaisseau sanguin et lymphatique) et du système d’hémostase (thrombose, coagulation et fibrinolyse). Cette étude sera menée selon plusieurs axes : Axe 1. Evaluation du vieillissement vasculaire Dans cet axe, une étude pilote sera menée pour la mise au point des immunomarquages de sénescence et de caractérisation. Pour ce faire, un groupe de 5 souris wt (C57BL6) dites jeune (1 semaine à 1mois) et un groupe de 5 souris wt (C57BL6) dites âgées (12 ou 24 mois) seront utilisées (n=10).

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’apporter de la connaissance sur le vieillissement vasculaire ainsi que l’impact de la physiologie plaquettaire et de l’endothélium, inconnu à ce jour et peu réalisable sur les humains à la vue de la diversité du système vasculaire. En effet, il est irréalisable d’obtenir sur le même individu des biopsies endothéliales (veines, artères et capillaires), à cause des méthodes invasives et des conséquences délétères (hémorragies). Par ailleurs, le second axe permettra de déterminer un composé diminuant ou stoppant le vieillissement vasculaire. Ces travaux serviront à l’ensemble de la population en général et pourront servir de tremplin pour de nouvelle thérapie innovante, des brevets. éral et pourront servir de tremplin pour de nouvelle thérapie innovante, des brevets.

Procédures

Prélèvements sanguins sur animeaux vigiles, 2 fois par mois. La durée de la prise de sang est de maximum 2minutes Les injections en intraperitoneale durent maximum 1minute.

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables que les animaux peuvent ressentir seront liés aux manipulations lors des prises de sang et injections. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent.

Devenir

Au cour de l'étude, les souris feront l'objet d'un suivi quotidien et de prise de sang bi mensuel. Al fin de l'etude, tous les animaux seront mis à mort afin de faire une etude des tissus murins.

Remplacement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Réduction

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Raffinement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique du vieillissement. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Qui plus est, plusieurs de nos analyses reposent techniquement sur la cytométrie en flux, méthodologie qui requière un nombre conséquent de cellules issues d’organes immunitaires. Ce type d’expériences rend impossible l’utilisation d’organismes comme le poisson zèbre ou la drosophile. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations hémostatiques humaines. Les souris utilisées seront de 1 semaine à 24 mois. Les souriceaux a une semaine de vie presentent un arbre vasculaire incomplet au niveau des retines et permet d'avoir un temps de reference "jeune". Les vaisseaux sanguins cerebrales sont matures chez les souriceaux de 1 semaine. Pour notre étude, nous avons besoin de souris jeunes (1 semaine à 1mois) et souris vieillissante de 3 à 24mois. Ces dernieres ont un stade de developpement complet.

2 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une stimulation magnétique du cerveau après une hypoxie. Selon les procédures, elles subissent une privation d'oxygène de quarante minutes à six semaines, quatorze jours de stimulation magnétique et des tests comportementaux, sous sédation profonde. Le porteur décrit des inconforts transitoires liés à l'hypoxie, à la stimulation et aux injections, et affirme que le cervelet ne peut être étudié hors d'un système nerveux entier. La plupart des souris sont mises à mort pour prélever le cerveau, tandis que 180 femelles ayant servi de mères sont renvoyées à l'élevage pour être réutilisées.

Objectifs

Notre projet testera les effets neurologiques de la stimulation cérébrale non invasive pour améliorer les déficits fonctionnels. Ces connaissances permettront d'optimiser des protocoles de stimulation et trouver des traitements potentiels. Nous analyserons les effets de différents patrons de stimulation magnétique répétée à faible intensité (LIrTMS), qui modifient la plasticité neuronale et améliorent le comportement chez les animaux pathologiques. Les fonctions cérébrales seront évaluées avec des tests de comportement, et les modifications structurales et fonctionnelles chez les mêmes animaux pour minimiser le nombre d’animaux utilisé. Ce traitement peut changer la signalisation cellulaire, modifier des réseaux neuronaux, et provoquer une réparation post-lésionnelle dans le cerveau.

Bénéfices attendus

Nous cherchons des protocoles pour traiter une pathologie commune chez l’Homme, l’hypoxie cérébrale. Nous étudierons le cervelet parce qu’il est particulièrement sensible à l’hypoxie; sa structure, sa fonction et son développement sont très bien décrits; son dommage lors du développement est associé avec les maladies neurodéveloppementales; et il est touché par le vieillissement.

Procédures

4 interventions au maximum. Procédure 1 : 40 minutes d’hypoxie ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 12 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 2 : hypoxie 6h/jour x 10 jours ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 14 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 3 : hébergement en cages hypoxie pendant 6 semaines, hypoxie intermittente 6h/jour ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 60 minutes dans 1 journée ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes

Impact sur les animaux

Les interventions individuellement induisent une douleur en deca de la douleur engendrée par une simple injection faite selon le bon pratique vétérinaire. La succession de ces interventions nous emmène à demander l’autorisation du projet avec degré de gravité modérée. Les effets indésirables possible sont : inconfort transitoire en début d’hypoxie ; inconfort lors de la stimulation; inconfort lors des tests de comportement ; inconfort lors de l’injection d’anesthésiants et analgésiants. La surveillance quotidienne permet de s’assurer du bien être des animaux et lorsqu’un point limite (comme décrit) est atteint, les responsables du projet sont avertis et prennent une décision sur le devenir de l’animal, en lien avec la structure du bien être animal, et le vétérinaire référent.

Devenir

Nos études sont designés pour obtenir un maximum d'information biologique et comportemental d'un nombre minimum de souris. La plupart des souris sujet à l'hypoxie et la stimulation non invasive est testé en comportement puis perfusé, et les cerveaux des autres sont prélévé pour les études moléculaires. 180 souris femelles, les mères des portées des nouveaux-nés impliqués, seront remis dans l’animalerie, pour qu’elles soient re-utilisées pour l’élevage et diminuer donc le nombre total d’animaux.

Remplacement

Comme toute structure du système nerveux central, les connexions complexes entre les neurones ne peuvent pas être entièrement remplacé par des méthodes de culture ni des modèles mathématiques. Les déficits de comportement dus à une mutation associée avec les troubles autistique, ou à la suite d'une hypoxie perinatale, et l'amélioration de ces déficits ne peuvent être étudiés hors contexte de l'ensemble du système nerveux et donc avec des animaux vivants.

Réduction

2700 animaux total seront impliqués dans cette étude de 4 années. Nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaire pour les trois procédures, pour diminuer le nombre d'animaux utilisé. Les tests de comportement nécessitent normalement 10 animaux par groupe, et les études d'expression génique nécessitent 5 animaux par groupe.Un calcul de puissance a été fait pour déterminer ces nombres d'animaux.

Raffinement

Avant le début des interventions, nous habituons les animaux au contact humain en pratiquant du « handling » quotidien pendant une semaine ; ceci diminue leur peur et leur angoisse. Pendant la stimulation non invasive (LIrTMS) les animaux ne montrent aucun signe d’angoisse. Les animaux sont hébergés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Les points limites sont définis pour chaque procédure, en cas de dérèglement physiologique ou souffrance de l’animal. Tout acte invasive est fait uniquement après administration des médicaments analgésique ou anésthetiques adaptés.

Choix des espèces

La souris est très utilisée pour des expériences sur le système nerveux car cette espèce partage un nombre de propriétés biologiques avec l'Homme. Sa petite taille et l'existence des lignées de souris transgénique facilitent les aspects pratiques de l'expérimentation. Il existe de protocoles standardisés du comportement, ce qui permet de mieux comparer les résultats obtenus par différentes équipes de recherche. La majorité des animaux seront utilisés pendant les premier mois de développement postnatal, les âges clés pendant le développement du cerveau. Les ages ont été choisi pour être équivalentes au 1) le 3ème trimestre de gestation chez l’Homme ; 2) jeune adulte ; ou 3) adulte agé.

3 045 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une protéine contre l'anorexie liée aux chimiothérapies ou au stress. Selon les groupes, elles subissent une microcoupure hebdomadaire de la queue, jusqu'à six injections intraveineuses, une contention de deux heures par jour pendant deux fois quinze jours, un jeûne de 48 heures ou l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique. Le porteur présente la perte de poids comme le principal effet indésirable et qualifie le stress lié à la contention et au jeûne de transitoire. Toutes les souris sont mises à mort pour prélever leurs organes.

Objectifs

Il a été récemment découvert qu’une protéine libérée par les cellules et les organes est impliquée dans un réflexe primitif de la faim, stimulant le comportement alimentaire par des mécanismes périphériques. Cette protéine agit comme un stimulateur lipogénique et un stimulateur de l'appétit efficace chez la souris. De plus, il a été montré que son injection chez la souris entraine une inhibition du processus autophagique. Une étude bio-informatique à montrer l’existence de plusieurs isoformes exprimées de façon différentielle dans l’organisme de la souris. Cette protéine apparaît comme un candidat d'intérêt dans la lutte contre l’anorexie du fait de son expression ubiquitaire, de ses liens avec la régulation centrale de l'appétit et de son rôle dans le métabolisme des lipides. L’objectif de ce projet est donc d’étudier et de déterminer si la présence de cette protéine (en fonction de son mode d’administration) peut empêcher : (i) l’anorexie (perte ou la forte diminution de l'appétit) associée aux traitements avec des agents chimiothérapeutiques ; (ii) ou l’anorexie associée à un stress psychologique/physique important.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à l’anorexie induite par les chimiothérapies ou par un stress mental trop important dans l'espèce humaine. Ceci pourrait avoir des retombées thérapeutiques dans ces cas par la suite.

Procédures

Sur tous les animaux, une microcoupure de 1mm de l’extrémité de la queue sur animal vigile au début de l’expérience sera réalisée pour analyse sur le sang (durée: quelques secondes), puis une fois par semaine pendant 46 jours. Pour certains animaux, au maximum 6 injections i.v. par souris (20 secondes) ou une injection intravasculaire hydrodynamique par souris (6-8 secondes). Pour d'autres animaux : 1 contention de 2h par jour pendant deux fois 15 jours dans un cylindre acrylique permettant la respiration. Pour d'autres animaux: Une période de jeûne de 48h et 1 injection intranpéritonéale (20 secondes). Pour une des procédures, les souris subiront une chirurgie légère par implantation de pompe osmotique sous anesthésie générale avec analgésie (durée 15 minutes).

Impact sur les animaux

L’ effet indésirable principal prévu pour les animaux est la perte de poids. Les animaux seront transitoirement stressés lors des périodes de contentions de 2 heures ou les périodes de jeûne.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, l’appétit, l’absorption des aliments et le comportement des individus par rapport à la nutrition vu sa complexité.

Réduction

Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Les tests statistiques utilisés seront des tests « LogRank » pour la survie, et des tests « Anova » pour la perte ou la récupération de poids.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie et analgésie des animaux pour toutes les procédures expérimentales (locale ou générale selon les cas), utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes...). La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. Du fait du but des recherches prévues, les animaux seront au stade adulte, étant des bons modèles pour les maladies à étudier. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

720 souris et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour élever et infecter des moustiques Anopheles vecteurs du paludisme. Les lapins sont exposés vingt minutes par semaine pendant six mois aux piqûres d'environ 500 moustiques femelles, les souris à quarante piqûres par semaine pendant deux mois, certaines étant en outre infectées par des parasites Plasmodium. Le porteur présente ces piqûres et les prélèvements de sang associés comme les seuls effets indésirables. Il justifie le gorgement sur animaux vivants par la difficulté de certaines lignées à se nourrir sur membrane, et met à mort lapins et souris à l'issue de chaque cycle.

Objectifs

L’objectif du projet est de produire régulièrement des moustiques femelles du genre Anopheles pour l’étude des interactions Plasmodium-Anopheles. Selon les questions scientifiques, il s’agira soit de colonies bien établies, soit de nouvelles lignées récemment établies ou à établir à partir de populations sauvages. Trois programmes scientifiques sont en cours. Programme 1 : Etude des bases moléculaires régissant un effet maternel chez Anopheles gambiae (souche Yaoundé) conduisant à une susceptibilité différentielle à Plasmodium falciparum des descendants. Programme 2 : Analyse fonctionnelle de gènes d’Anopheles arabiensis dont l’expression est régulée par P. falciparum et Plasmodium vivax. Programme 3 : Infection d’Anopheles darlingi par P. vivax pour le cyclage au laboratoire de ce parasite.

Bénéfices attendus

Globalement, le projet contribuera à une meilleure compréhension des interactions Anopheles-Plasmodium avec pour objectif principal la recherche de stratégies nouvelles et innovantes pour lutter contre la transmission du paludisme. Spécifiquement le programme 1 (Etude des bases moléculaires régissant un effet maternel chez Anopheles gambiae conduisant à une susceptibilité différentielle à Plasmodium falciparum des descendants) doit permettre d’identifier des facteurs de type épigénétique impliqués dans la susceptibilité du moustique Anopheles gambiae, vecteur majeur du paludisme en Afrique sub-saharienne, à P. falciparum et guider vers le choix de nouvelles stratégies de contrôle des populations de ce moustique sans avoir recours à des insecticides. Le programme 2 a pour objectif une meilleure connaissance des gènes du moustique spécifiquement régulés par P. vivax, un parasite négligé mais d’importance croissante en Asie et Amériques et ainsi orienter les programmes de stratégie de blocage de la transmission de ce parasite, tel que des vaccins bloquant la transmission. Le succès du programme 3 (cyclage au laboratoire de P. vivax) ouvrira un pan nouveau de recherches, notamment pour agir sur les formes quiescentes du parasite au niveau du foie, sensibles à une seule famille de molécule (primaquine et tafénoquine), qui présente de nombreux effets indésirables chez les patients déficients en G6PD. Sur le plan transmission de P. vivax, ce programme permettra de compléter les études développées dans le programme 2, facilitant et accélérant la validation des gènes d’intérêt du moustique.

Procédures

Dans la procédure 1, les lapins sont exposés pendant 20 minutes à une cage contenant environ 1000 moustiques (donc seulement 500 sont des femelles), une fois par semaine, pendant 6 mois. Dans la procédure 1, les souris sont exposées pendant 20 minutes aux piqures de moustiques, à raison de 40 anophèles femelles par souris, une fois par semaine, pendant 2 mois. Dans la procédure 3, les souris reçoivent une injection intra péritonéale (quelques secondes), puis subissent un prélèvement d’un micro-volume de sang par une micro incision à l’extrémité de la queue de la souris à l’aide de ciseaux stérilisés (quelques secondes par prélèvement), puis sont exposées aux femelles adultes d’Anopheles, pour un repas de sang sous anesthésie générale (injection intrapéritonéale/ quelques secondes par injection ; repas sanguin pendant 30 minutes).

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables sur les animaux peuvent être dus à l’inconfort lié aux piqures par moustiques et la quantité de sang qu’il leur sera prélevé à cette occasion.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure : au bout de 6 mois pour les lapins, au bout de 2 mois pour les souris non infectées par Plasmodium, 3 à 5 jours après l’infection pour les souris infectées par des Plasmodium de rongeurs

Remplacement

Le choix de nourrir les moustiques sur animaux et non par gorgement sur membrane est guidé par la difficulté de lignées à se gorger sur membrane (An. arabiensis, An. darlingi) et l’impact potentiel d’altérer l’effet maternel étudié chez An. gambiae souche yaoundé (programme 1). En effet le comportement et la physiologie du moustique sont très sensibles à l’origine du sang, aux odeurs émises par les animaux et au mode de piqure. Par ailleurs des souris infectées par un Plasmodium de rongeur (P. berghei ou P. yoeli) sont utilisées comme substitut à des infections avec les parasites infectant l’homme (P. falciparum ou P. vivax) difficiles à produire au laboratoire.

Réduction

Le nombre requis d’animaux découle de la longue expérience de l’équipe qui veille à respecter les recommandations 3R. L’utilisation d’un même lapin au-delà de 6 mois résulterait à une production réduite de moustiques incompatible avec les objectifs scientifiques du fait de l’apparition d’un taux trop élevé d’anticorps anti-salive de moustiques ayant pour conséquence une perte de qualité des repas sanguin pour les moustiques et donc une perte en nombre de descendants moustique. Il en va de même pour les souris, auquel s’ajoute l’effet cumulé d’une anesthésie hebdomadaire qui amènerait à avoir recours à des doses d’anesthésiant plus importante et les conséquences possibles sur le bien-être de la souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales d’hébergement répondant aux normes européennes, avec une surveillance de l’état général (observation de la mobilité, du pelage, et de la couleur des oreilles) et du poids. Avant et après chaque repas sanguin des suppléments alimentaires sous forme de gel seront proposés aux animaux.

Choix des espèces

Le choix des lapins et souris pour maintenir ou produire des lignées de moustiques anophèles est guidé par la qualité du sang fourni par les animaux vivants et le fait que certaines lignées ne se gorgent que très faiblement à travers une membrane produisant des progénitures dont la taille est incompatible avec les programmes scientifiques. Le programme 1 interroge une composante épigénétique pour laquelle une modification du mode de gorgement des moustiques (Lapin versus poche de sang) pourrait être dommageable sachant que de nombreux paramètres peuvent être impliqués dans l’expression de signatures épigénétiques. Stade de développement des animaux : souris et lapins adultes jeunes car les animaux vieux sont difficiles à « piquer » et leur poids est trop important et pour les souris hôtes de Plasmodium, pour leur sensibilité aux parasites.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections de cellules tumorales dans le flanc sous anesthésie locale, avec des prélèvements de sang, pour tester des molécules censées déclencher une mort des cellules cancéreuses reconnue par le système immunitaire. Le porteur décrit une croissance tumorale sous-cutanée dont il qualifie les nuisances de limitées. Il affirme que des tests in vitro existent mais n'évaluent pas la réponse immunitaire mémoire, juge l'animal vivant entier "indispensable", puis met à mort les souris pour prélever rate, ganglions et tumeur.

Objectifs

Le développement des tumeurs dépend fortement de l’interaction entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement, particulièrement avec les cellules immunitaires présentes comme les lymphocytes cytotoxiques. Ces dernières reconnaissent spécifiquement la tumeur via la présentation d’antigènes, qui sont de petites protéines spécifiques à la tumeur. Après avoir été activatés, les lymphocytes cytotoxiques peuvent détecter et détruire la tumeur. Le profil antigénique de la tumeur est donc un point déterminant dans la réponse anti-cancéreuse. Cependant, la présentation antigénique n’est pas suffisante pour produire une réponse immunitaire efficace ; d’autres paramètres sont requis. Les lymphocytes cytoxiques sont activés les cellules dendritiques, or lors de cet échange, des signaux co-stimulateurs sont requis pour finaliser l'activation. Ce paramètre est décrit comme l’adjuvanticité, et l'absence de ces signaux se traduit par l’échappement de la tumeur au près système immunitaire. Dans un contexte tumoral, l’adjuvanticité est décrite, entre autre, par l’émission de motifs moléculaires associés au danger (DAMPs). Ces DAMPs sont des biomolécules sécrétées lors de mort des cellules cancéreuses et causent une réponse inflammatoire locale. La mort cellulaire immunogène (ICD) est définie par l'induction d'un stress aux cellules cancéreuses, et aboutit à la mort de celles-ci, accompagnée de la libération de nombreux DAMPs. Ces DAMPs sont reconnus par les cellules dendritiques et initient une cascade cellulaire aboutissant à l'activation de réponse immunitaire anti-cancéreuse . Plusieurs études ont décrit certaines chimiothérapies et radiothérapies comme inductrices de mort cellulaire immunogène, ce qui renforce leurs effets thérapeutiques. Jusqu'à présent, peu de molécules ont été caractérisées comme inductrices de l’ICD. Or ces agents pourraient être pertinemment utilisés en thérapie combinatoire en oncologie, avec des immunothérapies par exemple, afin de renforcer la réponse immunitaire anti-cancéreuse, et à terme d’améliorer la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer la capacité de molécules à induire une vaccination contre 3 modèles tumoraux différents via une induction de la mort cellulaire immunologique. Cette mort cellulaire permet d’engendrer des populations de lymphocytes T spécifiques contre la tumeur. Ainsi les souris seraient vaccinées contre la tumeur étudiée, ce qui serait un bon modèle préclinique en vue de développer des stratégies identiques ou similaires dans l'espèce humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux injections durant toute la durée de l’expérience. Ces injections se feront après anesthésie locale sur l’un des deux flancs de l’animal, durée 5-10 minute. Du sang pourra être prélevé au niveau sub-mandibulaire après anesthésie sous anesthésie gazeuse (1 fois par semaine pendant la période entre la 1ère et la 2nde injection de cellules), durée: 2-3 minutes.

Impact sur les animaux

Croissance tumorale sur le flanc des souris, en sous-cutanée. Nuisances limitées liées à la présence de cette tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes (rate, ganglions drainants et tumeur) et d'étudier au mieux la réponse immunitaire mémoire mise en place.

Remplacement

Concernant cette étude, il existe des alternatives non-animales comme des tests elternatifs in vitro. Cependant ces alternatives nous permettent seulement de décrire la capacité de nos molécules à induire la mort cellulaire, or il nous est impossible d’évaluer leur capacité à engendrer une population celulaire spécifique. L'utilisation d’animaux vivants est donc indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier la réponse immunitaire mémoire, et une potentielle vaccination complète contre les tumeurs étudiées. En effet, les relations entre les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires s’effectuent via différents organes, nécessitant toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Les traitements et procédures seront faits après tirage au sort et en aveugle. Afin réduire le nombre d’animaux, seules deux concentrations par molécule seront testées afin d’observer une vaccination in vivo. Ces deux concentrations seront déterminées au préalable via des tests de toxicité in vitro. Les témoins seront regroupés pour éviter la multiplication des groupes témoins lors du test in vivo en faisant toutes ces procédures en parallèle pour chaque modèle tumoral. Les résultats seront analysés par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Afin de réduire la douleur chez l’animal : - Les injections seront effectuées après anesthésie locale - Le milieu est enrichi afin de réduire le stress des animaux. - Les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie gazeuse . - Les animaux seront maintenus en groupes et logés dans des cages appropriées de taille adaptée au nombre d’individus. De plus, le milieu sera enrichi afin de réduire le stress des animaux. - Des points limite ont été définis a priori et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

- Génétique proche de celle de l’Homme - Les modèles de tumeurs existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implatation chez la souris est indispensable pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale dans sa globalité. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines (travaux sur les cancers de l'adulte).

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une xénogreffe de tumeur dans le pancréas par chirurgie, parfois une seconde chirurgie d'exérèse, puis des injections de nanoparticules magnétiques, une exposition à des champs magnétiques et une irradiation, pour tester une destruction locale des tumeurs. Le porteur renvoie les retombées cliniques annoncées, sensibiliser des cancers résistants et abaisser les doses de chimiothérapie, au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme que la validation in vitro déjà obtenue doit maintenant passer par la souris, sans détailler d'alternative.

Objectifs

Les objectifs de cette étude consistent à analyser l’effet anti-tumoral de nanothérapies par ablation mécanique ou hyperthermie magnétique locales, consistant en l’injection de nanoparticules magnétiques suivie d’une application de champ magnétique alternatif à basse fréquence [amplitude 1 à 380 mT / Fréquence 0 à 20 Hz] ou haute fréquence [amplitude 1-50 mT, fréquence 100 à 350 kHz] en association ou non avec des agents chimiothérapeutiques, pharmacologiques ou un traitement radiothérapeutique.

Bénéfices attendus

Le projet vise à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur les nanothérapies pour des cancers incurables pour lesquels la clinique ne dispose pas ou peu de solutions thérapeutiques, tels que le cancer du pancréas. Ces stratégies nano-thérapeutiques pourront être associées aux traitements conventionnels (chimiothérapeutiques et radiothérapeutiques) et devraient sensibiliser ces tumeurs très résistantes à ces traitements. Les stratégies nanothérapeutiques pourraient également permettre d’abaisser la dose des traitements conventionnels (chimiothérapie, radiothérapie), réduisant ainsi leurs effets indésirables.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à une procédure chirurgicale permettant de réaliser des xénogreffes orthotopiques (intra-pancréatiques principalement, durée 15 minutes). Une seconde procédure chirurgicale sera éventuellement envisagée, consistant à l’exérèse de la tumeur principale (durée 30 minutes), antérieurement aux traitements nanothérapeutiques an association ou non avec un traitement chimiothérapeutique, pharmacologique ou radiothérapeutique, afin de mimer les conditions retrouvées en clinique humaine proposant les traitements anti-cancéreux après chirurgie. Les autres interventions consisteront en : 1) l’injection de nanoparticules, d’agents chimiothérapeutiques ou pharmacologiques (durée :

Impact sur les animaux

De nombreuses études in vivo utilisant des nanoparticules d’oxyde de fer ont été menées et permettront l’utilisation de ces nanoparticules (concentration, mode d’injection…) sont induire de nuisances sur les animaux. Il existe aussi des données sur l’utilisation des champs magnétiques. Ceux-ci peuvent induire quelques effets indésirables (notamment les champs à haute fréquence). Nous prévoyons de limiter les expositions en s’appuyant sur les données de la littérature pour ne pas induire de nuisances ou limiter les effets indésirables : les temps et séquences d’exposition ainsi que les paramètres de champs seront scrupuleusement choisis pour obtenir le meilleur rapport bénéfice/risque. L’implantation de xénogreffes peut engendrer des effets indésirables sur les animaux, ainsi que la chirurgie d’exérèse de ces tumeurs. Les souris ayant subi ces procédures (xénogreffes, chirurgie d’exérèse) sont suivies quotidiennement, pesées au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance, pendant toute la durée de l’étude. Si les animaux présentent des signes de souffrances (tels que perte de poids, défaut de toilettage, agressivité, …§points limites) les animaux seraient placés en cage individuelle dans un milieu enrichi et suivis attentivement. Si leur état ne s’améliorait pas, les animaux seraient euthanasiés.

Devenir

Les animaux utlisés dans les procédures 1 à 7 et 10 sont gardés en vie pour réaliser les procédures suivantes. Les animaux utilisés dans les procédures 8 et 9 sont maintenus en vie jsuquà la fin de l'expériences consistant à analyser l'efficacité des traitements sur la croissances tumorales. Les souris seront quotidiennement observées afin d’évaluer le bien-être ou la douleur. Les points limites sont définis ci-dessous : #1 : Perte de poids de 20% par rapport au poids initial #2 : Nécrose ou ulcération des tumeurs cutanées macroscopiquement visible Tumeur cutanée atteignant 2 cm³ #3 : Posture de prostration ou léthargie au-delà de 24 heures après la chirurgie En cas de dépassement des points limites, les animaux seront suivis attentivement pendant quelques jours et, si leur état ne s’améliorent pas, les animaux seront euthanasiés selon la méthode prévue décrite au paragraphe 3.3.3.

Remplacement

Nous avons validé in vitro l’efficacité de stratégies de ciblage des cellules cancéreuses, du microenvironnement ou de la matrice extracellulaire à l’aide de nanoparticules vectorisées. Nous devons maintenant valider l’efficacité de ce ciblage in vivo, afin d’optimiser ces stratégies qui feront l’objet de tests précliniques, notamment pour le dépistage et la thérapie des tumeurs. Nous avons validé que ces nanoparticules constituent in vitro un agent anti-cancéreux efficace : ciblage efficace des cellules d’intérêt, induction de mortalité et arrêt de prolifération des cellules après application d’un champ magnétique... Nous devons maintenant valider que cette efficacité thérapeutique est réelle in vivo, sur des modèles murins de cancer. Cette validation permettra d’optimiser ces stratégies (améliorer la conception de nanoparticules magnétiques, les paramètres de champs magnétiques…) qui pourront faire l’objet de tests précliniques.

Réduction

Les études in vitro ont été menées précédemment de façon approfondie afin d’anticiper au maximum les futurs résultats in vivo, de privilégier les orientations scientifiques prometteuses, et limiter le nombre d’animaux qui seront utilisées pour valider les stratégies thérapeutiques proposées dans le projet. Nous devons maintenant valider que cette efficacité thérapeutique est réelle in vivo, sur des modèles murins de cancer. Cette validation permettra d’optimiser ces stratégies (améliorer la conception de nanoparticules magnétiques, les paramètres de champs magnétiques…). Le retour aux validations in vitro, à chaque étapes-clefs (validation d’une nouvelle association de traitements nanothérapie + nouvel agent chimiothérapeutique, par exemple), seront toujours privilégiées afin de limiter les études in vivo.

Raffinement

Des tests sur un faible nombre d’animaux seront toujours envisagés, autant de fois que nécessaire, afin de définir et d’optimiser les conditions (concentrations en agents thérapeutiques, en nanoparticules, temps et séquences d’exposition aux champs magnétiques…) afin de garantir l’obtention de résultats concluants dans les études pré-cliniques menées.

Choix des espèces

Des données dans la littérature montrent une bonne tolérance des souris au protocole envisagé et la biocompatibilité des nanoparticules utilisées a été validée dans cette espèce. D’autre part, nous avons antérieurement validé que les modèles cellulaires utilisés (lignées tumorales pancréatiques humaines et murines – i.e. MiaPaca2, BxPc3, Panc1, R211…- et lignées de CAFS ou Cancer-associated fibroblasts humains et murins) permettent de réaliser des xénogreffes chez la souris nude ou C57/BL6 dans de bonnes conditions, sans souffrance de l’animal. Jeunes adultes pour les souris xénogréffées : Ce choix se justifie par la réalisation plus facile de la chirurgie chez de jeunes adultes. Jeunes adultes ou adultes pour les souris transgéniques par la nécessité d’attendre le développement d’une tumeur.