Oncologie

4 144 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une induction du cholangiocarcinome, un cancer des voies biliaires, puis jusqu'à seize échographies sous anesthésie, trente-deux passages en résonance magnétique et plusieurs injections de vaccin ou de chimiothérapie. Le porteur reconnaît des risques de péritonite après injections répétées et applique des points limites déclenchant la mise à mort. Le cancer visé a une survie à cinq ans inférieure à vingt pour cent, mais l'efficacité du vaccin peptidique reste à démontrer.

Objectifs

Le but de ce projet est d’évaluer l’efficacité de vaccins peptidiques comme nouvelle stratégie à la fois prophylactique et thérapeutique du cholangiocarcinome, un cancer affectant les voies biliaires. L’objectif est de stimuler le système immunitaire pour non seulement prévenir l’apparition de la tumeur, mais aussi limiter sa progression et, enfin, améliorer la réponse aux traitements existants.

Bénéfices attendus

Le cholangiocarcinome est le second cancer du foie en fréquence avec une incidence de 1.5 sur 100.000 habitants en Occident. Il présente un des pronostics les plus sombres avec une survie à 5 ans inférieure à vingt pour cent, en raison notamment d’un arsenal thérapeutique actuel peu efficace. Ce projet nous permettra de valider une nouvelle stratégie pour la prévention et le traitement du cholangiocarcinome.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une injection de trois vecteurs pour l’induction tumorale (une minute par souris vigile, 1 fois). Toutes les souris seront soumises à des examens par échographie sous anesthésie générale (dix minutes par animal, une fois par semaine, 16 fois maximum) et résonance magnétique nucléaire sur animal vigile (2 minutes par animal, deux fois par semaine, 32 fois maximum). Toutes les souris seront pesées au moins une fois par semaine (animaux vigiles, moins d’une minute par animal). Toutes les souris seront soumises à des injections pour la vaccination peptidique sous anesthésie gazeuse (pour un maximum de trois au total, une minute par souris par jour). Une partie des souris sera soumise à des traitements de chimiothérapie et/ou immunothérapie (pour un maximum de 6 au total, moins d’une minute par souris).

Impact sur les animaux

L’induction tumorale peut conduire à des effets indésirables et peut induire une gêne chez l’animal. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et de la détresse respiratoire. Les traitements de chimio- et immuno-thérapie peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et les sites d’injections peuvent s’infecter. La répétition des injections peut induire une distension abdominale et des signes cliniques de péritonite (cas rare). La manipulation et la contention des animaux peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert une induction tumorale, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude consiste à évaluer l’efficacité prophylactique et/ou thérapeutique de vaccins peptidiques dans un modèle de cholangiocarcinome orthotopique. Ces vaccins ont été développés, in vitro, via l’identification de 13 antigènes par des analyses immunopeptidomiques et immunologiques complémentaires. Cette étude peut être conduite seulement in vivo car il n’y a pas d’autres modèles pour pouvoir étudier l’efficacité de la vaccination et ses mécanismes, notamment immuno-dépendants, vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 4114 souris, pouvant être réduit à 2500-3000 grâce à l’approche séquentielle, où les procédures s’enchaînent à condition que l’hypothèse de la procédure précédente soit validée. Des groupes de seize souris (huit femelles et huit mâles) seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques appropriés pour comparer l’effet étudié entre les groupes, les croissances tumorales et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront soumis à une semaine d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger et tunnels en cartons). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et distinctes du personnel en charge de la gestion des élevages. Toutes les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants, etc...). Aucune médication supplémentaire ne sera administrée au cours des expériences, car les effets secondaires sur le système immunitaire pourraient interférer avec les résultats.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de six semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire efficient.

Relâchées sur leur lieu de capture à l'issue, 60 vipères sauvages mâles de trois espèces européennes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Capturées puis maintenues douze jours en laboratoire, elles subissent deux prises de sang, une biopsie musculaire sous anesthésie et une exposition de 24 heures à une chaleur simulant une canicule. Le porteur affirme que les conditions thermiques imposées restent proches de celles rencontrées dans leur milieu et sous les seuils critiques. L'objectif déclaré est de prédire la vulnérabilité des espèces au réchauffement, avec des applications de conservation.

Objectifs

Comprendre les mécanismes de réponse des organismes aux variations environnementales est un enjeu majeur en écologie et notamment en conservation. Les ectothermes (animaux à température variable dont les reptiles) sont soumis à des contraintes thermiques récurrents pendant la saison d’activité (canicules). Dans ce contexte, il est important de connaître les gammes de tolérance physiologique qui varient considérablement d’une espèce à l’autre selon leur répartition. Ainsi, on peut prédire que les espèces à affinités froides sont particulièrement vulnérables à l'augmentation des températures par rapport aux espèces de zone climatiques chaudes. L’objectif de ce projet est précisément de mieux comprendre ces adaptations climatiques et les capacités de réponse chez trois espèces proches de vipères avec des répartitions contrastées : une espèce boréale, une espèce de zone tempérée, et une espèce méditerranéenne. Nous étudierons l’impact de conditions thermiques imposées pendant 24heures avec deux conditions: un groupe contrôle et un groupe simulant une vague de chaleur. Les traitements choisis correspondent aux conditions auxquelles sont exposés les individus dans leur milieu et en dessous des seuils critiques. Nous étudierons ainsi les conséquences sur des paramètres physiologiques et comportementaux selon les espèces. Afin de quantifier au mieux les adaptations locales, nous étudierons un maximum de 10 mâles adultes par groupe et par espèce soit un total de 20 individus par espèces et 60 en tout. La captivité temporaire est très bien maîtrisée et tous les individus seront replacés sur le terrain à l'issue de l'étude. Ces travaux ont des implications importantes en termes de connaissance biologique et de conservation d’espèces avec des possibilité limitée de déplacement et donc très dépendantes des conditions locales. La prise en compte de ces besoins dans la gestion des habitats/microhabitat naturels pourra par exemple atténuer les effets des épisodes climatiques extrêmes (refuges microclimatiques) et donc favoriser la persistance des populations.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de faire progresser notre compréhension des effets environnementaux sur la condition physiologique et les réponses aux stress thermique dans les populations naturelles de vipères. Nos précédents travaux suggèrent une forte sensibilité aux conditions thermique. Ce projet permettra de franchir une étape complémentaire dans la compréhension écologique et physiologique de ce processus, en explorant les capacités de réponses d’espèces proches mais à répartition très contrastées. En caractérisant finement les différences de conditions environnementales entre populations nous pourrons mieux comprendre quels facteurs du milieu provoquent ou renforcent ce stress et comment les conditions diurnes et nocturnes interagissent pour moduler ces effets. Ces travaux ont des implications importantes en termes de connaissance biologique et de conservation d’espèces avec des possibilité limitée de déplacement et donc très dépendantes des conditions locales. La prise en compte de ces besoins dans la gestion des habitats/microhabitat naturels pourra par exemple atténuer les effets des épisodes climatiques extrêmes (refuges microclimatiques) et donc favoriser la persistance des populations.

Procédures

Une fois capturés, les individus feront l'objet de mesures morphométriques. Ils seront transportés au laboratoire et maintenus en hébergement individuel pendant 12 jours. Ils seront alors exposés à un traitement thermique de 24h (deux conditions : moyenne 32 vs 24°C). Deux prises de sang (300 µL) seront réalisées, avant et après le traitement thermique. Une petite biopsie musculaire (10mg) unique sera réalisée sous anesthésie dans le tiers postérieur du corps. Après le traitement les individus seront de nouveaux maintenus en hébergement standard pendant 7 jours puis relâchés sur le lieu de capture.

Impact sur les animaux

Une première nuisance sera associée à un stress transitoire à la capture sur le terrain et ensuite lors du transport. Une seconde nuisance potentielle sera associée aux prélèvements de sang réalisée captivité (deux prises sang) entrainant une douleur légère de courte durée. La biopsie musculaire (réalisée sous anesthésie et analgésie) induira une petite lésion et une douleur transitoire . Enfin un stress thermique sera associé aux conditions expérimentales imposées (24 heures). Les conditions thermiques reflètent les conditions auxquelles sont exposés les animaux en situation naturelle et donc des contraintes écologiquement cohérentes.

Devenir

L'ensemble des animaux sera relâché à l'endroit de leur capture (point GPS) une fois la procédure réalisée. Le fait de relâcher les animaux est inclus dans la demandes d'autorisation de capture de ces espèces

Remplacement

Cette étude vise à comprendre les réponses de populations en conditions naturelles et la sensibilité au réchauffement climatique. Le projet concerne spécifiquement des espèces de la faune sauvage pour comprendre sa réponse et les variations entre population. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux sauvages afin de pouvoir comparer les effets conditions de l’environnement local entre populations. Il n’est pas possible de remplacer in vivo ou in silico le modèle biologique utilisé

Réduction

Pour correctement caractériser l’effet des conditions thermiques et des populations nous avons estimé empiriquement et en tenant compte de nos travaux précédents qu’un effectif de 10 individus par espèce (n=3) et par traitement (n=2) permettra d’obtenir un échantillonnage suffisant à nos analyses. Nous capturerons un nombre limité mais homogène de mâles pour chaque espèce (10 vipères x 2 traitements x 3 espèces = 60 individus).

Raffinement

Plusieurs raffinements seront mis en place dans le cadre de cette étude. Les mesures sur le terrain seront effectuées en un temps réduits pour limiter les contraintes. Le protocole de terrain est défini et raffiné par l’équipe depuis plusieurs dizaines d’années. Toutes les manipulations se font à l’aide d’un tube de contention qui permet de réduire l’inconfort et d’éviter tout blocage au niveau de la tête. Un système dédié a été élaboré pour une entrée volontaire dans le tube de contention. En captivité au laboratoire, les animaux seront maintenus dans des conditions enrichies validées durant nos précédentes études et respectant la réglementation européenne ainsi que leurs exigences biologiques (gradient de température permettant une thermorégulation active, température des pièces contrôlées, litière et abris, mise à disposition d'eau et de nourriture en illimité. Ces conditions d’hébergements seront raffinées pour mieux correspondre aux besoins spécifiques des espèces notamment la mise à disposition de nombreux abris et l’aspersion d’eau pour maintenir l’humidité. Le volume sanguin prélevé cumulé est inférieur au seuil de 1% du volume sanguin. Les prélèvements seront suivis d’une administration de fluide de remplacement (eau par voie orale). Avant la biopsie musculaire la mise en place d’une sédation (midazolam,1mg/Kg) et d’une analgésie locale permettront réduire l’inconfort. Nous exposerons les animaux à des conditions écologiques pouvant être rencontrées dans leur milieu naturel. Les traitements expérimentaux correspondent donc à une contrainte thermique modérée, et éloignée de limites thermiques aigues. Les conditions thermiques des conditions d’hébergement standard et lors des traitements thermiques seront suivies en temps réel ainsi un système de mesure et transmission des alertes (site web, téléphone portable).

Choix des espèces

Notre étude vise à comprendre comment les conditions climatiques et imposées altèrent la réponse physiologique de trois espèces proches de serpents avec des répartition contrastées en Europe. Il est donc indispensable d’avoir recours à des animaux issus de la faune sauvage pour atteindre nos objectifs. Notre étude se concentre uniquement sur les mâles adultes réduisant les potentiels effets sur les femelles et leurs progénitures. L’ensemble des animaux étant relâchés à la fin de l’expérimentation

260 poulets de chair d'une lignée à croissance lente vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Une partie subit à 24 jours la pose chirurgicale de deux capteurs de température, l'un dans l'abdomen, l'autre sous la peau, avant une exposition en fin d'élevage à cinq jours de vagues de chaleur artificielles oscillant entre 32°C le jour et 25°C la nuit. Le porteur décrit les risques de la chirurgie, le stress des prises de sang et de l'exposition à la chaleur, jusqu'aux comportements de picage aggravés par la chaleur. Les carcasses seront valorisées commercialement, sauf celles des dix animaux ayant porté les capteurs.

Objectifs

Le projet vise à évaluer, l’impact de la « programmation thermique embryonnaire » appliquée sur des œufs embryonnés de futures reproductrices, sur leur descendance, des poulets de chair produits terminaux, exposés à des vagues de chaleur. Cette étude sera conduite sur une race à croissance lente adaptée aux conditions d'élevage en plein air, qui devrait être plus sensible aux vagues de chaleur potentielles. La capacité de la progéniture de ces femelles reproductrices soumises ou non à un traitement thermique à résister aux défis de la chaleur sera évaluée à l'aide d'indicateurs physiologiques et comportementaux qui ont été validés comme mesures de la robustesse ou de la résilience dans des environnements fluctuants et sous-optimaux. LE PROJET SE DEROULERA DANS L'EU 1, SAUF LA POSE DES CAPTEURS DE TEMPERATURE PAR VOIE CHIRURGICALE QUI SE DEROULERA DANS L'EU 2.

Bénéfices attendus

L’objectif général du projet est de proposer des stratégies de programmation thermique afin de renforcer la robustesse des animaux et leur capacité d’adaptation à des vagues de chaleur. L’intérêt scientifique de ce projet réside en premier lieu dans l’approche expérimentale réalisée sur les œufs de futures reproductrices qui est relativement peu étudiée. La connaissance de l’impact d’une programmation thermique d’œufs de futures reproductrices et la transmission potentielle à sa descendance d’une meilleure capacité à s’adapter à des vagues de chaleur n’a jamais été étudié, à notre connaissance, sous l’angle complémentaire des performances zootechniques et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être de la progéniture.

Procédures

Une prise de sang sera réalisée à l’éclosion sur 30 femelles futures reproductrices et 32 descendants. Ces animaux sont ensuite mis à mort pour des prélèvements de tissus. Une prise de sang sera également réalisées sur les femelles avant leur entrée en ponte (1 seule prise de sang) et sur les descendants avant, pendant et après le coup de chaleur (3 prises de sang sur les mêmes individus pour suivre leur réponse aux vagues de chaleur et leur capacité d’adaptation / récupération). La pose de capteurs internes de suivi de température sera réalisée par voie chirurgicale sur des poulets à l’âge de 24 jours (2 capteurs/poulet, l’un en intrapéritonéale et l’autre en sous cutané). Les animaux seront sous anesthésie générale dont de délai prévisionnel est de 30 min, le délai de chirurgie est estimé entre 15 et 20 min par poulet. L’application de vagues de chaleur sur tous les descendants débutera 10 jours avant la mise à mort pour une durée de 5 jours. Les fluctuations oscilleront entre 32°C pendant 6h en journée et 25°C durant 6h la nuit. Ces deux plages de température sont séparées de 6h durant lesquelles la température augmente ou diminue graduellement. DANS L'EU1 SERONT EFFECTUEES TOUTES LES EXPERIMENTATIONS SAUF L'ANESTHESIE GENERALE ET LA POSE DES CAPTEURS DE TEMPERATURE QUI SERONT REALISES DANS L'EU2. LES ANIMAUX SERONT TRANSPORTES DEUX FOIS ENTRE LES DEUX EU (5 MIN PAR TRAJET).

Impact sur les animaux

La chirurgie peut provoquer de la douleur et de l’inconfort en cas d’insuffisance d’action de l’anesthésie. Cette dernière peut provoquer une dépression respiratoire, même si le risque est limité avec une anesthésie gazeuse. Dans nos conditions, l’apparition de complications post-opératoires est peu probable mais reste possible (risques d’infection, de rejet du capteur, ou de réponse inflammatoire excessive). La contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. L’exposition aux vagues de chaleur peut engendrer des conséquences physiologiques potentielles (augmentation de la température corporelle, déséquilibre hydro-électrolytique, réduction de l’appétit, etc.) ainsi que des conséquences comportementales (agitation, apathie, ou comportements visant à éviter la chaleur comme regroupement en zones fraîches ou tentatives d’échappement). L’élevage des animaux au sol en groupe peut entraîner des comportements agressifs, voire de picage, qui peuvent être exacerbés lors d’épisodes de chaleur. LE TRANSPORT ENTRE LES DEUX EU PEUT ENGENDRER UN LEGER STRESS.

Devenir

Suite aux prélèvements de sang à l’éclosion, les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus d’intérêt métabolique. A la fin de la procédure de chirurgie, les animaux seront replacés dans leur parquet d'origine avec leurs congénères jusqu'à la fin de l'élevage du lot. Tous les autres animaux inclus dans le protocole seront mis à mort en fin d’élevage de la bande. Les carcasses de ces animaux pourront être valorisées commercialement à l’exception de celles des 10 animaux qui auront porté les capteurs de température.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ou in vitro n'est capable de reproduire l'effet de la programmation thermique chez l'espère cible, le poulet de chair, et son impact durant toute la durée de vie de l'animal (physiologie, comportement, performances, etc..).

Réduction

Au niveau du volet des reproductrices, 15 femelles par traitement (N=30) seront prélevés (sang + tissus) à l’éclosion pour évaluer l’impact de la programmation thermique sur la physiologie de l’animal à l’état initial. De nouveaux prélèvements de sang seront réalisés avant l’entrée en ponte des femelles (N=15 par groupe) pour évaluer le statut physiologique et métabolique des femelles. Le nombre d’animaux expérimentaux choisi est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives en tenant compte de nos expériences précédentes en intégrant la variabilité interindividuelle attendue en termes de poids, composition corporelle, statut métabolique et robustesse. Nous avons volontairement choisi une puissance statistique, car en absence de challenge type conditions d'élevage dégradées ou coup de chaleur plus tard dans la vie, nous nous attendons à avoir des effets de faible amplitude mais variés. Sur la base des travaux antérieurs réalisés, les marqueurs sanguins de stress oxydatifs sont les plus variables. L’unité statistique pour les dosages de biomarqueurs sera l’animal.

Raffinement

Dès l’éclosion, les descendants seront élevés au sol sur copeaux, avec accès à l’eau et à l’aliment ad libitum, dans un bâtiment à environnement contrôlé (température, ventilation, lumière). Ce mode d’élevage favorise les interactions sociales. Les animaux seront visités au moins deux fois par jour (week-ends et jours fériés inclus). En cas de signes de détresse ou de maladie (cf grille d’atteinte des points limites), un isolement en infirmerie ou une euthanasie pourra être envisagé. L’environnement sera enrichi avec des rubans colorés à picorer et un perchoir. Lors du coup de chaleur, les pipettes seront vidangées trois fois par jour pour garantir une eau fraîche. En période de forte chaleur, une attention particulière sera portée à la baisse effective des températures pour assurer des phases de récupération. Raffinement des prises de sang : elles seront réalisées par deux opérateurs expérimentés, avec une contention calme et précise. Une garde sur l’aiguille limitera les risques de pénétration excessive et de lésions cérébrales. Raffinement de la chirurgie : une prémédication sera administrée 15 min avant l’anesthésie gazeuse (bréchet). Chaque animal sera endormi individuellement. Une antibioprophylaxie débutera la veille de l’intervention et se poursuivra pendant 3 jours post-opératoires. En cas de signes de douleur (prostration, anorexie…), une dose d'antalgique pourra être donnée. Les animaux seront isolés durant 5 jours post-opératoires en infirmerie, avec suivi individuel selon une grille dédiée à l’évaluation post-chirurgicale. Cette procédure a été testée avec succès dans un essai précédent chez des poulets à croissance lente : aucune mortalité, réintégration au parquet d’origine après traitement, et croissance équivalente aux témoins. LE TRANSPORT DES ANIMAUX DE L'EU 1 VERS L'EU 2 AVANT L'OPERATION ET LEUR RETOUR DE L'EU 2 VERS L'EU 1 SERA REALISE PAR UN TECHNICIEN FORME DANS UN VEHICULE AGREE POUR LE TRANSPORT D'ANIMAUX VIVANTS. LE TRAJET EST TRES COURT (MOINS DE 5 MIN).

Choix des espèces

Le poulet de chair a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Les œufs embryonnés seront mis en incubation au couvoir de l’établissement expérimentateur. Après éclosion, les animaux seront mis en place dans le bâtiment d’élevage et élevés jusqu’à 30 semaines pour la partie « reproducteurs », et jusqu’à environ 75 jours pour la descendance. L’évaluation de l’intérêt d’une programmation thermique embryonnaire lors de l’incubation se fera tout au long de la durée d’élevage des animaux sur les 2 générations (reproductrices et descendants). La mise en place de capteurs de température interne sera faite sur les descendants. L’opération se fera sur des animaux de 24 jours afin qu’il puisse supporter l’acte de chirurgie et permettre de suivre les paramètres du capteur tout au long de la vie de l’animal. Par ailleurs, l’épisode artificiel de forte chaleur sera appliqué en fin d’élevage, 10 jours avant mise à mort, âge où les animaux sont les plus sensibles aux variations/pics température. Il convient donc de suivre les critères zootechniques, comportementaux et sanitaires pendant toute la durée de l’élevage. Les poulets seront élevés de leur jour d’éclosion jusqu’à l’âge classique de mise à mort pour un élevage d’animaux labels (75 jours max).

Greffées d'une tumeur sous la peau puis traitées par cinq injections, 1 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur, mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, peut occasionner gêne et douleur. L'objectif est de tester des anti-inflammatoires censés relancer les défenses immunitaires contre le cancer. Le porteur situe les retombées à l'identification possible de nouvelles cibles, sans engagement de résultat.

Objectifs

Chez l’homme, les réponses immunitaires anti-tumorales sont souvent inefficaces. Cela est notamment dû au développement d’un épuisement des réponses immunitaires. Il a été montré que certaines protéines sécrétées en contexte inflammatoire contribuaient au développement d’un épuisement des globules blancs lors du cancer. Au regard de ces résultats, nous souhaiterions déterminer l’impact d’un traitement bloquant l’action de ces protéines sur l’épuisement des réponses immunitaires et la croissance tumorale

Bénéfices attendus

A terme, ce projet pourrait aboutir à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d'améliorer les réponses anti-tumorales et le traitement de certains cancers.

Procédures

Une injection de cellules tumorales sous la peau sous anesthésie générale (1 minute/souris). Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation. 5 injections de traitements (30 sec/souris).

Impact sur les animaux

Les injections de traitement et l'injection de cellules tumorales peuvent entraîner un stress et une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peuvent également induire un stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort.

Remplacement

La complexité de l’étude du cancer nécessite d’avoir recours à un organisme vivant pour étudier l’ensemble des acteurs impliqués dans ce phénomène. Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes plus simples ne nécessitant pas d’animaux, et en se basant sur des données publiées de la littérature.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés afin d’avoir un nombre minimal d’animaux pour pouvoir obtenir des résultats exploitables. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi très régulièrement par le responsable du projet.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies biologiques sont conservées entre la souris et l'Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus pour envisager ensuite d’éventuels traitements chez l’Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la biologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Souris adultes de 10 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.

Un choc électrique, une restriction alimentaire et des injections de toxines directement dans le cerveau : 2 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les toxines détruisent des voies nerveuses pour reproduire la maladie de Parkinson, avant l'implantation d'une canule cérébrale et une série de tests comportementaux. Le projet cherche des marqueurs d'imagerie des troubles moteurs et cognitifs, sur deux établissements. Le porteur reconnaît que ces modèles ne reproduisent que partiellement la maladie humaine, ce qui le conduit à en combiner plusieurs.

Objectifs

Le projet se déroulera désormais dans 2 EU. La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par les classiques signes moteurs permettant le diagnostic mais également par des troubles cognitifs et psycho-comportementaux, plus variables dans leur apparition et leur expression, mais ayant un impact considérable sur l’autonomie et la qualité de vie des patients ainsi que sur les décisions thérapeutiques. Pourtant, leur prise en charge reste limitée et requiert une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, notamment via l’identification de biomarqueurs. Les biomarqueurs sont des indicateurs des processus pathogènes et des outils précieux tant pour faciliter le diagnostic précoce, que pour suivre l’évolution de la pathologie ou l’efficacité d’un traitement. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ses explorations anatomiques et fonctionnelles, combinée à des méthodes spécifiques d’analyse a récemment permis de mettre en évidence des marqueurs de certains des troubles observés en clinique. Cependant son utilisation reste encore marginale notamment pour le diagnostic, et le lien entre ces marqueurs d’imagerie et l’histologie reste à établir. Cette corrélation est indispensable tant à la compréhension des mécanismes sous-jacents qu’à la validation de ces marqueurs en tant que Biomarqueurs de la pathologie. L’utilisation de modèles animaux est le moyen le plus adapté pour mener ce type d’études. Cependant, ils ne miment que partiellement la pathologie humaine et chaque modèle présentent des avantages et des limites. Il convient donc de valider les résultats obtenus sur plusieurs modèles complémentaires pouvant représenter les différents aspects physiopathologiques de la maladie. Le présent projet vise d’abord à étudier plusieurs de ces modèles afin de reproduire les différents troubles moteurs et non moteurs associés à la pathologie. Les objectifs seront ensuite d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en IRM/TEP et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent. Enfin, en fonction des résultats de cette première partie (et des résultats in vitro fait en parallèle), certains de ces modèles seront reproduits afin de tester l’effet de stratégies thérapeutiques . Un modèle de démence induite par une déplétion cholinergique centrale sera aussi utilisé comme contrôle positif de déclin cognitif sévère afin de contrôler l’efficacité de ces stratégies.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM ou TEP) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Ces biomarqueurs pourraient être validés et utilisés en clinique pour aider au diagnostic de certains troubles, le suivi non invasif de l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet des traitements. L'étude des mécanismes sous jacents permettra l'idenitfication de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dont l'efficacité sera testée.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales visant à injecter des toxines pour induire des lésions cérébrales (30 minutes) dans l'EU2/2 pour les AAV2/9 hm-alpha-syn en A2 et dans l'EU1/2 pour les autres toxines (6OHDA, MPTP, IgG saporine). Après transfert dans l'EU1/2, certains d'entre eux subiront à nouveau une procédure chirurgicale pour l'implantation d'une canule d'administation cérébrale (30 minutes). Certains animaux subiront des injections sous-cutanées ou intra-péritonéales (Maximum 2/jours pendant 4 semaines). Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux dont certains nécessitent une restriction alimentaire avec rationnement, ou la délivrance d'un choc electrique (0,7 mA - 2 sec, 1 seule fois). Le transport entre les 2 EU sera assuré par un transporteur agréé respectant les conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA.

Impact sur les animaux

Les toxines injectées induisent une dégénérescence des voies cérébrales dopaninergiques et/ou cholinergiques, un déficit du contrôle moteur et/ou cognitif est donc attendu et étudié dans ce projet. Une perte de poids corporel peut aussi être observée chez certains animaux plus sévérement lésés. L'anesthésie subie lors de la chirurgie ou de l'imagerie en IRM pourrait être mal tolérée par certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. La restriction alimentaire associée au touchscreen pourrait être mal tolérée par certains animaux. La pose de canule intracérébrale et les injections de traitments pourraient être mal tolérées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des évaluations en imagerie in vivo ou après l'evaluation des effets thérapeutiques sur ces variables

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux pour étudier la physiopathologie de troubles cognitifs et comportementaux. Cependant pour limiter l’utilisation d’animaux, l'étude de la potentielle toxicité, des mécanismes d'action et l’efficacité des molécules thérapeutiques testées seront étudiés en parallèle sur un modèle cellulaire (Remplacement).

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au minimum sur la base d'un test de puissance. L'analyse statistiques des données débutera par une étude de la normalité et de l'homogénéité des variances. Selon la distribution des valeurs, des tests paramétriques (ANOVA puis Test de Fisher pour la compariason 2 à 2) ou non paramètriques (Kruskal-Wallis et Wil-Coxon test pour la comparaison 2 à 2) seront utilisés. Les mêmes animaux seront réutilisés pour l'analyse comportementale et l'imagerie cérébrale à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux seront réutilisés pour différentes évaluations (Comportement et Imagerie) à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem.

Raffinement

Les rats seront hébergés dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la règlementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. L'unique transport entre les 2 EU après la procédure de chirurgie en A2 sera effectuée par un transporteur agréé pendant 15 minutes maximum, dans des conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA (cage de transport spécifique, climatisation du camion, respect cycle lumière, vibrations amorties). De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Un point limite a été déterminé selon les critères suivants : Le comportement général : -Difficulté de mobilité, isolement, perte partielle de réactions aux stimuli -Prostration, automutilation, tremblements - Vocalisations, agressivité Le poids : perte de poids importante (20%) L’apparence physique : pelage très terne ou souillé, plaie cutanée, hémorragie oculaire, génitale et/ou anale. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique (Buprénorphine, 0.05 mg/kg), ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée (Doléthal®, 182.2mg/kg) . La structure BEA ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin.

Choix des espèces

Parmi les petits rongeurs, le rat est l’espèce la mieux adaptée pour l’évaluation des troubles cognitifs et psycho-comportementaux. Par ailleurs, les modèles expérimentaux choisis ont été décrits chez le rat. Les rats utilisés auront 8-10 semaines. Cet âge a été choisi en raison de la référence utilisé pour l’ATLAS cérébral de rat et la précision de localisation des repères stéréotaxiques pour les injections cérébrales.

Scarifiées à la queue pour des prélèvements répétés de gouttes de sang, 1 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations reproduisant un diabète ou des tumeurs du pancréas et reçoivent des injections activant la mutation, des gavages, un régime gras et des tests de glycémie répétés. Certains fœtus sont traités à travers la mère gestante. Le porteur qualifie ces souris de "modèles uniques au monde" et affirme que la mesure de la glycémie ne peut se faire qu'in vivo.

Objectifs

Récemment, une nouvelle mutation d’une protéine pancréatique a été décrite dans plusieurs familles de patients. Cette mutation cause un diabète chez les hommes, et des tumeurs du pancréas chez les femmes. Pour le moment, son mode d’action n’est pas connu. Les hommes touchés développent un diabète particulier différent du diabète de type 1 auto-immun et du diabète de type 2 lié à l’obésité. Les femmes présentent quant à elles des tumeurs particulières du pancréas issues des cellules productrices d’insuline, entrainant une sécrétion excessive et incontrôlée d’insuline qui provoque des hypoglycémies répétées (baisse anormale du sucre dans le sang). L’objectif de ce projet est donc de rechercher les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de ces troubles du pancréas. A plus long terme, ces recherches devraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et ainsi de proposer de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Cette étude présente un grand intérêt pour le traitement à la fois du diabète et du cancer du pancréas puisque les mutations de notre protéine d’intérêt ont été décrites dans ces deux pathologies. Sur le plan clinique, nous prévoyons des retombées potentielles à moyen et à plus long terme. En effet, le diabète est une maladie métabolique complexe qui implique souvent plusieurs gènes. Cette hétérogénéité rend difficile son étude. Il existe aussi certaines autres formes de diabète qui n’impliquent qu’un seul gène. Elles sont présentes soit chez des nouveau-nés, soit chez de jeunes adultes. Dans ce contexte, il est plus facile de comprendre les mécanismes à l’origine de la maladie et ainsi de progresser vers des voies thérapeutiques. C’est le cas du facteur que nous étudions au laboratoire, qui est produit dans le pancréas. Une seule mutation du gène codant pour ce facteur suffit à déclencher un diabète. Nous pensons donc que notre étude chez la souris pourra permettre non seulement de décrire une nouvelle forme de diabète monogénique, mais aussi d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d’élaborer de nouveaux traitements. Le facteur que nous étudions est également associé à l’apparition de tumeurs pancréatiques chez des patients. Son rôle biologique reste toutefois encore mal compris à ce jour. Notre projet permettra d’élucider son implication dans le cancer pancréatique qui représente une cause de mortalité importante.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des souris qui portent des mutations représentatives de celles portées par des patients qui présentent soit un diabète, soit des tumeurs du pancréas. Ces souris seront examinées à différents stades de la vie, allant de la vie fœtale à des stades âgés. Certains des animaux utilisés nécessitent l’injection d’un composé pour activer la mutation étudiée. Les animaux adultes vigiles (éveillés) porteurs de cette mutation inductible, recevront une ou cinq administrations de la substance par injection soit une (ou trois) administrations par voie orale, soit une administration par application d’une solution sur la peau (1 ou 3 fois) (durée de chaque geste inf à 30sec). Des fœtus seront également traités en administrant le composé chez la mère gestante : soit par gavage (1 à 2 doses), soit par injection (1 ou 2 fois) soit dans l’alimentation pendant une semaine (durée de chaque geste inf à 30 sec). Ces mêmes animaux seront ensuite étudiés grâce à des expériences de mesure de la régulation de la glycémie. Pour cela, ils auront un prélèvement, puis ils seront placés à jeun pendant 16 heures, et auront un second prélèvement (durée de chaque prélèvement inf à 10sec). Ils recevront une injection (10 sec) suivie de 5 prélèvements d’une goutte de sang durant les 2h suivantes. Trois jours plus tard, ces gestes seront répétés sur ces mêmes souris. Dans le cadre d’une étude longtudinale, ce lot de souris pourra être soumis à ce type d’injection puis prélèvement au maximum 3 fois lors de ces 2 tests (durée de chaque prélèvement inf à 10sec). Enfin, certaines souris seront exposées à un régime riche en graisse pendant des durées allant de 14 jours à 3 mois. Ces mêmes animaux seront ensuite étudiés grâce à des expériences de mesure de la glycémie, impliquants une injection et 7 prélèvements d’une goutte de sang, Trois jours plus tard, ces gestes seront répétés sur ces mêmes souris (durée de chaque prélèvement inf à 10sec).

Impact sur les animaux

Les modèles générés pour l’étude n’ont pas de phénotype dommageable. Les nuisances attendues sont celles liées aux différentes injections. Ces nuisances correspondent à l’introduction d’une aiguille et donc à des douleurs associées à une injection classique. Celles-ci sont de courte durée, et ces différentes injections ne provoquent aucun autre effet secondaire à l’exception de la nuisance de l’injection. Les souris exposées à régime particulier (riche en graisse) peuvent présenter une prise de poids sans conséquence sur le bien-être des animaux. Après injection, nous nous attendons à observer une légère hyperglycémie (élévation de la glycémie) à la fois chez les mâles et les femelles lorsque des tests métaboliques seront effectués. Sur la base de nos premiers résultats, l’hyperglycémie devrait être moindre chez les femelles. Néanmoins, cette hyperglycémie modérée ne sera probablement que passagère, et une glycémie normale sera rétablie après quelques heures. Pour les mesures de glycémie, le premier prélèvement étant réalisé après une légère scarification de la queue et les suivants après le retrait de la croûte, ce geste entraînera une douleur légère et de courte durée. Cela prend 10 à 20 secondes maximum répétées 5 fois sur 120 minutes, les temps de l’expérience.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Les souris que nous utilisons sont des modèles uniques au monde. Les paramètres physiologiques, c’est à dire les mesures de glycémie et d’insulinémie ne peuvent être effectuées que in vivo. De plus, il existe un dialogue entre les différents organes de la souris. Cette interaction entre les différents organes impliqués dans le métabolisme glucidique de la souris -le foie, le muscle et le tissu adipeux- ne peut être analysée que dans un organisme entier vivant. Néanmoins, pour limiter les investigations in vivo, un maximum d’informations proviendra d’analyses sur des tissus fixés et d’analyses bio-informatiques in silico à partir de prélèvement post-mortem. Nous effectuerons également des expériences in vitro quand cela est possible pour limiter les expériences in vivo. Par exemple, la culture d’îlots de Langerhans prélevés sur des souris post-mortem, un animal pouvant générer environ 100 îlots qui sont ensuite stimulés in vitro..

Réduction

Nos modèles représentent des modèles uniques au monde pour étudier les pathologies trouvées chez l’homme. En effet, ce sont le seul moyen d’étudier les effets d’une mutation, qui chez l’homme, déclenche un diabète ou un insulinome. Les stratégies d’accouplement ont été optimisées afin de réduire le nombre d’animaux.. D’après la littérature, nous avons défini la taille de nos groupes pour permettre des résultats concluants et faire des analyses statistiques. Pour réduire le nombre de souris utilisées, une étude pilote sera réalisée pour certains modèles de souris avant de définir les conditions optimales. Une approche Go/No Go sera ensuite appliquée afin de déterminer si les inductions pour activer la mutation étudiée se feront au stade fœtal ou adulte. Cela signifie que nous ferons un choix de la méthodologie utilisée selon les résultats préliminaires obtenus. Si nous constatons que l’activation de la mutation est satisfaisante pendant le développement foetal, nous choisirons plutôt cette méthode et nous n’activerons pas la mutation au stade adulte.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine du diabète et de la cancérologie, les animaux seront suivis régulièrement afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations seront arrêtées avant la souffrance des animaux. Une grille de score sera également mise en place. Dans le cadre des procédures, toutes les manipulations seront réalisés pour garantir le meilleur confort à l’animal. En particulier, lors des expériences impliquant des injections, les animaux seront observés de façon quotidienne, de manière à surveiller l'état général de la souris. Pour rappel, nous n’attendons pas de nuisance particulière, hormis une légère hyperglycémie chez les mâles après injection. De plus, les animaux aux stades fœtal et nouveau-né seront utilisés uniquement pour des prélèvements d’organes après injection. Aux stades plus tardifs, les tests réalisés ne nécessitent pas d’utiliser des analgésiques pour ces tests.

Choix des espèces

Nos modèles murins sont uniques et la souris est le seul organisme existant qui puisse permettre d’étudier l’effet de mutations de notre protéine d’intérêt. Etant donné son cycle de reproduction et sa parenté biologique avec l’homme, la souris constitue un modèle de choix pour mener nos expériences. De plus, il est accepté et validé par la communauté internationale que la souris est pleinement appropriée pour les études du métabolisme que nous proposons. Les stades de développement étudiés sont les suivants : fœtus (E18,5), 1 mois, adultes de 3 mois, 6 mois, 12 mois, 18 mois, et 24 mois. En effet, on sait que notre protéine d’intérêt peut jouer un rôle dans la différenciation des cellules pancréatiques pendant la vie fœtale, mais aussi sur leur prolifération pendant la période postnatale jusqu’à un mois.. Nous souhaitons donc déterminer si la mutation étudiée affecte ces cellules à ces stades. Plus tard, cette mutation pourrait déclencher un diabète ou une tumeur pancréatique, selon le stade de la vie de la souris. En effet, on sait que ce type de phénotype est très dépendant du métabolisme et de l’âge de la souris). C’est pour cette raison qu’il est impératif d’étudier le phénotype des souris à ces différents stades de la vie adulte.

Saignés et mis à mort dès l'éclosion pour une partie, opérés à 24 jours pour l'implantation de deux capteurs de température pour d'autres, 260 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La pose des capteurs se fait sous anesthésie, l'un dans l'abdomen, l'autre sous la peau. Tous sont ensuite exposés à des vagues de chaleur artificielles, jusqu'à 32°C six heures par jour pendant cinq jours, pour mesurer une résistance à la chaleur transmise par la mère. Les carcasses seront valorisées commercialement, sauf celles des dix animaux ayant porté les capteurs.

Objectifs

Le projet vise à évaluer, l’impact de la « programmation thermique embryonnaire » appliquée sur des œufs embryonnés de futures reproductrices, sur leur descendance, des poulets de chair produits terminaux, exposés à des vagues de chaleur. Cette étude sera conduite sur une race à croissance lente adaptée aux conditions d'élevage en plein air, qui devrait être plus sensible aux vagues de chaleur potentielles. La capacité de la progéniture de ces femelles reproductrices soumises ou non à un traitement thermique à résister aux défis de la chaleur sera évaluée à l'aide d'indicateurs physiologiques et comportementaux qui ont été validés comme mesures de la robustesse ou de la résilience dans des environnements fluctuants et sous-optimaux. LE PROJET SE DEROULERA DANS L'EU 1, SAUF LA POSE DES CAPTEURS DE TEMPERATURE PAR VOIE CHIRURGICALE QUI SE DEROULERA DANS L'EU 2.

Bénéfices attendus

L’objectif général du projet est de proposer des stratégies de programmation thermique afin de renforcer la robustesse des animaux et leur capacité d’adaptation à des vagues de chaleur. L’intérêt scientifique de ce projet réside en premier lieu dans l’approche expérimentale réalisée sur les œufs de futures reproductrices qui est relativement peu étudiée. La connaissance de l’impact d’une programmation thermique d’œufs de futures reproductrices et la transmission potentielle à sa descendance d’une meilleure capacité à s’adapter à des vagues de chaleur n’a jamais été étudié, à notre connaissance, sous l’angle complémentaire des performances zootechniques et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être de la progéniture.

Procédures

Une prise de sang sera réalisée à l’éclosion sur 30 femelles futures reproductrices et 32 descendants. Ces animaux sont ensuite mis à mort pour des prélèvements de tissus. Une prise de sang sera également réalisées sur les femelles avant leur entrée en ponte (1 seule prise de sang) et sur les descendants avant, pendant et après le coup de chaleur (3 prises de sang sur les mêmes individus pour suivre leur réponse aux vagues de chaleur et leur capacité d’adaptation / récupération). La pose de capteurs internes de suivi de température sera réalisée par voie chirurgicale sur des poulets à l’âge de 24 jours (2 capteurs/poulet, l’un en intrapéritonéale et l’autre en sous cutané). Les animaux seront sous anesthésie générale dont de délai prévisionnel est de 30 min, le délai de chirurgie est estimé entre 15 et 20 min par poulet. L’application de vagues de chaleur sur tous les descendants débutera 10 jours avant la mise à mort pour une durée de 5 jours. Les fluctuations oscilleront entre 32°C pendant 6h en journée et 25°C durant 6h la nuit. Ces deux plages de température sont séparées de 6h durant lesquelles la température augmente ou diminue graduellement. DANS L'EU1 SERONT EFFECTUEES TOUTES LES EXPERIMENTATIONS SAUF L'ANESTHESIE GENERALE ET LA POSE DES CAPTEURS DE TEMPERATURE QUI SERONT REALISES DANS L'EU2. LES ANIMAUX SERONT TRANSPORTES DEUX FOIS ENTRE LES DEUX EU (5 MIN PAR TRAJET).

Impact sur les animaux

La chirurgie peut provoquer de la douleur et de l’inconfort en cas d’insuffisance d’action de l’anesthésie. Cette dernière peut provoquer une dépression respiratoire, même si le risque est limité avec une anesthésie gazeuse. Dans nos conditions, l’apparition de complications post-opératoires est peu probable mais reste possible (risques d’infection, de rejet du capteur, ou de réponse inflammatoire excessive). La contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. L’exposition aux vagues de chaleur peut engendrer des conséquences physiologiques potentielles (augmentation de la température corporelle, déséquilibre hydro-électrolytique, réduction de l’appétit, etc.) ainsi que des conséquences comportementales (agitation, apathie, ou comportements visant à éviter la chaleur comme regroupement en zones fraîches ou tentatives d’échappement). L’élevage des animaux au sol en groupe peut entraîner des comportements agressifs, voire de picage, qui peuvent être exacerbés lors d’épisodes de chaleur. LE TRANSPORT ENTRE LES DEUX EU PEUT ENGENDRER UN LEGER STRESS.

Devenir

Suite aux prélèvements de sang à l’éclosion, les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus d’intérêt métabolique. A la fin de la procédure de chirurgie, les animaux seront replacés dans leur parquet d'origine avec leurs congénères jusqu'à la fin de l'élevage du lot. Tous les autres animaux inclus dans le protocole seront mis à mort en fin d’élevage de la bande. Les carcasses de ces animaux pourront être valorisées commercialement à l’exception de celles des 10 animaux qui auront porté les capteurs de température.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ou in vitro n'est capable de reproduire l'effet de la programmation thermique chez l'espère cible, le poulet de chair, et son impact durant toute la durée de vie de l'animal (physiologie, comportement, performances, etc..).

Réduction

Au niveau du volet des reproductrices, 15 femelles par traitement (N=30) seront prélevés (sang + tissus) à l’éclosion pour évaluer l’impact de la programmation thermique sur la physiologie de l’animal à l’état initial. De nouveaux prélèvements de sang seront réalisés avant l’entrée en ponte des femelles (N=15 par groupe) pour évaluer le statut physiologique et métabolique des femelles. Le nombre d’animaux expérimentaux choisi est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives en tenant compte de nos expériences précédentes en intégrant la variabilité interindividuelle attendue en termes de poids, composition corporelle, statut métabolique et robustesse. Nous avons volontairement choisi une puissance statistique, car en absence de challenge type conditions d'élevage dégradées ou coup de chaleur plus tard dans la vie, nous nous attendons à avoir des effets de faible amplitude mais variés. Sur la base des travaux antérieurs réalisés, les marqueurs sanguins de stress oxydatifs sont les plus variables. L’unité statistique pour les dosages de biomarqueurs sera l’animal.

Raffinement

Dès l’éclosion, les descendants seront élevés au sol sur copeaux, avec accès à l’eau et à l’aliment ad libitum, dans un bâtiment à environnement contrôlé (température, ventilation, lumière). Ce mode d’élevage favorise les interactions sociales. Les animaux seront visités au moins deux fois par jour (week-ends et jours fériés inclus). En cas de signes de détresse ou de maladie (cf grille d’atteinte des points limites), un isolement en infirmerie ou une euthanasie pourra être envisagé. L’environnement sera enrichi avec des rubans colorés à picorer et un perchoir. Lors du coup de chaleur, les pipettes seront vidangées trois fois par jour pour garantir une eau fraîche. En période de forte chaleur, une attention particulière sera portée à la baisse effective des températures pour assurer des phases de récupération. Raffinement des prises de sang : elles seront réalisées par deux opérateurs expérimentés, avec une contention calme et précise. Une garde sur l’aiguille limitera les risques de pénétration excessive et de lésions cérébrales. Raffinement de la chirurgie : une prémédication sera administrée 15 min avant l’anesthésie gazeuse (bréchet). Chaque animal sera endormi individuellement. Une antibioprophylaxie débutera la veille de l’intervention et se poursuivra pendant 3 jours post-opératoires. En cas de signes de douleur (prostration, anorexie…), une dose d'antalgique pourra être donnée. Les animaux seront isolés durant 5 jours post-opératoires en infirmerie, avec suivi individuel selon une grille dédiée à l’évaluation post-chirurgicale. Cette procédure a été testée avec succès dans un essai précédent chez des poulets à croissance lente : aucune mortalité, réintégration au parquet d’origine après traitement, et croissance équivalente aux témoins. LE TRANSPORT DES ANIMAUX DE L'EU 1 VERS L'EU 2 AVANT L'OPERATION ET LEUR RETOUR DE L'EU 2 VERS L'EU 1 SERA REALISE PAR UN TECHNICIEN FORME DANS UN VEHICULE AGREE POUR LE TRANSPORT D'ANIMAUX VIVANTS. LE TRAJET EST TRES COURT (MOINS DE 5 MIN).

Choix des espèces

Le poulet de chair a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Les œufs embryonnés seront mis en incubation au couvoir de l’établissement expérimentateur. Après éclosion, les animaux seront mis en place dans le bâtiment d’élevage et élevés jusqu’à 30 semaines pour la partie « reproducteurs », et jusqu’à environ 75 jours pour la descendance. L’évaluation de l’intérêt d’une programmation thermique embryonnaire lors de l’incubation se fera tout au long de la durée d’élevage des animaux sur les 2 générations (reproductrices et descendants). La mise en place de capteurs de température interne sera faite sur les descendants. L’opération se fera sur des animaux de 24 jours afin qu’il puisse supporter l’acte de chirurgie et permettre de suivre les paramètres du capteur tout au long de la vie de l’animal. Par ailleurs, l’épisode artificiel de forte chaleur sera appliqué en fin d’élevage, 10 jours avant mise à mort, âge où les animaux sont les plus sensibles aux variations/pics température. Il convient donc de suivre les critères zootechniques, comportementaux et sanitaires pendant toute la durée de l’élevage. Les poulets seront élevés de leur jour d’éclosion jusqu’à l’âge classique de mise à mort pour un élevage d’animaux labels (75 jours max).

Pour mettre en place trois modèles de métastase dans un ganglion, 1 338 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal subit une chirurgie d'injection de cellules cancéreuses dans le ganglion inguinal, puis pour certains deux injections d'immunothérapie dont les effets indésirables reproduisent l'inflammation et l'auto-immunité observées chez l'humain. Le développement tumoral peut lui-même causer des douleurs. Les souris sont tuées pour des prélèvements de tumeurs et d'organes, ces trois modèles devant servir de base à un projet ultérieur sur l'immunothérapie des ganglions métastatiques.

Objectifs

Les traitements par l’immunothérapie anti-cancéreuses ont révolutionné le traitement des cancers. Cependant aujourd’hui, l’effet de ces traitements sur les métastases au ganglion n’est pas encore bien décrit. Nous souhaitons étudier l’effet des traitements d’immunothérapie dans un ganglion métastatique, et étudier l’environnement vasculaire et immunitaire de celui-ci. Pour réaliser notre étude, nous avons besoin de 3 modèles reproductibles et robustes de ganglion métastatique. L’objectif de ce projet est de mettre en place nos modèles de ganglion métastatique, puis dans un second temps de mettre en place le schéma thérapeutique d’immunothérapie utilisé actuellement en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’obtenir 3 modèles différents de métastases au ganglion, permettant d’étudier différents types de cancer et les effets des traitements d’immunothérapie sur ceux-ci. Par la suite, nous approfondirons l’étude avec un projet nécessitant ces modèles pour étudier les interactions entre les systèmes immunitaires et vasculaires des ganglions métastatiques au cours du traitement d’immunothérapie.

Procédures

Tous les animaux de ce projet auront une chirurgie au niveau du ganglion inguinal pour l’injection de cellules cancéreuses (10 minutes) sous anesthésie générale avec un analgésique générale et une crème anesthésiante sera appliquée sur la zone d’injection. Par la suite, certains animaux recevront deux injections en vigile (environ 10 secondes par injection) de traitement d’immunothérapie.

Impact sur les animaux

L’anesthésie et l’injection de cellules tumorales peut induire une douleur modérée et du stress chez les animaux, ainsi qu’une dégradation de l’état des animaux (perte de poids, lenteur dans les mouvements). Le développement tumoral peut causer des douleurs chez l’animal. Les traitements d’immunothérapie peuvent avoir des effets indésirables identiques à ceux observés chez l’homme avec une inflammation et une autoimmunité.

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort pour des prélèvements post-mortem de tumeurs ou organes.

Remplacement

Les procédures réalisées sur l’animal ne peuvent pas être remplacées par des méthodes expérimentales alternatives. A ce jour, il n’est pas possible d’étudier le système immunitaire et son interaction avec le développement tumoral et le système vasculaire in vitro. La mise en place de métastases nécessite un organisme complexe pour étudier les interactions et paramètres mis en jeux. De plus, les cellules des vaisseaux sanguins auxquelles nous nous intéresserons dans la suite de ce projet sont très plastiques et ne conservent leur phénotype que dans un environnement particulier in vivo.

Réduction

Nous souhaitons mettre en place des modèles de tumeur métastatique dans le ganglion inguinal. Pour la robustesse de nos résultats, nous avons besoin de plusieurs modèles cellulaires. Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience est suffisant pour mettre en évidence que les modèles sont robustes et écarter de façon certaines ceux qui ne le sont pas. Ce projet est conçu avec une hiérarchie entre les deux procédures, où la réalisation d’une procédure ultérieure n’est possible que si les résultats des procédures précédentes le justifient.

Raffinement

Pour l’injection des cellules ainsi que pour l’imagerie, les souris sont maintenues sur tapis chauffant. Les conditions d’anesthésie, avec une analgésie générale et locale, sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. La colle chirurgicale permettra d’une part de diminuer les traumatismes induits à la peau causés par des points de suture et d’autre part d’augmenter la rapidité d’action et de diminuer ainsi le temps d’anesthésie. Le suivi des animaux sera réalisé tous les jours par les expérimentateurs et les soigneurs, tous ayant connaissance des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques du projet.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. Les ganglions lymphatiques étant apparus tardivement au cours de l’évolution, un modèle mammifère est nécessaire pour l’étude présentée ici, centrée sur les métastases dans ces ganglions lymphatiques. Les souris sont âgées entre 6 à 12 semaines, et présentent à ce stade un système immunitaire mature.