Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etudes histologiques chez les rongeurs
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Rats : 100
200 souris et 100 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil par exsanguination puis dissection. Ils ne servent pas à produire des connaissances mais à mettre au point des protocoles d'histologie et à former étudiants et collaborateurs à ces techniques. Le porteur justifie le recours aux animaux par la baisse du nombre de pièces anatomiques disponibles et par le souci de ne pas "gaspiller" des tissus issus de projets scientifiques. Il affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer l'utilisation des animaux" puisque l'histologie porte sur des pièces anatomiques.
Objectifs
L’objectif du projet est de développer et valider des protocoles d’histologie (2D et 3D), pour la plateforme. En effet, l’histologie reste la méthode de référence pour visualiser post mortem les biomarqueurs ou les différents types cellulaires présents dans un tissu biologique. La réduction du nombre d’animaux dans les études fait qu’il n’y plus de reliquat de pièces anatomiques non utilisées dans les projets. Il n’est pas pertinent de compter uniquement sur les animaux dédiés à une étude pour à la fois mettre en place un protocole d’histologie et réaliser une étude complète, les zones d’intérêt étant parfois très petites (structures cérébrales) ou le protocole d’histologie difficile à mettre au point (multi-marquage et histologie 3D). Ce projet vise donc à utiliser des animaux afin à mettre au point de nouveaux protocoles d’histologie avant de les utiliser pour les projets scientifiques, tels que les études de vieillissement ou les études sur le cancer. Les développements méthodologiques que sont les multiples marquages, l’histologie 3D, ou révélation de la vascularisation d’un organe entier nécessitent de nombreuses mises au point. Les multiples marquages permettent de visualiser sur une même coupe de tissus plusieurs marqueurs, permettant la visualisation de colocalisations de marqueurs ou le dénombrement de différentes cellules dans une même région. Les nouvelles techniques d’histologie en 3D nécessitent également beaucoup de mises au point, pour obtenir un immunomarquage visible en profondeur, en rendant transparent la pièce anatomique. La visualisation de la vascularisation d’un organe entier, en rendant transparent la pièce anatomique, est particulièrement intéressante pour corréler avec l’imagerie IRM mais également très difficile à mettre en place, nécessitant de nombreux ajustements. Ce projet vise aussi à obtenir assez de pièces anatomiques pour pouvoir vérifier un protocole déjà validé sur une espèce sur une autre espèce ou une autre souche. Enfin, et de façon non négligeable, il est nécessaire de disposer de pièces anatomiques pour former les étudiants et les collaborateurs, aux techniques d’histologie, sans gaspiller une pièce « précieuse » car issue d’un projet scientifique. La prise en main des techniques (découpes, immunomarquages et microscopie) nécessitant un apprentissage important, notamment sur la découpe au cryostat.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la mise au point de nouveaux protocoles complexes d’immunomarquages en 2D et 3D pour pouvoir réaliser ensuite des études complètes en histologie sur les projets scientifiques de la plateforme. Le bénéfice est également de pouvoir réaliser la formation des étudiants sans gâcher des pièces anatomiques « précieuses » car issu d’un projet et de pouvoir contrôler les résultats sur un animal sain en cas de résultat inattendu (ex : perte neuronale dans une souche de rat).
Procédures
Une procédure chirurgicale sans réveil, comportant une exsanguination perfusion puis une dissection afin de recueillir des organes d’intérêt. La procédure est déclinée en plusieurs possibilités : 1 : procédure standard d’exsanguination perfusion, puis recueil des organes, durée totale estimée à environ 15 à 20 minutes en fonction du nombre d’organes à prélever. 2 : Injection intracardiaque, intra-artérielle ou intraveineuse préalable d’un marqueur coloré (colorant vasculaire), avant exsanguination perfusion et recueil des organes. Le produit est laissé agir 5 min avant de commencer la procédure d’exsanguination perfusion, durée totale estimée à environ 30-40 minutes, en fonction du site d’injection et du nombre d’organes prélevés. 3 : Injection d’un marqueur coloré (colorant vasculaire) pendant la procédure d’exsanguination perfusion et recueil des organes, durée totale estimée à environ 15 à 20 minutes en fonction du nombre d’organes à prélever. 4 : Injection d’un marqueur coloré (remplissage vasculaire) à la fin de la procédure d’exsanguination perfusion et recueil des organes, durée totale estimée à environ 15 à 20 minutes en fonction du nombre d’organes à prélever.
Impact sur les animaux
Procédures sans réveil.
Devenir
Une procédure sans réveil pour histologie
Remplacement
L’histologie concerne les pièces anatomiques, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation des animaux.
Réduction
Les études rats étant moins nombreuses que les études sur souris, le nombre de 20 rats/an a été déterminé par le nombre de projets nécessitant ce type de mise au point. Les études souris sont beaucoup plus nombreuses mais nous avons déjà accumulé également plus de données histologique, nous pensons donc que 40 souris /an seront suffisantes, en tenant compte des besoins de formation. Soit un total maximal de 100 rats et 200 souris en 5 ans. Il est estimé qu’environ 10 à 15 % de ces animaux seront utilisés pour les action de formation et 85 à 90% pour des actions de mise au point en histologie. Une partie des animaux peuvent être des animaux de réforme issus de projets antérieurs, ou des élevages du CEA, n’ayant subi soit aucune procédure, soit des procédures légères ou modérées n’ayant pas entrainés de signes cliniques persistants. Les actions de formations seront réalisées sur ces animaux. Les mises au point peuvent également être réalisés sur ces animaux à l’exclusion des animaux suivants : - Animaux ayant des signes cliniques, pathologiques ou non. - Animaux d’un âge trop avancé pour l’expression des biomarqueurs d’intérêt (en fonction des marqueurs) - Animaux qui ont reçu un traitement (y compris produits de contraste) - Animaux qui ont subi des procédures chirurgicales lourdes (craniotomies …) - Animaux qui ont subi des procédures pouvant entrainer une inflammation (ouverture de la barrière hémato-encéphalique) - Animaux issus de souche atypique, de souche immunodéficiente ou encore ayant un métabolisme pathologique (sans forcément présenter des signes cliniques - Animaux de l’élevage ayant déjà montré une déficience cellulaire/moléculaire (sans signes cliniques) Les animaux jeunes et sains sont privilégiés pour ces mises au point, limitant les facteurs pouvant troubler l’analyse de l’expression des marqueurs et permettant d’avoir des points de comparaisons avec des animaux ayant une pathologie ou un traitement. Des animaux d’élevage n’ayant absolument subi aucune procédure, peuvent cependant servir pour les mises au point en histologie quand cela concerne l’expression des biomarqueurs liés à l’âge, à condition que la souche soit identique à celle prévue dans le projet lié à l’âge et que les animaux n’ont pas déjà été identifié comme déficients/anormaux pour les marqueurs d’intérêts. Les animaux provenant d’autres animalerie que celle de notre plateforme, seront gardés en quarantaine à réception jusqu’à utilisation.
Raffinement
Procédure sans réveil Une antalgie sera réalisée par injection sous-cutanée de Buprénorphine (0,06 mg/kg pour les souris et 0,03 mg/kg pour les rats), 30 minutes avant anesthésie.. Les animaux seront anesthésiés par une injection intrapéritonéale d’un mélange Kétamine/Xylazine (100/10 mg/kg, dose de 10 ml/kg).
Choix des espèces
La plupart des projets scientifiques sont réalisés sur le rongeur, les mises au point techniques se sont donc en priorité sur ces espèces. Des souris de 6-8 semaines environ, pour un poids de 20-25 g, et des rats de 8 semaines environ, pour un poids de 300 g, seront utilisés de préférence, sauf pour mettre au point des études histologiques sur des animaux plus âgés, où des animaux de plus de 6 mois seront utilisés. En effet, les tissus et en particulier le cerveau montre des différences importantes au cours du temps, avec par exemple la diminution de certains types cellulaires et l’augmentation de dépôts protéiques susceptibles d’interagir avec les anticorps et de donner de faux positifs.
Caractérisation des fibroblastes infiltrant les tumeurs pulmonaires dans le modèle transgénique Kras/Tp53.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. Vingt souris de réforme servent, sous anesthésie et sans réveil, à entraîner un geste technique au niveau du larynx, tandis que 88 souris porteuses de tumeurs pulmonaires, dans des procédures de souffrance sévère, sont suivies par imagerie sous anesthésie pour étudier les fibroblastes qui isolent la tumeur des lymphocytes. Le porteur indique surveiller poids et respiration, avec une mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids. Il affirme qu'un modèle in vivo est "indispensable" pour isoler et caractériser ces fibroblastes.
Objectifs
Le cancer du poumon est la principale cause de décès par cancer dans le monde. Les traitements des stades précoces par la chirurgie et la radiothérapie conduisent à des rémissions mais les stades métastatiques ont une faible survie. Les nouvelles approches par immunothérapie permettent de détruire les cellules cancéreuses en stimulant le système de défense immunitaire du patient (lymphocytes T). Ces nouvelles approches ont conduit à des résultats spectaculaires de rémission durable de tumeurs solides (mélanome et cancer du poumon principalement). Toutefois, cette stratégie thérapeutique fonctionne chez un nombre limité de patients (30% environ), incitant à étudier et comprendre les éléments contrôlant cette résistance. Une caractéristique fréquemment observée chez les patients ne répondant pas aux immunothérapies est l’exclusion des lymphocytes T des ilots de cellules tumorales. Maintenus à distance les lymphocytes T sont inaptes à détruire les cellules tumorales. Les fibroblastes associés aux tumeurs (CAF) semblent en partie responsables de cette exclusion en formant une barrière autour des ilots tumoraux. L’objectif de ce projet est de caractériser in vivo dans un modèle transgénique de tumeur pulmonaire chez la souris, les différentes populations de CAF et d’étudier leurs interactions avec les lymphocytes T infiltrant les tumeurs. Pour cela nous avons choisi un modèle transgénique murin inductible de tumeurs pulmonaires qui permet d’étudier les interactions entre les cellules tumorales pulmonaires et le microenvironnement fibroblastique et immunitaire. Cette recherche fondamentale pourrait déboucher sur des applications cliniques en proposant des thérapies innovantes ciblant les CAF afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies.
Bénéfices attendus
Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car une meilleure caractérisation des cellules composant le microenvironnement tumoral a un impact majeur sur l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques antitumorales. Ainsi, l’identification de cibles pour manipuler les CAF et libérer les lymphocytes T afin qu’ils infiltrent les îlots tumoraux permettrait de guérir un nombre plus important de patients par immunothérapie.
Procédures
Tous les gestes techniques de ce projet sont réalisés sous anesthésie : - Induction de l’expression du transgène par administration à l’entrée de la trachée- réalisée sous anesthésie générale des souris transgéniques 108 souris sont concernées. Le geste n’est pas douloureux mais l’anesthésie générale est obligatoire pour garantir une immobilité de l’animal et l’accès au larynx. Durée de l'anesthésie : 20 minutes. - Une anesthésie gazeuse des souris est réalisée pour le suivi longitudinal des tumeurs pulmonaires par imagerie. Celle-ci est réalisée tous les 15 jours à partir de 8 semaines post induction : 3 imageries maximum pour le temps précoce 10-12 semaines (44 souris concernées) et 8 imageries maximum pour le temps tardif 20-24 semaines(44 souris concernées). Durée de l'anesthésie : 10 min - Une anesthésie gazeuse des souris est réalisée pour l’administration intra-veineuse de lymphocytes T La cornée est protégée par un onguent durant l’anesthésie générale. Durée de l'anesthésie : moins de 5 minutes
Impact sur les animaux
Les souris inductibles élevées n’ont pas de phénotype dommageable car le transgène ne s’exprime qu’après une étape d’induction. Cette induction dans les cellules épithéliales pulmonaires conduit au développement de tumeurs pulmonaires chez 100% des animaux en 3 mois. Les dommages sont causés par le développement des tumeurs pulmonaires qui induisent à long terme une perte de poids importante et une difficulté respiratoire. Dans cette étude, une définition de points limites prédictifs et suffisamment précoces permet d’éviter la survenue de douleur en suivant la croissance des tumeurs par imagerie et par suivi du poids des animaux.
Devenir
Mise à mort pour les 20 souris de réforme utilisées dans la procédure sans réveil d’apprentissage de la technique d’administration au niveau du larynx afin de vérifier la qualité du geste technique. Euthanasie des 88 souris induites porteuses de tumeurs pulmonaires pour prélèvement post mortel des poumons et analyse
Remplacement
Ce projet est fondé sur ces observations préliminaires réalisées sur des tumeurs humaines. L’établissement d’un modèle de tumeur pulmonaire murine est indispensable afin d’isoler et de caractériser la fonction de ces CAF. Il sera complété par des approches alternatives ex vivo Seul un modèle in vivo permet de modéliser toutes les interactions cellulaires et d’apprécier l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
Le nombre maximal d’animaux utilisés pour ce projet sera de 108 souris pour 5 ans. L'imagerie des animaux permet des analyses et un recueil de données longitudinales et donc contribue à la réduction du nombre d'animaux Les analyses cellulaires des CAF seront réalisées sur N=6 souris par temps (10-12 sem et 20-24 sem post induction) . Une caractérisation des CAF sera réalisée et une corrélation avec une exclusion des lymphocytes T des ilots tumoraux sera recherchée (test de correlation de Pearson) Le nombre de souris par groupe a été défini à minima tout en permettant une analyse fiable. Afin d’apprécier la reproductibilité des résultats obtenus l’expérience sera répétée une fois avec le même nombre d’animaux par groupe. 10 souris transgéniques porteuses de tumeurs pulmonaires seront nécessaires à chacun des temps afin d’obtenir suffisamment de CAF pour les analyses de single cell RNA
Raffinement
La bonne connaissance du modèle tumoral, un suivi adapté des points limites (suivi des tumeurs par imagerie et pesées des animaux) et la manipulation des animaux sans stress, sous anesthésie si besoin, par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum le stress et la douleur des souris. Les tumeurs seront mesurées par imagerie. Les animaux sont pesés 1 fois/sem. La grille de score jointe est appliquée pour confirmer le bon état général de l’animal. Les points limites plus spécifiques pour ce modèle sont une perte de poids>20% du poids à l’induction, une dypsnée..
Choix des espèces
Le choix d’un modèle tumoral préclinique chez la souris est justifié du fait de l’existence de modèles de souris génétiquement modifiées qui reproduisent la physiopathologie des tumeurs humaines. Le modèle transgénique choisi ici reproduit la pathologie de certains cancers pulmonaires humains. De plus, de nombreux outils sont disponibles (anticorps, cytokines, souris transgéniques possédant des lymphocytes T spécifiques de tumeurs) qui permettent d’étudier précisément la réponse immunitaire antitumorale dans cette espèce. Les souris transgéniques seront induites à l’âge de 3 à 4 mois pour l’expression du transgène et utilisées dans les procédures, 10 à 12 semaines ou 20 à 24 semaines post induction donc âgées de 6 mois à 12 mois. Souris adultes avec un système immunitaire mature
Effets rénaux de la protéine Claudine 14 (Cldn14)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Soumises deux semaines à un régime riche en calcium, elles sont ensuite anesthésiées pour un prélèvement de sang et l'ablation des reins, qui entraîne leur mort, afin d'étudier le rôle d'une protéine rénale. Le porteur indique que le régime, jugé moins appétent, peut réduire la prise de nourriture et faire perdre du poids, avec des points limites de surveillance. Il affirme qu'un modèle cellulaire in vitro ne peut pas restituer la complexité des transports ioniques d'un épithélium rénal.
Objectifs
L’adaptation de l’organisme aux variations des apports de calcium pourrait impliquer la protéine Cldn14 exprimée dans la branche ascendante large de l’anse de Henle (BLAH). L’expression de Cldn14 augmente en régime riche en calcium et, dans des modèles cellulaires de cellules épithéliales, la protéine Cldn14 peut interagir avec la protéine Cldn16. On ne sait ni si ces interactions protéiques existent dans le tissu natif, ni si elles sont nécessaires à l’adaptation de la BLAH, ni s’il est pertinent de chercher des anomalies de la protéine Cldn14 chez les patients ayant une perte rénale de calcium. Objectif: déterminer si l’adaptation du transport de calcium dans la BLAH native, en réponse à une augmentation des apports calciques, implique la protéine Cldn14.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de déterminer l'implication (ou l'absence d'implication) de la protéine Claudine 14 dans l'adaptation du rein à un régime riche en calcium. Plus généralement, cette étude apportera des éléments permettant de mieux comprendre les mécanismes d'adaptation des mammifères aux variations de leur environnement, en particulier alimentaire. En effet les apports de calcium peuvent varier considérablement et rapidement en fonction du type de nourriture consommée : une adaptation rapide à ces changements est nécessaire dans le but de maintenir l ‘homéostasie.
Procédures
Les animaux sont soumis successivement - à un régime alimentaire riche en calcium pendant 2 semaines - à une anesthésie terminale au cours de laquelle un prélèvement sanguin puis une exérèse des reins sont pratiqués, entrainant la mort de l'animal
Impact sur les animaux
Le régime riche en calcium peut avoir un gout perçu comme moins agréable que la nourriture standard par certains animaux : dans ce cas, les animaux concernés peuvent diminuer leur prise de nourriture et perdre du poids. L'évolution du poids et la quantité de nourriture consommée font l'objet d'une surveillance et, le cas échéant, des points limites s'appliquent.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure : en effet, des tests fonctionnels rénaux doivent être réalisés à la fin de la procédure, nécessitant le prélèvement des reins sous anesthésie générale et donc l'euthanasie.
Remplacement
Le projet explore les mécanismes de l'adaptation rénale à un régime riche en calcium et permet la mesure directe de transport ionique à travers un épithélium spécialisé intact. La complexité des déterminants des transports ioniques transépithéliaux est telle qu'un modèle cellulaire in vitro ne peut pas la restituer
Réduction
Les méthodes choisies testent directement l’hypothèse énoncée en utilisant la microperfusion in vitro, méthode de référence dans le domaine : cette approche maximise la probabilité d’obtenir des réponses non ambiguës à la question posée. Les données seront comparées par un test de Student pour variables non appariées. Nous utiliserons 20 souris par groupe (10WT et 10KO pour le transport de calcium, 10WT et 10KO pour le transport de sodium) du fait de notre expérience des différences quantitatives attendues et des tests statistiques utilisés. Les manipulations des animaux sont réduites au minimum et la seule contrainte imposée est l’alimentation avec un régime riche en calcium pendant 2 semaines.
Raffinement
Toutes les procédures le nécessitant seront réalisées sous anesthésie. Les animaux bénéficient d’un environnement enrichi et leur souffrance est prise en compte et atténuée au maximum. Les manipulations des animaux sont réduites au minimum et la seule contrainte imposée est l’alimentation avec un régime riche en calcium pendant 2 semaines. Des points limites ont été définis et les animaux sont l'objet d'une surveillance au cours des différentes procédures exposées dans la demande
Choix des espèces
Le modèle d'inactivation constitutionnelle du gène Cldn14, codant pour la proteine Cldn14, a été développé chez la souris Les animaux sont nourris avec le régime riche en calcium à partir de l'âge de 2 mois. Les animaux ont alors terminé leur phase de croissance rapide et sont considérés comme matures ; la taille de leur rein permet la dissection d'une branche large ascendante de longueur suffisante pour pouvoir mesurer le transport transépithélial de calcium et celui de sodium
Modèles d’étude pour les pathologies infectieuses humaines : souris humanisées pour le système immunitaire et/ou le foie
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
5 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Greffées avec des cellules humaines, elles subissent une irradiation sublétale, des prélèvements de sang, des chirurgies puis une infection par des virus comme le VIH ou les hépatites B et C, pour étudier ces infections et tester des traitements. Le porteur indique que certaines souris présentent un poids réduit lié à une déficience hépatique et peuvent développer une dermatite, avec mise à mort si le score de souffrance atteint le point limite. Il présente ce modèle comme le "seul" permettant ces infections et comme une alternative au recours aux primates non-humains.
Objectifs
Ce projet utilise le seul modèle murin expérimental qui permet de suivre la progression in vivo des infections par des virus à tropisme restreint aux humains et aux primates non-humains. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la physiopathologie induite par l’infection des virus de l’immunodéficience humaine (VIH), d’Epstein-Barr (EBV), de l’hépatite B (VHB), et de l’hépatite C (VHC) en suivant les réponses immunitaires, et évaluer l’impact des nouvelles approches antivirales ou vaccinales. Ce type d’expérimentation ne peut pas être mené chez l’hôte naturel de ces virus pathogènes (l’homme) et s’avère de plus en plus difficile à mettre en place chez des primates non-humains. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces virus, des modèles de souris humanisés pour le système immunitaire (souris HIS), ou pour le foie avec l'ajout d'hépatocytes humains (souris HUHEP), ont été développés au cours des deux dernières décennies. Comme premier modèle, nous avons généré des souris immunodéficientes (BRGS), par l’invalidation fonctionnelle des gènes codant pour certaines protéines. Les principaux mécanismes de rejet de greffe sont absents chez ces souris ce qui permet l’établissement d’une xénogreffe hématopoïétique humaine après injection de cellules souches hématopoïétiques humaines (HSC). Des études précédentes ont montré que les souris HIS étaient susceptibles aux infections par les virus HIV ou EBV, et modélisaient les réponses immunitaires humaines. Un second modèle murin immunodéficient porte en plus un gène urokinase plasminogen activateur (uPA) qui est toxique pour les hépatocytes dans le foie, ce qui induit une déficience hépatique. Ces souris sont greffées avec des hépatocytes humains adultes sains qui participent à la régénération du foie et constituent le modèle HUHEP. Des études précédentes ont montré que les hépatocytes humains pouvaient être infectées par les virus VHB et VHC ainsi que par le parasite de la malaria (Plasmodium falciparum) chez ces souris HUHEP. La combinaison des deux modèles ci-dessus, dite HIS-HUHEP permet une étude approfondie des interactions entre le système immunitaire et le foie dans le cadre d’infections hépatiques (VHB, VHC, P. falciparum). Celui-ci permet de décortiquer les mécanismes d’infection et de mieux comprendre la pathogénèse complexe induite par ces microbes invasifs.
Bénéfices attendus
Ces modèles animaux permettront de mieux caractériser les mécanismes d'infection et de réplication des virus (VIH, EBV, VHB, VHC), le rôle du système immunitaire dans l'évolution des pathologies, ainsi que de tester des nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales. Bien que des traitements thérapeutiques existent pour les patients atteints de VIH, un vaccin thérapeutique permettrait de contrôler les infections de manière pérenne. Il n’existe pas de vaccin préventif pour le VIH et le VHC, ainsi des millions de nouvelles infections surviennent par an, ne permettant pas d’éliminer ces virus de la population globale. Bien qu’un vaccin sûr et efficace existe pour le VHB, plus de 260 millions de personnes sont actuellement infectées et seul 1% de ces patients ont accès aux traitement thérapeutiques, le VHB induit des hépatocarcinomes à mauvais pronostique. Ces traitements, comme celui pour le VIH, doivent être pris à vie, induisant un coût élevé pour la société et un risque de survenu d’échappement virologique. Ainsi, les recherches se poursuivent pour développer des vaccins, ou des traitements curatifs, pour ces pathologies. L’interaction entre la réponse immunitaire et le virus est essentiel dans la progression de la pathologie, comprendre ces mécanismes d’action est une clé de voute pour développer des nouveaux concepts de traitements à visé thérapeutiques, ou des vaccins. Or, les modèles animaux qui permettent d’étudier ces interactions sont rares étant donné que ces virus n’infectent que des cellules humaines ou de chimpanzés. Afin de modéliser ces questions, nous avons développé des modèles de souris greffées avec des cellules humaines qui sont susceptibles à ces virus, permettant d’étudier les réponses immunitaires antivirales humaines. L’ensemble de ces études participe à comprendre la physiopathologie induite par ces virus chez l’humain, et à développer des nouveaux traitements thérapeutiques et des stratégies vaccinales afin d’éliminer ces maladies.
Procédures
Les procédures expérimentales décrites prévoient les interventions suivantes : irradiation avec des doses sous-létales (une fois par vie, 1-3 minutes), prélèvements sanguins en retro-mandibulaire (chaque prélèvement dure quelques secondes et est réalisé tous les 15 jours au maximum), anesthésie et procédures chirurgicales (une fois par vie, environ une heure et demi par animal), infection par des virus (une fois par vie, chaque infection dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Le degré de gravité des procédures est considéré comme léger (injections et prélèvements) ou modéré (conséquences potentielles à long terme de l’irradiation sous létale ou chirurgie). Les animaux portant le transgène uPA ont un poids réduit (autour de 10% en dessous du poids normal) du à leur déficience hépatique qui entraîne des défauts métaboliques. Ce poids diminué n’affecte pas le comportement des animaux, n’entraîne pas de souffrances, ni de stress, d’après nos observations sur plusieurs années d’expérimentation. Les animaux humanisés pour le système immunitaire et exprimant le transgène TSLP peuvent développer une dermatite. Afin de soulager la dermatite, les animaux seront traités avec une solution antiseptique (bétadine) avec un anesthésiant locale (lidocaine) et ils pourront être hébergés sur une litière de cellulose plus adaptée aux peaux sensibles. Leur phénotype est suivi toutes les semaines selon les critères et les points limites suivants : 1. Apparence global de l’animal score 0 : normal score 1: poils ébouriffés, rougeur de peau ou perte de poils sur moins de 50% du corps, expression faciale modérée, animal en mouvement score 2: dos voûté, perte de poils sur plus de 50% du corps, expression faciale sévère, absence de mouvement, prostration. 2. Conditions corporelles (cachexie) score 0: BCS (Body Condition Scoring) 3: L’animal est bien conditionné. La colonne vertébrale est continue. Vertèbres palpables seulement avec une pression ferme. score 1: BCS 2: L’animal est sous-conditionné. Segmentation de la colonne vertébrale évidente. Les os du bassin dorsal sont facilement palpables. score 2: BCS 1 : L’animal est amaigri. Structure squelettique extrêmement visible et peu ou pas couverte par la chair. Vertèbres distinctement segmentées 3. Poids score 1: perte de plus de 10% du poids score 2: perte de plus de 20% du poids Le point limite est défini par la détection d’un score =2 Si un score > 0 est observé, les animaux auront une surveillance renforcée. Si un score = 2 est observé, les animaux seront mis à mort.
Devenir
A l’issu de la procédure expérimentale #1 les animaux seront mises en expériences suivant les procédures expérimentales # 2, 3, 4 et 6. A la fin de ces procédures expérimentales les animaux seront mis à mort pour être analysés afin de caractériser la physiopathologie et la réponse immunitaire induite par les virus VIH, VHB, VHC, EBV. A l’issu de la procédure expérimentale #5 les animaux seront mis en accouplement.
Remplacement
Ce projet nécessite un modèle expérimental soutenant l’ensemble des mécanismes de la physiopathologie induite par une/des infection(s) virale(s). Or, de nombreux exemples démontrent que les tests d’efficacité de thérapies antivirales in vitro ne se confirment pas systématiquement in vivo en phase clinique chez l’Homme du fait des dynamiques complexes mises en jeu dans l’organisme (cinétique de l’infection; distributions cellulaires ; bio-distribution des composés; réponse immunitaire). Historiquement, les modèles infectieux de choix restent le macaque pour le VIH (avec le virus simien apparenté VIS ou l’hybride SHIV) et le chimpanzé pour le VHC et le VHB. En proposant comme modèle alternatif la souris humanisée pour le système immunitaire et/ou le foie, nous appliquons de manière relative le principe de remplacement en écartant l’utilisation de primates non-humains, avec l’avantage supplémentaire d’utiliser un modèle expérimental directement adapté au pathogène humain natif. A ce titre, les souris HIS et HIS-HUHEP sont le seul modèle expérimental correspondant à ces critères (mis à part l’Homme lui-même, chez lequel il est éthiquement inacceptable de tester directement de nouvelles stratégies préventives ou thérapeutiques).
Réduction
Le plan d’étude bénéficie de nos connaissances antérieures obtenues avec des souris humanisées sur l’infection par le VIH et le VHB. De plus, nous utilisons un modèle de souris HIS qui est à la pointe du domaine, ce modèle est sans cesse optimisé pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux requis par expérience. Il sera essentiel de compter un minimum de 10 animaux par groupe, du fait de cette variabilité intrinsèque, et d’inclure l’ensemble des groupes contrôles pour valider les conclusions de chaque étude. La planification des expériences en amont et la concertation entre les membres de l’équipe seront des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux.
Raffinement
Les cages d’hébergement sont enrichies avec un coton dentaire permettant une nidification, et avec des refuges en forme de dômes en cellulose dans les cages de croisements. Par ailleurs, le stress des animaux est largement diminué par l’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques lors de la majorité des procédures. L’isoflurane par voie respiratoire présente l’avantage d’être un anesthésiant permettant des séquences d’endormissement courtes et répétées. Les soins post-opératoires tels que des pansements, du gel oculaire, une réhydratation par voie sous-cutanée, et une alimentation hydratante (DietGel) sont inclus dans nos protocoles expérimentaux.
Choix des espèces
La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale soutenant une infection productive par le VIH. La souris HUHEP greffée avec des hépatocytes humains est permissive aux infections hepatotropiques (VHB, VHC, P. falciparum). Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris humanisées pour le système immunitaire (HIS) sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+ dans des souriceaux nouveau-nés (
Etablissement d’un modèle de glioblastomes (GBM) chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
808 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des souriceaux d'un jour sont anesthésiés, reçoivent une injection d'ADN dans un ventricule cérébral puis des chocs électriques d'électroporation, pour induire et étudier les premières étapes d'un glioblastome. Le porteur indique que l'électroporation peut provoquer stress de séparation, refroidissement et douleur modérée, et prévoit d'arrêter l'expérience quand les tumeurs atteignent 15 % du volume du cerveau. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle cellulaire capable de récapituler ces niches de cellules souches.
Objectifs
Les glioblastomes (GBM) représentent la forme la plus fréquente et aussi la plus agressive des tumeurs primaires du cerveau avec un pronostic de survie post-diagnostique très bas. L’objectif du projet est d’établir dans notre laboratoire un modèle murin de GBM qui permettra d’étudier les étapes précoces de progression de ces tumeurs. Récemment les cellules souches neurales localisées autour des ventricules latéraux du cerveau ont été identifiées comme les cellules qui sont à l’origine des GBM. En effet lorsque certains gènes sont mutés dans ces cellules souches, celles-ci sont en capacité de se transformer en cellules tumorales. Sur la base d’études publiées dans d’autres laboratoires, nous souhaitons effectuer des expériences pilotes pour mettre au point un modèle d’induction de GBM basé sur l’introduction de mutations dans ces cellules souches neurales. Grâce à une méthode d’électroporation mise au point au laboratoire, nous pouvons cibler spécifiquement ces cellules souches et y introduire des modifications génétiques. L’analyse de ces cellules ainsi modifiées sera effectuée à différents temps après l’induction des mutations et permettra de caractériser les évènements cellulaires et moléculaires qui interviennent pendant la période d’induction et de développement précoce des GBM.
Bénéfices attendus
Grâce à l'électroporation nous avons le moyen unique de pouvoir cibler les cellules qui sont à l’origine de la formation de GBM. La mise au point d’un nouveau modèle de glioblastome basé uniquement sur l’électroporation ouvre la possibilité d’étudier les étapes précoces du développement des GBM dans un contexte physiologique avec un niveau de résolution cellulaire et moléculaire qui n’existe pas à l’heure actuelle. Ainsi de nouveaux processus cellulaires et moléculaires intervenant au commencement de la tumorigenèse pourront être découverts.
Procédures
Nombre total d'animaux= 808. Tous les animaux de ce projet seront traités avec le même protocole. Pour l'étape d'électroporation, les souriceaux âgés de 1 jour seront anesthésiés, des solutions d'ADN seront injectés dans un ventricule latéral du cerveau grâce un capillaire très fin, puis des électrodes placées de part et d'autre de la tête de l'animal délivreront des chocs électriques. L’ensemble de ces actes ne dure que 30 secondes. Ils seront réveillés progressivement en les ramenant à une température de 37°C et replacés auprès de leur mère. Avant leur mise à mort, les animaux recevront une injection intrapéritonéale d’EdU ou de BrdU, composés qui permettent de suivre la prolifération des cellules, qui ne provoquent aucune douleur et qui ne sont pas délétères à l’animal. Les animaux seront euthanasiés à différents temps après l'électroporation. La mise à mort se fera après injection d'une surdose d'anesthésique.
Impact sur les animaux
Dans la procédure d'électroporation, certaines étapes peuvent potentiellement générer du stress lié à la séparation d’avec leur mère, au refroidissement utilisé pour l’anesthésie et à la douleur modéré de l’électroporation. Cependant avec le recul de plusieurs années d’utilisation et de maitrise des procédures d’électroporation, nous avons pu constater que les souriceaux ne présentent pas de signes de douleur ni d’anxiété au réveil et sont allaités par la mère très rapidement après leur retour dans la cage. Les autres effets indésirables attendus sont le développement de tumeurs qui sera évalué au cours du temps. Comme le but de notre étude est concentré sur les étapes précoces de l’établissement des tumeurs, nous ne souhaitons pas atteindre le stade où les tumeurs deviennent délétères pour l’animal. C’est pourquoi, nous suivrons un lot d’animaux pour déterminer le temps nécessaire à la survenue de tumeurs en analysant par histologie les cerveaux prélevés toutes les deux semaines jusqu'à un maximum de 16 semaines après l'électroporation. L’expérimentation sera arrêtée lorsque les tumeurs atteindront 15% du volume du cerveau. Ce stade de développement des tumeurs est suffisant pour notre étude et n’entraine pas de perte de poids chez l’animal ni de comportement anormal.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin d’analyser le devenir des cellules souches modifiées génétiquement et afin d’ évaluer si et comment des tumeurs se développent.
Remplacement
Le but de notre projet est d’étudier les mécanismes celluaires et moléculaires intervenant dans les phases précoces de développement des GBM dans le contexte écologique de l’avènement des tumeurs en ciblant les cellules souches neurales situées dans le cerveau antérieur et qui sont à l’origine de ces GBM. Malheureusement il n’existe pas de modèles cellulaires capables de récapituler ces niches cellulaires.
Réduction
Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. - Les animaux test et témoin seront issus d’une même portée - des méthodes statistiques adaptées aux petits échantillons seront utilisés pour pouvoir obtenir des données statistiques fiables tout en utilisant un nombre restreint d’animaux par expérience. - Le contrôle des paramètres environnementaux et du statut sanitaire et génétique des animaux limitera la variabilité des résultats expérimentaux. - Des expériences pilotes seront effectuées en début de protocole sur un nombre très réduit d’animaux pour établir la chronologie des évènements conduisant à des GBM et permettront ainsi de réduire ainsi la fenêtre d’étude aux étapes précoces de développement des tumeurs avant que celles-ci ne deviennent délétères.
Raffinement
- L’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé quotidiennement. - Les cages sont enrichies avec des carrés de coton, des cylindres de carton et des dômes de nidification. - Les animaux sont hébergés en groupes sociaux. - Pour limiter l’anxiété lors des procédures expérimentales d’électroporation, les souriceaux sont maintenus au maximum en portée avec leur mère. - Une prémédication d’anti-douleur sera administrée en sous cutanée 30 minutes avant la mise à mort pour éviter toute souffrance ; les animaux seront euthanasiés après avoir reçu une surdose d’anesthésique. Pour limiter les effets trop délétères liés au développement de tumeurs cérébrales, une analyse histologique des cerveaux au cours du temps permettra de déterminer le stade de progression des tumeurs qui soit suffisant pour l'étude mais qui ne provoque pas de perte de poids ni de comportement anormal.
Choix des espèces
De façon générale, la souris est le modèle Mammifère le plus utilisé par la communauté scientifique pour établir des modèles de cancers in vivo permettant l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires des phases précoces de développement de cancer. Un modèle d'induction de GBM similaire au nôtre a déjà été décrit chez la souris et mime différentes caractéristiques cellulaires et moléculaires de la genèse et du développement des glioblastomes. Ce modèle est donc réalisable et pertinent. De plus, grâce à l'adaptation de notre protocole basée uniquement sur l’électroporation, nous pourrons, dans le futur, étudier les étapes d’induction et de développement précoce des GBM dans des contextes génétiques mutants existant uniquement chez la souris. Tous les animaux seront électroporés au stade nouveau-nés car c’est le stade où les cellules souches neurales qui bordent les ventricules latéraux, peuvent être modifiées génétiquement grâce à l’électroporation de plasmides. Des animaux seront euthanasiés à différents temps, à partir d’une semaine jusqu’à un maximum de 16 semaines après l’électroporation pour suivre l’évolution des cellules électroporées.
Importance physiologique de la modulation nutritionnelle dans le traitement des désordres métaboliques du foie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries seize semaines avec un régime riche en gras et en sucre, elles subissent des jeûnes, des gavages ou injections et des prélèvements de sang à la queue lors de tests de tolérance, avant une mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie. Le porteur affirme que ce régime n'engendre ni douleur ni anxiété d'après l'observation du comportement, et classe en modéré la souffrance liée au jeûne, au gavage et aux prélèvements. Il affirme que l'usage d'animaux est "essentiel", une enzyme clé n'étant pas exprimée par les lignées cellulaires.
Objectifs
Les points de contact entre les mitochondries et le réticulum endoplasmique (RE), appelés MAMs pour Mitochondria-Associated Membranes, ont un rôle crucial dans le contrôle de l'homéostasie glucido-lipidique de l’hépatocyte. Ces plateformes dynamiques peuvent être régulées par différents facteurs, notamment les nutriments. Des données récentes montrent que les MAMs sont altérées dans le foie de modèles murins d'obésité, de résistance à l’insuline et de stéatose hépatique, faisant des MAMs une cible thérapeutique privilégiée pour la prévention ou le traitement des désordres métaboliques hépatiques associés à l’obésité. Ces derniers sont étroitement associés à une diminution de la concentration plasmatique en certains acides aminés comme l'arginine, la glycine et la bétaine. Par ailleurs, des travaux in vitro ont démontré que les acides aminés arginine, citrulline, glycine et bétaine sont capables de réguler les MAMs par des voies de signalisation que l'on peut cibler par des molécules pharmacologiques comme la tetrahydrobioptérine (pour arginine et citrulline) et la S-adenosyl-méthionine (pour la glycine et la bétaine). L'objectif de ce projet consistera à 1) valider l'intérêt d'une supplémentation en acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques (résistance à l'insuline, stéatose) associés à l'obésité, 2) démontrer que les bénéfices santé sont associés à une restauration de d'intégrité des MAMs dans le foie des souris traitées et 3) valider in vivo les voies de signalisation impliquées par l'utilisation de molécules pharmacologiques.
Bénéfices attendus
Le projet présenté vise à apporter des preuves de concept, d'une part sur l'intérêt de certains acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité, d'autre de l'intérêt des MAMs comme cible thérapeutique pour la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité chez l'Homme. Le projet apportera des connaissances mécanistiques solides pour soutenir une approche très originale et porteuse de potentiel d'innovation pour la santé humaine pour le futur proche.
Procédures
L'intervention principale sur les animaux consistera en de petits prélèvements sanguins au niveau de la queue lors de tests de tolérance au glucose et au pyruvate qui seront réalisés sur animal vigil, à jeun depuis 6h (tolérance au glucose) ou 10h (tolérance au pyruvate), respectivement. Après anesthésie locale (crème lidocaïne) et incision au scalpel à l'extrémité de la queue, des ponctions de 4-5 µL de sang seront réalisées à la veine caudale avant et 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes après gavage oral (pour la moitié des souris) ou injection intrapériotonéale (pour l'autre moitié des souris) de glucose (2mg/g) ou injection intrapériotonéale (pour toutes les souris) de pyruvate (1.5 mg/g) pour suivre la glycémie à l'aide d'un glucomètre. Après le premier prélèvement, les suivants seront réalisés par simple grattage du caillot sanguin. La durée du jeune avant chaque test a été optimisée afin de limiter la nuisance infligée à l'animal tout en garantissant l'obtention d'un résultat métabolique fiable et reproductible, donc interprétable. Les protocoles se termineront par un jeune de 10h avant la mise à mort des animaux. Cette durée de jeune est indispensable pour garantir la qualité des mesures réalisées sur le foie de animaux.
Impact sur les animaux
D’après les premiers protocoles réalisés, 16 semaines de régime riche en gras et en sucre n’engendrent pas de douleur ou d’anxiété comme évalué par l’observation régulière du comportement des animaux, et n'empêchent pas les animaux de bouger dans la cage, notamment pour se nourrir et boire. Par ailleurs, selon les connaissances actuelles, il est peu probable que les interventions nutritionnelles testées aient des effets indésirables sur la santé et le bien-être des animaux. Lors de la mise à mort, l’utilisation de la dislocation cervicale sur animal anesthésié est une méthode rapide qui respecte les réglementations en vigueur pour les petits rongeurs. La douleur associée à la mise à jeun, au gavage ou aux injections intrapéritonéales, et aux prélèvements sanguins à la queue sont des contraintes dont le degré de sévérité est évalué de classe modérée.
Devenir
Les protocoles se termineront après anesthésie des animaux (kétamine/xylazine: 100/20 mg/kg soit 220µL de mélange pour une souris pesant 20g) et mise à mort par dislocation cervicale pour pouvoir récupérer différents tissus et organes. La nécessité de faire des anlayses histologiques et biochimiques justifie la mise à mort pour récupérer les tissus et organes.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l'analyse des effets de régimes sur un organisme complexe, et d'un point de vue mécanistique, l'étude ne peut être conduite sur des lignées cellulaires immortalisées, qui n'expriment pas une enzyme clé impliquée dans nos mécanismes, la GNMT.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été réduit au maximum afin que la taille de l'échantillon permette de dégager des résultats statistiquement fiables sur des souris mâles et femelles.
Raffinement
Nous aurons pour objectif d'optimiser les procédures expérimentales pour réduire au maximum l'inconfort et les stress subis par les animaux. En particulier, nous n'utilisons pas de procédures susceptibles d'induire un dépassement de point limite de souffrance. Le raffinement sera appliqué tout au long de la vie des animaux. Pour cela, nous planifierons les protocoles de façon à éviter les perturbations susceptibles de procurer le stress de l'animal. Les protocoles ont été prévus de façon à obtenir le plus d'informations possibles par animal en imposant en même temps, un "moindre coût" en terme de mal-être de l'animal. Nous utiliserons une procédure d'analgésie pour les prises de sang, et une procédure d'anesthésie et de mise à mort par dislocation cervicale. Enfin, nos procédures de raffinement nous permettront de générer des résultats de meilleure qualité et d'exploiter au mieux les résultats obtenus.
Choix des espèces
Le travail avec des animaux est indispensable pour mimer au plus près la réalité de la surnutrition, de l'obésité et des désordres métaboliques comme dans l’espèce humaine. Le travail en épidémiologie sur l’Homme permet, en effet, de faire des corrélations entre la surnutrition et l'apparition de l’obésité et des désordres métaboliques. Le travail sur l’animal nous permet de montrer un effet causal, des manipulations nutritionnelles sur les paramètres biologiques ciblés et leurs bénéfices métaboliques à l'échelle de l'organe et du corps entier.
Rôle des macrophages dans le cancer du foie et la réponse aux immunothérapies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections induisant des tumeurs du foie et un suivi par échographie sous anesthésie, pour étudier le rôle des macrophages dans le cancer hépatique et la réponse aux immunothérapies. Le porteur indique qu'un quart des animaux peut développer une encéphalopathie foudroyante deux à quatre semaines après l'invalidation d'un gène. Il affirme que les lignées cellulaires ne permettent pas d'appréhender le foie dans sa globalité et présente le recours à Crispr comme une réduction du nombre d'animaux.
Objectifs
Notre objectif est d’étudier comment les macrophages du foie sont impliqués dans le développement du cancer du foie dépendant de la beta-caténine et modifient la réponse aux traitements d’immunothérapie dans des modèles murins de CHC (carcinome hépatocellulaire) relevants. Ce projet est divisé en 3 grands axes: 1) déterminer de manière cinétique au cours du processus tumoral comment une activation oncogénique de la beta-caténine dans les hépatocytes remodele le paysage immunitaire à son voisinage et notamment les macrophages embryonnaires. 2) comprendre comment les macrophages embryonnaires sont progressivement perdus au cours du processus tumoral pour être remplacés par des macrophages dérivés des monocytes et comment des événements oncogéniques associés à l'activation de la beta-caténine modifient ce remodelage macrophagique et 3) déterminer comment la réponse aux immunothérapies de ces cancers est modifié selon le remodelage des macrophages.
Bénéfices attendus
En aidant à la compréhension des mécanismes de développement et de réponse aux traitement des cancers du foie en s'intéressant à une population immunitaire qui fut longtemps peu étudiée et dont la diversité des sous-populations a récemment été mise en lumière grâce à l'utilisation du single RNAseq (scRNAseq), ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques à coupler aux traitements d'immunothérapie émergeants ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre.
Procédures
1) Injection intrapéritonéale sur animaux vigiles durant 10 secondes, 2) Injection intraveineuse sous anesthésie durant 30secondes 3) échographie hépatique sous anesthésie durant 10minutes si l'animal ne présente pas de tumeurs jusqu'à 25minutes si les tumeurs sont nombreuses 4) prélèvement sanguin sous anesthésie durant 30secondes
Impact sur les animaux
Les modèles de CHC décrits dans ce projet sont des modèles créés au laboratoire et que nous utilisons depuis plusieurs années. Entre la 2ème et la 4ème semaine après invalidation d’Apc un phénotype délétère lié à une encéphalopathie foudroyante peut être observé chez 25% des animaux, sans perte de poids. Ce phénomène est aussi observé dans le modèle de déletion de l'exon 3 de la beta-catenine par Crispr/Cas9 mais un mois et demi à deux mois après édition du gène du fait du temps de latence plus long pour que la machinerie Crispr soit pleinement efficace. Les autres traitements sont sans nuisances sur les animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux de ce projet seront euthanasiés pour analyse de leurs tissus hépatiques et leurs tumeurs afin de comprendre les événements génétiques et immunitaires à l'origine du développement de ces tumeurs et si nos traitements ont pu modifier leurs caractéristiques (invasion, prolifération)
Remplacement
Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire (cellules immunitaires, cellules endothéliales...). L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité, d’autant plus que les CHC mutés pour la beta-caténine sont peu proliférants et donc difficiles à maintenir en culture. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous optons pour la technique des ciseaux moléculaires ou crispr/cas9. 1290 animaux sur les 2650 nécessaires au projet suivent ce protocole, le quadruple ayant été nécessaire sans l’utilisation de cette stratégie. Nous suivrons le développement des tumeurs par suivi échographique, un appareil ayant été acquis récemment au sein de l'animalerie, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral évitant d'euthanasier les animaux à l'aveugle. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à nos expériences précédentes et à un calcul de puissance pour obtenir des résultats robustes : le suivi échographique de 20 animaux par lot est nécessaire et suffisant pour générer des résultats statistiquement fiables.
Raffinement
Nous suivrons le développement des tumeurs par échographie, ce qui permet un suivi longitudinal depuis les phases précoces du développement tumoral évitant la souffrance des animaux liée à un développement tumoral trop important. Nous connaissons les phases possiblement délétères après invalidation génique, et les procédures se dérouleront avec une surveillance adaptée - les animaux étant euthanasiés si le score de souffrance est trop élevé. Les injections stressantes et les échographies seront réalisées sous anesthésie et les animaux mis sur tapis chauffant pour limiter l’hypothermie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues et les animaux hébergés à raison de 5 animaux par cage au maximum.
Choix des espèces
Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié : 1) A notre expertise pour l’étude, l’utilisation et le développement de modèle murin. 2) A la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les CHC humains. Pour toutes les procédures, des souris mâles âgées de deux mois seront utilisées pour induire les délétions géniques d'intérêt (par Cre/lox ou Crispr/cas9) afin de réaliser un suivi longitudinal de l’initiation et du développement tumoral chez la souris adulte jeune et de les traiter avec les immunothérapies
Impact d’une pollution lumineuse nocturne sur le métabolisme et la fertilité féminine chez un modèle animal diurne
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Ovariectomie avec implant d'œstradiol, pose d'un capteur de glycémie ou d'un cathéter permanent lors de chirurgies de deux heures, frottis vaginaux quotidiens et prélèvements de sang par incision de la queue : 312 femelles d'un rongeur diurne, Arvicanthis ansorgei, subissent ces actes dans un projet sur les effets de la lumière nocturne sur le métabolisme et la fertilité. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tuées à l'issue pour l'étude de leurs gènes, hormones et organes. Pour 16 d'entre elles, 150 microlitres de sang sont prélevés toutes les trois heures pendant vingt-quatre heures par le cathéter. Le porteur reconnaît que ces rongeurs sont sociaux et prévoit d'en garder une partie en cage individuelle pendant toute l'expérimentation.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à déterminer les mécanismes biologiques, à ce jour très mal connus, impliqués dans les effets néfastes de la pollution lumineuse et de la désynchronisation circadienne (= désynchronisation des rythmes biologiques proche de 24 heures). Les résultats permettront de répondre aux enjeux de santé publique visant à améliorer la santé du personnel exposé aux conditions de travail posté et des populations exposées à la lumière nocturne (professionnels navigants sur plusieurs fuseaux-horaires, travaillant très tôt ou très tard, enfants et adolescents s’exposant à la lumière d’écrans la nuit). Les mécanismes impliqués dans les effets sanitaires néfastes de la pollution lumineuse et des horaires décalés sont difficiles à établir chez les sujets humains, et nécessitent l'utilisation d’un modèle animal proche de l’homme. Les modèles classiques (rats, souris) ont un phénotype nocturne (vivent la nuit) qui est inadapté aux applications biomédicales. Nombre de leurs rythmes journaliers (cycles veille-sommeil, prise alimentaire-jeune) sont inversés par rapport à l’Homme (phénotype diurne, de jour). La majorité des études expérimentales sont réalisées chez des individus mâles, ignorant l’effet sexe de ces analyses. Les études ne distinguent pas l’impact direct de la pollution lumineuse nocturne de l’effet indirect de la désynchronisation circadienne sur la physiologie. Nous proposons une approche originale pour mieux comprendre les effets de la pollution lumineuse et des décalages horaires sur le métabolisme et la fertilité féminine. L’objectif de ce projet est de fournir de nouvelles connaissances pour mieux comprendre les effets délétères de la pollution lumineuse sur l'homéostasie métabolique et la fertilité. Le choix d’un modèle diurne, le rongeur Arvicanthis Ansorgei, permettra la production de résultats rapidement exploitables dans le domaine de la santé humaine. La majorité des études dans cette thématique étant menées chez les individus masculins, notre choix de sujets féminins permettra d’évaluer les points critiques et, de gérer les risques sanitaires de la pollution lumineuse sur l'ensemble de la population générale. La réalisation de ce projet aidera à développer des approches préventives.
Bénéfices attendus
Ce projet va aider à mieux comprendre les mécanismes néfastes de la pollution lumineuse nocturne sur la santé métabolique et la fertilité. Les résultats obtenus chez un modèle animal diurne ( = vivant de jour) féminin permettront de mieux appréhender les risques sanitaires de la pollution lumineuse pour le personnel exposé aux conditions de travail en horaires décalés ainsi que pour toutes les autres catégories populationnelles exposées à de la lumière nocturne (par exemple, personnel navigant sur plusieurs fuseaux-horaires, personnes de toutes classes d’âge s’exposant à la lumière d’écrans pendant la nuit). La réalisation de ce projet conduira ensuite à développer des approches préventives sous forme de mesures interventionnelles ou de recommandations de bonnes pratiques et de gestion des risques professionnels.
Procédures
108 animaux vigiles seront soumis à une injection d’une solution sucrée ((2 g de D-glucose / kg masse corporelle) à l’aide d’une seringue d'un mL afin de réaliser un test de tolérance au glucose (durée 3H). Ce test sera effectué avant le début de l'expérience, puis à la fin de chaque mois, l’expérimentation durant entre 1 et 3 mois selon les résultats obtenus. Des micro-volumes de sang (5 μl) seront prélevés à 5 reprises sur une durée totale de 3 h à l’aide d’une micro-incision de la queue. Un anti-douleur sera administré sur la queue à la fin du protocole. 16 animaux seront soumis à une chirurgie permettant la pause d’un capteur donnant la glycémie 24/24h (durée 2H). Cette opération s’effectuera sous anesthésie générale et un traitement post opératoire sera fourni à l’animal ainsi qu’un suivi quotidien de rétablissement. 32 animaux seront soumis à une cathétérisation permanente (durée de la chirurgie 2H). Cette chirurgie s’effectuera sous anesthésie générale et un traitement post opératoire sera fourni à l’animal ainsi qu’un suivi quotidien de rétablissement. Pour 16 des animaux, un volume de 150 μl sera prélevé toutes les 3 heures avec réinjection des éléments sanguins (durée 24H). Pour les 16 animaux restants ce volume sera de 50 μl (prélèvement répété sur plusieurs jours) avec réinjection des éléments sanguins. 48 animaux seront soumis à une ovariectomie et à un implant estradiol sous anesthésie générale puis un traitement post opératoire sera fourni à l’animal ainsi qu’un suivi quotidien de rétablissement. Ces animaux seront soumis à un unique frottis vaginal. Les frottis seront réalisés sur animaux éveillés maintenu à l’aide d’un tissu englobant le corps (pour réduire le stress) pendant une durée d’environ une minute. Les cellules sont recueillies avec 10 microL de sérum physiologique inséré dans le vagin à l’aide d’une micropipette. 108 individus seront soumis à des frottis vaginaux quotidiens (décrit précédemment) et des micro-prélèvements sanguins réguliers (jour déterminé par frottis). Les micro-volumes de sang (4 μL) seront prélevés à 4 reprises sur une durée totale de 8h par une micro-incision de la queue. Un anti-douleur sera administré sur la queue à la fin du protocole.
Impact sur les animaux
L’intervention chirurgicale est jugée douloureuse (douleur modérée) et inflammatoire. Toute intervention chirurgicale sera donc effectuée sous anesthésie générale, anti-douleur locale et avec apport d’anti-inflammatoires pour réduire toute souffrance et éviter toute inflammation post-opératoire. Les procédures chirurgicales peuvent entraîner une perte de poids de 15%. Au-delà de ce seuil,l'expérience sera interrompu. Le poids sera surveillé à J+1, J+3 et J+5 après tout prélèvement sanguin ou toute intervention chirurgicale. Bien que les rongeurs soient des espèces « dit » social, il faudra garder certains individus en cage individuelle après intervention chirurgicale pour éviter que ses congénères ouvrent la plaie et empêchent la cicatrisation. De plus, certaines analyses s’effectueront dans des cages particulières n’étant pas prévu pour l’analyse de 2 individus simultanément. Une partie des animaux sera donc placés en cages individuelles pendant toute l’expérimentation. Les cages seront enrichies au mieux (bâton à ronger). Dans une telle étude, l’animal devra être habitué à être manipulé. Pour l’habituation de la présence humaine tout sera fait de façon la plus neutre possible (même blouse, absence de parfum).
Devenir
L’euthanasie des animaux est nécessaire puisqu'elle permettra d’étudier les gènes, hormones et organes afin de comprendre le mécansime biologique d’action de la lumière sur le métabolisme et la reproduction.
Remplacement
En termes de remplacement, la régulation du métabolisme et des cycles reproducteurs impliquant plusieurs organes (notamment, cerveau, foie, pancréas, muscles, hypophyse, ovaires), l’investigation des interactions nécessite l’utilisation d’organismes entiers, et non pas d’organes ou de cellules isolées.
Réduction
En termes de Réduction, le nombre d’animaux propose est basé sur un nombre minimal qui prend en compte les moyennes des données comportementales recueillies dans des études précédentes. Ici nous privilégions l’utilisation des mêmes animaux pour les expérimentations calorimétrie, tolérance au glucose, actimétrie.
Raffinement
En termes de Raffinement, les cages seront systématiquement enrichies d’un morceau de bois à ronger. L’ajout de matériel de nidification n’est pas utile chez les Arvicanthis en stabulation car ni les mâles, ni les femelles hors reproduction ne construisent de nid avec ce matériau. Par ailleurs, bien que ce projet nécessite des procédures invasives, le maximum sera fait pour réduire la douleur et le stress des animaux tout au long de l’expérience (environnement enrichi, anesthésie et analgésie profondes, suivi du score de douleur). De plus, l’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement. Des points limites prédictifs ont été établis permettant d’interrompre les procédures et soustraire ainsi l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Le rongeur diurne Arvicanthis ansorgei a été choisi car son système circadien fonctionne d’une manière similaire à celui des Hommes, contrairement aux rongeurs classiques de laboratoire (rats et souris qui ont une activité nocturne). Le modèle Arvicanthis présente donc des atouts novateurs indéniables pour les applications biomédicales visant à étudier les effets de la pollution lumineuse sur la santé humaine. Nous avons choisi d’étudier l’effet de la pollution lumineuse sur un modèle de rongeur de sexe féminin pour trois raisons majeures : 1) le genre féminin est rarement étudié dans les investigations scientifiques à ce jour, 2) il existe des différences spécifiques liées a la reproduction féminine qui implique les rythmes biologique de 24 h dans la création des cycles reproducteurs ; 3) un nombre croissant de femmes travaille en horaires décalés alors que leurs systèmes reproducteur et métabolique sont particulièrement sensibles à la pollution lumineuse. La tranche d'âge choisi est jeunes adultes entre 3 et 6 mois pour étudier des fonctions matures dont la fonction de reproduction étudiable qu'en période mature. La tranche d'âge choisi est jeunes adultes entre 3 et 6 mois pour étudier les fonctions physiologiques matures dont la fonction de reproduction étudiable qu'en période mature et non-sénescentes.
Etude du rôle d’Arhgef18 dans la biologie endothéliale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Certaines reçoivent dès la naissance trois injections dans l'estomac ou l'abdomen en trois jours, d'autres, adultes, dix injections abdominales de tamoxifène en deux semaines. Une partie subit ensuite une prise de sang derrière l'œil et des mesures de pression artérielle par brassard sur la queue, après deux semaines d'accoutumance. Le projet doit établir le rôle d'une protéine des vaisseaux, ARHGEF18, et renvoie au long terme les retombées annoncées, de nouveaux médicaments contre l'anévrisme intracrânien. Des souriceaux sont tués à six et à quatorze jours de vie pour l'analyse de leur rétine.
Objectifs
La physiologie vasculaire est fortement influencée par la circulation sanguine qui génère des contraintes mécaniques variables sur la paroi des vaisseaux. Les artères sont principalement soumises à un fort flux sanguin générant de fortes contraintes de cisaillement sur les cellules endothéliales tapissant l’intérieur des vaisseaux. Ces contraintes participent à la production de facteurs vaso-actifs et à la quiescence des cellules endothéliales. Une modification de ces contraintes ou une perte de sensibilité des cellules endothéliales impactent la fonction de ces dernières. Aujourd’hui il est reconnu que les contraintes de cisaillements participent à certains processus développementaux et leur modification ou mauvaise perception par les cellules endothéliales contribue à de nombreuses pathologies cardiovasculaires comme l’athérosclérose ou l’anévrisme intracrânien. Mieux comprendre comment les cellules endothéliales perçoivent ces forces contribue, à terme, à l’identification de nouveaux axes de recherche pour prévenir, détecter et traiter les maladies cardiovasculaires. Grâce au travail réalisé in vitro, nous avons identifié une protéine mécano-sensible, ARHGEF18, contrôlant différentes fonctions endothéliales : l’adhésion, la prolifération et l’inflammation. Maintenant que nous avons déterminé la pertinence d’ARHGEF18 in vitro, nous souhaitons comprendre son rôle dans un système intégré plus complexe. Cela nous permettra de valider son impact sur les fonctions identifiées in vitro et d’identifier sa contribution exacte dans la physiologie vasculaire.
Bénéfices attendus
La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie sous-arachnoïdienne dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Malheureusement, il n'y a que peu de laboratoires travaillant sur la physiopathologie de l'anévrisme intracrânien. Le projet pour lequel cette saisine est déposée contribuera à répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. En identifiant le rôle d’ARHGEF18 dans la réponse aux forces mécaniques des artères cérébrales, ce projet facilitera la découverte de cibles thérapeutiques pertinentes pour prévenir la progression de la maladie, diminuer le risque de rupture et optimiser l'évaluation du risque pronostique pour prévenir les hémorragies aiguës. Les résultats obtenus pourront donc avoir un impact spécifique à long terme en ouvrant de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Une des perspectives de ce projet est le développement de nouveaux modulateurs pharmacologiques ciblant ARHGEF18 ou les voies de signalisation associées. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'anévrisme intracrânien est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Par conséquent, ces patients vivent avec un stress permanent. Faciliter le diagnostic et offrir une perspective de traitement pharmacologique à ces patients soulagera leur anxiété et leur détresse.
Procédures
Procédure 1: injection intra-gastrique ou intra-péritonéale chez le nouveau-né: 3 injections sur 3 jours. Chaque injection dure moins d'une minute par animal. Procédure 2: injection intra-péritonéale chez l'adulte: 5 injections/semaine sur 2 semaines (cad 1injection IP/jour/5j/2semaines, à raison d'une minute par injection et par souris). Procédure 3: prélèvement rétro-orbitaire chez l'adulte. Le prélèvement est réalisé une seule fois et ne dure pas plus de 5 minutes. Procédure 4: prise de pression artérielle systolique chez l'adulte (tail cuff). 2 semaines d'acclimatation + 3 mesures définitives. Chaque cycle de mesures dure en moyenne une vintaine de minutes.
Impact sur les animaux
Les procédures liées à ce projet sont réalisées en routine dans le laboratoire par du personnel qualifié. Nous n'attendons pas, à priori, de nuisances particulières. Toutefois, les risques potentiels sont: Injection de tamoxifen: les injections intrapéritoéales répétées (2x5jours) peuvent entrainer une irritation au site d'injection. C'est pourquoi une alternance Droite/Gauche est prévue, pour palier à ce problème. Prélèvement rétro-orbital: une douleur post-prélèvement peut survenir, c'est pourquoi un analgésique local à base de lidocaïne est appliqué après le prélèvement.
Devenir
Procédure 1: Lot 0: mis à mort après la fin d'entrainement Lot 1 : jusqu’à 6 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 2 : jusqu’à 14 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 3 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire) Lot 4 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Procédure 2: Lot 5 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire). Lot 6 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4 Procédure 3: Lot 4 et Lot 6 entièrement pour la procédure 4. Procédure 4: Mise à mort des Lots 4 et 6 pour prélèvement d'organes en vue d'analyse histologique.
Remplacement
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites. Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Réduction
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites.
Raffinement
Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Choix des espèces
Le modèle murin est le seul permettant la délétion inductible et tissu-spécifique de la protéine étudiée ainsi que la complexité nécessaire pour l’étude du rôle de la protéine sur le fonctionnement du système cardiovasculaire. Le but de cette saisine est d’établir le rôle d’ARHGEF18 dans le développement vasculaire et son homéostasie. Par conséquent, la recombinaison chez les animaux sera faite à deux stades : post-natal (procédure 1) ou à l’âge adulte (procédure 2). Pour la partie développementale, les animaux seront utilisés à P6 et P14. Pour la partie homéostasie vasculaire qui s’étudie à l’âge adulte, les souris seront utilisées entre 7 et 13 semaines (procédures 3 et 4).
Interactions douleur et prise excessive de sucre ou d’alcool chez la souris : analyses comportementales et moléculaires
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Opérées sous anesthésie générale pour leur provoquer une douleur neuropathique, puis suivies jusqu'à huit semaines sans traitement contre la douleur, une partie des souris a aussi accès à du sucre ou à de l'alcool, dont le projet mesure la consommation excessive. 1 008 souris vont être utilisées au total dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, isolées en cage pour mesurer ce qu'elles consomment, soumises à des prises de sang jusqu'à tous les quinze jours, et toutes tuées à l'issue. Le projet teste l'hypothèse que des prises excessives de nourriture sucrée jouent un rôle dans les douleurs décrites chez des personnes dépendantes à l'alcool. Le porteur écrit qu'il ne peut "pas utiliser de moyens pharmacologiques pour réduire la souffrance des animaux", et qualifie l'enchaînement des tests de "compatible avec le bien-être de l'animal".
Objectifs
Dans les pays développés, la consommation alimentaire semble être motivée par le plaisir plus que par le besoin de se nourrir. Ce phénomène, qui consiste à consommer un aliment pour son goût agréable (appétissant), apparaît préoccupant puisqu’il peut devenir la cause de maladies comme l’obésité. Les adaptations comportementales et cérébrales associées à ces troubles de l’alimentation pourraient partager des similitudes avec celles mises en place dans l’addiction à l'alcool. Notre programme de recherche vise à étudier la relation entre les prises excessives de nourriture appétissante et la consommation d'alcool. En particulier, l’apparition de douleur chez des patients souffrant d’addiction à l’alcool a été décrite mais n’est pas bien comprise. Nous faisons l’hypothèse que les troubles de l’alimentation pourraient jouer un rôle dans le développement de douleur, et nous étudions les mécanismes sous-jacents. Les objectifs sont donc dans un premier volet de (1) mesurer les réponsesà la douleur dans nos modèles, et d'effectuer des mesures du bien-être ; (2) caractériser les changements d’expression de gènes et de protéines dans le cerveau. Dans un deuxième volet, nous souhaitons (3) étudier les effets d’une douleur neuropathique sur la consommation de sucre ou d’alcool.
Bénéfices attendus
En identifiant les mécanismes physiologiques, notre recherche permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes centraux impliqués dans les troubles alimentaires et dans l’addiction en général, et en particulier dans le cadre de douleur neuropathique.
Procédures
-Prélèvement sanguin, au maximum tous les 15j, après le début des régimes, en PE2, PE3 et PE5; -Chirurgie, PE5, Modèle douleur neuropathique, 1 fois pour chaque animal, suivi sur 8 semaines maximum
Impact sur les animaux
Nous utilisons des modèles de consommation excessive qui nécessitent l’isolement des animaux pour une précision des mesures. Nous surveillons les animaux quotidiennement. Un modèle de douleur neuropathique sera utilisé dans le deuxième volet de l’étude, pour lequel une chirurgie est effectuée sous anesthésie générale. Dans ce modèle, les souris présentent des seuils nociceptifs abaissés, qui sont aussi des symptômes de neuropathie observés en clinique. Cependant nous ne pouvons pas utiliser de moyens pharmacologiques pour réduire la souffrance des animaux car cela risquerait d’interférer avec les mécanismes que nous étudions.
Devenir
PE1 à PE5: Les animaux sont tous mis a mort ( lots détaillés dans chaque PE)
Remplacement
Dans la mesure où nos travaux portent sur la caractérisation comportementale et moléculaire d’une consommation excessive d’aliment ou d’alcool, ou d’une douleur, il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques, soit 12 souris/groupe pour le comportement et les approches moléculaires et 18 souris/groupe pour le modèle de neuropathie. Des tests statistiques paramétriques seront effectués sur les données (ANOVA multifactorielles suivies de tests post-hoc de type Newman-Keuls lorsque les comparaisons multiples sont nécessaires). Mais si les données ne présentaient pas la normalité attendue après vérification par le test de Kolmogorov-Smirnov, nous basculerions sur des analyses non paramétriques (tests de Kruskall-Wallis, Mann-Whitney et Wilcoxon des rangs signés). L’effectif est plus important pour l’expérience de neuropathie, pour prévenir des aléas expérimentaux ainsi qu'une éventuelle variabilité et garantir les 12 animaux finaux. Les expériences seront menées sur les deux sexes. Pour l’expérience 1 de binge sucrose, nous pourrons determiner le temps minimum permettant de mesurer l’apparition d’une neuroinflammation. Nous comparons 2, 4 et 8 semaines d’exposition. Si nous pouvons réduire la durée des expériences à 4 semaines, au lieu de 8, ceci est souhaitable. De plus, dans l’expérience 2, nous faisons des mesures nociceptives, et les mesures moléculaires pourraient être impactées par cette étude comportementale. Nous préférons faire une mise au point dans les meilleures conditions (expérience 1) pour ensuite déterminer nos paramètres de travail pour la suite des études.
Raffinement
La surveillance des animaux est journalière (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture) et une pesée au minimum 2x/semaine est réalisée lors du suivi des consommations (sucre ou alcool), permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris ont toujours le choix de consommation (sucre ou alcool) avec de l’eau. Les souris, habituées au dispositif expérimental avant le début des mesures, peuvent se soustraire à la stimulation nociceptive. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale. Un suivi spécifique à chaque procédure avec des points limites adaptés sera mis en place pour éviter toute souffrance éventuelle. Les procédures regroupent plusieurs tests comportementaux dont l'enchaînement est compatible avec le bien-être de l'animal, ce qui permet de réduire l’effectif.De plus, les animaux sont isolés dans des cages enrichies et en cages ouvertes ce qui permet les contacts olfactifs entre congénères et permet aux animaux de communiquer entre eux ce qui concourt à limiter l’impact du stress d’isolement.
Choix des espèces
Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des troubles alimentaires et l’addiction. Sur un plan évolutif, les rongeurs, appartiennent au clade des mammifères le plus proche de celui des Primates. Nous choisissons de travailler avec la souris car nous pourrons ensuite étudier le rôle de gènes précis dans les adaptations observées, en utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées Souris jeunes adultes (8 semaines en début de procédure). Le jeune adulte correspond à la période de vie de vulnérabilité accrue chez l’Homme vis-à-vis des troubles alimentaires et de la dépendance aux drogues.
Mise en place d’un modèle murin de xénogreffes de lignées humaines de myélome multiple (MM) pour étudier l’impact de molécules à visée thérapeutique dans le MM.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Conditionnées par chimiothérapie à l'hydroxyurée ou au busulfan, ou par irradiation, puis greffées de cellules humaines de myélome dans le fémur ou dans une veine, 664 souris sévèrement immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. À partir de la deuxième semaine après la greffe, elles subissent une prise de sang chaque semaine et des séances d'imagerie par bioluminescence, et reçoivent par voie intraveineuse ou par gavage des inhibiteurs de la protéine PIM2 ou une thérapie par ARN. Le cancer peut provoquer perte de poids, léthargie et dos courbé, selon le porteur. Chaque souris passe jusqu'à douze mois en expérimentation, gardée en vie pour la procédure suivante ou tuée.
Objectifs
Le myélome multiple (MM) est un cancer du sang (hémopathies) parmi les plus fréquents, en deuxième position après les lymphomes. Il représente 1% de la totalité des cancers et environ 10% des hémopathies. Malgré l’apparition de nouveaux traitements, le MM reste aujourd’hui une maladie incurable avec une médiane de survie moyenne à 6 ans (Rapport InVS 2018). Des travaux ont montré que la surexpression de la proteine PIM2 dans les cellules tumorales du MM était associée à une maladie plus agressive et à une survie réduite pour les patients. Le ciblage thérapeutique de la protéine PIM2 ouvre donc de nouvelles perspectives thérapeutiques dans cette maladie. Des tests in vitro ont été réalisés au sein du laboratoire montrant l’efficacité de molécules pour inhiber la protéine PIM2 dans les cellules de MM et induire la mort des cellules. L'expérimentation animale est cependant rendue indispensable du fait de l'impossibilité de reproduire le microenvironnement tumoral in vitro et de mener ce type d'exploration directement chez l'Homme. Notre projet a pour objectif d’utiliser un modèle murin de xénogreffe de lignées de MM pour tester différentes molécules ciblant la protéine PIM2. Les traitements que nous voulons tester sont d’une part des inhibiteurs chimiques de la protéine PIM2 (utilisés seuls ou en association avec d'autres inhibiteurs) et, d’autre part, une thérapie de type ARN qui inhibe le gène PIM2. Globalement, ce projet consiste à implanter, chez des souris immunodéprimées, des cellules de lignées de myélome multiple (MM) humaines dans le but de pouvoir étudier la progression tumorale après injection de molécules à visée thérapeutique dans le MM.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’établir de nouveaux modèles murins de myélome pertinents pour reproduire la pathologie humaine et pour tester de nouvelles thérapeutiques dans le MM. La première étape permettra de déterminer les meilleures conditions d’implantation des cellules de MM chez une souris immunodéficiente avec une prise de greffe permettant un développement tumoral durable, et la deuxième étape caractérisera précisement la progression et dissémination tumorale dans les conditions définies comme optimales à l’étape 1. Enfin, grâce à ces étapes d'optimisation, nous pourrons évaluer à l’étape 3, l'impact de traitement inhibant la protéine PIM2 sur la progression tumorale. Nous testerons deux nouvelles possibilités de traitement ciblant cette protéine, soit au moyen d'association d'inhibiteurs chimiques, soit au moyen d'une thérapie ARN originale, toutes deux jamais testés à ce jour dans le MM. Ces stratégies thérapeutiques pourraient trouver leur place dans la prise en charge des patients atteints de MM.
Procédures
Pour obtenir des modèles murins fiables et robustes des myélomes humains, les souris devront recevoir un conditionnement (traitement chimique par hydroxyurée ou busulfan, ou irradiation) puis une greffe de cellules tumorales humaines dans un site reproduisant au mieux la pathologie humaine (dans la moelle par voie intra-fémorale ou à défaut, dans le sang par voie intraveineuse). Les traitements évalués seront administrés soit par voie intraveineuse soit par gavage. Enfin dans le cadre du suivi de ces animaux greffés, des prélèvements de sang hebdomadaires à partir de la 2eme semaine post-greffe seront réalisés ainsi que des analyses par imagerie bioluminescence (méthode non invasive) dès l'étape 2, au plus tôt une semaine après la greffe et au maximum une fois par semaine.
Impact sur les animaux
Le maintien de ces souris en hébergement protégé permettra de prévenir tous les risques d’infection. Egalement le développement tumoral peut engendrer un affaiblissement de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter l'apparition de signes de myélome (perte de poids, léthargie, dos courbé...).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, chaque souris sera gardé en vie afiin de subir la procédure suivante ou sera euthanasiée.
Remplacement
Le projet est basé sur des études préliminaires in vitro ayant démontrées l'efficacité de nos différentes molécules (inhibiteurs chimiques et oligonucléotide) pour induire la mort des cellules de MM (cellules de lignées de MM et cellules primaires de patients atteints de MM). Le microenvironnement tumoral ne peut être reproduit in vitro du fait de sa complexité, de nombreux acteurs impliqués dans le développement tumoral et la résistance aux traitements. Il est par ailleurs impossible de conduire ce type d’expérimentation chez l’Homme rendant indispensable le recours à des modèles murins.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Aussi, avant de mener les expérimentations à visée thérapeutique nécessitant des lots d’animaux importants (10 animaux par lots), les choix des conditions expérimentales seront étudiés en amont sur des lots réduits mais suffisants (6 animaux par lots) afin de trouver la technique la plus optimale en termes de prise de greffe : choix du type de souris (NSG, RagGC ou BRGS), du type de conditionnement (hydroxyurée, busulfan ou irradiation) et enfin du type d’injection (intra-veineuse ou intra-fémorale). Des combinaisons de conditions vont être testées successivement à l'étape 1 (en commençant par les plus relevantes au regard de notre expérience) et si une s'avère pertinente et validée, nous ne testerons pas les autres. Les tailles des groupes de souris sont choisies de façon à permettre une interprétation des données statistiquement valides, que l’expérimentation soit donc réalisée de façon productive et sans nécessiter d’avoir à refaire ces tests. Les statistiques seront réalisées à l’aide de tests non paramétriques car la normalité de la loi sur la population considérée n'est pas certaine. Pour les échantillons indépendants, le test de Mann-Whitney sera appliqué. Pour les échantillons appariés, le test de Wilcoxon sera utilisé. Pour les comparaisons de plus de 2 groupes, les tests non-paramétriques de Kruskal-Wallis (pour les échantillons indépendants) ou de Friedman (pour les échantillons appariés) seront utilisés avec le test de comparaison multiple de Dunn pour comparer chaque groupe par rapport à un groupe contrôle.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Également, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Enfin, au cours de nos expérimentations, la caractérisation précise de la propagation/dissémination des cellules de MM dans l’organisme murins au cours du temps sera fait par bioluminescence ; technique non invasive, sans aucun prélèvement, et sans sacrifice des animaux en cours d'expérimentation.
Choix des espèces
Seul un modèle à l'échelle d'un organisme vivant peut reproduire la complexité des interactions entre les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement et permet d'être au plus près de l'effet obtenu chez l'homme lors du test de nouvelles thérapeutiques. Les souris sont de bons modèles d'étude, notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilitées d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leur similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de souris sévèrement immunodéprimées pour permettre la prise tumorale. Plusieurs lignées murines sont parfaitement adaptées à ce type de greffes, notamment les RagGC (RAG2-/- IL2 gammaC-/-), les NSG (NOD SCID IL2gammaC-/-) ainsi que les BRGS (BALB/c RAG2-/- IL2gammaC-/- SIRPA.NOD) que nous testerons à l’étape 1. L’espèce avec laquelle nous obtenons la meilleure prise de greffe sera alors utilisée pour l’ensemble des expérimentations aux étapes 2 et 3. L’expérimentation sera commencée sur des animaux à partir de 6 semaines jusqu'à 5 mois de vie. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 12 mois.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire : modèle d’étude pour l’immunobiologie, les pathologies humaines et l’évaluation de traitements.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Une souris qui montre une difficulté respiratoire dans les cinq à dix minutes suivant l'injection hydrodynamique est mise à mort. 3 260 souris profondément immunodéficientes vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : une irradiation, une injection de cellules souches sanguines humaines avant l'âge de neuf jours, l'injection hydrodynamique et jusqu'à huit prises de sang pour mesurer la part de cellules humaines dans leur sang. Le porteur cite parmi les effets une grande sensibilité aux infections, des dermatites et des tumeurs après l'irradiation. Les souris produites sont fournies aux laboratoires utilisateurs de la plateforme, 75 en moyenne par utilisateur et par an, pour être réutilisées dans d'autres projets.
Objectifs
L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite utilisées par ou en collaboration avec des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements.
Bénéfices attendus
Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).
Procédures
- irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes)
Impact sur les animaux
Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.
Devenir
Les animaux issus de la procédure 1 pourront être inclus dans la procédure 2. Certaines souris issues de la procédure 1 pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet ultérieure. Les souris issues de la procédure 2 pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.
Réduction
Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).
Raffinement
La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+isolées dans des souriceaux nouveau-nés (