Oncologie

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils sont rendus obèses par un régime riche en graisses pendant vingt-huit semaines, soumis à une heure de tapis roulant cinq jours par semaine, à des tests de tolérance au glucose et au test comportemental du catwalk, puis euthanasiés par exsanguination de l'aorte. Le porteur affirme n'attendre aucun dommage majeur du régime seul et vise à prévenir les atteintes ostéo-articulaires par la vitamine D et la marche. Il affirme l'absence de méthode "in silico ou in vitro" pour reproduire ces lésions.

Objectifs

L’obésité est une affection très répandue aussi bien chez l’Homme que chez les animaux de compagnie. Cette maladie correspond à un déséquilibre entre les apports et les dépenses énergétiques de l’individu et se caractérise par un excès de masse grasse corporelle et une altération de la qualité de vie conduisant à de nombreuses complications. Des altérations ostéo-articulaires résultent de la surcharge pondérale et de l’inflammation associées à cette obésité. La prise en charge des complications ostéo-articulaires, comme l’arthrose, passe souvent par l’utilisation de médicaments visant seulement à soulager les douleurs engendrées. Très peu de composés sont destinés à limiter la propagation des lésions, à l’exception de traitements chirurgicaux lourds et coûteux. Malgré une prévalence élevée de l’obésité, aussi bien chez les animaux de compagnie que chez l’Homme, et des nombreuses complications ostéo-articulaires qui en découlent, l’association d’une intervention nutritionnelle à la vitamine D avec une activité de marche sur tapis roulant n’a jamais fait l’objet de travaux expérimentaux visant la prévention tertiaire (traitement après installation de la pathologie) des anomalies ostéo-articulaires liées à l’obésité. L’action préventive de la vitamine D et de l'activité physique sera évaluée sur un modèle de rat Wistar soumis à un régime riche en gras. La vitamine D3 (cholécalciférol) sera incorporée dans l’alimentation (15 000 UI/kg). L'activité physique sera effectuée sur tapis roulant selon un programme de 60 minutes, 5 fois par semaine. Pendant une première période de 14 semaines, les rats seront soumis au régime riche en gras seul. Pendant les 14 semaines suivantes, en plus du régime riche en gras, les rats seront traités avec la vitamine D3 et la marche sur tapis roulant. Après réception de tous les animaux sur leur lieu d'hébergement, ils subiront une période d’acclimatation de 7 jours avant le début des procédures. L’aliment et l’eau seront fournis ad libitum. Les rats seront âgés de 6-7 semaines au commencement de l’étude. Un total de 80 rats seront utilisés dans le cadre de ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin de limiter et/ou prévenir les complications ostéo-articulaires associées à l’obésité chez le rat. À terme, l'étude pourrait déboucher sur de potentielles applications chez l'Homme ou chez les animaux de compagnie tels que les chiens et les chats. Ce projet pourrait également donner l'opportunité de mieux comprendre les mécanismes qui régissent la pathogenèse de l'arthrose. De plus, il pourrait mettre en lumière de nouveaux bénéfices de l'utilisation de la vitamine D et/ou de la marche. Enfin, ces travaux pourraient permettre d'éclaircir le lien entre le microbiote et l'obésité ou les complications ostéo-articulaires et ainsi amener de nouvelles informations sur son rôle.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions. La marche sur tapis roulant pour 4 groupes sur 8 (1 heure par rat) sera effectuée 5 jours par semaine pendant les 14 dernières semaines du protocole expérimental. Le test de tolérance au glucose (1h30 par rat), le prélèvement de fèces (environ 1h par rat), le prélèvement de sang (environ 20 minutes par rat) et le catwalk (environ 30 minutes par rat) seront effectués en début, milieu et fin de protocole (0, 14, 28 semaines). Les animaux seront également soumis à des prélèvements d'organes (après 28 semaines) après leur anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) / médétomidine (150 μg/kg) puis euthanasie par exsanguination au niveau de l'aorte abdominale. Ces interventions concernent les 80 animaux sur une durée totale de 28 semaines.

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu sur les animaux du groupe avec le régime contrôle. Les animaux soumis au régime HFD vont développer une obésité avec des complications métaboliques et ostéoarticulaires qui seront l'objet de l'étude. Chez les animaux soumis uniquement au régime HFD, il y a une très bonne tolérance de ce régime sur la période (28 semaines) sans dommage majeur pour la santé de l'animal. Les traitements mis en oeuvre ont comme objectif d'atténuer les complications générées par l'obésité.

Devenir

Tous les animaux des lots étudiés sont concernés par l’euthanasie. Cette dernière est pratiquée par exsanguination au niveau de l’aorte abdominale après anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) / médétomidine (150 μg/kg). L'euthanasie est justifiée par les prélèvements d'organes qui serviront aux analyses fonctionnelles, histologiques, biochimiques et moléculaires.

Remplacement

Le remplacement des animaux n’est pas possible pour répondre aux questions du présent projet en raison de l’absence de méthodes alternatives (in silico ou in vitro) pour explorer un développement naturel des lésions ostéo-articulaires liées à l’obésité et des potentiels effets bénéfiques du traitement.

Réduction

De manière à respecter la règle de réduction, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum permettant d’anticiper les différences interindividuelles. Le nombre de 10 rats par groupe est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats reproductibles et exploitables et réaliser une analyse descriptive. Le nombre d'animaux a été calculé sur BiostaTGV en prenant l'estimation de la variation du taux de leptine avec ou sans traitement (delta de 35 pg avec écart-type de 24 pg à 5% d'erreur de première espèce et 0,93 de puissance) et donne 10 animaux par groupe expérimental.

Raffinement

- Un hébergement qui respecte les recommandations en vigueur, une animalerie contrôlée (température, hygrométrie) et un enrichissement des cages (des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). - Manipulation douce régulière des animaux pour habituation à l'expérimentateur. - Un suivi régulier des animaux par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). - Définition des points limites et une grille de scoring de la souffrance et/ou de la douleur chez tous les animaux soumis aux différents traitements prévus dans le projet. - Optimisation des protocoles expérimentaux pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.

Choix des espèces

L’obésité est une pathologie systémique caractérisée par des altérations multi-organiques et une inflammation de bas-grade qui peuvent déclencher des problèmes ostéo-articulaires comme étudié ici. La souche de rat Wistar est communément utilisée, selon la bibliographie, pour étudier les modifications métaboliques et ostéo-articulaires et répond très bien à l'utilisation d'un régime obésogène. L’utilisation de ce modèle permettra d’étudier la capacité de nos produits testés à prévenir le développement des problèmes ostéo-articulaires et son impact sur l'obésité. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6-7 semaines pendant 28 semaines. Ces animaux sont des jeunes adultes, stade optimal pour étudier l'impact de nos traitements sur les régimes apportés.

488 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales en sous-cutané ou près du tibia, puis l'injection de traceurs radioactifs pour l'imagerie, avant d'être tuées pour analyser la distribution des molécules. Le porteur reconnaît que la greffe près du tibia peut être douloureuse et gêner le déplacement une fois la tumeur développée. Il affirme qu'une étude in vitro "ne peut représenter la complexité du vivant" pour valider ces traceurs.

Objectifs

Les mutations des gènes de l’Isocitrate Déshydrogénase (mIDH) favorisent la progression tumorale. Ces mutations sont fréquemment identifiées dans des cancers comme le gliome ou le chondrosarcome (CHS), tumeurs solides infiltrantes et invasives, limitant une résection complète et provoquant souvent des récidives ainsi qu’une incapacité progressive des patients. De nouveaux inhibiteurs ciblant mIDH pourraient représenter de nouveaux espoirs de thérapie, mais leur succès repose sur une évaluation préalable de l’expression de mIDH dans ces tumeurs. Cependant, contrairement aux alternatives invasives comme la biopsie, les modalités d’imagerie non invasives pour la quantification de l’expression de mIDH n’ont été que peu étudiées pour ces tumeurs. Ce projet consiste en une approche translationnelle et multimodale de développement de méthodes d’imagerie, via des radiotraceurs marqués au fluor-18 pour l’imagerie par tomographie par émission de positons (TEP). Ces stratégies d’imagerie constitueraient un outil précieux pour une médecine de précision pour ces pathologies cancéreuses.

Bénéfices attendus

Si les résultats de biodistribution sont favorables au transfert et à évaluation clinique de radiotraceurs, la quantification de l’expression de mIDH sera évaluée par autoradiographie sur tissus de tumeurs cérébrales et de CHS issus de patients, afin de conduire pour la première fois à des données quantitatives concernant l’expression de mIDH sur des tumeurs humaines. Si ces résultats sont favorable, cette mutation et son impact métabolique seront également étudiés en clinique par spectroscopies per-opératives de résonance magnétique chez des patients atteints de gliome ou de CHS afin d’évaluer leur intérêt pour estimer plus précisément l’étendue de la résection à réaliser, paramètre impactant fortement le taux de survie. A plus long terme, Ces stratégies d’imagerie constitueraient un outil précieux pour une médecine de précision pour ces pathologies cancéreuses.

Procédures

L’ensemble des animaux recevra une injection sous cutanée ou paratibiale sous anesthésie gazeuse (durée 5min). Pour les animaux des lots 2 à 4, ils recevront également une injection intraveineuse (moins de 1min) en vigile entre 15 jours et 6 semaines après l’injection sous cutanée ou paratibiale.

Impact sur les animaux

L’injection des cellules en paratibiale pourrait entrainer une douleur poste injection (douleur anticiper par l’administration préventive d’antalgique (Rimadyl, 20mg/kg ou Méloxicam 5 mg/kg) en pré et post implantation. Une gêne au déplacement pourra aussi être observé une fois la tumeur ayant atteint un certain stade de développement.

Devenir

Procédure 1 et 2 : Mise à mort Lot 1 pour l’analyse protéique, génomique et histologique des tumeurs Procédure 3 : Mise à mort Lot 2 détermination de la distribution des radiotraceur dans les organes des animaux à différent temps Mise à mort Lot 3 analyses de spécificité de fixation par prélèvement Mise à mort du lot 4 analyses des métabolites sang et urine et tumeur

Remplacement

Suite aux études in vitro, le développement et la validation préclinique de nouveaux radiotraceurs requièrent la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Ce nombre a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. De plus, l’étude pilote (étude 1) et les examens d’imagerie (étude 3) permettent également de réduire le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux est de 488 souris maximum sur une période de 5 ans.

Raffinement

Les modèles animaux choisis sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Des méthodes sont utilisées afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale – minimum 3 animaux/cage-, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques (Rimadyl, 5mg/kg en sous-cutanée, 1 fois par jours pendant 5 jours maximum) avant l'atteinte des points limites définis (perte de poids supérieure à 20%, du poids maximal observé, prostration, hérissement du poil, volume tumoral, aspect du point d’injection…). Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié. De plus, l’étude pilote ainsi que l’étude impliquant des examens d’imagerie permettent de raffiner cette étude en termes de caractérisation du modèle et d’examen non invasif.

Choix des espèces

Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. De plus, les souris immunodéficientes porteuses de greffe de lignée tumorale humaine (xénogreffe) sont adaptés pour les études fondamentales et appliquées de développement de traitements des cancers humains. Des animaux de 5 à 7 semaines sont classiquement utilisés pour ce type de modèle.

4 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent gavages, injections répétées, greffes de moelle osseuse et prélèvements de sang et de fèces, une partie recevant du busulfan qui supprime l'immunité et peut provoquer des hémorragies sévères. Le porteur mène une recherche fondamentale sur des bactéries intestinales et écrit ne prévoir "aucune perte" et juger "négligeable" l'effet de l'hébergement en cage. Il conclut à la nécessité de la souris pour reproduire ces interactions entre hôte et bactéries.

Objectifs

Les bactéries filamentaires segmentées sont des bactéries naturellement présentes dans la flore intestinale de nombreuses espèces dont l’Homme. Ces bactéries sont attachées à la paroi intestinale de manière spécifique à l’espèce hôte. Ces bactéries peuvent entrainer une réponse immunitaire au niveau de l’intestin de leur hôte. Chez la souris, la colonisation par les bactéries filamentaires segmentées protège l’hôte de certaines bactéries infectieuses. Cette colonisation peut également accentuer la gravité de certaines maladies ayant pour cause un dysfonctionnement du système immunitaire de l’hôte. Pour ces raisons les bactéries filamentaires segmentées sont des bactéries clés à la fois dans l’évolution de la santé et de la maladie. Cependant de nombreux impacts de la colonisation d’un hôte par les bactéries filamentaires segmentées restent à définir. Au cours de notre projet nous tenterons de définir les impacts de la colonisation par les bactéries filamentaires segmentées sur l’activation de la réponse immunitaire. Nous étudierons également les mécanismes de détection des bactéries filamentaires segmentées par le système immunitaire de l’hôte. Nous évaluerons ensuite l’impact de la colonisation de l’hôte par les bactéries filamentaires segmentées sur l’évolution de la flore intestinale, mais également lors d’infection par des entéropathogènes.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est une meilleure compréhension des premiers évènements survenant pendant la colonisation des bactéries filamentaires segmentées chez l’hôte. De plus, nous comprendrons mieux comment la colonisation par les bactéries filamentaires segmentées a un impact sur l’évolution de la flore intestinales et la résistance aux infections bactériennes intestinales. Ces connaissances fondamentales constitueront la base d’une application des bactéries filamentaires segmentées dans l’amélioration de la santé intestinale dans le futur.

Procédures

Au cours de notre projet les animaux subiront différentes interventions en fonctions des procédures expérimentales. En ce qui concerne la colonisation et l’inoculation de bactéries, un gavage ponctuel sera réalisé sur 3456 animaux éveillés, 2 gavages ponctuels et distant de 21 jours seront réalisés sur 864 animaux éveillés. En ce qui concerne les traitements par injection, sur une période de 6 jours, 2 injections ponctuelles distantes de 5 jours seront réalisées sur 96 animaux éveillés. Sur une période de 7 jours, 3 injections ponctuelles distantes de 3 jours seront réalisées sur 96 animaux éveillés. Sur une période de 8 jours, 1 injection ponctuelle par jour sera réalisé sur 288 animaux éveillés. Sur une période de 5 jours, 1 injection ponctuelle par jours sera réalisé sur 1728 animaux éveillés. En ce qui concerne la greffe de moelle osseuse, 1 injection ponctuelle sera réalisée sur 1728 animaux sous anesthésie générale. En ce qui concerne le traitement administré par l’eau de boisson, sur une période de 4 jours, une administration en continue sera réalisée sur 24 animaux éveillés. Sur une période de 8 jours, une administration en continue sera réalisée sur 24 animaux éveillés. Sur une période de 22 jours, une administration en continue sera réalisée sur 24 animaux éveillés. En ce qui concerne le prélèvement de fèces, sur une période de 5 jours, 1 prélèvement sera réalisé tous les jours sur 1728 animaux éveillés. Sur une période de 22 jours, 1 prélèvement sera réalisé tous les 2 jours sur 864 animaux éveillés. En ce qui concerne le prélèvement de sang, 2 prélèvements sanguin distant de 60 jours seront réalisés par ponction sur 1728 animaux éveillés.

Impact sur les animaux

Durant notre projet certaines procédures entraineront des nuisances et effets secondaires sur les animaux. La procédure de gavage bien que non douloureuse pour l’animal entrainera une nuisance uniquement lors de la manipulation de l’animal. L’inoculation de bactérie aura pour effets indésirables des troubles gastriques sans gravités dus au changement de la flore intestinale. L’injection entrainera une nuisance uniquement lors de la manipulation. Toutes les substances injectées ou administrées à l’animal à l’exception du busulfan n’auront pas d’effets indésirables sur les animaux. Le traitement au busulfan aura comme effets indésirables attendus une suppression des cellules responsables de l’immunité. Nous pourrons observer également comme effets secondaires, des troubles de la nutrition, diarrhée, inflammation au niveau du site d’injection, ainsi que de manière exceptionnelle des hémorragies sévères dues à une diminution du nombre de plaquettes. En ce qui concerne les prélèvements effectués chez l’animal, seul le prélèvement sanguin entrainera une nuisance après le prélèvement. Cette nuisance se caractérisera par une fatigue transitoire après le prélèvement.

Devenir

A la fin de chaque procédure expérimentale la totalité des animaux sera mise à mort par dislocation cervicale ou inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Nous justifions cela par la nécessité à la fin de chaque procédure de procéder au prélèvement d’organe tel que la rate, le foie, le ccum, le colon ainsi que les ganglions lymphatiques. Ces organes sont des organes vitaux ce qui exclut pour des raisons éthiques leur prélèvement sur animaux éveillés. Les animaux qui ne seront pas prélevés en raison de leur exclusion d’un lot expérimentale afin de ne pas compromettre les résultats d’une expérience seront également mis à mort par dislocation cervical ou inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Nous justifions cela par l’impossibilité de réutiliser, replacer ou adopter ces animaux à la fin de nos procédures expérimentales.

Remplacement

La culture en laboratoire des bactéries filamentaires segmentées reste très difficile et limitée dans le temps. Ceci limite l'utilisation de système artificiel. Les systèmes artificiels seuls ne nous permettrons pas d'atteindre les différents objectifs de recherche décris dans ce projet. Afin de caractériser en détail les interactions complexes entre bactéries filamentaires segmentées et son hôte, nous devons avoir recours à un modèle animal pouvant reproduire ces types d'interactions en laboratoire et ce dans différentes conditions avec des paramètres contrôlés. La souris est la solution que nous avons retenue pour atteindre nos objectifs. La grande variété de modèle disponible pour cet animal et ça similarité anatomique et physiologique avec l'humain en font un modèle adapté pour atteindre les objectifs de notre projet.

Réduction

Dans un principe de réduction nous avons conçu nos expérimentations en réduisant au minimum le nombre de procédure expérimentale. Ainsi chaque procédure expérimentale nous permettra d’atteindre spécifiquement un des objectifs précédemment décrits. Nous nous sommes assurés d’exclure toute répétition et de garantir l’obtention de résultats originaux. Pour l’ensemble de nos procédures et afin d’obtenir des résultats significatifs nous avons fixé un niveau de risque suffisamment faible et une puissance élevée afin d’obtenir avec un minimum d’animaux des résultats expérimentaux incontestables. Les animaux seront hébergés en groupe de 5. Nous ne prenons pas en compte l’effet lié à l’hébergement en cage que nous jugeons négligeable durant nos expériences. Lors de la réalisation de nos expérimentations nous ne prévoyons aucune perte. Nous décidons d’utiliser 12 animaux par groupe. Ce nombre nous permettra d’obtenir lors de nos analyses statistiques des résultats significatifs. Nous utiliserons lors de nos procédures expérimentales des animaux ayant des caractéristiques similaires nous permettant de diminuer la variabilité entre individu et indépendante de nos protocoles expérimentaux.

Raffinement

Dans un principe de raffinement, et afin de limiter l’impact de la vie en captivité, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies avec des cylindres de coton, des bâtons à ronger et un tunnel. Les animaux seront hébergés en groupe. Le nombre d’animaux par cage ne pourra être supérieur à 5. En conditions d’hébergement sans microorganisme les animaux seront hébergés dans les mêmes conditions. Nous avons également favorisé aux maximum les procédures non invasives, et limité à l’essentiel les procédures invasives. Les procédures invasives décrites ci-dessous seront réalisées par un personnel correctement formé et limité au maximum dans le temps. Afin de diminuer les désagréments et les douleurs lors de certaines expérimentations les animaux seront anesthésiés. Toutes les expérimentations incluant un traitement avec une substance chimique pouvant potentiellement induire des effets secondaires, ont été conçues afin de réduire au maximum la posologie du traitement tout en garantissant l’induction des effets souhaités chez l’animal. Des points limites généraux et spécifiques à chaque procédure, suffisamment prédictifs ont été mis en place. Si aucun moyen efficace n’est disponible afin de supprimer la souffrance, la douleur et l’angoisse de l’animal sans compromettre les résultats de nos expériences, l’animal sera mis à mort. Le bien-être animal sera une priorité lors de notre projet de recherche et ce dernier sera régulièrement évalué et optimisé au cours de notre projet.

Choix des espèces

Nous avons choisi d'utiliser cette espèce car elle présente de nombreux avantages pour notre projet d'étude. Cette espèce peut nous fournir un grand nombre de modèle génétique et d'individu dépourvus de flore bactérienne nécessaires pour notre projet. Cette espèce possède également une grande similarité anatomique de son système digestif avec l'Homme. Il en est de même du point de vu immunitaire. Cette espèce est également facile à manipuler en laboratoire ce qui participera de limiter les risques liés aux manipulations expérimentales. L’hébergement séparé des mâles et des femelles est également possible. Des souris mâles et femelles de chaque espèce, âgées de 8 à 12 semaines, seront utilisées. Pour cette étude nous avons choisi de travailler avec des souris adultes dont le système immunitaire et la flore intestinale sont pleinement développés. De plus, les procédures de manipulation telles que le gavage et l'injection sont plus faciles à réaliser chez les souris adultes, ce qui minimise les douleurs inutiles dues aux manipulations.

Toutes tuées à la fin de chaque procédure, 3 350 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour évaluer des candidats vaccins et des virus de la rougeole modifiés contre le cancer. Une partie est infectée par des virus humains ou par le parasite du paludisme des rongeurs Plasmodium berghei, une infection qui peut entraîner selon le porteur fièvre, prostration, perte de poids et paralysie, avec une mise à mort dès le score 2 de sa grille de douleur. D'autres reçoivent une greffe de cellules tumorales, avec des tumeurs qui peuvent s'infecter ou s'ulcérer, et des injections de vaccins une à deux fois par semaine pendant dix semaines au plus. Pour la virothérapie des cancers, le porteur invoque un "besoin médical" et un "marché" qu'il dit "également immenses".

Objectifs

L’objectif du projet est l’évaluation préclinique chez la souris de l’immunogénicité et de l’efficacité des différents candidats vaccins développés au laboratoire. Les capacités anticancéreuses de virus de la rougeole modifiés seront aussi évaluées dans des modèles de greffes de tumeurs syngéniques. Ces objectifs sont justifiés du point de vue scientifique car ils permettent de démontrer la fonctionnalité des candidats vaccins ou thérapeutiques. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves, ainsi qu’un possible traitement contre certains cancers, deux domaines d’impact majeur en santé publique.

Bénéfices attendus

Les candidats vaccins développés dans le laboratoire sont destinés à être évalués par la suite dans des essais cliniques. Leur évaluation préalable dans un modèle murin permet de démontrer leur efficacité et leur sûreté préclinique et de définir les doses et schémas vaccinaux. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves pour lesquelles le besoin médical est immense, ainsi qu’un traitement viro-thérapeutique contre certains cancers pour lesquels le besoin médical et le marché sont également immenses.

Procédures

Les animaux sont immunisés par voie intrapéritonéale, intramusculaire, intradermique, intraveineuse ou orale selon l'agent pathogène ciblé (quelques secondes par animal). Les prélèvements sanguins à la veine rétro-mandibulaire sont effectués à J0 - J7 - J28 - J60 après la vaccination (quelques secondes par animal). Pour évaluer l'efficacité des vaccins, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses (quelques secondes par animal) par des virus humains pathogènes ou non-pathogènes chez les souris contrôles ou par le parasite du paludisme Plasmodium berghei, pathogène. Le suivi du challenge est effectué sur une goutte de sang récupérée à la queue de chaque animal à J1, J2, J3, J5, J7, J10 (quelques secondes par animal). Pour évaluer les propriétés immuno-oncolytiques des vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales (quelques minutes par animal). Le traitement des tumeurs est effectué par des injections intratumorales, intrapéritonéales, intramusculaires, intradermiques ou intraveineuses de vaccins recombinants contre la rougeole (quelques secondes par animal). Les vaccins candidats sont inoculés (quelques secondes par animal) une ou deux fois par semaine pendant un maximum de 10 semaines.

Impact sur les animaux

Pour évaluer l'efficacité des vaccins recombinants, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses par des virus humains pathogènes ou non chez les souris contrôles, ainsi que par le parasite du paludisme murin Plasmodium berghei, également pathogène. Selon l'agent testé, l'infection peut entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précédera la mort de l'animal. Pour évaluer les propriétés anticancéreuses des candidats vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales syngéniques qui peuvent entrainer des effets indésirables. En effet, la croissance des tumeurs chez la souris peut provoquer une gêne ou affecter le comportement ou la locomotion. La tumeur peut s'infecter ou s'ulcérer.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Il n'existe pas d'alternatives non-animales dans le domaine de la recherche préclinique sur les vaccins recombinants. En absence de telles alternatives, l'utilisation d'animaux vivants dans les procédures expérimentales est prévue pour atteindre les objectifs du projet. L'étude des réponses immunitaires des candidats vaccins nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier avec un système immunitaire développé. Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris IFNAR ou hCD46/IFNAR permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins.

Réduction

Pour appliquer le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous composons les groupes d’animaux « contrôles » de 4 souris et les groupes « test » de 6 souris. Ainsi deux souris sont épargnées à chaque test. Par la suite nous pourrons diminuer le nombre d’animaux à 4 dans les groupes « contrôle négatif » car, d’une expérience à l’autre, ces animaux contrôles reçoivent systématiquement le vaccin rougeole standard Schwarz et que la réponse des souris à l’immunisation est relativement homogène d’un animal à l’autre. Les groupes « test » sont composés de 6 souris, le nombre minimal d’animaux pour que les résultats soient statistiquement significatifs, comme validés par un bioinformaticien en interne. Le nombre de souris utilisées par groupe représente la moitié des normes utilisées dans l’industrie du vaccin. Nous pouvons appliquer cette réduction car nous observons des effets forts : réponses immunitaires présentes ou absentes ; protection d’épreuves infectieuses efficace ou non. Ces observations sont basées sur notre longue expérience (67 publications dans ce domaine).

Raffinement

Les animaux soumis à des procédures qui produisent une douleur ou une détresse minimale/transitoire seront suivis par une observation quotidienne. Lorsque les animaux subiront des épreuves infectieuses, ils seront également contrôlés quotidiennement. En effet, selon le pathogène utilisé, l’infection pourra entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précèdera la mort de l’animal. La mort des animaux comme point limite est strictement évitée. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une grille évaluation douleur stress inconfort sera utilisée pour noter la douleur et la détresse qui peuvent survenir chez les animaux exposés à des agents pathogènes connus pour provoquer des effets graves. Nous suivrons : 1) L'apparence générale (poil luisant/terne, hérissé, état d'embonpoint, perte de poids, rétrécissement des orbites oculaires, renflement du nez, changement de position des vibrisses. 2) Signes cliniques : respiration, posture, activité, fèces, pli cutané. 3) Comportement : comportement normal/agitation, mobilité, mâchonnement des barres, déplacement en cercle, saut arrière. Pour éviter au maximum la douleur et la détresse nous suivrons les recommandations suivantes : mise à mort en cas de score 2 et observation quotidienne si score >0. Un aliment enrichi sera ajouté et l'enrichissement de l’environnement sera amélioré dès le début des procédures des épreuves infectieuses.

Choix des espèces

Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins. Nous utilisons ces souris depuis de nombreuses années et avons publié un grand nombre d’articles décrivant leurs propriétés et leurs qualités dans ce contexte. Pour étudier les propriétés immuno-oncolytiques du virus de la rougeole, des modèles de greffe de tumeurs sont utilisés. Age moyen des animaux : 11 semaines +/- 4 semaines. Les animaux doivent être matures au plan immunologique. Par ailleurs les jeunes individus répondent mieux que les plus vieux. Enfin, il est inutile de laisser vieillir les animaux avant utilisation.

3 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une insuffisance rénale aiguë leur est provoquée par ischémie-reperfusion ou par injection d'agents néphrotoxiques, avec un taux de mortalité de 20 à 30 % lié à cette induction, puis des traitements sont testés pour bloquer la fibrose du rein. Le porteur affirme que cette pathologie complexe est "impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés". Il indique retenir la souris comme celle "la moins susceptible de ressentir de la douleur", formulation générique accompagnant le choix de l'espèce.

Objectifs

Etudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’insuffisance rénale aiguë (IRA) induite par des agents néphro-toxiques et sa progression vers l’insuffisance rénale chronique.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques mis en jeu lors d'une agression rénale aigue et recheche d'acteurs potentiels dans la mise en place de fibrose rénale.

Procédures

L'IRA sera induite par ischémie-reperfusion ou injection d'agents néphrotoxiques (glycérol ou PHZ). Après caractérisation des modèles, les souris seront exposées à des traitements pharmacologiques ou moléculaires susceptibles de bloquer la fibrose rénale. Avant leur sacrifice, les animaux seront soumis à des investigations in vivo pour évaluer la fonction rénale (diurèse, débit de filtration glomérulaire). Des prélèvements de quelques gouttes de sang au niveau de l'artère caudale (volume inférieur à 50µl) pourront être effectués à H6 (Rhabdomyolyse) et J2 après l'induction d'IRA pour évaluer la fonction rénale.

Impact sur les animaux

Procédure #1: stress transitoire lié à la chirurgie, apparition progressive d'une insuffisance rénale Procédure #2: stress transitoire lié à l'injection du glycerol, apparition progressive d'une insuffisance rénale Procédure #3: apparition progressive d'une insuffisance rénale Procédure #4: léger stress transitoire lié à l'irradiation Procédure #5: léger stress transitoire lié à l'installation des capateurs Procédure #6: léger stress transitoire lié aux cages métaboliques

Devenir

Procédures #1, #2 et #3 : gardés en vie en vue de leur utilisation dans les procédures 5 à 7. Procédure #4 : gardés en vie en vue de leur utilisation dans les procédures 1 à 3 puis 5 à 7.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est justifié par le fait qu’une insuffisance rénale aiguë est une pathologie complexe, impliquant différents compartiments cellulaires (épithélium, vaisseaux, cellules immunitaires…), impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés. (ex : cultures cellulaires).

Réduction

Les effectifs des cohortes sont réduits au maximum dans la limite de l’outil statistique. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons sont extraits de l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de matériel biologique.

Raffinement

Tous les animaux sont hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère dans un environnement enrichi (ajout de papier essuie tout pour la nidification). Pendant toute la durée de nos études, les animaux sont suivis quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance. Compte tenu du risque de mortalité (environ 20-30%) lié à l'induction d'IRA (ischémie reperfusion ou l'injection d'agents nephrotoxiques (glycerol ou PHZ)), 5-6 animaux par groupe avec 3 à 4 protocoles seront suffisants. Les comparaisons entre groupes traités et non traités seront réalisées en utilisant un test de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d'utiliser le moins d'animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. adultes de 8-20 semaines