Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
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- Système respiratoire
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Etude du microbiote et du métabolome chez le poulet de chair co-infecté par Campylobacter et Salmonella
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
205 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont infectés par voie orale avec les bactéries Campylobacter et Salmonella, seules ou combinées, pour étudier leur effet sur le microbiote intestinal. Le porteur affirme que ces bactéries sont asymptomatiques chez le poulet et qu'aucun effet indésirable n'est attendu. Tous les animaux sont pourtant tués, par dislocation cervicale pour les poussins et par électronarcose puis saignée pour les plus âgés, afin de prélever leurs organes.
Objectifs
Campylobacter et Salmonella sont responsables des deux zoonoses bactériennes d’origine alimentaire majoritaires en Europe, avec respectivement, 220 682 et 87 923 cas humains en 2019 et la viande de volaille est identifiée comme principale source de contamination. Par ailleurs, au cours d’un précédent travail mené par le laboratoire, il a été montré in vitro que la présence de Salmonella permettait d'améliorer la survie de Campylobacter en condition aérobie. A notre connaissance, l'impact de la présence simultanée des deux bactéries n'a jamais été évalué chez le poulet de chair. Par ailleurs, si le microbiote gastro-intestinal est modifié lors de la contamination des poulets par l’une de ces deux bactéries, aucune étude n’a décrit sa modulation au cours d’une co-infection Salmonella / Campylobacter. Plusieurs études ont aussi démontré des modifications au niveau de l’ensemble des métabolites (petites molécules) présents dans le sérum de l’hôte à la suite d’une infection intestinale, en partie causées par l’altération du microbiote, mais aucune donnée n'est disponible pour le poulet de chair lors d'une infection ou co-infection par ces bactéries. Les objectifs de ce projet sont donc : (1) d'étudier si une interaction peut exister entre ces deux bactéries dans le tube digestif des poulets, et impacter les niveaux de colonisation de chacune d'elles ; (2) d'étudier l'effet d'une co-infection sur la composition et la structure du microbiote intestinal ; (3) explorer les modifications d’expression l’ensemble des métabolites présents dans le sérum de l’hôte en réponse à ces bactéries seules ou en co-infection.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra de générer des données sur le comportement de Campylobacter et Salmonella en co-infection et leur impact sur le microbiote intestinal et l’ensemble des métabolites présent dans le serum du poulet de chair. Ces données n’ont jusqu’alors jamais été décrites, mais sont nécéssaires pour l’acquisition de connaissance sur leur comportement dans un système complexe prenant en compte leur niche écologique, afin d’adapter ou donner lieu au développement de nouveaux moyens de lutte. Plus précisément, les données nouvelles porteront sur : - le comportement de Salmonella et Campylobacter en co-infection chez le poulet de chair, et leur potentielle interaction. - la modulation du microbiote intestinal ainsi que les modifications de l’ensemble des métabolites sériques induites par une co-infection de Salmonella et Campylobacter chez le poulet de chair. - l’analyse conjointe des données hétérogènes issues de l’analyse du microbiote intestinal et des métabolites présents dans le sérum dans ce contexte de co-infection. -l'identification de potentiels biomarqueurs spécifiques aux infections par Salmonella et Campylobacter mais aussi à leur co-infection chez le poulet de chair
Procédures
Inoculation (per os) de Campylobacter jejuni contenu dans 100 µl de trypsone-sel pour le lot 1 à J1 Inoculation (per os) de Salmonella thyphimurium contenu dans 100 µl de trypsone-sel pour le lot 2 à J1 Inoculation (per os) de Salmonella typhimurium et Campylobacter jejuni contenus dans 100 µl de trypsone-sel pour le lot 3 à J1 Administration per os 100 µl de tryptone-sel pour le lot 4 à J1
Impact sur les animaux
Chez le poulet, Campylobacter jejuni est considérée comme une bactérie commensale, et est à ce titre asymptomatique. Il en est de même pour la souche de Salmonella typhimurium selectionnée. Par ailleurs, ces deux souches ont déjà fait l’objet de plusieurs essais in vivo au sein de notre laboratoire et aucun effet indésirable n’a jusqu’alors été observé. Afin de limiter les gestes invasifs et le stress chez les animaux, nous limiterons la manipulation d’animaux vigiles en réalisant les prélèvements de sang lors d’une saignée à la veine jugulaire après mise à mort. Il n’est donc attendu aucun effet indésirable tout au long de l’essai.
Devenir
Les prélèvements d’organes nécessitent la mise à mort des animaux. C’est pourquoi tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, par dislocation cervicale les jeunes poussins (poids < 250 g) et pour les poussins plus âgés et les poulets adultes après une anesthésie par électronarcose suivie d’une saignée à la veine jugulaire.
Remplacement
La volaille et notamment le poulet de chair représente la source majeure de campylobactériose et de salmonellose pour l’homme. Afin de lutter au mieux contre ces zoonoses, il est indispensable de mieux comprendre leur interaction avec les bactéries du microbiote intestinal et leur conséquence sur l’ensemble des métabolites (petites molécules dosées dans le sang) produits par l’hôte. Dans ce contexte, et en l’absence de lignée cellulaire ou d’organoïdes pouvant mimer l’intéraction des bactéries de la flore commensale aviaire avec Campylobacter et Salmonella, et leur impact sur l’ensemble des métabolites produits par l’hôte, l’utilisation de test in vitro ou in silico n’est pas possible. C’est pourquoi il est nécessaire de travailler sur un modèle intégré que seule le modèle in vivo permet. Afin de se rapprocher au maximum des conditions du terrain il convient de réaliser cette étude sur le poulet de chair qui est le premier réservoir de Salmonella et Campylobacter. Le poulet de chair est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure.
Réduction
Les animaux seront utilisés au seuil de la pertinence scientifique et statistique. En raison de la variabilité interindividuelle importante du microbiote intestinale, et afin d’évaluer au mieux l’évolution de ce microbiote caecal au cours du temps, il a été déterminé qu’un minimum de 10 animaux par groupe était nécessaire pour chaque temps donné. Des tests de comparaison de moyennes seront effectués pour analyser les résultats des différents lots à chaque date de prélèvement. Des tests paramétriques (Student ou Anova) seront utilisés lorsque les critères de normalité et d’homogénéité des variances seront réunis. Sinon des tests non paramétriques (Kolgomorov-Smirnov ou Kruskall Wallis) seront utilisés.
Raffinement
Dans nos expériences précédentes, d’inoculation avec ces souches de Campylobacter jejuni et Salmonella Typhimurium utilisées, aucun symptôme ou effet indésirable n’a été détecté chez les animaux étudiés. Le protocole a été établi pour limiter au maximum le nombre de manipulation vigile. Ainsi l’inoculation des bactéries à la pipette par voie orale et les pesées seront réalisées par le personnel expérimenté qui apportera la même attention à chaque inoculation de sorte à éviter/limiter les inconforts au moment de l’administration. Afin de limiter les gestes invasifs et le stress chez les animaux, les prélèvements de sang auront lieu lors de la saignée à la veine jugulaire après mise à mort des animaux et non sur animaux vivants. Aucun effet indésirable n’est donc attendu au cours de cet essai. Néanmoins, les animaux seront observés quotidiennement. Si toutefois, une altération de l’état de santé était observée quelle que soit la raison, les animaux concernés seront mis à mort en cas d’atteinte des points limites suivants : blessure grave, prostration, absence de réaction après sollicitation (absence de réponse à des stimuli tactiles et visuels), anorexie ou impossibilité de s’abreuver ou de s’alimenter. Le raffinement des conditions d’hébergement visera à assurer des conditions d’hébergement limitant l’inconfort potentiel des animaux. Quatre animaleries de type A2 seront utilisées en dépression (légère ou moyenne). Chaque lot de poulets sera installé dans des parcs au sol de 4 m² entourés par des panneaux grillagés en inox de 1 m de haut. La litière sera composée de copeaux de bois (qui sert d’enrichissement du milieu puisque les animaux grattent et picorent cette litière). Les paramètres d’ambiance utilisés sont préconisés pour les élevages de poulets de chair. Les installations sont équipées de lumières électriques programmables, d'un chauffage électrique automatisé et d'une ventilation. Les animaux recevront à volonté, de l’eau et de l’aliment réservé aux poulets de chair spécifiques à leur âge. Afin de stimuler les poussins à s’alimenter dans leurs premières heures de vie, des alvéoles en carton de plateaux d’oeufs seront disposés sur les copeaux de bois avec de l’aliment et des cartons seront apposés sous les mangeoires. Les alvéoles en cartons servent également d’éléments de grattage et de picotage. L’évolution pondérale sera obtenue par des pesées individuelles à l'installation des animaux dans les animaleries, et au moment des mises à mort.
Choix des espèces
La volaille et notamment le poulet de chair représente la source majeure de campylobactériose et de salmonellose pour l’homme. Afin de lutter au mieux contre ces zoonoses, il est indispensable de mieux comprendre leur interaction avec le microbiote intestinal et leur conséquence sur les métabolites sériques produits par l’hôte. Afin de se rapprocher au maximum des conditions du terrain il convient de réaliser cette étude sur le poulet de chair qui est le premier réservoir de Salmonella et Campylobacter. Des poussins de 1 jour seront utilisés et élevés jusqu’à 35 jours (âge d’abattage des poulets de chair pour la consommation). Le but est de suivre la modulation du microbiote et l’influence sur le métabolome à la suite d’une infection à J1 par Campylobacter, par Salmonella ou d’un coinfection Campylobacter + Salmonella
Création d’un modèle tumoral orthotopique pancréatique chez des souris CD169-DTR
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
255 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une laparotomie pour accéder au pancréas et y créer une tumeur, ainsi que trois injections intrapéritonéales, pour étudier le stroma de l'adénocarcinome pancréatique. Le porteur indique des risques d'infection, d'hypothermie liée à la durée de la chirurgie et d'effets digestifs de la tumeur. Toutes les souris sont tuées pour prélever des organes vitaux.
Objectifs
L’adénocarcinome pancréatique (ADK) qui a un taux de survie global de 2-9%, est actuellement la quatrième cause principale de décès liés au cancer dans le monde industrialisé et d’ici 2030, il sera considéré comme le deuxième cancer le plus mortel au monde. Ce cancer est très difficilement pris en charge et son diagnostic souvent tardif ne laisse que peu d’opportunités de traitements thérapeutiques. La plupart des approches thérapeutiques jusqu’à présent se sont intéressées à cibler directement les cellules tumorales et ont jusqu’à récemment, ignoré les réactions stromales adjacentes qui sont une des caractéristiques importantes des cancers pancréatiques humains. Depuis quelques années, le dépôt de ce stroma massif a émergé en tant qu'acteur nouveau et contributeur dans l'initiation et la progression pancréatique de la tumeur. Il a été mis en évidence la présence d’une sous-population cellulaire souche péricytaire dans le stroma du pancréas de souris atteintes d’ADK. Ces cellules ont été isolées et mises à proliférer en culture pour établir une lignée permettant son étude. Par ailleurs, il a été montré une augmentation significative de macrophages spécifique dans différents modèles de cancer pancréatique. Cette population a été décrite comme pro-tumoral dans le cancer du sein et du poumon. Nous pensons que ces macrophages spécifique jouent un rôle important dans la mise en place de l’immunosuppression présente dès le début du cancer pancréatique en étant recrutés et programmés par les cellules entourant le cancer, notamment les cellules stromal. Nos objectifs seront 1) de dépléter ces macrophages spécifiques via l’utilisation de souris génétiquement modifiées 2) D’étudier cette déplétion au niveau de la masse tumorale mais aussi de l’infiltrat immunitaire.
Bénéfices attendus
On estime à environ 10.000 le nombre de nouveaux cas de cancer du pancréas en France. L'incidence dans le monde, varie entre 1 et 10 cas pour 100 000 personnes et reste globalement stable dans le temps mais en croissance dans les pays développés. D’ici 2030, il sera considéré comme le deuxième cancer le plus mortel au monde. Le cancer du pancréas est difficile à diagnostiquer et particulièrement compliqué à traiter. Il résiste en effet à plusieurs traitements antitumoraux (Thérapie ciblée, immunothérapie, chimiothérapie). L’accès des traitements antitumoraux au sein de la tumeur est empêché par la nature du microenvironnement qui soutient les cellules cancéreuses mutées. Ce microenvironement est modifié par les macrophages. Ces derniers représentent près de 40% des cellules immunitaires infiltrées, comprendre le rôle d’une population potentiellement immunosuppressive de macrophages permettrait de développer de futur traitement contre le cancer du pancréas.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéale ainsi qu’une procédure chirurgicale de laparotomie permettant d’accéder au pancréas. Chaque souris sera soumise à 3 injections intra-péritonéale 1 avant la chirurgie, 2 après la chirurgie, chacune dure environ 1 minute. Chaque souris sera soumise à une laparotomie permettant d’accéder au pancréas. La durée estimée est entre 15 et 20 minutes.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables dues à l’injection intra-péritonéale peuvent être ressentis. Les autres principaux risques sont l’infection due à la chirurgie ainsi que l’hypothermie due à la durée de l’acte chirurgicale. Également, la tumeur peut avoir des effets sur la souris, notamment sur son système digestif.
Devenir
L’ensemble des animaux étant soumis aux procédures seront mis à mort car notre projet nécessite le prélèvement d’organes vitaux pour analyse.
Remplacement
Des études in vitro ont préalablement été effectué afin de déterminer le rôle des cellules stromal dans la différenciation des macrophages spécifique ainsi que le rôle de ces macrophages spécifique. Ainsi, l'utilisation d'un modèle murin afin de vérifier si ces observations ont lieu dans un environnement complexes ne peut être remplacé.
Réduction
Le nombre de souris sera réduit à minima pour permettre une analyse statistique et l’obtention de conclusions interprétables qui conduiront à ne pas répéter les expériences que nous mettons en place sur les animaux.
Raffinement
Afin de respecter le bien-être animal, les souris sont dans des cages avec un milieu enrichi et du coton pour qu’elles se fassent un nid (quotidien de l’animalerie). Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Les animaux seront observés au minimum 3 fois par semaine durant la durée de l’expérience afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur douleur ou leur détresse et ainsi améliorer leur bien être Afin de maximiser l’obtention des données scientifiques et raffiner nos approches expérimentales, nous établirons un suivi attentif des souris et fixerons des points limites pour réduire au maximum la souffrance des animaux et éviter l’apparition de tout signe de souffrance Dans ce cadre, un analgésique sera également utilisé dans les procédures de chirurgie afin d’enrayer la douleur chez l’animal.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études en cancérologie du fait de l’existence de nombreux modèles bien caractérisés. Spécifiquement, il n’existe pas d’autre espèce que la souris permettant une déplétion conditionnelle des macrophages spécifique. Les souris adultes de 6 semaines ayant un système immunitaire compétent et un pancréas développé et fonctionnel seront utilisées pour ce projet.
Prolifération cellulaire saisonnière hypothalamique chez le hamster syrien : Influence de la mélatonine et des hormones thyroïdiennes (TSH et T3)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
240 hamsters syriens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des injections répétées de mélatonine, une autre subit une chirurgie d'implantation d'un système d'infusion continue d'hormones thyroïdiennes dans le cerveau, pour étudier la prolifération cellulaire saisonnière de l'hypothalamus. Le porteur indique que la chirurgie est douloureuse, que le passage en jours courts provoque une perte de poids d'environ 15 % et que l'isolement en cage individuelle peut générer du stress. Tous les animaux sont ensuite tués pour prélever le cerveau, le sang et les testicules.
Objectifs
L’hypothalamus est une partie du cerveau qui contrôle les fonctions métaboliques et reproductives. Chez les mammifères, il a été montré que les changements saisonniers des hormones thyroïdiennes et de la mélatonine régulent l’activité de l’hypothalamus pour ajuster les fonctions métaboliques et reproductives avec les saisons. Notre projet déterminera quel est le rôle des hormones saisonnières (mélatonine et hormones thyroïdiennes) dans la prolifération cellulaire saisonnière de l’hypothalamus du hamster syrien, un mammifère saisonnier. Des études chez le mouton ont montré que l'exposition à des jours courts d’hiver (avec un pic long de mélatonine), qui induit une activation de leur reproduction, est associée à une augmentation de la prolifération cellulaire dans l’hypothalamus. Nos données préliminaires chez le hamster syrien montrent que l'exposition à des jours courts (qui, à l’inverse du mouton, inhibent sa reproduction) induit également une prolifération cellulaire dans l’hypothalamus. Ces observations suggèrent que la prolifération saisonnière des cellules hypothalamiques se produit en réponse au signal saisonnier, indépendamment de la stratégie de reproduction de l'animal. Notre projet testera quelles hormones saisonnières (mélatonine et/ou hormones thyroïdiennes) induit la prolifération cellulaire hypothalamique en jours courts chez le hamster syrien mâle.
Bénéfices attendus
Ce projet nous aidera à mieux comprendre la nature du signal saisonnier endocrine (mélatonine et/ou hormones thyroïdiennes) qui contrôle la prolifération cellulaire saisonnière dans l'hypothalamus du cerveau adulte d’un mammifère. Les résultats obtenus nous permettront ensuite d’envisager de futures expériences pour 1) établir la nature des cellules hypothalamiques nouvellement formées suite au changement des saisons, 2) analyser le rôle physiologique de la prolifération cellulaire adulte saisonnière et 3) d’étudier l’effet de perturbateurs saisonniers (réchauffement climatique, pollution lumineuse nocturne) sur la prolifération cellulaire saisonnière. Ces travaux ont des implications cliniques potentielles car des études récentes montrent que la physiologie humaine présente aussi des variations saisonnières d’hormones liées au métabolisme, à la reproduction et à la croissance.
Procédures
Dans la première expérience où nous testons l’effet d’un allongement du pic nocturne de mélatonine en jours longs, chaque hamster recevra une injection de solvant ou de la mélatonine (durée de la préhension plus injection : 2 min) chaque jour pendant 2 ou 4 semaines. Un jour avant la fin de l’expérience, une injection intrapéritonéale d’une substance qui permet la visualisation des cellules nouvellement formées (durée de la préhension plus injection : 2 min) sera donnée sur chaque hamster vigile. Toutes les injections se feront sur animal vigile. Les hamsters seront stabulés à raison de de 3 individus par cage enrichie (tunnel, nid, bâton en bois). Dans la deuxième expérience où nous testons l’effet d’une augmentation des concentrations des hormones thyroïdiennes en jours courts, chaque hamster aura une chirurgie pour implanter un système permettant l’infusion continue de solvant ou d’hormones thyroïdiennes dans le cerveau (durée de la chirurgie sous anesthésie profonde : 30 min) pendant 2 ou 4 semaines. Un jour avant la fin de l’expérience, une injection intrapéritonéale d’une substance qui permet la visualisation des cellules nouvellement formées (durée de la préhension plus injection : 2 min) sera donnée sur chaque hamster vigile. Les hamsters seront stabulés en cages individuelles enrichies (tunnel, nid, bâton de bois) car la situation de jours courts les rend naturellement agressifs et les animaux pourraient s’attaquer les uns aux autres, notamment au niveau des plaies des implantations. A la fin de l'étude, tous les animaux seront mis à mort après anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Le hamster syrien peut être stressé par les manipulations/préhensions qu’il devra subir régulièrement. Les injections intrapéritonéales peuvent engendrer une douleur locale mais de courte durée. L’intervention chirurgicale est jugée douloureuse per se (douleur modérée) et peut également entrainer des inflammations. Le transfert en jours courts entraine naturellement une perte de poids d’environ 15%, mais il est possible que la perte de poids soit supérieure. Les hamsters opérés et leurs contrôles sont suite à l'impantation transférés en jours courts et sont placés en cage individuelle (car étant naturellement plus agressifs en jours courts, ils pourraient s’attaquer, notamment au niveau des plaies) ce qui peut conduire à un stress de l’isolement.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux pour prélèvements 1) du cerveau post-mortem dans le but d’analyser la prolifération cellulaire grâce à la visualisation par une technique de coloration de cellules nouvelles nées par immunohistochimie ; 2) du sang pour doser les hormones de la reproduction, 3) des testicules dont la masse indique le statut reproducteur de l’animal.
Remplacement
Le projet vise à étudier l’effet de plusieurs hormones de la saisonnalité sur les processus de prolifération cellulaire dans l’hypothalamus. Ce sont des fonctions intégrées typiques des mammifères qui par conséquent ne peuvent pas être étudiées chez des organismes non-mammifères, des lignées cellulaires ou des modèles biomathématiques, et qui nécessitent des organismes entiers. Dans ce contexte il n'est encore pas possible de proposer d’alternatives pour des études préliminaires dans des modèles hors-champs.
Réduction
Le nombre de animaux a été calculé sur des connaissances du modèle et une méthode mathématique en intégrant la variabilité inhérente au modèle et aux gestes réalisés. Ce nombre permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les tests statistiques utilisés pour comparer les groupes ont été choisis pour permettre d’évaluer l’effet de plusieurs hormones de la saisonnalité sur les processus de prolifération cellulaire dans l’hypothalamus.
Raffinement
Tous les hamsters seront dans des cages enrichies avec du matériel de nidation, un bâton à ronger, et tunnel de refuge. Avant et pendant les traitements, les hamsters, qui sont des animaux sociaux, seront placés en cage collective (3 individus par cage). Il y aura une exception pour les hamsters stabulés en jours et ayant eu une intervention chirurgicale qui seront isolés car il y a des risques qu’ils soient agressifs entre eux. Les hamsters soumis à des traitements seront traités avec des analgésiques et anesthésiques adaptés pour réduire leur souffrance induite par les procédures à un niveau minimum. Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début des injections pour limiter le stress généré par celles-ci. Ils seront observés quotidiennement pour détecter tout signe de souffrance. Des points-imites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance durant la durée de l’étude.
Choix des espèces
Le hamster syrien est un modèle de rongeur dont la physiologie saisonnière est bien caractérisée. Des résultats récents chez le hamster syrien ont montré l’existence d’une prolifération cellulaire hypothalamique augmentée lors du transfert en jours courts type hiver. De plus les procédures expérimentales proposées chez cette espèce sont bien maitrisées, ce qui contribuera à en limiter les effets dommageables pour l’animal. Pour ce projet seuls les mâles seront utilisés car la bonne intégration de l’information photopériodique est facilement observable par la modification de la taille des testicules. Nous utiliserons des hamsters mâles post-pubères âgés entre 3 et 8 mois, car notre expérience nécessite que les hamsters aient un âge où la maturation sexuelle est optimale.
Efficacité d’anticorps monoclonaux en combinaison avec des inhibiteurs de point de contrôle dans des modèles de greffe chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des injections répétées d'anticorps et d'inhibiteurs deux à trois fois par semaine, avec un risque de nécrose de la tumeur, de cachexie et d'isolement. Le porteur, une société, indique évaluer l'efficacité anticancéreuse de ses anticorps monoclonaux en combinaison, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet ce test faute de système immunitaire fonctionnel. Les animaux dont la tumeur ne prend pas sont eux aussi mis à mort.
Objectifs
Ces dernières années l’immunothérapie a connu un essor important dans la prise en charge des cancers. Elle a montré une efficacité conséquente dans diverses indications, cependant un certain nombre de patients présentes des résistances spontanées ou acquises. Notre société développe des anticorps monoclonaux à visée thérapeutique dans le cancer. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer l’efficacité anti-cancéreuse des anticorps monoclonaux en combinaison avec des inhibiteurs de point de contrôle dans des modèles de souris. L’objectif secondaire est d’appréhender les mécanismes d’action de ces anticorps par l’évaluation des modulations du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Notre hypothèse est que nos cibles thérapeutiques jouent un rôle dans le développement tumoral. Notre société évalue l’effet anti-tumoral de thérapies ciblées seules ou en combinaison avec des inhibiteurs de point de contrôle dans le cadre de plusieurs projets cliniques. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement des candidats médicaments et de leur fonctionnement en association avec des inhibiteurs de point de contrôle. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.
Procédures
Toutes les souris prévues dans le protocole subiront des injections intrapéritonéales d'anticorps ciblés (2 injections par semaine sur toute la durée du suivi tumoral, soit du jour d'inclusion dans un groupe de traitement jusqu'à l'obtention d'un point limite) et/ou inhibiteurs de point de contrôle (3 injections espacées de 4 jours à partir de l'inclusion des animaux dans les groupes de traitement). Une injection sous-cutannée de lignées cellulaires est réalisée lors de la greffe (une seule fois). Toutes les injections sont réalisées dans un volume de 100μL. Elles sont faites sur animal vigile dans un délais de 20 secondes à partir de la contention.
Impact sur les animaux
Dans les deux procédures il est possible d’observer des phénomènes de nécrose des tumeurs à la surface de la peau. Les individus concernés seront mis à mort. Des signes de fatigue, cachexie et d'isolement sociale sont également possibles. Des mesures d'enrichissement du milieu et de nourriture semi-liquide dans la cage seront mises en œuvre dans un premier temps. Si les point limites sont atteints, les animaux seront mis à mort et une autopsie sera effectuer de manière à évaluer la présence potentielle de métastases. Si de telles observations sont avérées, les surveillances des animaux restants seront accrues.
Devenir
Tous les animaux porteurs de tumeurs seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet. Des prélèvements tumoraux postmortem seront effectués afin d'analyser le mécanisme d'action des différentes combinaisons de traitements. Etant donné la variabilité de prise de greffe des différents modèles cellulaires, certains animaux peuvent ne pas présenter de tumeur. Ayant subi une injection de cellules, il ne peuvent être considérés comme naïfs de traitement et réutilisés dans d'autres procédures.Les animaux ne présentant pas de prise tumorale seront mis à mort 2 mois après la greffe, en fin de procédure. Des prélèvements biologiques postmortem pourrons également être réalisés sur ces animaux afin d'obtenir des tissus contrôles sains en référence de nos expérimentations
Remplacement
La présence de tous les acteurs micro-environnementaux est nécessaire à la compréhension des mécanismes biologiques qui impliquent l’activité de nos anticorps monoclonaux. Il n'existe pas de modèles d'étude in silico ou in vitro permettant l'évaluation de l'efficacité des inhibiteurs de point de contrôle car ils nécessitent la présence d'un système immunitaire fonctionnel.
Réduction
Nous avons calculé le nombre minimum de souris à inclure, en prenant en compte notre expérience, les études déjà publiées utilisant ces modèles ainsi que pour de disposer de suffisamment de matériel biologique pour rendre nos résultats interprétables. Pour les procédures 1 et 2) D'après notre expérience la variabilité des modèles de greffes sur souris immunocompétentes traitées avec ces composés ne permet pas de voir l'effet de ces drogues seules ou en combinaison au-dessous d'un effectif de 12 souris. Compte tenu des aléas de prise tumorales, nous envisageons des groupes de 15 souris. Dans l’analyse des résultats, nous porterons une attention à la fréquence des animaux répondeurs. Une réduction a été opérée dans les différentes procédures en mutualisant les bras contrôle pour plusieurs lignes de traitement. Une réduction sera opérée dans la procédure 2 sur la base des réponses observées en procédure 1.
Raffinement
Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Dans toutes les procédures le volume tumoral sera évalué 2 fois par semaine avec un pied à coulisse. Le poids des animaux sera évalué 1 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, les signes de souffrance (prostration, propreté, amaigrissement, isolement social) seront surveillés à chaque mesure tumorale ou pesée soit 2 fois par semaine. Des signes de fatigue, cachexie et d'isolement sociale sont également possibles. Des mesures d'enrichissement du milieu et de nourriture semi-liquide dans la cage seront mises en œuvre dans un premier temps. Si les point limites sont atteints, les animaux seront mis à mort et une autopsie sera effectuer de manière à évaluer la présence potentielle de métastases. Si de telles observations sont avérées, les surveillances des animaux restants seront accrues.
Choix des espèces
Certaines de ces molécules sont des anticorps dirigés contre des cibles de souris. La souris compétente est le modèle le plus approprié pour greffer du tissu de cette même espèce tout en permettant de faire des suivis de pharmacocinétique et pharmacodynamie dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux et de inhibiteurs de point de contrôle. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps sont bien standardisés (voie, doses, posologies, ...) contrairement à d'autres modèles tels que le zebrafish. Par conséquent, les modèles immunocompétents tels que les souris BalbC ou C57b6 sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément aux modèles établis.
fourniture de produits biologiques de primates non humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Macaques à longue queue : 800
Macaques rhésus : 40
Singes vervets : 10
Ce projet est une prestation : une plateforme fournit sur commande à des chercheurs, qu'elle désigne comme ses clients, du sang, de la moelle osseuse, du lait, du sperme ou des humeurs de l'œil prélevés sur des primates. 1 000 primates vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 800 macaques à longue queue, 150 ouistitis, 40 macaques rhésus et 10 singes vervets, gardés ensuite en hébergement ou réutilisés dans d'autres projets. Capturés par un tunnel et immobilisés dans un sabot de contention, ils subissent prises de sang, ponctions de moelle et de liquide céphalo-rachidien, prélèvements d'humeur vitrée, biopsies et lavages des bronches, et les petits sont séparés de leur mère jusqu'à six heures pour la collecte du lait. Le porteur écrit que ces interventions "diffèrent peu d'interventions de don du sang ou de prélèvements diagnostics menés chez l'humain".
Objectifs
L’accès à des échantillons biologiques de primates non humains (PNH) est un élément clé dans le développement préclinique. Ils permettent de valider in vitro différentes hypothèses scientifiques et de tester l’efficacité ou la toxicité de candidats médicaments. Autrement dit, utiliser des échantillons de PNH 1) permet de réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire en les remplaçant par l’utilisation in vitro de cellules (plusieurs produits testés avec les cellules d’un seul animal) ; 2) rend le développement d’un médicament plus fiable, grâce à une sélection objective de l’espèce animale la plus proche de l’homme. Les prélèvements sont réalisés sur des animaux anesthésiés en suivant les recommandations correspondant aux bonnes pratiques chez l’Homme. De plus, un hébergement spacieux en groupe sociaux et un enrichissement du milieu adapté sont fournis à ces animaux. Anesthésie, analgésie, hébergement en groupe sociaux et enrichissement participent ainsi au principe de raffinement. La réalisation de prélèvements biologiques suit donc parfaitement la règle des 3R, tant dans son concept que dans sa réalisation. Pour les besoins de la recherche scientifique , l'objectif de ce projet est de proposer et fournir à la communauté scientifique la fourniture d’échantillons biologiques (sang et dérivés sanguins, cellules, tissus, fluides…). Le besoin en prélèvements biologiques/cellules de PNH est dépendant de projets extérieurs à la plateforme
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, les prélèvements de sang, moelle osseuse, liquide céphalo-rachidien, urine, humeur aqueuse, humeur vitrée, sperme, biopsies cutanées, biopsies musculaires, lait et liquide bronco-alvéolaire peuvent avoir de nombreuses utilisations. On peut notamment citer parmi les utilisations faites par les utilisateurs de ces prélèvements : (i) des recherches sur les cellules primaires pour développer de nouvelles molécules de biothérapie en oncologie ou contre les maladies inflammatoires ; (ii) des pré études de sécurité pour mettre en place avec les doses adaptées les futures études de toxicologie sur les primates non humains ; (iii) des comparaisons avec le sang humain afin d’étudier la compatibilité des résultats obtenus sur les primates non humains lors de leur application chez l’Homme (iv) des études de bioanalyses pour le développement de médicaments ; (v) des recherches pour découvrir de nouvelles molécules pour inhiber l’immunité innée pour le traitement des maladies à médiation immunitaire.
Procédures
Les interventions réalisées sur les animaux dans ce projets diffèrent peu d'interventions de don du sang ou de prélèvements diagnostics menés chez l'humain. De plus, contrairement à ce qui est fait chez l'Homme, ces procédures sont ici réalisées sur animaux anesthésiés et analgésiés. Pour les prélèvements de sang, un prélèvement vigil pourra être effectué dans le seul cas où l'anesthésique affecteraits les analyses ou les expériences menées par le chercheur. L'ensemble de interventions sont des prélèvement biologiques : prise de sang, prélèvement de LCR, moelle osseuse, urine, lait, sperme et humeurs oculaires, biopsies de peau ou musculaire, lavage broncho-alvéolaire. Le nombre des interventions dépend des demande des utilisateurs mais sont toujours réalisées en respectant les procédures définissant des intervalles de prélèvements et de volume maximaux afin de préserver la bonne santé et le bien être de l'animal.
Impact sur les animaux
La réalisation des prélèvements biologiques nécessite au minimum la capture et la contention des animaux. Ces deux actes sont stressants car réalisés de manière contrainte. La capture consiste à diriger les animaux vers un tunnel de capture installé dans chaque animalerie. Une fois dans le tunnel de capture, les animaux peuvent être triés et dirigés vers le sabot de contention au bout du tunnel équipé d’un fond de contention. Le fond de contention permet de manière sécurisée (i) d’attraper le bras de l’animal afin de pouvoir le tenir et le sortir en vigil du tunnel à l’aide de gants de contention, ou (ii) d’accèder à sa cuisse afin de pouvoir effectuer une injection intra-musculaire du produit anesthésiant. A noter que l’habituation des animaux ainsi que le renforcement positif permet de réduire la durée et l’intensité du stress de capture. Ces méthodes de raffinement sont appliquées le plus souvent possible. Les effets post-prélèvements peuvent également représenter une nuisance en termes de récupération physiologique et/ou physique des animaux. Il s’agira au maximum des effets secondaires liés à l’anesthésie (somnolence, nausée). Toutes les nuisances sont considérées comme légères. De plus, des mesures de raffinement sont mises en place propres à chaque type de prélèvements. A noter que -pour le prélèvement de lait, les petits sont séparés de leur mère pour une durée de 6h maximum engendrant un stress de séparation. Cette séparation sera la plus courte possible et n’entraine pas d’effet à long terme sur le petit. Des mesures particulières sont mises en place afin de limiter le stress immédiat des petits due à cette séparation comme la présence d’une peluche pour s’agripper si le petit est seul ou la mise en groupe des petits s’ils sont plusieurs. - pour le prélèvement de sperme, le mâle est séparé de son groupe la veille pour obtenir le meilleur prélèvement possible. Cette séparation engendre un stress chez l’animal. Afin de réduire au maximum ce stress, le temps de séparation est limité à 24h maximum et le mâle est relâché dans son groupe dès que possible. Le contact visuel avec le groupe est maintenu si possible.
Devenir
Les procédures de prélèvements biologiques étant des procédures très légères, les animaux sont gardés en hébergement standard ou pourront être réutilisé pour d'autres projets scientifiques.
Remplacement
Dans la mesure où les produits de synthèses ne permettent pas encore de reproduire toutes les réactions des différentes cellules visées dans ce projet, l’utilisation d’animaux en tant que donneurs non terminaux reste indispensable. Les prélèvements biologiques réalisés sur animaux vivants proposés dans ce projet permettent justement de remplacer l’utilisation d’animaux vivants « entiers » par des produits biologiques issus de ces animaux permettant ainsi d’éviter l’injection de composants en tests à ces animaux et de multiplier les essais réalisés sur les produits biologiques testés sans multiplier le nombre d’animaux utilisés.
Réduction
L’utilisation de produits biologiques à la place d’animaux entiers permet en soi de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques puisqu’un même animal peut être réutilisé pour le prélèvement de plusieurs produits biologiques, dans la limite des volumes et de la fréquence maximale permettant à l’animal de retrouver son état de santé et de bien-être général entre chaque prélèvement. Concernant les prélèvements biologiques eux-mêmes, ceux-ci sont réalisés après une demande spécifique validée d’un demandeur (en général client chercheurs). Les animaux ne sont pas prélevés systématiquement s’il n’y a pas de demande pour la fourniture de produits biologiques qui ne seraient pas utilisés. Dans la mesure du possible, toutes les demandes sont couplées afin de limiter le nombre d’interventions pour un même groupe d’animaux hébergés ensemble et réduire le stress lié à la capture dans une même animalerie. Ainsi tout est fait pour prélever un minimum d’animaux pour satisfaire les demandes des chercheurs.
Raffinement
La plupart des prélèvements est réalisée sur des animaux anesthésiés en suivant les recommandations de prélèvement correspondant aux bonnes pratiques chez l’Homme. Dans les rares cas où l’anesthésie n’est pas réalisée (pour les prélèvements sanguins uniquement : demande spécifique de l'utilisateur : interraction de l’anesthésique avec leur recherche), il est jugé que le dommage engendré par la réalisation du prélèvement en vigil ne diffère pas de celui engendré par l’anesthésie (douleur de la piqure d’une aiguille + stress d’un prélèvement vigil vs douleur de la piqure d’une aiguille + réveil, respectivement). De plus, tous les animaux disposent d’un hébergement répondant à la règlementation en vigueur, avec accès extérieur (volume supplémentaire par rapport à la réglementation) le cas échéant et en groupes sociaux. Les animaleries intérieures et extérieures sont équipées d’enrichissements du milieu adaptés à chaque espèce (au minimum perchoirs, reposoirs, barrières visuelles, matériaux variés, jouets, litière). En ce qui concerne les méthodes de prélèvements des produits biologiques, des mesures de raffinement spécifique (dont analgésie si nécessaire) sont mises en place pour chaque procédure.
Choix des espèces
De nombreuses thématiques de recherche sont menées sur les PNH et peuvent nécessiter l’utilisation de produits biologiques (ici sang et dérivés, LCR, moelle osseuse, urine, humeurs oculaires, biopsies de peau ou musculaire, lait, liquide broncho-alvéolaire, sperme) soit pour des études préliminaires soit comme témoin négatif en comparaison aux produits récoltés lors de l’expérimentation. Les espèces PNH choisies sont celles utilisées le plus couramment en recherche biomédicale et pour lesquelles la communauté scientifique dispose du plus de données bibliographiques et de connaissances (Macaques cynomolgus, rhésus, singes verts et ouistitis). L’espèce prélevée est choisie sur demande du chercheur. Animaux de tous âges en fonction des demandes des utilisateurs. Les volumes prélevables sont ajustés en fonction de l’âge et du poids de l’animal.
Optimisation de l’imagerie non invasive (IRM et TEP) dans le cadre de tumeurs cérébrales et dans les AVC
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 100
200 animaux, 100 souris et 100 rats, vont être utilisés dans des procédures classées de souffrance modérée à sévère, la plupart tués à l'issue et cinquante animaux témoins réutilisés. Les rats reçoivent une tumeur cérébrale et les souris un accident vasculaire cérébral provoqué, la gravité venant de ces modèles et non des séances d'imagerie qui suivent. Le porteur indique que l'objectif est d'optimiser des séquences d'IRM et de TEP fournies par le constructeur, un travail de mise au point technique de la plateforme. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité d'étudier ces pathologies dans un "organisme entier".
Objectifs
Le projet consistera principalement à optimiser des séquences en imagerie par resonance magnétique grâce à un imageur à très haut champ. La plateforme dispose également d’un imageur hybride qui réalise des imageries par resonance magnétique couplés à de la tomographie par émission de positons qui permet des imageries à haute résolution. Les séquences et acquisitions à optimiser bénéficieront aux deux imageries. Pour cela nous avons prévu d'étudier les deux pathologies à étude. Les séquences à optimiser seront celles disponibles pour nos imageurs que nous souhaitons optimiser : anatomiques, de diffusion, de perfusion, ... avec injection ou non de produits de contraste ou de produits spécifiques.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons optimiser nos séquences d'imagerie à la mailleure qualité possible afin d'assurer aux chercheurs un maximum de signal réalisant des manipulations le plus courtes possibles (techniques moins invasives pour les animaux et moins de frais de temps machine et personnel).
Procédures
Les animaux setont inclus dans les groupes expérimentaux: - rats : tumeurs ou controles. - souris : accident vasculaire cérébral ou controles. Ils suivront donc une des deux procédures ou en seront les controles (sans chirurgie). Modèle tumoral : anesthésie maximum 30 minutes. Modèle d'accident vasculaire cérébral, anesthésie maximum 120 minutes. Dans les deux casn ils suivront les optimisations d'imagerie suivant maximum 3heures d'expérience pour les rats et 1,5h pour les souris, incluant le temps de pose de cathéter quand nécessaire (autour de 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux suivront des procédures d'imagerie qui ne sont pas invasives. Les séances se feront sous anesthésie et analgésie. Nous savons de facto qu'une pose de cathéter sera nécessaire pour des challenges en imagerie dynamique par exemple ou pour l'injection simple de contrastes, l'analgésie sera faite en conséquence. Nous avons prévu une analgésie locale (lidocaïne en spray) puis également à la buprénorphine au moment de la sédationLes animaux qui suivront des procédures pour la création d'AVC ou de tumeurs cérébrales auront en plus suivi le modèle propre à la thématique et qui prévoit une analgésie adaptée. La sévérité du protocole ne vient pas des séances d’imagerie mais des modèles utilisés (création de tumeurs et d’AVC) en amont de cette imagerie. Pour le modèle tumoral, d'après notre expérience les animaux ont un comportement social et score clinique normal. Néanmoins, un suivi du volume tumoral et du poids de l'animal est fait pour suivre le bien-être des animaux. Pour le modèle d'AVC, d'après notre expérience les animaux récupèrent de la chirurgie sans problème de comportement ou de score clinique une fois l'analgésie post-opératoire faite. Néanmoins, un suivi du score clinique est réalisé afin de suivre le bien-être des animaux.
Devenir
Les animaux modèle ont eu des procédures chirurgicales qui sont cumulées à l'imagerie. Ils seront mis à mort à la fin de la dernière séance d'imagerie, sous anesthésie (comme décrit dans l'onglet mise à mort). Les animaux contrôle seront réutilisés si possible pour les formations prévues en interne car ils n'auront pas subi d'interventions invasives (les animaux avec contraste auront eu une pose de cathéter veineux à la queue, nous attendrons une récupération totale avant réutilisation, au minimum d'une semaine). Ces animaux que nous prévoyons pouvoir réutiliser sont les 5 controles utilisés par an, donc 25 pour chaque espèce et pour l'intégralité du projet.
Remplacement
Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’étudier les deux pathologies à étude dans un organe spécifique qu’est le cerveau et d’un organisme entier.
Réduction
Pour chaque pathologie, 15 animaux « modèle » et 5 « contrôle » seront utilisés au maximum afin de valider ces séquences d’IRM par an (20 rats et 20 souris par an, donc 100 rats et 100 souris maximum en total pour tout le projet). Nous tenons compte du temps machine disponible en interne pour notre section de recherche et développement et la disponibilité de notre personnel pour réaliser deux séances de test par mois maximum. De plus, ces groupes expérimentaux sont calculés suivant le fait que le constructeur Bruker met à disposition 41 séquences d'imagerie que nous souhaitons optimiser pour assurer aux chercheurs un maximum de signal dans le minimum de temps possible. Cette optimisation ne nécessitera donc pas plus d'animaux que 50 par an maximum.
Raffinement
Tous les moyens sont mis en oeuvre afin de limiter la souffrance animale. En pré-opératoire et lors de la chirurge les animaux seront anesthésiés à l'isoflurane (4% en induction dans l'O2; 2.5% dans un mélange O2/N2O 30/70%). Une anesthésie locale est appliquée aau niveau de la sutire cutanée (xylocaïne 2%). En péri-opératoire, l'analgésie est assurée par l'injection de buprénorphine (0.05mg/kg au moment de l'installation dans la paillasse) et répétée à 6-8h post-chirurgie. Une surveillance post-opératoire est effectuée quotidiennement pour le suivi des points limites avec une pesée pour le suivi de croissance tumorale (3 fois par semaine). Si l'apparition de signes de critères de mise à mort s'avèrent, les animaux seront ethanasiés. Lors des examens d'imagerie par IRM et/ou TEP, les animaux seront anesthésiés de la même manière.
Choix des espèces
D’après l’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et grâce à l’expérience des plateformes thématiques développant ces modèles, nous avons décidé d’utiliser les espèces choisies : - des rats wistar pour l’implantation intrastriatale de cellules 9L permettant de développer des tumeurs. - des souris swiss dans le cas de l’étude de l’AVC, avec une occlusion de l’artère cérébrale moyenne reperfusées au bout de 20 minutes. Les rats seront âgés d’environ 8 semaines (250g) et les souris 8-10 semaines (30-35g) en début de protocole. Nous effectuons les procédures sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles de tumeurs cérébrales et d’AVC.
Etude d’efficacité comparée des thérapeutiques de traitement des MICI sur les symptômes comportementaux extra-digestifs
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Une colite provoquée par du dextran sulfate de sodium versé dans l'eau de boisson, répétée jusqu'à trois cycles de cinq jours, entraîne douleur, perte de poids et prostration chez des souris étudiées pour les symptômes psychologiques des maladies inflammatoires de l'intestin. 231 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, avec, pour 90 d'entre elles, des tests comportementaux répétés six fois, un test de nage forcée pour 30, et pour 45 autres trois jours de gavage d'antibiotiques suivis d'une transplantation fécale par gavage. Le porteur promet pourtant un "bien-être optimal tout au long de l'étude". Toutes sont tuées à l'issue de chaque procédure pour l'examen de leur intestin.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’étudier l’impact de stratégies thérapeutiques de modulation de l’écologie microbienne intestinale en développement dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sur un plan comportemental. Le projet a recours à un modèle murin de référence de MICI : colite au dextran sulfate de sodium (DSS). Cette molécule soluble dans l’eau de boisson des animaux entraine une inflammation de la muqueuse intestinale, reproduisant ainsi les lésions existantes dans la maladie humaine et ses caractéristiques physiopathologiques. Les animaux seront étudiés sur un plan comportemental avec une batterie de tests successifs pour évaluer leur état d’anxiété, leur état de dépression, leur réaction au stress et leur capacité de socialisation. Ces tests seront menés de manière séquentielle pour tous les groupes d’animaux. Enfin, l’administration de thérapeutique sera réalisée et l’évaluation sera faite par une nouvelle séquence de tests comportementaux, afin de montrer un avantage ou non de la thérapeutique sur les aspects comportementaux de la colite au DSS. Ceci répondra à des questions de physiopathologie des symptômes psycho-comportementaux des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, et d‘étudier la réponse de ces symptômes aux stratégies thérapeutiques. Etant donné les expériences nécessaires à la mise en place du projet, un nombre minimal de souris a été fixé permettant une bonne analyse des résultats. Le nombre d’animaux a été réduit au maximum sans entraver l’interprétation des résultats et leur significativité au plan statistique. Ainsi, un maximum de souris sera nécessaire pour une étude scientifique pertinente. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. Par ailleurs, ils seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition en permanence.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’améliorer les connaissances sur le modèle de colite au DSS, notamment à court terme sur la faisabilité d’un modèle consistant en une répétition de cycles d’exposition. Le projet consiste en une étude pré-clinique de test d’hypothèse thérapeutique afin d’obtenir des données qui permettront des études en population humaine pour apporter une réponse thérapeutique aux symptômes extra digestifsneuro-comportementaux des MICI. Ces bénéfices du projet sont à long terme.
Procédures
Induction d'une colite inflammatoire par boisson au DSS (exposition de 5 jours par inductions) : - Procédure expérimentale 1 pilote : 6 groupes de 6 souris (un groupe par dosage), une seule induction, mise à morts d'une souris par cage (cages de 3) pour étude histologique et biologique à J5, J10 et J12. - Procédure expérimentale 2 : 6 souris, 2 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. - Procédure expérimentale 3 : 9 souris, 3 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. - Procédure expérimentale 4 : 45 souris, 3 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. - Procédure expérimentale 5 : 90 souris, 2 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. Prélèvement sanguin par ponction de la veine mandibulaire avant les mises à mort pour dosage des différents marqueurs inflammatoires dans la procédure expérimentale 1 (36 souris concernées). Test comportementaux léger : 90 souris dans la procédure expérimentale 4, passés à 6 reprises, lors des pics inflammatoire et en fin de rémission pour chaque cycle. Test de la nage forcée : 30 souris dans la procédure expérimentale 4. Gavage antibiotique pour déplétion du microbiote intestinal pendant 3 jours consécutifs, puis gavage pour transplantation fécale le 4ème jour : 45 souris dans la procédure expérimentale 5, entre les 2 cycles d'induction.
Impact sur les animaux
Colite au DSS : douleur, perte de poids, prostration, stress pendant la durée d’exposition au DSS dans l’eau de boisson. Tests comportementaux : stress pendant une période réduite de quelques heures après le test.
Devenir
Mise à mort de toutes les souris à l’issue de chaque procédure pour étude et comparaison histologique et biologique de l'intestin.
Remplacement
Notre projet porte sur l’étude comportementale d’un modèle de colite inflammatoire. Les alternatives expérimentales aux animaux vivants ne permettent pas l’étude comportementale.
Réduction
Le nombre d’animaux destiné au projet a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante d’analyse statistique. Le nombre d’animaux pour la PE1 et PE2 a été réduit au minimum pour permettre de construire de manière adapté le protocole final. Les PE3 et 4 nécessite un nombre plus important d’animaux du fait de la variabilité importante et inhérente aux analyses comportementales. Les tests statistiques comportent des analyses descriptives et des analyses de comparaisons. Du fait du faible nombre de données les analyses seront menées par des tests non paramétriques.
Raffinement
Les nuisances pour les animaux seront prévenues par une surveillance accrue lors de l’exposition au DSS sur le plan du comportement, du stress, de la douleur et du poids. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Concernant le gavage de la PE5, celui-ci sera réalisé par un expérimentateur entrainé. Les cages d’hébergements seront enrichies (nid et bâton à ronger).
Choix des espèces
La souris est l’espèce référencée pour le modèle au DSS. Elle répond aux compétences de l’animalerie PLEXAN où l’expérimentation va être menée. Cette espèce est bien référencée sur les études comportementales et la littérature existante permettra une analyse de qualité. Les animaux seront achetés à l’âge de 6 semaines, et seront utilisé dans le projet à l’âge de 8 semaines. L’âge adulte correspond aux données de la littérature en termes de modèle DSS et d’étude comportementale.
Effets d’une carence gestationnelle en vitamine A sur la transmission dopaminergique mésocorticolimbique dans le contrôle de la prise de décision
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Douze semaines de restriction alimentaire, avec une perte de poids tenue sous 10 %, pour 360 souris soumises à un conditionnement opérant : le projet utilise 936 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou menées sous anesthésie sans réveil, toutes tuées à l'issue. Les 216 souris reproductrices sont tuées au sevrage de leurs petits, exposés pendant la gestation à une carence en vitamine A. Le projet doit établir si cette carence altère, chez la descendance, le circuit de la dopamine qui intervient dans la prise de décision. 120 descendantes passent des tests d'anxiété qui, selon le porteur, provoquent un stress aigu, et le RNT ne précise pas lesquels.
Objectifs
La carence en vitamine A au cours de la période périnatale, causée par un régime appauvri en vitamine A, reste un enjeu majeur de santé publique dans les pays en voie de développement. En effet, l’acide rétinoïque (AR), métabolite actif de la vitamine A est indispensable au développement cérébral du foetus et du nouveau-né mais joue également un rôle très important dans les fonctions cérébrales à l’âge adulte. En se fixant sur ses récepteurs nucléaires les RARs (Retinoic Acid Receptors) et les RXRs (Retinoid X Receptors) qui jouent le rôle de facteur de transcription, l’AR régule l’expression de nombreux gènes impliqués dans les processus de plasticité cérébrale. Ainsi, de faibles apports en vitamine A pendant la période périnatale conduiraient à une hypoactivité de la voie de signalisation de l’AR et des modifications d’expression de certains gènes comme le récepteur dopaminergique D2 (D2R) avec des conséquences néfastes sur les fonctions cérébrales associées (fonctions exécutives, planification motrice). Nous faisons l’hypothèse qu’un déséquilibre d’apports alimentaires en vitamine A durant la période périnatale altère le développement de la transmission dopaminergique et pourrait participer à l’étiologie de pathologies neurodèveloppementales qui impliquent des déficits des fonctions exécutives et motrices.
Bénéfices attendus
cette étude vise à proposer de nouvelles stratégies pour la prise en charge des maladies psychiatriques dont l’arsenal thérapeutique reste insuffisant. Ce projet va permettre de tester l’effet potentiellement protecteurs de molécules d’intérêts et donc de proposer de nouvelles stratégies curatives dans le contexte des maladies psychiatriques. Il va aussi permettre d’explorer les mécanismes par lesquels ces métabolites influencent la fonction cérébrale et le comportement. Cela permettra donc d’accroitre les connaissances dans un champ de recherche nouveau et prometteur.
Procédures
216 souris reproductrices seront euthanasiées au sevrage des animaux et 240 souris descendantes seront euthanasiés pour réaliser des enregistrements électrophysiologiques (456 sans réveil). 360 souris descendantes seront soumises à un conditionnement opérant (classe légère). Pour le test de conditionnement opérant, les animaux seront maintenus en restriction alimentaire légère (moins de 10% de perte par rapport au poids ad libitum) pendant toute la durée des expériences comportementales (12 semaines). Afin d’évaluer le comportement de type anxieux, 120 souris descendantes seront soumises à des tests comportementaux qui peuvent engendrer un stress aigü (classe légère). Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré. 240 souris descendantes (dont 120 soumises au conditionnement opérant) seront perfusées pour réaliser des analyses immunohistochimiques (classe légère). Cette intervention dure 15 min par souris (480 classe legère).
Impact sur les animaux
De part sa nature et son objectif les tests comportementaux évaluant le comportement de type anxieux que nous allons utiliser entraine un stress aigü chez la souris. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré. Les souris seront de toute façon suivies comme suit : les animaux en cours de protocole sont surveillés chaque jour par l’expérimentateur et 2 fois par semaine par les animaliers. Pour le test de conditionnement opérant, les animaux seront maintenus en restriction alimentaire légère (moins de 10% de perte par rapport au poids ad libitum) pendant toute la durée des expériences comportementales (12 semaines). Pour cela, les animaux seront pesés chaque jour et la quantité de nourriture ajustée en fonction.
Devenir
En fin de procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires. En fin de procédure 2, tous les animaux seront euthanasiés pour collecter des tissus fixés afin de réaliser de l'immunomarquage sur les tranches de cerveau. En fin de procédure 3 tous les animaux seront euthanasiés et le cerveau sera prélevé (comme tissu frais) afin de réaliser des enregistrements électrophysiologiques. En fin de procédure 4, tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires.
Remplacement
L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal les conséquences comportementales et neurobiologiques d’une carence gestationnelle en vitamine A . Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude de la cognition reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. L’objectif à long terme du projet étant de tester les effets comportementaux d’une supplémentation nutritionnelle en vitamine A dans le contexte des maladies neurodéveloppementales. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la seconde. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Ceci permettre de réduire au maximum le nombre de souris nécessaire à l'étude. Aucun dupliqua du travail proposé n'est aujourd'hui identifié
Raffinement
Concernant le raffinement différentes approches seront mises en œuvre. Les animaux seront hébergés en cages collectives avec un environnement enrichi (carré de coton ou maison en carton). Les animaux seront observés quotidiennement et pesés au moins 1 fois par semaine. Les animaux seront inspectés et si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées, les animaux recevront une injection d'analgésique si nécessaire et seront surveillés deux fois par jour. Si l’animal apparaît malade ou avoir des douleurs, il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera mis à mort dans les 24h. Concernant l’administration des métabolites d’intérêt, nous priviligérons l’utilisation de l’eau de boisson par rapport à des méthodes plus traumatisantes comme les injections intrapéritonéales répétées ou le gavage. L’étude d’acceptabilité aura aussi pour objectif d’éliminer des métabolites ou des dosages qui pourraient entrainer un inconfort chez l’animal. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur. Par ailleurs pour les procédures induisant de la douleur nous utiliserons des associations d’anesthésiques et analgésiques afin de limiter la douleur chez l’animal.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille et peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Les expériences de comportement et d’électrophysiologie sont facilement mises en oeuvre d’un point de vue technique sur les souris. La souche de souris utilisée (C57/Bl6J) constitue un modèle d’étude particulièrement intéressant et informatif dans le cadre des études sur l'impact des carences gestationnelles de nutriments sur la prise de décision , de ce fait les résultats de ce projet seront donc plus faciles à intégrer dans la littérature déjà existante. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet.
Etude du rôle d’un facteur de synthèse des ribosomes dans le maintien de l’identité des cellules souches embryonnaires murines
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
16 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules souches embryonnaires leur sont injectées dans les testicules par chirurgie pour y former des tumeurs bénignes, analysées ensuite au microscope. Le porteur indique que l'ensemble du projet a jusqu'ici été mené sur cellules en culture, sans animaux, et que le recours à la souris vise à démontrer un résultat réclamé dans la phase de finalisation pour publication. Les souris sont mises à mort au plus tard huit semaines après l'injection ou dès l'atteinte des points limites.
Objectifs
Contexte. Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) apparaissent au début de l’embryogénèse et sont à l’origine de la formation de tous les tissus qui constituent les embryons. Les cellules ES peuvent être cultivées en laboratoire indéfiniment, tout en conservant leurs 2 propriétés principales. 1) l’auto-renouvellement qui permet à une cellule ES de se diviser en 2 cellules filles identiques. 2) La pluripotence, c’est à dire la capacité à changer d’identité pour se transformer en toutes les cellules constituant les organes. Comprendre comment les cellules ES conservent leur identité ou en changent est donc essentiel pour différents champs d’application de la biologie et de la médecine car cela contribue aussi bien à améliorer la médecine de la reproduction qu’à mieux comprendre certaines pathologies humaines telles que le cancer. Hypothèse. Depuis 2018, une protéine a été identifiée pour son implication dans un mécanisme biologique essentiel qui aboutit à la fabrication des protéines, appelé traduction. Il a été établi que cette protéine est très exprimée dans les cellules ES et est essentielle pour qu’elles conservent leur capacité à se diviser à l’identique mais pas pour leur capacité à changer d’identité (pluripotence). Toutes les expériences ont été réalisées sur des cellules ES en culture et doivent maintenant être confirmées par des expériences in vivo qui miment le développement embryonnaire. Description du modèle. Toutes les expériences in vitro ont été réalisées sur des cellules ES de souris, aussi les tests in vivo doivent être réalisés chez la souris afin de limiter les biais d’analyse entre différentes espèces. Le test in vivo consiste à injecter des cellules ES dans les testicules de souris mâles adultes. Les cellules ES injectées vont former des tumeurs bénignes non disséminantes et constituées, non pas de cellules cancéreuses, mais de cellules ES qui auront changé d’identité. L’enjeu principal de ces tests est donc d’identifier les types cellulaires différenciés une fois la tumeur bénigne formée, grâce à des analyses au microscope des tumeurs collectées. Objectif. Le projet a pour finalité de déterminer si la perte de la protéine impliquée dans la traduction dans les cellules ES entraîne une modification de leur capacité à changer d’identité in vivo afin de confirmer les nombreuses observations qui ont été réalisées sur des cellules ES de souris in vitro.
Bénéfices attendus
L’étude des processus responsables du développement précoce des embryons chez l’homme et chez les mammifères contribue à l’amélioration de la prise en charge de l’infertilité (par ex., fécondation in vitro). Un des modèles biologiques les plus étudiés pour mieux comprendre ces processus sont les cellules souches embryonnaires (ou cellules ES). Les cellules ES présentent le gros avantage de pouvoir être cultivées en laboratoire tout en conservant leur capacité à former tous les tissus qu’on retrouve dans les embryons qui se développent. Pour améliorer nos connaissances de la biologie du développement des embryons, il est donc essentiel de décortiquer les mécanismes qui contrôlent l’activité des cellules ES et donc les mécanismes qui contrôlent l’expression des gènes dans ces cellules ES. De plus, ces mécanismes fondamentaux peuvent être conservés dans d’autres types de cellules souches à l’origine de pathologies humaines telles que le cancer. En conséquence, approfondir la connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent l’identité des cellules ES présente un enjeu majeur aussi bien pour la recherche fondamentale en biologie, pour la médecine de reproduction et pour la cancérologie. Au cours d’une étude portant sur le rôle du mécanisme responsable de la synthèse des protéines dans les cellules ES chez la souris, et un tout nouveau facteur a été identifié comme jouant un rôle essentiel dans ce mécanisme. Grâce à des approches in vitro, c’est à dire, sur des cellules en culture en laboratoire, ce facteur a été montré comme essentiel pour préserver les propriétés des cellules souches. Ce facteur est présent dans d’autres types de cellules souches (cellules ES humaines, cellules souches adultes, cellules souches cancéreuses) et pourrait donc jouer un rôle important dans le développement des embryons humains et dans certains types de cancers tel que le cancer du colon où il est fortement exprimé.
Procédures
Les souris seront soumise à une unique procédure chirurgicale d'une durée de 10-15 min sous anesthésie générale et traitement entalgique pour éviter toute douleur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables qui sont attendus pour les animaux sont ceux qui peuvent découler : i) de la procédure chirurgicale (inflammation, infection et douleurs localisées), ii) de la présence de sutures cutanées qui peuvent entrainer des blessures cutanées à postériori causées par l’animal lui-même par démangeaisons, iii) de douleurs et de modifications du comportement de la souris (perte de poids) liées à la procédure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après une anesthésie générale dès l'atteinte des points limites ou après une période maximale de 8 semaines après l'injection des cellules ES dans les testicules.
Remplacement
Jusqu’à présent, tout le projet a complètement été réalisé grâce à des expériences en laboratoire sur cellules ES de souris, donc sans faire appel à aucun modèle animal. Dans sa phase de finalisation pour publication, il nous est demandé de démontrer par d’autres approches que les cellules ES que nous étudions, maintiennent leur capacité à générer des embryons. Cela ne peut être réaliser sans le recours à des modèles animaux.
Réduction
Le nombre de souris utilisées sera réduit à 16 (2 groupes de 8 souris) pour les raisons suivantes : 1) Le choix des testicules comme site d’injection permet de doubler le potentiel de développement de tumeurs bénignes sans augmenter le nombre d’animaux. 2) Le résultat attendu de ce projet est l’observation qualitative de tissus adultes au sein des tumeurs bénignes mais nous ne recherchons d’effet statistique, permettant ainsi de réduire la taille des groupes d’animaux. Notre expérience antérieure nous permet de prédire que 2 souris sur 3 injectées avec des cellules ES développent des tumeurs bénignes dans les testicules. Ceci, combiné aux données de la littérature, nous permet de réduire le nombre de souris receveuses à 8 par condition pour obtenir un nombre suffisant de tératomes analysables et ne pas reproduire l'expérience inutilement.
Raffinement
Durant toute la procédure, et en particulier dès le réveil post-chirurgie, les souris seront observées régulièrement (2 à 3 fois par semaine) afin de détecter tout signe de souffrance qui conduirait à la mise à mort de ces souris. De plus, anesthésiques et analgésiques seront utilisés pendant l’expérimentation avant, pendant et après la procédure opératoire.
Choix des espèces
L’ensemble du projet est focalisé sur l’étude de la biologie des cellules souches embryonnaires de souris. Bien que nous ayons montré que le rôle de la protéine candidate est conservé dans les cellules souches embryonnaires humaines et dans les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) de souris, il nous apparaît donc plus opportun de réaliser les expériences de formation de tératomes chez la même espèce afin de récapituler au mieux les voies de signalisations qui vont induire la différenciation des cellules souches embryonnaires dans les tératomes. Toutes les expériences seront réalisées avec des souris adultes de 6 à 8 semaines, qui est l'âge habituellement utilisé pour l’induction de tératomes.
Utilisation de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) pour la caracterisation des glioblastomes
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, puis des séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements sanguins hebdomadaires, avant l'euthanasie pour prélever le cerveau. Le porteur indique que l'imagerie n'ajoute pas de douleur mais qu'elle sera réalisée malgré l'observation préalable de signes de souffrance liés à la tumeur, les souris perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. L'objectif reste de valider l'IRM comme outil de suivi tumoral, les retombées pour les patients étant renvoyées à un stade ultérieur.
Objectifs
Le glioblastome multiforme (GBM) est le type de tumeur cérébrale le plus fréquent et le plus mortel. En principe, les médicaments peuvent atteindre les tumeurs via les vaisseaux, mais l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses joue le rôle d'un antagoniste à toute délivrance efficace de médicaments. Les traitements récents associent la chimiothérapie à des médicaments, qui visent à renormaliser les vaisseaux de la tumeur en réduisant l'angiogenèse, c'est-à-dire la ramification de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux existants. Cependant, il n'existe pas encore de facon de distinguer les différents effets du traitement sur les cellules cancéreuses. Le but de ce projet est d’utiliser l'imagerie par résonance magnétique (IRM) afin d'évaluer chez la souris 1) la taille de la lésion tumorale suite à l’implantation de cellules tumorales dans le cerveau 2) les modifications des propriétés visqueuses et élastiques du cerveau qui permettent d'évaluer l'intégrité des tissus et l'organisation vasculaire, 3) la circulation du sang dans les vaisseaux et leur organisation.
Bénéfices attendus
Disposer d’un marqueur biologique identifiable par imagerie robustes et non-invasifs pour évaluer les composants individuels de la t umeur, c'est-à-dire la composition des tissus et l'organisation du réseau des vaisseaux. Ces approches d'imagerie sont donc le moyen idéal pour évaluer les effets de la thérapie sur les tumeurs et l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses.
Procédures
Tous les animaux seront soumis a: 1) Imagerie par résonance magnétique au temps J7, J14, J28, J40 après implantation des cellules tumorales dans le cerveau (J0) pour une duree de 2h par souris (réalisé sous anesthésie gazeuse ) 2) prélèvement sanguin (qui dure environ 5 sec) afin d’évaluer la lésion tumorale 1 fois par semaine sans anesthesie pendant toute la duree du protocole 3) euthanasie pour prélever le cerveau.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ne sont pas spécifiques à la procédure car l’IRM n’induit pas de douleur supplémentaire. Néanmoins, en cas d’observation de la douleur des mesures seront prises telles que l’administration d’ analgésiants. La procédure IRM, qui n'induit pas de douleur, sera réalisée malgré l'observation préalable de signes de souffrance liee à l’implantation des cellules tumorales ou a la croissance de la tumeur. Pendant la procédure d'IRM, l'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pendant l’intégralité de la procédure, la fréquence respiratoire est surveillée et l'animal est placé sur un lit chauffé.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure a fin de recuperer les cerveaux pour les analyses biologiques.
Remplacement
Dans ce projet, l'expérimentation animale sera mise en place pour étudier une modification locale de l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses, qui serait difficile à étudier par des moyens alternatifs (par culture cellulaires ou en modélisation par logiciel).
Réduction
Les groupes ont été conçus de manière à minimiser le nombre d'animaux utilisés. Un calcul statistique du nombre de sujets nécessaires a été effectué afin d'évaluer le nombre d'animaux à inclure pour obtenir des résultats significatifs tout en minimisant le nombre d'animaux. Ces calculs ont été rendus possibles par les résultats antérieurs obtenus avec ces modèles animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur seront limités pour garantir le bien-être de l'animal et des résultats fiables. Le stress a un impact important sur le comportement biologique de la réponse immunitaire. Par conséquent, la manipulation des animaux sera réduite au minimum. Toutes les manipulations seront effectuées sous anesthésie. Les soins et le suivi des animaux seront effectués par des personnes compétentes et expérimentées. De facon systematique, du coton est ajoute dans les cages pour que les souris fassent leurs nids. Les critères d'évaluation de la douleur ne sont pas spécifiques à la procédure car l’IRM n’induit pas de douleur supplémentaire. La douleur observée peut être due à l’implantation des cellules tumorales. Neanmoins, en cas d’observation de la douleur des mesures seront prises. Les points les plus précoces sont les troubles du comportement (repli dans un coin, poil hérissé, etc.), l'altération de l'apparence physique (grattage, poil terne, etc.) puis l'anorexie, perte de poids > 20%. Si les points limites sont atteints, l'animal sera euthanasié et ne sera donc pas soumis à la procédure IRM. La procédure IRM, qui n'induit pas de douleur, sera réalisée malgré l'observation préalable de signes de souffrance liee à l’implantation des cellules tumorales ou a la croissance de la tumeur. En effet, si le score comme indiqué ci-dessous indique des signes de douleur et donc la nécessité d'utiliser un analgésiant, celui-ci sera administrée avant de se rendre sur le site de l'IRM. Pendant la procédure d'IRM, l'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pendant l’intégralité de la procédure, la fréquence respiratoire est surveillee et l'animal est placé sur un lit chauffé.
Choix des espèces
L'utilisation des animaux pour etudier le cancer présente de nombreux avantages par rapport à l'utilisation des cellules in vitro (n’utilisant pas de modèle animal). Plus de 80 % des gènes de la souris sont similaires à ceux de l'homme, ce qui a conduit à l'adoption de la souris comme organisme pour etudier la biologie et la thérapie du cancer du cerveau. Beaucoup d'etudes scientifiques ont démontré que les tumeurs dans les animaux, reproduisent mieux les caractéristiques des vaisseaux et des cellules des tumeurs cérébrales humaines. Dans ce contexte, les souris (âge adulte, agées 9-11 semaines) sont soumises à une transplantation dans le cerveau des cellules tumorales, et puis les souris sont soumises au protocole d’IRM pour étudier les propriétés des tissus et développer de nouvelles stratégies diagnostiques.
Etude des effets bénéfiques nutritionnels d’une alimentation enrichie en farine d’insectes
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue par asphyxie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont isolés en cage métabolique puis mis à jeun seize heures, avant la mise à mort et le prélèvement d'organes, pour comparer des farines de quatre insectes destinées à l'alimentation humaine. Le porteur reconnaît que l'environnement appauvri et la privation de nourriture induisent une angoisse et un stress modérés. Il affirme que ces effets nutritionnels ne peuvent être évalués in vitro ni maîtrisés directement chez l'homme.
Objectifs
Pour nourrir la population mondiale de demain, il y a un enjeu majeur à trouver d'autres sources de protéines riches en composés nutritionnel d'intérêt pour pallier la consommation de poissons (dont la disponibilité diminue) et de viandes. Les insectes riches en protéines de haute qualité sont considérés comme une alternative durable aux protéines animales face à̀ la raréfaction des ressources naturelles et à l’augmentation de la population mondiale. Actuellement, 2/3 des terres agricoles dans le monde sont consacrées à l’élevage ou à la production d’aliments pour le bétail. Ce mode de production a des répercussions négatives sur notre environnement, notamment sur l’émission de gaz à effet de serre, sur l’eau potable et sur les surfaces agricoles. L’élevage des insectes, plus vertueux, utilise des déchets organiques et nécessite en moyenne quatre fois moins de nourriture qu’un élevage conventionnel. Suite aux résultats obtenus dans une étude préliminaire précédemment autorisée, il a été identifié une première farine d’insectes, source de protéines et enrichie en certains oligo-éléments (fer). Dans ce contexte, cette étude a pour objectif d’approfondir les effets observés en évaluant les impacts sur d’autres nutriments (fibres, acides gras, acides aminés) mais aussi en évaluant des impacts physiologiques (activité anti-inflammatoire, effet prébiotique, effet sur l’immunité). De plus, 3 autres types de farines provenant d’autres insectes seront étudiées et comparées.
Bénéfices attendus
Nous pensons que le statut nutritionnel en minéraux, oligo-éléments, vitamines, acides aminés, acides gras essentiels et le statut antioxydant de ces farines d'insectes seront supérieur à une alimentation standard, ce qui mettra en évidence un potentiel bénéfice nutritionnel à la consommation de ces farines dont il est envisagé qu'elles puissent être utilisées en alimentation humaine en substitut aux protéines d'origine animale.
Procédures
Les rats seront placés en cage métabolique pendant 40 heures au total. Durant les 24 premières heures, les rats recoivent eau et aliments spéciaux sans restriction. Ensuite, les rats seront placés à jeun pendant 16 heures toujours en cage métabolique, l'eau sera accessible sans restriction durant cette période. A l'issue de la procédure expérimentale, les rats seront mis à mort par asphyxie.
Impact sur les animaux
Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole et la mise à jeun pendant 16h, ceci classe la procédure en classe gravité modérée selon les recommandations réglementaires (https://www.legifrance.gouv.fr/loda/id/LEGITEXT000027038877/2020-09-23/) : en effet, l'environnement apauvri (pendant 2 jours) et la privation alimentaire (pendant une journée) induisent une angoisse et un stress modérés.
Devenir
Les rats seront mis à mort par asphyxie afin de recueillir tissus et organes qui doivent être analysés pour obtenir les résultats scientifiques escomptés.
Remplacement
L'étude des effets bénéfiques nutritionnels d’une alimentation enrichie en farine d’insectes ne peut pas être évaluée in vitro. De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports et les consommations en nourriture enrichie en farines d’insectes sur la durée totale du projet (42 jours) ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres, ce qui ne serait pas possible si l’étude était réalisée directement chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux s’appuie sur une étude statistique de l’effectif nécessaire basée sur des données de la littérature qui permet chez un groupe ayant consommé des protéines d’insectes de mesurer des modifications des statuts nutritionnels statistiquement différentes d’un groupe témoin. De plus, nous souhaitons tester des farines issues de quatre insectes qui présentent des propriétés nutritionnelles différentes afin d’identifier celle qui sera la plus pertinente à proposer pour l'alimentation humaine.
Raffinement
Les rats seront nourris avec un régime standard auquel sera ajouté au maximum 30 % de farines d’insectes. La formulation finale des aliments permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels, caloriques et physiologique des rats (aliments sous forme de croquettes à ronger). Les animaux seront hébergés dans des cages individuelle, dans un environnement adapté et contrôlé dépourvu de pathogènes. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies sans restriction excepté pendant les heures de jeun. Le milieu sera enrichi pour pallier l'isolement. Les rats seront traités selon les règles éthiques de l’expérimentation animale. L’ensemble du projet est mené par un personnel compétent en expérimentation animale qui maîtrise parfaitement les gestes techniques nécessaires. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.
Choix des espèces
Le modèle animal a été choisi en tenant compte de la littérature récente. En effet, les études sur le sujet ont pour la plupart été réalisées sur des rats. Nous nous appuyerons sur les données décrites dans ces études pour l’analyse de nos résultats. De plus, ce projet s’inscrit dans la continuité de l’étude préliminaire précédemment autorisée réalisée sur des rats. Nous utiliserons de jeunes rats âgés de 6 semaines au démarrage de l’étude. Notre étude cible une population de jeunes adultes plus disposée à consommer des protéines issues d’insectes. Nous souhaitons donc adapter notre modèle animal à cette tranche d'âge.
Étude des agents de contraste capables de détection du zinc – un biomarqueur de cancer de pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
345 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart reçoivent une greffe de tumeur du pancréas par chirurgie, puis des injections d'agents de contraste radiomarqués et un prélèvement de sang intracardiaque suivi de la mise à mort, pour étudier la détection du zinc par imagerie. Le porteur indique un suivi par grille de score, avec mise à mort si la perte de poids dépasse 20 % ou si les signes cliniques s'aggravent. Il affirme que la complexité des tumeurs pancréatiques ne peut se modéliser que sur un "organisme vivant entier".
Objectifs
Le zinc revêt un intérêt particulier car il s'agit d'un micronutriment essentiel requis pour plus de 300 processus cellulaires différents. La teneur en zinc est particulièrement importante dans le pancréas : le zinc est relargué avec l’insuline et est impliqué dans le diabète mais aussi dans le cancer pancréatique. C’est estimé que le cancer du pancréas deviendra la deuxième cause de mortalité liée au cancer au cours de la prochaine décennie, dans les pays occidentaux. Son pronostic actuel est extrêmement mauvais avec un taux de survie global à 5 ans de seulement 3% en raison de l'absence de symptômes spécifiques et de l'absence de diagnostic précoce. Des chercheurs ont développé des agents de contraste détectables en IRM sensibles au zinc. Après complexation avec le zinc présent au niveau du pancréas, il va s’ensuivre une variation du signal sur l’image du pancréas. Des études précédentes, déjà validées par le ministère, ont permis l’obtention de preuve de concept de la détection IRM de Zn2+ in vivo dans le cadre du diabète et dans le cadre de l’adénocarcinome de pancréas. Néanmoins, la technique d'IRM ne permet pas une quantification absolue de l'agent de contraste dans un organe d'intérêt du fait que le signal dépend à la fois de la concentration locale d’agent mais aussi de son environnement. L’utilisation d’un analogue radioactif permet l’accès à la distribution relative de l’agent dans l’organisme (biodistribution) car l’activité qui est retenue par chaque organe dépend exclusivement de la concentration locale en agent. L’objectif de cette saisine est d’étudier la biodistribution in vivo (par tomographie d’émission monophotonique, TEMP) et ex vivo (prélèvement d’organes post-mortem à des temps précis), des agents de contraste développés (et validés en IRM) en souris saines et souris modèle de cancer de pancréas (modèles adénocarcinome et insulinome), à l'aide des analogues marqués à l'111In ou à l'165Er, deux émetteurs gamma possibles de visualiser par TEMP.
Bénéfices attendus
L'objectif de cette demande est donc d'évaluer la possibilité de détecter et quantifier le zinc par TEMP, grâce à des agents de contraste dédiés, développés par le client, dans des souris témoins saines et modèles de cancer du pancréas. Des biodistributions ex vivo de ces agents de contraste sont réalisées. L'objectif à long terme de ce projet sera de fournir un diagnostic précoce aux populations à haut risque afin d'accroître leur taux de survie et d'améliorer le suivi des patients après traitement.
Procédures
270 souris auront des greffes orthotopiques au niveau du pancréas (procédures 1, 2, 3) Elles seront placées sous paracétamol (analgésique) dans l'eau de boisson la veille de l’intervention (500mg dans un biberon de 200mL) jusqu’à 24h post induction. L'induction sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2% dans l'air). A la fin de l’intervention, une injection de tolfédine 4mg/kg (anti inflammatoire) sera réalisée en sous cutané (50μL) et renouvelée le lendemain de l'intervention. Elles subiront une seule chirugie lors de l'induction tumorale qui durera 20 minutes maximum. 75 souris vigiles (dont 60 avec des tumeurs pancréatiques) recevront 2 fois 150μL d'agent de contraste radiomarquée par voie intraveineuse au niveau de la queue (à un temps précoce J7 et à un temps tardif J21 ou J35) (procédure 2) et 180 souris vigiles (dont 120 avec des tumeurs pancréatiques) recevront 1 fois 150μL d'agent de contraste radiomarquée par voie intraveineuse au niveau de la queue. 180 souris vigiles portant une tumeur du pancréas recevront une IP de 50μL de glucose 40% (modèle insulinome dans les procédures 1, 2 et 3). 180 souris ((dont 120 avec des tumeurs du pancréas) anesthésiées à l'isoflurane (2% dans l'air) subiront un prélevement sanguin de 400μL en intracardiaque qui sera immédiatement suivi par la mise à mort sans réveil intermédiaire. (procédure 3)
Impact sur les animaux
Les dommages attendus lors de ce projet sont dûs au développement tumoral pancréatique. Pour suivre cela, nous mettons en oeuvre une grille de scoring qui permettra de prendre les mesures nécessaires afin d'éviter toute souffrance chez l'animal. En pratique, une perte de poids et une modification du comportement pourront être observés (diminution de la locomotion, prostration, amaigrissement, aspect du pelage).
Devenir
Procédure 1: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever les foies et les pancréas post mortem pour le dosage du Zinc présent. Procédure 2: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les souris ayant des tumeurs pancréatiques et ayant été injectées avec des agents de contraste radiomarquées ne peuvent être réutilisées. Procédure 3: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort, afin de pouvoir prélever différents organes (pancréas, rate, foie, coeur, poumons, reins, cerveau, intestins, muscles) post mortem afin de quantifier précisément des molécules marquées à l'111In ou à l’165Er préalablement administrées.
Remplacement
Le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisqu'à notre connaissance il n'existe pas de modélisation capable de représenter la complexité des tumeurs pancréatiques et la distribution des agents de contraste à tester in vitro ; cette étude ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles.
Raffinement
Les animaux seront suivis par observation individuelle chaque jour de la semaine pour anticiper, le cas échéant, le développement de douleurs ou de souffrances. Les animaux seront également suivis individuellement par pesée 1 fois par semaine. Si une perte de poids est supérieure à 20% du poids initial, cela entraînera la mise à mort de l’animal (points limites). Par ailleurs, l’absence de socialisation des animaux, le changement d’aspect de la peau (reflet de la qualité du toilettage de l’animal) et l’absence de toilettage seront évalués quotidiennement pour anticiper la souffrance des animaux. Les modèles de tumeur pancréatique peuvent se dérouler sur une période maximale de 35 jours postinjection des cellules. De par notre expérience, à J35, les tumeurs auront une taille inférieure ou égale à 100mm3. Si toutefois un animal venait à présenter des signes de souffrance, il serait mis à mort avant. Une grille de scoring sera utilisée pour le suivi clinique des animaux :ASPECT GENERAL, COMPORTEMENT/ LOCOMOTION, PHYSIOLOGIE CLINIQUE Chaque animal sera mis à mort dès que le score d’un paramètre sera égal à 2, ou dès que le total des scores sera strictement supérieur à 3. De plus, l’imagerie TEMP est une approche non invasive pratiquée sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le modèle d’adénocarcinome chez la souris a été décrit et mis en oeuvre par notre équipe depuis plusieurs années. La lignée immunodéprimée Swiss nude est la lignée qui répond le mieux à l’induction de l’adénocarcinome. Les niveaux de zinc changeant avec la lignée et le sexe des souris, cette même lignée sera utilisée comme témoin et pour l’induction des insulinomes. Des souris femelles âgées adultes de 6-8 semaines seront utilisées conformément aux études déjà publiées sur ce modèle.