Oncologie

L'objet réel du projet est de mettre au point un modèle de cancer du côlon réutilisable dans d'autres études, présenté comme un "outil fiable" pour de nombreuses équipes. 180 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, classées en souffrance modérée et toutes tuées pour analyse. Un polype est induit dans le côlon par une sonde rectale ou par injection chirurgicale sous anesthésie, avec apparition de tumeurs sur 16 à 24 semaines. La finalité affichée est la production d'un modèle animal servant à d'autres travaux, en amont de toute avancée thérapeutique.

Objectifs

Dans le cancer du côlon chez l’homme, les tumeurs commencent souvent par de petits amas de cellules appelés polypes, qui se forment dans le côlon. Mais dans les souris utilisées habituellement pour la recherche, ces polypes se développent surtout dans l’intestin, et très peu dans le côlon. Cela rend l’étude du cancer du côlon plus difficile. Nous cherchons donc à mettre au point une méthode qui permettrait de créer un polype précisément dans le côlon de la souris, pour que ce modèle ressemble davantage à la maladie humaine. Grâce à ce modèle, les chercheurs pourront comprendre comment les cellules du côlon se transforment en cellules tumorales, étudier comment le polype interagit avec son environnement dans le côlon et observer les premières étapes de la formation d’une tumeur. Une fois mis au point, ce modèle pourra être réutilisé dans plusieurs projets de recherche sur le cancer colorectal, ce qui évitera de recommencer tout le travail de mise au point à chaque fois. Il deviendra un outil fiable, pratique et utile pour de nombreuses équipes de recherche.

Bénéfices attendus

Notre projet consiste à créer chez la souris un modèle de cancer du côlon qui ressemble vraiment à ce qui se passe chez l’être humain. Cela permettra aux chercheurs d’étudier comment un simple polype (une petite excroissance dans le côlon) peut évoluer et devenir un cancer. Nous voulons aussi comprendre le rôle de tout ce qui entoure la tumeur, appelé microenvironnement : ce sont les cellules, les tissus et les molécules autour du polype, qui peuvent aider ou freiner son développement. Grâce à ce modèle, nous espérons découvrir ce qui se passe au tout début de la maladie et peut-être trouver des marqueurs qui permettraient de mieux diagnostiquer ou suivre le cancer du côlon chez l’homme. Ce projet est très important, car les premières étapes du cancer colorectal sont encore mal connues et difficiles à étudier sans un bon modèle.

Procédures

Les animaux auront soit une administration unique par voie rectale à l’aide d’une sonde de cathéter (moins de 10 minutes) ou une injection unique directement dans le côlon nécessitant une intervention chirurgicale. Les actes s’effectueront sous anesthésie générale gazeuse (moins de 30 minutes). Ils recevront une dose d’analgésique 30 minutes avant l’anesthésie, 8h après l’intervention et deux dose le lendemain (moins d’une minute).

Impact sur les animaux

La drogue utilisée n’est pas dangereuse aux doses utilisées, mais elle peut parfois provoquer une petite irritation. L’introduction d’une sonde rectale peut entraîner un léger inconfort. Après une intervention chirurgicale, les animaux peuvent ressentir une sensibilité et une petite inflammation autour de la zone opérée. Des petits amas de cellules (polypes) apparaitrons dans le côlon après traitement. Nous avons estimé les effets indésirables attendus sur les animaux en fonction du temps : 16 à 20 semaines après traitement : inconfort léger, parfois un peu moins d’activité ou un pelage moins soigné. 20 à 24 semaines après traitement : inconfort modéré, avec possible sensibilité abdominale, baisse d’énergie ou petites perturbations du transit.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et les organes d’intérêts seront récupérés pour une analyse histologique post mortem.

Remplacement

Ce projet vise à développer un modèle murin du cancer colorectal., afin de mieux comprendre comment débute le cancer colorectal. Pour étudier ces mécanismes, il est nécessaire d’utiliser des organismes vivants complets, car ils possèdent l’ensemble des interactions naturelles présentes dans un corps (circulation sanguine, système immunitaire, environnement cellulaire complexe…). Les modèles murins utilisés dans ce projet reproduisent de manière fidèle les premières étapes de la formation des tumeurs intestinales. À ce jour, aucun modèle en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permet de reconstituer toutes les composantes d’un tissu vivant dans son intégralité. C’est pourquoi l’utilisation de ces modèles animaux reste indispensable pour répondre aux questions scientifiques posées dans ce projet.

Réduction

Nous avons choisi le nombre minimum de souris nécessaire pour obtenir des résultats fiables, en nous appuyant sur des données scientifiques et des méthodes statistiques. Nous utilisons des animaux des deux sexes afin de limiter le nombre total d’animaux élevés et utilisés. Nous commencerons par la méthode qui est moins invasive. Si elle fonctionne, la méthode plus lourde ne sera pas utilisée, ce qui réduira encore le nombre d’animaux nécessaires. Une fois la meilleure technique validée, elle pourra servir dans d’autres projets, évitant de répéter les mêmes étapes et contribuant à diminuer l’utilisation d’animaux à long terme.

Raffinement

Nous avons mis en place toutes les mesures nécessaires pour assurer le bien-être des animaux. Leur état sera vérifié chaque jour, et les procédures seront réalisées sous anesthésie pour éviter la douleur et réduire le stress. Les animaux seront maintenus au chaud jusqu’à leur réveil. Nous surveillerons attentivement tout signe de malaise (perte de poids, diarrhée, saignement, isolement…). En cas de problème, des actions rapides seront mises en place pour soulager l’animal, comme une alimentation plus facile à consommer, des améliorations de l’environnement ou l’administration d’antidouleurs en complément si besoin.

Choix des espèces

Ce projet nécessite un modèle animal proche de l’humain sur le plan physiologique. La souris utilisée ici reproduit très fidèlement les premières étapes du cancer colorectal, car elle développe les mêmes types de polypes que ceux observés chez l’homme. Aucune autre espèce ou modèle de laboratoire ne permet d’étudier aussi précisément le début de cette maladie. C’est pourquoi ce modèle de souris génétiquement modifié est indispensable pour mener à bien ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de 2-3 mois d'âge selon le protocole établi dans la littérature ou lorsqu’ils auront atteint un poids minimum de 20g.

852 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie subit des gavages, une autre deux chirurgies successives, une greffe de cellules tumorales dans le pancréas puis une injection dans la rate pour provoquer des métastases au foie. Le projet étudie le rôle de cellules immunitaires dans la progression d'un cancer du pancréas très agressif. Le porteur présente les organoïdes comme incapables de reproduire le processus métastatique et conclut à la nécessité du modèle vivant.

Objectifs

L’adénocarcinome canalaire pancréatique est un cancer très agressif, qui se propage fréquemment vers le foie. Chez de nombreux patients, des métastases hépatiques sont déjà présentes au moment du diagnostic. Il se développe à partir de lésions précancéreuses (appelées PanIN), mais les mécanismes qui conduisent à leur progression vers un cancer invasif et à la formation de métastases restent mal compris. Des études récentes montrent que le foie peut être modifié avant même l’arrivée des cellules tumorales, créant un environnement favorable aux métastases, appelé niche pré-métastatique. Les macrophages, cellules immunitaires importantes du microenvironnement tumoral, semblent jouer un rôle clé dans ces processus. Cependant, leur implication précise dans la progression de l'adénocarcinome canalaire pancréatique et dans l’apparition des métastases hépatiques n’est pas encore clairement établi. L’objectif principal de ce projet est d’étudier le rôle des macrophages dans la progression des lésions précancéreuses vers un cancer invasif et dans l’initiation des métastases hépatiques, en utilisant un modèle murin génétique. Plus spécifiquement, ce projet vise à : Étudier l’évolution des macrophages dans le pancréas au cours de la progression tumorale. Analyser le rôle des macrophages du foie dans la formation de la niche pré-métastatique. Évaluer l’impact de la modification des macrophages sur la croissance tumorale et la dissémination métastatique. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre le rôle des macrophages dans le développement du PDAC et des métastases hépatiques, et pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à la progression des lésions précancéreuses vers un cancer pancréatique invasif, en s’intéressant en particulier au rôle du microenvironnement tumoral. Il vise également à améliorer nos connaissances sur la formation des métastases de ce cancer, un problème majeur de santé publique. La présence de métastases empêche souvent les patients de bénéficier d’une chirurgie, qui reste actuellement le traitement curatif le plus efficace pour ce cancer. Mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la dissémination tumorale est donc essentiel. Ce projet analysera les changements qui affectent les macrophages au cours du développement tumoral et de la formation de la niche métastatique, ainsi que leur rôle dans ces processus. Les résultats pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Enfin, les données produites seront partagées en libre accès afin de soutenir d’autres travaux de recherche utilisant les mêmes modèles expérimentaux.

Procédures

Certains animaux auront 3 ou 4 gavages, durée 1 minute. D'autres animaux auront deux chirurgies successives : Injection de cellules tumorales dans le pancréas (greffe orthotopique, durée 10 minutes) puis injection dans la rate de cellules tumorales (10 jours plus tard) pour induire des métastases hépatiques (durée 10 minutes). Ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie adaptée.

Impact sur les animaux

Les gavages induiront un stress transitoire léger. Les souris modèles présenteront par la suite une fragilité liée à l’activation de l’oncogène après l’administration de tamoxifène. Le développement progressif de lésions PanIN puis d’un cancer pancréatique invasif (PDAC) peut entraîner une contrainte chronique modérée, se traduisant notamment par une perte de poids, une diminution de l’activité et une altération de l’état général. Dans le modèle orthotopique, induit par chirurgie, les souris subiront deux interventions chirurgicales. Un stress léger et transitoire pourra être ressenti avant l'anesthésie. Ces procédures en elles-mêmes peuvent provoquer une douleur temporaire, et une légère perte de poids. Par la suite, la croissance des tumeurs, en particulier au niveau du foie, peut également entraîner des douleurs et un amaigrissement progressif. L’intensité globale des nuisances est estimée comme modérée selon le stade de la maladie, le modèle utilisé et les points d'arrêt prévus.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin des procédures. Dans le modèle génétique génétique, les souris seront mises à mort à différents stades de la progression tumorale afin de permettre l’analyse des tissus, notamment le pancréas, le foie, les poumons et la rate. Ces prélèvements sont nécessaires pour étudier le microenvironnement tumoral et pré-métastatique à l’aide de différentes techniques biologiques. La mise à mort de tous les animaux est indispensable pour permettre l’analyse des tissus.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro avancés, tels que les organoïdes et tumoroïdes, existent pour étudier le cancer, ils ne permettent pas de reproduire correctement le processus métastatique, qui implique des interactions complexes entre plusieurs organes. Ce projet s’intéresse en particulier au rôle du système immunitaire, notamment des macrophages et des monocytes circulants, dans la progression du cancer pancréatique depuis les lésions précancéreuses jusqu’au PDAC invasif. L’étude de ces interactions nécessite un environnement physiologique complet et un suivi à long terme, qui ne peuvent pas être obtenus avec des modèles in vitro seuls. Des approches in vitro seront néanmoins utilisées en complément pour confirmer certains résultats obtenus chez l’animal, contribuant ainsi à réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, elles ne peuvent pas remplacer entièrement l’expérimentation animale dans le cadre de ce projet.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été limité au strict minimum, en s’appuyant sur les données de la littérature et sur des calculs statistiques d’effectif. Après la mise à mort, de nombreuses cellules, y compris des populations rares, seront collectées afin d’étudier leur rôle dans les tumeurs pancréatiques et les métastases hépatiques à différents niveaux d’analyse (cellulaire, moléculaire et transcriptomique). Chaque animal permettra ainsi de produire un grand nombre de données, optimisant l’utilisation de chaque individu et contribuant à la réduction globale du nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes, dans la limite de cinq animaux par cage, afin d’éviter l’isolement, sauf en cas de nécessité liée à des comportements agressifs. Leur environnement est enrichi avec du matériel adapté (papier, abris en carton) pour réduire le stress. Les animaux sont surveillés quotidiennement par l’équipe de recherche et le personnel de l’animalerie afin d’assurer un suivi rigoureux de leur état de santé. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués pour limiter toute souffrance. Les procédures ont été adaptées pour réduire au maximum les nuisances. Des anesthésies locales ou générales sont utilisées lorsque nécessaire lors des injections, avec des aiguilles fines. Pour les prélèvements sanguins, des dispositifs permettant de contrôler précisément les volumes prélevés sont employés.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent pour notre étude car il nous permet d'utiliser des modèles de tumeurs issus de lignées cellulaires murines ainsi qu'un modèle spontanné qui se rapprochent des pathologies humaines. Ses ressemblances en termes de physiologie nous permettent d'étudier le rôle du système immunitaire dans le processus tumoral dans sa globalité.

2481 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant recevoir une injection d'agent mutagène, une greffe de cellules cancéreuses dans la rate ou la paroi digestive, jusqu'à cinq prélèvements de sang sur quarante-deux jours et un produit qui provoque une inflammation du côlon. Les procédures sont classées au niveau de souffrance modéré. Le porteur signale des diarrhées, une perte de poids d'environ 10 % et des tumeurs pouvant devenir irritantes. L'ensemble vise à décrire le rôle d'une protéine nucléaire dans plusieurs cancers, sans qu'aucun bénéfice thérapeutique ne soit à ce stade autre chose qu'une preuve de concept.

Objectifs

Malgré des avancées dans la prise en charge des patients, les cancers restent la première cause de mortalité prématurée. Ce projet a pour but de décrypter les rôles dans les cancers d’une protéine et à apporter une preuve de concept pour son ciblage thérapeutique. Les cellules cancéreuses doivent s’adapter pour survivre dans un environnement en dehors de leur tissu d’origine. Interférer avec leur capacité d’adaptation, présente une opportunité thérapeutique potentielle. Ceci repose sur la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents. Nos travaux récents suggèrent que notre protéine d’intérêt en est un élément clé. Nos études précédentes ont démontré qu’elle facilite plusieurs étapes de la carcinogénèse, et pourrait représenter une nouvelle classe de cible thérapeutique. Il est nécessaire de mieux comprendre ses fonctions normales et son rôle dans des cancers différents, et tester les effets de son élimination. Notre projet, qui sera réalisé chez la souris, comporte 4 volets. Nous allons : 1) Déterminer si l’élimination du gène chez la souris interfère avec (a) l’équilibre du système immunitaire, comme suggéré dans la littérature scientifique; (b) le vieillissement (un facteur de risque dans les cancers); (c) la tumorigénèse intestinale, induite de différentes façons. 2) Déterminer si l’ablation du gène directement dans les cellules cancéreuses affecte la tumorigénèse et les réponses aux traitements (chimiothérapie ou immunothérapie) dans trois modèles de cancers différents: mélanome, cancers du sein et colorectal. 3) Identifier des protéines partenaires qui affectent aussi la tumorigénèse. 4) Apporter une preuve de concept thérapeutique via une molécule qui permet d’induire la destruction d’une protéine génétiquement modifiée. A terme, ce projet pourrait permettre de développer des nouvelles stratégies thérapeutiques contre les cancers.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment les cellules cancéreuses s’adaptent à leur environnement, aux réponses immunitaires anti-tumorales et aux traitements, et pourrait à terme permettre le développement de nouvelles thérapies.

Procédures

Les interventions sur animaux vigiles prévues sont : 1) des injections . Celles-ci seront uniques, pour injecter un agent mutagène afin d’initier la tumorigénèse, un médicament qui agit sur des cellules cancéreuses, ou un agent qui induit la perte transitoire des cellules immunitaires. Elles durent environ 5 secondes. 2) des piqûres pour prélèvement sanguins. Celles-ci seront effectuées un total de 5 fois sur 42 jours, espacés d’au moins une semaine. Elles durent environ 1 seconde. Les procédures chirurgicales prévues sont uniques, et se font sous anesthésie général. Elles consistent en la greffe des cellules soit dans la rate, soit dans la paroi du tube digestif. La procédure dure environ un quart d’heure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont: 1) L’inflammation intestinale provoquée par la prise dans l’eau de boisson d’un produit qui induit une inflammation transitoire dans le colon. Ceci peut provoquer des diarrhées et induit également une perte de poids d’environ 10% entre les jours 6 et 9 de la procédure. Ensuite les souris reprennent très vite du poids pour revenir à leur poids initial en 3-4 jours. 2) La greffe de cellules sous la peau. Il est possible que les tumeurs, qui généralement ne gênent pas les animaux, deviennent irritantes. Si c’est le cas nous appliquerons des crèmes cicatrisantes et anti-douleur aux animaux concernés. 3) Pour les animaux greffés dans la rate ou dans la paroi du tube digestif, la chirurgie peut entraîner de la douleur ou de l’inconfort liés à l’incision et à la manipulation des organes internes, ainsi que des complications possibles telles qu’une infection, un saignement ou une inflammation locale. Les injections dans la rate peuvent parfois provoquer des lésions ou hémorragies internes, tandis que les injections dans le tube digestif peuvent fragiliser l’intestin et entraîner une infection abdominale ou des troubles digestifs. Enfin, si la suture est arrachée avant cicatrisation, il pourrait y avoir une plaie non-fermée et/ou infectée. Ces souris seront surveillées quotidiennement pour détecter des signes précoces de mal être (pelage non nettoyé, manque de vivacité, perte de poids supérieure à 10%, sur-vascularisation des tumeurs, mauvaise cicatrisation des sutures). Les animaux montrant l’un de ces signes seront suivis quotidiennement et évalués selon une échelle standard de la nuisance afin de prévoir des adaptations, et la mise à mort de l’animal sera effectuée si la nuisance est excessive.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort pour prélèvement d’échantillons.

Remplacement

Un large travail en amont pour étudier les rôles cellulaires de la protéine d’intérêt a préalablement été réalisé dans les cellules en culture. Il n’existe aucune méthode alternative au recours aux animaux pour suivre son éventuel rôle dans la production cellules sanguines, le vieillissement et la tumorigénèse.

Réduction

Nos études précédentes permettent d’estimer avec précision le nombre de souris nécessaires pour générer des données statistiquement robustes. Pour chaque procédure, une étude statistique préalable a été réalisée afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Notre pratique régulière nous permet de réduire au maximum le temps de contention et d’injection. Pour minimiser la douleur de la piqûre, l’aiguille utilisée sera très fine. Pour les prélèvements sanguins, nous utiliserons des lancettes qui possèdent une pointe fine pour une pénétration sans douleur et permettent une collecte de sang facilitée et une cicatrisation rapide. Les cages restent sous surveillance 20 minutes après toute injection pour détecter les éventuels signes de douleurs. Les animaux seront pesés une fois par semaine. Un anesthésique et un analgésique seront utilisées lors des chirurgies pour réduire la douleur. En post-chirurgie de la nourriture et de l'eau gélifiée seront posé à même le sol afin de leur permettre de se nourrir facilement. Enfin, la comparaison des observations quotidiennes des animaux avec une échelle de nuisance pré-établie permettra de prendre des décisions objectives pour soigner les animaux ou, le cas échéant, leur euthanasie si la souffrance est excessive.

Choix des espèces

Les lignées cellulaires de cancer de souris que nous avons choisi reproduisent au mieux les cancers humains. Les animaux génétiquement modifiés pour le gène de Ki-existent uniquement chez la souris, et permettent d’analyser les rôles physio-pathologiques de Ki-67. Les animaux seront utilisés à partir de 2 mois d'âge selon les protocoles établis dans la littérature, lorsqu’ils auront atteint un poids minimum de 20g. Cet âge tient compte de la maturité sexuelle nettement dépassée pour les animaux, compatible avec la description des âges des patients atteints de cancer du sein, colorectal ou mélanome.

Tester si un extrait de larves de vers de farine calme l'anxiété de souris soumises à des changements de gravité, tel est l'objet de ce projet qui utilise 75 souris dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les animaux subissent des gavages ou des injections, trois tests comportementaux, puis une session en manège tournant allant de dix minutes à trois semaines, un stress inspiré de celui des astronautes. Toutes sont mises à mort pour doser des marqueurs d'anxiété dans leurs tissus. Le porteur admet n'attendre que des effets anxiolytiques "légers", ce qui interroge l'ampleur du bénéfice mis en regard de trois semaines d'hypergravité.

Objectifs

Plusieurs extraits de protéines obtenus à partir d’animaux (lait de vache, têtes de saumon, larves de vers de farine) sont intéressants pour diminuer l’anxiété. Ce projet fait suite à une étude précédente qui a permis d’identifier que des protéines issues de larves de vers de farine possède une action de calmant naturel contre l’anxiété. Parmi six extraits différents, l’extrait complet (appelé «Fraction Totale») réduisait le plus efficacement les signes d’anxiété après ingestion chez des souris. La nouvelle étude a pour objectifs principaux d’explorer l’effet préventif et/ou curatif de cet extrait : voir s’il peut aider les souris à mieux gérer le stress soit avant (préventif), soit après (curatif) une exposition à des situations stressantes générées par des changements de gravité. Ces situations de stress sont inspirées de celles que subissent les astronautes.

Bénéfices attendus

Puisque cet extrait réduit l’anxiété, nous souhaitons savoir s’il sera assez puissant pour contrer les effets négatifs provoqué par une simulation de décollage ou de modification de la gravité sur une durée de 3 semaines, deux situations anxiogènes rencontrées par les astronautes. La prise préventive et curative chronique d’extraits anxiolytiques de vers de farine pourrait être une contre-mesure potentielle à cette élévation de l’anxiété.

Procédures

Les animaux subiront, selon le groupe dans lequel ils seront placés : - 2 gavages plus 3 tests comportementaux simples de 5 minutes chacun, ainsi que (1) une session d’accélération puis de décélération en manège tournant d’une durée totale de 10 minutes, ou bien (2) une session de 3 semaines en manège tournant. - Ou 3 injections de calmant plus 3 tests comportementaux simples de 5 minutes chacun ainsi que (1) une session d’accélération puis de décélération en manège tournant d’une durée totale de 10 minutes, ou bien (2) une session de 3 semaines en manège tournant.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress léger de 30 secondes lors des administrations par gavages (2 fois pour certains groupes) ou injections (3 fois pour d’autres groupes). Tous les animaux réaliseront 3 tests comportementaux pouvant induire un léger stress de 5 minutes chacun. Trois groupes d’animaux subiront un stress modéré engendré par une session d’accélération puis de décélération en manège tournant d’une durée totale de 10 minutes. Deux autres groupes d’animaux subiront un stress modéré engendré par une session de 3 semaines en manège tournant. Dans les 2 cas, une augmentation de l’état anxieux des animaux sera attendue.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de procéder à des prélèvements pour des dosages de marqueurs d’anxiété permettant de compléter et de consolider les résultats issus des tests comportementaux.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de méthodes alternatives permettant de reproduire la complexité des phénomènes générés par un changement de gravité chez un organisme, particulièrement lorsque son système nerveux est sous l’influence d’un mélange complexe de composés actifs issus de la digestion d’un aliment. La multitude de paramètres et de facteurs engagés dans cette étude implique l’utilisation de souris en tant qu’organismes complets, dont les actions comportementales dans les divers tests impliqués seront des réponses globales et donc pertinentes quant aux interprétations des résultats dans la problématique des futurs voyages spatiaux.

Réduction

Sur le plan statistique, nous avons fait des simulations à l’avance grâce à un logiciel spécialisé, sur la base des résultats de nos précédentes études ayant montré un effet fort de l’hypergravité sur le niveau d’anxiété des souris, avec persistance de l’anxiété au moins 2 semaines après la fin du stress. On peut s’attendre à ce que les extraits de vers de farine montrent des effets anxiolytiques légers dans ce type de stress. Ainsi, des effectifs de n=15 souris par groupe expérimental sont requis pour permettre la comparaison statistique.

Raffinement

Les tests comportementaux seront réalisés sur une période limitée à 5 minutes par animal. Les administrations par gavage ou injection seront réalisées par le référent de ces gestes au sein de la structure, validé par notre vétérinaire. Tout au long du déroulement de ce projet, une observation quotidienne des souris sera réalisée et ce, même lorsque les souris seront en hypergravité pour 3 semaines, grâce à des caméras présentes dans le manège tournant. Une roue d’activité sera placée dans les cages afin d’enrichir l’environnement. Ainsi, les animaux seront surveillés plusieurs fois par jour, y compris le week-end. Cette surveillance permettra de repérer à la fois des signes indirects d’anxiété et de mal-être. Des points limites adaptés ont été définis.

Choix des espèces

Le modèle souris, particulièrement bien connu dans l'étude du comportement animal, est fréquemment utilisé lorsqu'on cherche à caractériser les effets d'un médicament agissant contre l’anxiété. De plus, nos précédents travaux concernant les effets du changement de gravité ont été réalisées avec ce modèle : souris âgées de 8 semaines au moment du premier test comportemental.

3 824 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection sous-cutanée de cellules tumorales puis jusqu'à treize injections et deux prélèvements sanguins, pour tester des vaccins peptidiques contre le cholangiocarcinome, un cancer des voies biliaires. Le porteur justifie l'effectif par le regroupement des expériences et le partage des tissus, sans détailler le calcul qui conduit à 3 824 animaux. Il rappelle que la maladie tue plus de quatre patients sur cinq en cinq ans, un constat qui situe le bénéfice espéré loin de l'atteinte immédiate infligée aux souris.

Objectifs

Le but de ce projet est d’évaluer l’efficacité de vaccins peptidiques comme nouvelle approche à la fois prophylactique et thérapeutique du cholangiocarcinome, un cancer agressif et encore mal pris en charge qui affecte les voies biliaires. L’objectif est de stimuler le système immunitaire afin, non seulement, de prévenir l’apparition de la tumeur, mais aussi de limiter sa progression et d’améliorer la réponse aux traitements existants.

Bénéfices attendus

Le cholangiocarcinome est le second cancer du foie en fréquence avec une incidence de 1.5 sur 100.000 habitants en Occident. Il présente l’un des pronostics les plus sombres, avec moins d’un patient sur cinq encore en vie après cinq ans, en raison notamment d’un arsenal thérapeutique actuel peu efficace. Ce projet nous permettra de valider une nouvelle stratégie pour la prévention et le traitement du cholangiocarcinome, non disponible à ce jour en clinique.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une seule injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (moins de 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à des injections sous anesthésie générale (pour un total maximum de 4, moins d’une minute par animal) et une partie des animaux vigiles sera soumise à des injections (pour un maximum total de 9, moins d’une minute par animal). Tous les animaux vigiles seront soumis à un maximum de 2 prélèvements sanguins (durée d’environ 2 minutes). A la fin des expériences, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L’induction tumorale peut conduire à des effets indésirables (cachexie) et peut induire une gêne chez l’animal. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et de la détresse respiratoire. Les traitements de chimiothérapie et immunothérapie peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et un risque de péritonite associé aux administrations fréquentes. Les sites d’injections et de prélèvements peuvent s’infecter. Les prélèvements sanguins peuvent induire des hématomes. La manipulation et la contention des animaux peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude consiste à évaluer l’efficacité prophylactique et/ou thérapeutique de vaccins peptidiques dans un modèle de cholangiocarcinome ectotopique. Ces vaccins peptidiques ont été développés, in vitro, par clonage de 13 antigènes identifiés (ex vivo) par des analyses immunopeptidomiques et immunologiques complémentaires. Cette étude peut être conduite seulement in vivo car il n’y a pas d’autres modèles pour pouvoir étudier l’efficacité de la vaccination et ses mécanismes, notamment immuno-dépendants, vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 3824 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les procédures seront effectuées de manière séquentielle : seulement les traitements qui s’avèrent efficaces lors de la première procédure seront utilisés dans les procédures suivantes; et elles seront effectuées seulement si les procédures précédentes s’avèrent efficaces. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes homogènes de souris pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous utiliserons des tests statistiques pour évaluer et comparer les effets immunologiques dans les divers groupes de traitements. Une veille bibliographique attentive et constante sera effectuée pour s’assurer que les expériences planifiées n’ont pas été déjà rapportées dans la littérature scientifique.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger, maisonnettes, …). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Le comportement général des animaux sera suivi. Le poids sera mesuré 1 fois par semaine. Avant l’administration des produits, les sites d’injections seront désinfectés. Des points limites surveillés seront mis en place lors des procédures de croissance tumorale. L’anesthésie gazeuse des animaux sera effectuée (avec tapis chauffants). Aucune médication supplémentaire ne sera administrée au cours des expériences, car les effets secondaires sur le système immunitaire pourraient interférer avec les résultats. Si les souris apparaissent affaiblies (prostration) pendant la procédure, la nourriture et l’eau seront mises à l’intérieur de la cage pour leur faciliter l’accès ainsi que du coton pour les réchauffer.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques. La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Notre établissement utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

Toutes mises à mort à l'issue pour prélèvement des tumeurs et des organes, 288 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules cancéreuses du sein, jusqu'à six injections intraveineuses dans la queue, des mesures d'haleine en cage métabolique et une ponction intracardiaque, pour tester une molécule qui libère à la fois une chimiothérapie et un marqueur volatil détectable dans l'haleine. Les bénéfices annoncés pour les patientes, un suivi en temps réel et moins d'effets secondaires, restent au conditionnel et à long terme. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la diffusion du marqueur dans un "organisme entier" et conclut au caractère "indispensable" de la souris.

Objectifs

Le cancer reste l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès estimés chaque année selon l’Organisation mondiale de la Santé. Le cancer du sein constitue la première cause de décès par cancer chez les femmes. Certaines formes de cancer du sein sont particulièrement agressives, avec un risque élevé de rechute. Malgré les progrès récents en cancérologie, les traitements disponibles restent limités et le suivi de leur efficacité demeure difficile. Ce projet propose de tester une nouvelle approche qui combine, traitement et suivi de l’efficacité du traitement dans une même molécule. Cette molécule reste inactive dans le sang et ne s’active qu’au contact de certaines substances présentes autour de la tumeur. Une fois activée, elle libère à la fois une chimiothérapie et une petite molécule volatile détectable dans l’haleine ou dans le sang. La chimiothérapie agit directement sur la tumeur, en limitant les effets secondaires sur les tissus sains. La libération de la molécule volatile sur le site tumoral permet de suivre l’efficacité de la chimiothérapie sans recourir à des examens invasifs. Le projet prévoit d’évaluer une molécule issue de cette technologie. Au préalable, nous évaluerons l’efficacité de cette molécule sur des cellules tumorales humaines en boite de culture. Par la suite, le composé sera testé sur un modèle murin. Ce modèle permet de reproduire au plus près la physiologie complexe d’un organisme humain. En effet, à ce jour, aucun modèle biologique, autre que les modèles animaux, ne peut reproduire le fonctionnement du système respiratoire et de la circulation sanguine de manière optimale. À terme, cette approche vise à offrir une nouvelle option thérapeutique pour les cancers du sein agressifs. Cette approche permettra d’améliorer la prise en charge clinique, de réduire les effets secondaires et de faciliter le suivi personnalisé des patientes.

Bénéfices attendus

Dans le domaine de l’oncologie, le développement de nouvelles approches thérapeutiques demeure une priorité majeure, notamment pour les cancers solides tels que le cancer du sein, dont certains sous-types restent difficiles à traiter. Cette approche pourrait apporter plusieurs bénéfices importants dans la lutte contre le cancer du sein. Elle permettrait de suivre l’évolution de la tumeur en temps réel grâce au sous-produit volatil libéré dans l'organisme. Cette approche limite ainsi le recours à des examens lourds ou invasifs nécessaires au suivi de l’efficacité thérapeutique. Ce suivi rapide de l’efficacité des traitements, permettrait de l’ajuster plus précocement en fonction de la réponse de la tumeur. D’autre part, comme cette molécule est activée au niveau de la tumeur, cela réduit les effets secondaires souvent observés avec les chimiothérapies classiques. À terme, cette approche innovante présenterait un intérêt clinique majeur car elle offrirait une nouvelle façon d’évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux tout en améliorant le confort et la qualité de vie des patientes.

Procédures

La totalité des animaux seront soumis à un baguage auriculaire des animaux sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour permettre leur identification. Dans l’étude de toxicité chaque animal subit les actes suivants : 6 injections intraveineuses par voie caudale (2 injections par semaine pendant 3 semaines) 1 injection maximum sur animal vigil, sous anesthésie locale, jusqu’à 5 injections sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. 1 mesure de l’haleine par animal durant 2 heures sur animaux vigiles, en cage métabolique 3 prélèvements sanguins submandibulaires sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane avec une fréquence : 1 prélèvement avec un intervalle de plus de 7 jours sur 3 animaux . Dans l’étude de libération du sous-produit volatil sur le site tumoral chaque animal subit les actes suivants : 1 injection sous-cutanée de cellules cancéreuses du sein ou PBS/matrigel (selon le lot) sous anesthésie gazeuse. 1 injection intraveineuse par voie caudale sur animal vigile, sous anesthésie locale. 1 mesure sur l’haleine par animal d’une durée comprise entre 30 minutes et 2 heures sur animal vigile, en cage métabolique 1 ponction intracardiaque gazeuse à l’isoflurane avec analgésie à la buprénorphine Certains animaux subiront 1 prélèvement sanguin submandibulaire sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour le groupe 4 heures après l’injection du composé. Dans l’étude d’efficacité antitumorale chaque animal subit les actes suivants : 1 injection sous-cutané injection de cellules cancéreuses du sein sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. 6 injections intraveineuses par voie caudale (2 injections par semaine pendant 3 semaines) : 3 injections maximum sur animal vigile, sous anesthésie locale et 3 injections sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. 3 mesures de l’haleine par animal entre 30 minutes et 2 heures sur animal vigile, en cage métabolique. 3 prélèvements sanguins submandibulaires sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane avec une fréquence : 1 prélèvement tous les 7 jours à un temps post-injection défini précédemment.

Impact sur les animaux

Les souris immunodéprimées présentent un phénotype fragile et sensible aux infections. Ce phénotype nécessite des conditions d’hébergement adaptées, telles que celles présentes au sein de notre animalerie. L’utilisation de l’anesthésie gazeuse au cours de ce projet peut provoquer un stress léger et passager lors du réveil des animaux. Cette anesthésie sera utilisée pendant l’implantation des cellules tumorales en sous cutanée, les injections et les prélèvements sanguins ainsi que le marquage auriculaire. La croissance des tumeurs en sous-cutané entraînera une gêne locomotrice proportionnelle à la taille de la protubérance tumorale. Enfin les injections intraveineuses de composé pourront être réalisées chez des animaux vigiles sous anesthésie locale à l’aide de tubes de contention, ce qui induit un stress et l’inconfort pour les animaux.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Des études des tissus, incluant des prélèvements d’organes et de tumeurs, seront réalisées post mortem. Ces études sont absolument fondamentales. Elles permettront de vérifier dans les tumeurs récupérées après la mise à mort, l’efficacité de notre composé sur les tumeurs ainsi que leurs effets potentiels chez des animaux ne portant pas de tumeur. De plus, ces procédures permettront également d’investiguer le mécanisme d’action de notre composé. Nous réaliserons différents marquages immunohistochimiques de protéines cibles couramment étudiées en cancérologie. Nous évaluerons aussi les niveaux d’enzymes dans le tissu intra-tumoraux et péri-tumoraux sur les tissus à l’aide de techniques de chimie analytique.

Remplacement

Les paramètres de distribution de notre composé ne peuvent être obtenus qu’au moyen d’animaux. Ces études précliniques sont indispensables avant toute évaluation en essais cliniques chez l’homme. À l’heure actuelle aucun modèle non biologique ou in vitro ne permet de réaliser ces analyses sans perte d’informations scientifiques essentielles. Le développement de notre composé nécessite le recours à un modèle systémique complexe intégrant les systèmes circulatoire et respiratoire. En effet, l’activation du composé dans l’environnement tumoral entraîne la libération d’un sous-produit volatil. Ce dernier diffuse dans la circulation sanguine, puis est transféré vers le système respiratoire, où il est finalement expiré par les animaux. La détection du sous-produit de notre composé dans l’haleine des animaux constituera un marqueur direct de la libération du composé au sein du microenvironnement tumoral. Elle servira également de marqueur indirect de l’efficacité du composé sur la tumeur. Ce phénomène repose sur des interactions physiologiques dynamiques entre plusieurs organes. Elles sont impossibles à reproduire de manière pertinente à l’aide de modèles in vitro ou in silico. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable pour reproduire fidèlement la diffusion et l’élimination du sous-produit volatil dans l’organisme.

Réduction

Afin de limiter le nombre de composés à tester chez l’animal, des essais préliminaires in vitro ont été réalisés sur des lignées cancéreuses afin d’évaluer leur efficacité et la libération du sous-produit volatil. Nous avons ainsi pu réduire le nombre d’animaux grâce à ces études. De plus, seul le composé le plus prometteur sera ainsi évalués in vivo. Nous disposons également des connaissances et du savoir-faire technique pour mesurer les produits volatils contenus dans l’haleine chez l’animal. En effet, cette technique a déjà été mise en œuvre avec succès lors de précédentes études in vivo menées par notre équipe. Cette maîtrise de la technique réduit les risques d’échec des mesures. Elle contribue aussi à limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant des essais exploratoires supplémentaires. Les protocoles ont été conçus pour maximiser les informations obtenues tout en minimisant la douleur et la souffrance des animaux. De plus, certaines parties des procédures seront réalisées de manière séquentielle. Nous ajusterons les différents paramètres expérimentaux sans mobiliser l’ensemble des souris dès le départ, conformément au principe de réduction. De plus nous avons prévus de faire des tests pilotes qui seront des étapes conditionnant la poursuite de certaines procédures. Une organisation optimisée des groupes expérimentaux permettra également de réduire le nombre d’animaux sans compromettre la fiabilité des résultats. Le nombre d’animaux a été déterminé grâce à une analyse statistique a priori permettant de déterminer le nombre minimal qui donnera des résultats robustes. Les données utilisées pour le calcul se basent sur des données issues de la littérature décrivant des modèles murins comparables. Le calcul conduit à un effectif de 12 souris par groupe permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante tout en respectant le principe de réduction des animaux. Ces procédures d’expérimentation animale sont nécessaires pour progresser dans la mise au point de nouvelles thérapies anti-tumorales et de procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. À ce jour, aucun modèle alternatif ne permet de réaliser de manière fiable des études biologiques aussi complexes. De plus, la collecte post-mortem des organes et des tumeurs permettra de compléter nos procédures à posteriori.

Raffinement

Des mesures de raffinement ont été mises en place afin de réduire la douleur, la souffrance, le stress et l’anxiété des animaux tout au long du protocole. À leur arrivée, les souris immunodéprimées présentent un statut sanitaire contrôlé garantissant l’absence d’agents infectieux connus. Elles seront hébergées dans des armoires ventilées en pression positive qui sont adaptées au maintien de leur statut sanitaire et permettent de limiter l’expression de leur phénotype immunodéficient. Les animaux seront maintenus en groupes dans un environnement enrichi, grâce à la présence de tunnels, et des modules en bois, favorisant leurs comportements naturels et leurs interactions sociales. Les conditions d’hébergement seront strictement contrôlées, et une période d’acclimatation de 10 jours. Au cours cette période, les animaux seront progressivement habitués aux manipulations grâce à la distribution de récompenses alimentaires stérilisées, afin de réduire le stress. Les interventions susceptibles de provoquer de la douleur, telles que l’implantation tumorale, le baguage auriculaire et les prélèvements sanguins, seront réalisés sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, avec maintien de la température corporelle. Lorsque cela est compatible avec le protocole expérimental, les injections seront également réalisées sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane afin de réduire la douleur. Dans les cas où l’anesthésie gazeuse n’est pas possible, une anesthésie locale (lidocaïne gel) sera utilisée pour garantir le confort des animaux tout en préservant l’intégrité des mesures. Pour anticiper toute douleur, une analgésie adaptée sera systématiquement mise en place, incluant des injections et l’ajout de buprénorphine dans l’eau de boisson. Toutes les manipulations seront effectuées avec du matériel stérile à usage unique afin de minimiser le risque de contamination. L’état clinique et le comportement de chaque animal seront évalués quotidiennement à l’aide d’une grille d’observation spécifique, permettant de détecter précocement tout signe de souffrance. Des points limites précis et validés seront appliqués pour assurer une prise en charge rapide et appropriée des animaux présentant des signes cliniques anormaux. Si les animaux atteignent les points limites nous effectuons une mise à mort par dislocation cervicales sous anesthésie gazeuse. De plus, toutes les mises à morts seront réalisées après sédation pour limiter le stress des animaux et améliorer la réalisation de l’acte.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées offrent la possibilité de développer des modèles tumoraux humains sans risque de rejet immunitaire. Les techniques employées pour l’induction tumorale sont rapides, reproductibles et bien documentées, ce qui permet de connaître précisément les limites éthiques associées à ce type d’expérimentation. Ces modèles animaux sont essentiels pour le développement de nouvelles thérapies et pour leur évaluation préclinique avant d’être testées chez l’homme. La souris constitue l’espèce la mieux adaptée et la mieux caractérisée pour la réalisation de protocoles de thérapie in vivo. Nous allons avoir recours à des souris ayant 5 semaines. À ce stade de développement, elles sont considérées comme jeunes adultes et présentent une capacité optimale de prise tumorale. Une période d’acclimatation de 10 jours sera mise en place à leur réception, afin de leur permettre de s’habituer à leur nouvel environnement. Les procédures expérimentales débuteront lorsque les souris auront atteint l’âge de 7 semaines.