Oncologie

76 souris mâles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de sang intracardiaque et de tissus. Pendant douze semaines, elles reçoivent des régimes riches en gras et en sucre, des prélèvements sanguins répétés à l'entaille de la queue, des gavages de glucose et de lipides et des injections d'insuline et d'héparine. Le porteur note que les prises de sang répétées sur douze semaines peuvent générer un stress modéré malgré l'espacement des tests. L'étude cherche à mesurer l'effet d'une féverole fermentée sur le métabolisme et le microbiote, et n'inclut que des mâles.

Objectifs

Ce travail s’inscrit dans une démarche globale d’exploration des bénéfices potentiels de la substitution partielle de protéines animales par des protéines végétales fermentées, dans le cadre d'un programme qui promeut le développement et la valorisation des protéines végétales dans l’alimentation humaine. La féverole (FB) (Vicia faba) est une légumineuse cultivée en Europe et reconnue pour sa forte teneur en protéines (25–30 %). Elle représente une piste majeure pour diversifier les sources protéiques et réduire la dépendance aux protéines animales dans un contexte de transition agroécologique. Sur le plan nutritionnel, elle est riche en acides aminés essentiels, en fibres fermentescibles et en composés bioactifs. Toutefois, la présence de facteurs antinutritionnels peut limiter sa digestibilité. La fermentation lactique des concentrats de féverole constitue une approche prometteuse pour améliorer ses qualités nutritionnelles en augmentant la digestibilité, en réduisant les composés antinutritionnels et en modulant favorablement les populations bactériennes intestinales. Dans ce contexte, ce projet vise à déterminer dans quelle mesure la substitution d’une partie des protéines animales par des protéines de (FB) fermentées peut influencer la santé cardio-métabolique et les composition/fonction du microbiote intestinal. L’étude des effets métaboliques d’une consommation de concentrats protéiques fermentés chez la souris après le sevrage, permettra d’évaluer l’impact de différents régimes (protéines animales, FB non fermentée, FB fermentée) sur la croissance, le métabolisme lipidique, la tolérance au glucose, l’inflammation de bas grade ainsi que la santé intestinale et la composition du microbiote. Des approches métabolomiques et transcriptomiques permettront d’identifier les voies biologiques modulées par ces régimes. L’impact de ces régimes sur le microbiote intestinal sera analysé en caractérisant sa composition taxonomique et fonctionnelle. Nous rechercherons si la fermentation des protéines de FB modifie favorablement la structure et les fonctions microbiennes intestinales. Ce projet vise à apporter des connaissances nouvelles sur le rôle d’ingrédients fermentés issus de légumineuses dans la prévention des pathologies métaboliques, sur les mécanismes impliquant le microbiote intestinal, et sur le potentiel de leur intégration dans l’alimentation humaine dans un objectif de santé publique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à générer des connaissances essentielles sur l’impact de protéines végétales fermentées issues de la féverole (Vicia faba L.) sur la santé cardio-métabolique d’un mammifére et sur son microbiote intestinal. Les résultats attendus présentent un double intérêt, à la fois scientifique et sociétal. Ce projet permettra d’améliorer la compréhension des effets des protéines végétales fermentées sur la santé cardio-métabolique, en évaluant leur impact sur le métabolisme glucidique et lipidique ainsi que sur l’inflammation de bas grade. Il contribuera également à identifier des signatures métaboliques et microbiennes associées aux régimes à base de féverole, offrant de nouveaux biomarqueurs pour les recherches futures. Les résultats soutiendront le développement d’aliments plus durables et plus sains, en cohérence avec les objectifs du programme scientifique, et pourraient contribuer à la prévention des pathologies métaboliques chez l’humain.

Procédures

Des prélèvements sanguins seront réalisés les semaine 1, semaine 6, semaine 9, semaine 10, semaine 11 et semaine 12 du protocole sur animal vigile pour effectuer les tests de tolérance au glucose et aux lipides. Aprés administration des solutions (glucose, lipide) par biberonage ou gavage, des préevements sanguins seront effectués pour des dosages. Ils sont effectués par incision superficielle de l’extrémité de la queue, après désinfection et application préalable de lidocaïne et sont réalisés à 1 semaine d’intervalle minimum. Chaque goutte de sang correspond à un volume d’environ 5µL et le recueil ne dépassera pas 70µL par session sauf pour le test de tolérance aux lipides où le volume devra être de 180 µL au total. L’hémostase au niveau de la queue sera assurée par compression locale pendant 60 secondes à chaque prélèvement. Seulement en cas de nécrose de la queue, le prélèvement de sang sera réalisé par ponction de la veine caudale latérale après réchauffement de la queue de la souris sur un pad chauffant, ou bien un prélèvement dans la veine faciale submandibullaire.

Impact sur les animaux

Pour les souris incluses dans ce projet, les nuisances induites par la procédure seront limitées aux manipulations pour l’administration de lipide par gavage, de glucose par gavage ou biberonage, l’injection d’insuline, l’injection d’héparine, les prises de poids, les prélèvements sanguins ainsi que la mise à mort des animaux. Les prélèvements de sang réalisés à l’extrémité de la queue peuvent provoquer une gêne passagère, un stress léger et une douleur brève au moment de l’incision. Le test fonctionnel de tolérance au glucose implique l’administration d’une solution de glucose par biberonnage volontaire des souris ou bien par gavage gastrique, pouvant générer un stress transitoire lié à la contention et à la manipulation, de courte durée. Il en est de même pour le test fonctionnel de tolérance aux lipides qui implique un gavage en contention douce de l’animal, provoquant ainsi un stress transitoire. L’injection intrapéritonéale d’insuline générera un inconfort transitoire lié à la manipulation et à la procédure invasive. L’injection unique d’héparine en fin de protocole est également susceptible d'entraîner une gêne momentanée. L’ensemble de ces effets indésirables est attendu comme léger à modéré, transitoire, et limité par des pratiques de raffinement (contention douce, personnel formé, surveillance des animaux, arrêt anticipé en cas de signe clinique anormal). Cependant les prises de sang répétees sur la durée de 12 semaines d'expérimentation, bien que espacées d'au moins 1 semaine entre 2 tests peut générer un stress modéré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude afin de permettre la réalisation des analyses biologiques finales sur prélèvements de sang intracardique et de tissus, indispensables aux objectifs scientifiques du projet. Aucun animal n’est maintenu en vie à la fin du protocole.

Remplacement

Le recours au modèle murin est indispensable pour répondre aux objectifs du projet. Les interactions entre alimentation, métabolisme, microbiote intestinal et inflammation impliquent des mécanismes physiologiques complexes qui ne peuvent être reproduits ni par des modèles in vitro, ni par des simulations in silico. Les paramètres étudiés (tolérance au glucose, sensibilité à l’insuline, régulation lipidique, réponses inflammatoires systémiques, modifications du microbiote) nécessitent un organisme entier dans lequel les systèmes digestif, immunitaire et métabolique et microbien, interagissent. Aucun modèle alternatif ne permet aujourd’hui de refléter fidèlement cette intégration physiologique. Le recours aux animaux est donc justifié scientifiquement et constitue la seule approche pertinente pour répondre à la question posée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’obtenir une puissance statistique suffisante tout en respectant l’objectif de minimiser l’utilisation d’animaux. Une analyse de puissance satistiques indique qu’un effectif théorique de 12 animaux par groupe serait nécessaire. Nous choisissons d’utiliser 14 animaux par groupe, cet effectif correspond au standard utilisé dans l’unité pour les études nutritionnelles et métaboliques, où il permet régulièrement d’obtenir des résultats robustes malgré la variabilité biologique qui est relativement faible pour des animaux consanguins. Par ailleurs, toutes les mesures physiologiques (poids, prise alimentaire, glycémie, insulinémie, prélèvements sanguins, collectes fécales) sont réalisées longitudinalement sur les mêmes individus, ce qui maximise la quantité de données obtenues par animal et évite la constitution de groupes supplémentaires. Pour tester l'appétit des souris (procédure 1) nous utilisons un effectif minimal (6 animaux) puisque le but est juste de vérifier que les animaux mangent et ne perdent pas de poids. Ainsi, le design expérimental adopté permet de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire, tout en garantissant la validité et la robustesse des résultats. Nous ne testerons les effets des régimes que sur des souris de sexe mâle.

Raffinement

Les procédures ont été conçues pour limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Les manipulations (pesées, collecte fécale, distribution des aliments) sont non invasives et réalisées avec une contention minimale, rapide mais sans brusquerie, par un personnel compétent et entraîné. Le stress généré par la pesée des animaux et des prélèvements sanguins seront limités du fait de leur mise en oeuvre dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale et des recommandations relatives aux volumes de sang prélevés. Les tests métaboliques (OGTT, ITT, OFTT) sont effectués par du personnel expérimenté, avec des jeûnes courts (4h à 12h) pour réduire le stress. Les animaux sont hébergés par 2 dans des cages enrichies à l’aide de matériau cellulosique pour le nid et de tunnels et font l’objet d’une surveillance quotidienne. L’absence de nuisance durable sur le bien-être animal sera néanmoins vérifiée par observation des animaux lors des visites qui seront effectuées quotidiennement et les observations seront recueillies dans un fichier de suivi des souris (Annexe 1). Tout animal présentant une perte de poids supérieure à 20 %, une léthargie marquée, un refus persistant de s’alimenter, une respiration anormale ou un comportement anormalement agressif persistant sera immédiatement retiré du protocole en accord avec le resposnable SBEA. Toute souffrance est anticipée par des points limites stricts (Annexe 2) ce qui conditionnera les éventuelles décisions d’administration d’analgésique sous-cutané dans le cas d’observation de signes attestant d’une souffrance ou si score de point limite supérieur à 22 (Annexe 2) a mise à mort sera proposée par le responsable SBEA et réalisée sous anesthésie générale profonde, garantissant l’absence de douleur.

Choix des espèces

Le modèle murin C57BL/6J est une lignée de souris est largement utilisé en recherche métabolique et nutritionnelle car il développe de manière reproductible une obésité, une altération de la tolérance au glucose, ainsi qu’une résistance à l’insuline lorsqu’il est exposé à un régime riche en sucre et graisse. Par ailleurs, le microbiote intestinal de la souris est l’un des plus étudiés en recherche préclinique, avec des signatures microbiennes bien référencées, ce qui en fait un modèle pertinent pour examiner les interactions nutrition–microbiote. Aucun modèle in vitro, ex vivo ou alternatif ne permet actuellement de reproduire l’ensemble des interactions physiologique entre digestion, microbiote, immunité et métabolisme. Ce choix est donc scientifiquement justifié, cohérent avec les standards internationaux en nutrition/microbiote, et indispensable pour répondre aux objectifs du projet. Les animaux à leur arrivée à l’animalerie auront 28 jours. À cet âge, les souris sont pleinement autonomes : elles ont achevé la transition alimentaire vers le solide, régulent correctement leur température corporelle et ne dépendent plus des soins maternels. A 35 jours de vie nous leur apporterons les différents régimes alimentaires à tester. A cet âge la croissance somatique des souris est presque stable et leur poids proche du plateau physiologique. Les régimes seront appliqués pendant 12 semaines. Les variations pondérales que nous observerons au cours du protocole reflèteront essentiellement des modifications de la composition corporelle — notamment l’accumulation de masse grasse induite par les différents régimes — et non la croissance physiologique normale des animaux. Ce stade post-sevrage avancé constitue également une période pertinente pour étudier la maturation du microbiote intestinal, qui est suffisamment structuré pour permettre l’analyse des interactions nutrition–microbiote, tout en restant sensible aux modifications alimentaires. Par ailleurs, les tests métaboliques tels que tolérance aux sucres et aux ainsi que les suivis physiologiques (poids, mesures des lipides plasmatiques) présentent à cet âge une fiabilité et une reproductibilité reconnues. L’utilisation d’animaux plus âgés ne permettrait pas d’évaluer l’impact des régimes durant les fenêtres critiques de maturation métabolique, tandis que l’utilisation d’animaux plus jeunes exposerait inutilement à des contraintes supplémentaires et obligerait à prendre en compte la croissance.

Une injection de toxines dans le cerveau pour détruire des neurones, un choc électrique de 0,7 milliampère et une restriction alimentaire : 2 280 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Plusieurs modèles de la maladie de Parkinson sont reproduits, avec pose d'une canule cérébrale et injections répétées sur quatre semaines, suivies de tests comportementaux et d'imagerie. Le protocole prévoit la mise à mort dès qu'un rat atteint des points limites : perte de 20 % du poids, prostration, automutilation ou hémorragie. L'objectif est d'identifier des marqueurs d'imagerie des troubles moteurs et cognitifs, sur des modèles dont le porteur reconnaît qu'ils ne reproduisent que partiellement la maladie humaine.

Objectifs

Le projet se déroulera désormais dans 2 EU. La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par les classiques signes moteurs permettant le diagnostic mais également par des troubles cognitifs et psycho-comportementaux, plus variables dans leur apparition et leur expression, mais ayant un impact considérable sur l’autonomie et la qualité de vie des patients ainsi que sur les décisions thérapeutiques. Pourtant, leur prise en charge reste limitée et requiert une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, notamment via l’identification de biomarqueurs. Les biomarqueurs sont des indicateurs des processus pathogènes et des outils précieux tant pour faciliter le diagnostic précoce, que pour suivre l’évolution de la pathologie ou l’efficacité d’un traitement. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ses explorations anatomiques et fonctionnelles, combinée à des méthodes spécifiques d’analyse a récemment permis de mettre en évidence des marqueurs de certains des troubles observés en clinique. Cependant son utilisation reste encore marginale notamment pour le diagnostic, et le lien entre ces marqueurs d’imagerie et l’histologie reste à établir. Cette corrélation est indispensable tant à la compréhension des mécanismes sous-jacents qu’à la validation de ces marqueurs en tant que Biomarqueurs de la pathologie. L’utilisation de modèles animaux est le moyen le plus adapté pour mener ce type d’études. Cependant, ils ne miment que partiellement la pathologie humaine et chaque modèle présentent des avantages et des limites. Il convient donc de valider les résultats obtenus sur plusieurs modèles complémentaires pouvant représenter les différents aspects physiopathologiques de la maladie. Le présent projet vise d’abord à étudier plusieurs de ces modèles afin de reproduire les différents troubles moteurs et non moteurs associés à la pathologie. Les objectifs seront ensuite d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en IRM/TEP et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent. Enfin, en fonction des résultats de cette première partie (et des résultats in vitro fait en parallèle), certains de ces modèles seront reproduits afin de tester l’effet de stratégies thérapeutiques . Un modèle de démence induite par une déplétion cholinergique centrale sera aussi utilisé comme contrôle positif de déclin cognitif sévère afin de contrôler l’efficacité de ces stratégies.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM ou TEP) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Ces biomarqueurs pourraient être validés et utilisés en clinique pour aider au diagnostic de certains troubles, le suivi non invasif de l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet des traitements. L'étude des mécanismes sous jacents permettra l'idenitfication de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dont l'efficacité sera testée.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales visant à injecter des toxines pour induire des lésions cérébrales (30 minutes) dans l'EU2/2 pour les AAV2/9 hm-alpha-syn en A2 et dans l'EU1/2 pour les autres toxines (6OHDA, MPTP, IgG saporine). Après transfert dans l'EU1/2, certains d'entre eux subiront à nouveau une procédure chirurgicale pour l'implantation d'une canule d'administation cérébrale (30 minutes). Certains animaux subiront des injections sous-cutanées ou intra-péritonéales (Maximum 2/jours pendant 4 semaines). Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux dont certains nécessitent une restriction alimentaire avec rationnement, ou la délivrance d'un choc electrique (0,7 mA - 2 sec, 1 seule fois). Le transport entre les 2 EU sera assuré par un transporteur agréé respectant les conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA.

Impact sur les animaux

Les toxines injectées induisent une dégénérescence des voies cérébrales dopaninergiques et/ou cholinergiques, un déficit du contrôle moteur et/ou cognitif est donc attendu et étudié dans ce projet. Une perte de poids corporel peut aussi être observée chez certains animaux plus sévérement lésés. L'anesthésie subie lors de la chirurgie ou de l'imagerie en IRM pourrait être mal tolérée par certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. La restriction alimentaire associée au touchscreen pourrait être mal tolérée par certains animaux. La pose de canule intracérébrale et les injections de traitments pourraient être mal tolérées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des évaluations en imagerie in vivo ou après l'evaluation des effets thérapeutiques sur ces variables

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux pour étudier la physiopathologie de troubles cognitifs et comportementaux. Cependant pour limiter l’utilisation d’animaux, l'étude de la potentielle toxicité, des mécanismes d'action et l’efficacité des molécules thérapeutiques testées seront étudiés en parallèle sur un modèle cellulaire (Remplacement).

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au minimum sur la base d'un test de puissance. L'analyse statistiques des données débutera par une étude de la normalité et de l'homogénéité des variances. Selon la distribution des valeurs, des tests paramétriques (ANOVA puis Test de Fisher pour la compariason 2 à 2) ou non paramètriques (Kruskal-Wallis et Wil-Coxon test pour la comparaison 2 à 2) seront utilisés. Les mêmes animaux seront réutilisés pour l'analyse comportementale et l'imagerie cérébrale à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux seront réutilisés pour différentes évaluations (Comportement et Imagerie) à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem.

Raffinement

Les rats seront hébergés dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la règlementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. L'unique transport entre les 2 EU après la procédure de chirurgie en A2 sera effectuée par un transporteur agréé pendant 15 minutes maximum, dans des conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA (cage de transport spécifique, climatisation du camion, respect cycle lumière, vibrations amorties). De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Un point limite a été déterminé selon les critères suivants : Le comportement général : -Difficulté de mobilité, isolement, perte partielle de réactions aux stimuli -Prostration, automutilation, tremblements - Vocalisations, agressivité Le poids : perte de poids importante (20%) L’apparence physique : pelage très terne ou souillé, plaie cutanée, hémorragie oculaire, génitale et/ou anale. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique (Buprénorphine, 0.05 mg/kg), ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée (Doléthal®, 182.2mg/kg) . La structure BEA ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin.

Choix des espèces

Parmi les petits rongeurs, le rat est l’espèce la mieux adaptée pour l’évaluation des troubles cognitifs et psycho-comportementaux. Par ailleurs, les modèles expérimentaux choisis ont été décrits chez le rat. Les rats utilisés auront 8-10 semaines. Cet âge a été choisi en raison de la référence utilisé pour l’ATLAS cérébral de rat et la précision de localisation des repères stéréotaxiques pour les injections cérébrales.

Capturés au filet, anesthésiés, puis équipés par chirurgie d'une balise acoustique et d'un marqueur fluorescent en moins de dix minutes, 30 picarels sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré avant d'être relâchés sur leur lieu de capture. La capture et la manipulation peuvent causer stress et blessures, l'implant étant présenté comme une gêne légère. L'étude suit leurs déplacements vers des zones de reproduction déjà connues pour compter des millions de nids. Le porteur associe à cet objectif de connaissance la production d'un documentaire valorisant ces colonies.

Objectifs

Trois précédents projets ont mis en lumière une biodiversité et une richesse spectaculaires associées à la limite inférieure des herbiers et du substrat meuble. L’intérêt majeur de la zone d'étude nous amène à poursuivre la dynamique d’exploration des colonies de reproduction de picarels (Spicara smaris) en réalisant cette étude complémentaire. Ce projet a pour objectifs de : - Caractériser plus précisément la dynamique de trois arènes de reproduction (dates, paramètres environnementaux, surface, densité de nids) et inventorier les comportements associés. - Décrire ces colonies de reproduction de picarels, ainsi que les espèces présentes dans ces écosystèmes temporaires, et les valoriser à travers la production d’un documentaire.

Bénéfices attendus

Ce projet propose de suivre les déplacements des picarels entre leur site de vie et leur site de nidification et sur leur site de nidification afin de déterminer : (1) la connectivité entre leur habitat préférentiel et la zone de reproduction, (2) le temps de résidence et le comportement au sein de la zone de nidification et (3) s’il existe plusieurs sessions de reproduction (aller-retours). Une connaissance accrue de cette espèce permettra une meilleure protection de la biodiversité dans un habitat fragile..

Procédures

L'ensemble des individus seront soumis à une phase de captures par un filet qui durera quelques minutes, puis anesthésié pendant 6-7 mn avant une phase d'implantation d'une balise acoustique par voie chirurgicale et l'injection sous cutanée d'une marqueur fluorochrome qui durent moins de 3-4 mn.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de la capture sont essentiellement le stress lié à la capture et des blessures éventuelles liées à l’engin de pêche ou à la manipulation entre l’engin et les bacs de confinements. L’implantation d’une balise interne unique engendre une nuisance de gravité légère ne dérangeant pas l’activité normale du poisson par la suite. En ce qui concerne l'injection du fluorochrome, l'anmal peut developper un léger stress lié à l’injection. Le fluorochrome peut aussi entrainer des sensibilités ou retards de croissance mais sur les jeunes stades de vie uniquement, ce qui n’est pas le cas ici puisque seuls des adultes seront marqués. Peuvent s’ajouter une modification temporaire du comportement (nage, alimentation) après marquage.

Devenir

Tous les animaux seront relachés vivant dans le milieu naturel sur leur lieu de capture.

Remplacement

L'intérêt du projet étant d’étudier le comportement spatial de ces espèces dans leur milieu naturel, il n’est pas possible de les remplacer.

Réduction

Il est difficile en écologie spatiale de déterminer le nombre d’individus nécessaire pour capturer la variabilité de l’utilisation de l’espace pour une population et son comportement. Ce nombre est variable en fonction des objectifs, des caractéristiques écologiques de l’espèce concernée et des modèles utilisés. Le projet cherchant à déterminer les differents comportements pour cette espèce, il est nécessaire d’etudier un nombre d’individus suffisamment grand pour capter cette variabilité dans l’utilisation et les comportements de migration au site de reproduction. Afin de minimiser le nombre d’individus dans cette étude, il est envisagé de marquer 30 individus de picarel répartis autour d’une zone de nidification connue afin de pouvoir documenter leur migration au site de reproduction. La plupart des études de ce type montrent qu’une trentaine d’individus permet de capter cette diversité de comportements. Le nombre de 30 individus de cette espèce de petite taille reste toutefois est minimal compte tenu de leur nombre et densité en milieu naturel (plusieurs millions de nids observés sur une même aire géographique).

Raffinement

L’ensemble des étapes du projet est mis en œuvre de sorte à limiter les nuisances : la capture est réalisée à l’aide de filet non maillant (formant des poches) en plongée ou posé par des professionnels, le transfert à bord et entre les bacs est réalisé à l’aide d’épuisettes en silicon limitant l’abrasion du poisson. Le marquage est réalisé sous anesthésie générale, un bullage dans le bac de réveil permet une bonne récupération du poisson avant d’être relâché en douceur sans exondation. L'ensemble du protocole de l'endormissement au réveil dure moins de 10 mn.

Choix des espèces

Le picarel (Spicara smaris) est un petit poisson vivant sur le fond qui forme des colonies de reproduction massives, pouvant couvrir plus de 130 hectares (ha) au sein d'une zone de 700 ha, une seule colonie couvrant de 2 à 30 ha entre 40 et 50 mètres de profondeur. Avec une densité de plus de 2,5 nids par m², on estime à plus de 18 millions le nombre de nids dans la colonie. Chaque nid est gardé par un mâle. Les femelles nagent en groupe au-dessus des nids et y déposent parfois des œufs. L’objectif du projet est de documenter leur comportement reproductif. Ces arènes de reproduction forment aussi un écosystème temporaire important puisqu’elles attirent de nombreux prédateurs ainsi que des pêcheurs. Il s’agit de marquer des individus dans leur habitat préférentiel (les herbiers alentours) afin de documenter leur migration vers ces sites de nidification et au sein de la colonie de reproduction afin de mieux comprendre la provenance des poissons et leur résidence sur le site ainsi que de déterminer les facteurs qui déclenchent leurs déplacements vers ces sites de reproduction. Ceci permettra de déterminer si ces phénomènes sont prédictibles et ainsi de pouvoir mieux protéger la biodiversité associée.

Pour vérifier in vivo une hypothèse sur le rôle de la protéine NLRP3 dans l'immunité anti-tumorale, 260 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les poumons. Des tumeurs sont provoquées dans les poumons par injection dans une veine de la queue, suivies de chimiothérapies par voie intrapéritonéale. Le porteur affirme que ces foyers, maintenus à moins de cent nodules d'un millimètre, n'affectent pas la vie des animaux, en s'appuyant sur plus de dix ans de pratique du modèle. L'objectif reste d'apporter des connaissances sur NLRP3 et d'évaluer si elle pourrait un jour servir de cible, retombée présentée comme incertaine.

Objectifs

NLRP3 est une protéine largement décrite pour ses fonctions dans l’inflammation, dans des globules blancs appelés myéloïdes. Nos données préliminaires obtenues d’autres globules blancs appelés lymphocytes, isolés de souris montrent que NLRP3 est présent dans ces cellules. En l’absence de NLRP3 ces globules blancs ont une activité anti-tumorale marquée contre différents types de tumeurs. L’absence de NLRP3 dans ces globules blancs semble impacter le recrutement de ces cellules au site tumoral. Grâce à des cellules isolées des tumeurs de souris déficientes pour NLRP3 nous avons pu observer une différence dans l’expression de certains récepteurs membranaires suspecter d’être impliqué dans le recrutement des globules blancs déficients pour NLRP3. Le récepteur appelé CXCR3 interagit avec 3 molécules ayant des effets différents. Différentes lignées tumorales sont capables de les produire. Nous avons validé in vitro la différence de recrutement. Au regard de ces résultats, nous souhaitons aujourd’hui valider ces observations in vivo. En effet, la complexité de la réponse immunitaire anti-tumorale est telle que les résultats obtenus in vitro ne sont pas suffisants pour affirmer que les mécanismes de recrutement des globules blancs identifiés in vitro sont transposables à un organisme entier et qu’ils pourraient servir de cible thérapeutique. Pour confirmer nos hypothèses in vivo, nous utiliserons des souris contrôles ou déficientes pour NLRP3 comme donneurs de globules blancs. Ces globules blancs seront injectés à des souris ayant de tumeurs au niveau pulmonaire. Ainsi, nous pourrons comparer le recrutement des globules blancs contrôles ou déficients pour NLRP3 dans des tumeurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : - apporter des connaissances nouvelles concernant NLRP3. - évaluer si NLRP3 pourrait être une cible thérapeutique ou un complément à l’immunothérapie

Procédures

Les injections de cellules seront réalisées en intra veineux sur souris vigiles (2 par souris, chaque injection dure quelques secondes). Les traitements par chimiothérapies seront réalisés en intra péritonéal sur souris vigiles (4 par souris, chaque injection dure quelques secondes). La mise à mort sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane.

Impact sur les animaux

Les tumeurs seront induites dans les poumons suite à une injection intra veineuse dans la veine caudale. Les traitements par chimiothérapie par injection intra péritonéales. Ces actes peuvent engendrer du stress chez l’animal car il doit être maintenu dans un système de contention. L’injection induit une douleur de faible intensité au site de l’injection. Les foyers tumoraux au niveau des poumons permettent d’obtenir des résultats plus clairs et de meilleure qualité. Les animaux seront mis à mort à J11 ou J17 post-injection des cellules tumorales. A ce stade, il y a moins de 100 foyers tumoraux sur les poumons (d’environ 1mm de diamètre) et cela n’impacte pas la vie des animaux (nous avons plus de 10 ans d’expérience sur ces modèles).

Devenir

Les 260 souris seront toutes euthanasiées afin de prélever les poumons

Remplacement

Nous avons déjà réalisé un certain nombre d’expériences in vitro pour caractériser les différences entre les CD8 issus de souris C57Bl6 et les CD8 déficients pour NLRP3. Ceci nous a permis d’identifier des marqueurs d’intérêt et des phénomènes à explorer in vivo. Malheureusement, le recrutement au site tumoral et l’implication dans la réponse immunitaire antitumorale ne peuvent pas être appréhendés in vitro à l’heure actuelle car ce sont des mécanismes trop complexes qui font intervenir plusieurs acteurs cellulaires et moléculaires.

Réduction

Dans un souci de réduction et étant donné que nous voulons confirmer des résultats obtenus in vitro, les expériences ne seront réalisées que 2 fois avec 5 souris par groupes et par des personnes parfaitement formées aux gestes permettant d’optimiser la reproductibilité. De plus, chaque expérience sera accompagnée d’une analyse complète de l’infiltrat immunitaire afin de récolter un maximum d’informations sur les mêmes souris sans avoir besoin de recommencer les expériences (1 lobe pour l’analyse de l’infiltrat et 1 lobe pour les marquages). Enfin, un « go-no go » est appliqué à la fin de chaque phase du projet..

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Ils seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (la fréquence de surveillance sera bien entendu augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux). Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.

Chacune des 96 souris enchaîne, à 6, 12 puis 18 mois, une batterie de tests répartie sur trois semaines : prélèvements sanguins, suspension à un câble à 45 cm du sol, labyrinthe, mesure de force, arène lumineuse, course forcée sur tapis roulant et 48 heures en cage individuelle. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue pour nécropsie. La course sur tapis roulant est entretenue par des chocs électriques que le porteur qualifie de légers et destinés à motiver le mouvement. L'étude vise à mesurer l'effet d'un anticorps anti-GDF15 sur le vieillissement, le protocole imposant à chaque animal trois cycles de tests sur dix-huit mois.

Objectifs

Le vieillissement est un processus complexe et hétérogène, se manifestant par différentes trajectoires de déclin fonctionnel et métabolique. GDF15 est l’une des protéines les plus corrélées à l’âge avec des niveaux qui augmentent progressivement tout au long de la vie. Elle a un effet protecteur à court terme, mais son élévation chronique est associée au déclin lié à l’âge. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif d'évaluer de manière approfondie l'impact d'un traitement par anticorps anti-GDF15 sur ces trajectoires. L'étude vise à mettre en évidence comment ce traitement influence la préservation d'un ensemble de capacités intrinsèques (aptitudes physiques et cognitives non liées à un apprentissage ou un entrainement) et l'amélioration des marqueurs clés du métabolisme comme le taux de cholestérol et de glucose dans le sang, et la dépense énergétique par exemple. En identifiant les effets précis du traitement, ce projet contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes physiologiques impliqués dans le vieillissement, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour favoriser la vitalité et la qualité de vie à un âge avancé. Le projet pourra se dérouler dans deux Établissements Utilisateurs si nécessaire.

Bénéfices attendus

Grâce à cette étude, nous serons en mesure de mieux comprendre le rôle de la GDF-15 dans les processus de vieillissement ainsi que son lien avec le déclin fonctionnel, et d'envisager de nouvelles approches thérapeutique pour favoriser la vitalité et la qualité de vie à un âge avancé.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à une série d'évaluations comportementales, motrices, et métaboliques, réparties sur 3 semaines, le tout à 3 reprises, soit à l’âge de 6, 12 et 18 mois : - Les prélèvements de sang : faible volume et sous anesthésie gazeuse pour la Biochimie du sang et l'hématologie. - L’analyse de la composition corporelle : les animaux seront placés dans une cellule de contention, type tube, lui-même placé dans une chambre RMN durant moins de 3 minutes au total. - Evaluation de la coordination motrice : Les animaux seront suspendus à un câble métallique à une hauteur de 45 cm pendant maximum 4 minutes et le temps de chute (sur une surface épaisse et molle pour amortir le choc) sera mesuré à trois reprises, chaque mesure étant espacée d’une heure. - Évaluation de la mémoire spatiale à court terme : Les animaux seront soumis à un test d'exploration dans un labyrinthe, d'une durée d'environ 8 minutes par souris. - Évaluation de la force de préhension : La force motrice des membres sera mesurée par trois prises espacées d'une heure pour une durée totale d'environ 5 minutes par mesure. - Évaluation de l'activité motrice et de l'anxiété : Les animaux seront observés pendant 10 minutes dans une arène lumineuse. - Évaluation de l'endurance physique : Les animaux seront soumis à un exercice forcé sur tapis roulant. La durée de cette intervention est variable en fonction des performances individuelles. Des stimulations électriques de faible intensité encouragent le mouvement. - La mesure des échanges gazeux : les animaux sont temporairement individualisés (48h) pour permettre la mesure des gaz consommés et produits de chaque individu. Afin de limiter la fatigue et l'interférence entre les mesures, les tests seront répartis sur 3 semaines (Prélèvements de sang et Analyse de la composition corporelle en semaine 1, tests comportementaux en semaine 2, mesure des échanges gazeux en semaine 3). L’ensemble du projet jusqu’à ce stade sera réalisé dans le premier Etablissement Utilisateur. En fin de procédure, les animaux seront mis à jeûn durant 2 heures, anesthésiés pour un prélèvement de sang terminal puis mis à mort pour nécropsie dans le premier ou le second Etablissement Utilisateur.

Impact sur les animaux

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent un faible niveau de stress : - Les prélèvements de sang génèrent un stress et une douleurs légers. Ces prélèvements n'auront lieu que tous les 6 mois, soit 3 fois au cours du protocole. - L’analyse de la composition corporelle implique le placement des animaux dans une cellule de confinement exigüe, ce qui génère un stress léger et court (moins de 3 minutes au total). - La préhension de une à cinq minutes lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement génère un stress léger. - L'évaluation de la coordination motrice génère un stress physique léger. Les animaux seront suspendus à un câble métallique à une hauteur de 45 cm pendant maximum 4 minutes. - L'évaluation de la mémoire spatiale à court terme génère un stress léger et court (environ 8 minutes) lié à un environnement nouveau et non familier. - L'évaluation de la force de préhension genère un stress lors de la préhension mais également un stress physique court lors de l’expérience (5 minutes par mesure). - L'évaluation de l'activité motrice et de l'anxiété génère un stress léger et court (10 minutes) car l’environnement est nouveau, lumineux et non sécurisant (absence d’enrichissement). - L'évaluation de l'endurance physique génère un stress modéré et un inconfort physique dus à l'exercice forcé (la durée de cette intervention est variable en fonction des performances individuelles). Les stimulations électriques sur la grille arrière sont utilisées uniquement pour inciter l'animal à courir et sont calibrées au niveau minimal efficace (choc aversif léger) pour motiver le mouvement par inconfort et non par douleur. - La mesure des échanges gazeux génère un stress modéré lié à l’individualisation temporaire (48h) des animaux. Les fonds de cage de calorimétrie sont les mêmes que les fonds de cages d’hébergement habituel, ils sont transparents et les animaux peuvent se voir d’une cage à l’autre durant l’enregistrement. - Le transport éventuel en fin de protocole pour la mise à mort dans le second Etablissement Utilisateur, entrainera un stress léger lié au mouvement des cages durant quelques minutes (300m à parcourir).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de procéder à des nécropsies (analyses en biochimie et en expression génique sur différents organes d'intérêt).

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons analyser comment un traitement anti-GDF15 influence l'évolution des capacités intrinsèques et des fonctions métaboliques d'individus d'âge avancé. L'évaluation de ces processus exige l'utilisation d'organismes vivants (humains ou modèles animaux), car les tests comportementaux essentiels ne peuvent être reproduits par des approches in vitro ou ex vivo. Compte tenu de son espérance de vie plus courte et de ses processus physiologiques similaires à ceux de l'Homme, la souris apparaît comme le modèle de choix le plus pertinent pour cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum en se basant sur les données de la littérature et ce nombre a été corrigé par un calcul de puissance statistique. L'utilisation d'un analyseur de composition corporelle pour évaluer les masses grasses et maigre constitue également un élément de réduction du nombre d'animaux utilisé, en ceci que 60 secondes dans une cellule de contention remplacent l'utilisation d'animaux supplémentaires : avant l'utilisation de cet automate, il était nécessaire de prévoir un groupe d'animaux dédié à la composition corporelle, évaluée par prélèvement et pesée des tissus lors d'une nécropsie.

Raffinement

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent peu de stress (préhension lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement). Une habituation aux gestes de manipulation sera effectuée avant chaque lot de tests pendant 5 minutes par souris pendant 3 jours avant le début des tests pour limiter le stress généré par l’expérimentateur. Les animaux seront également acclimatés à la salle d’expérimentation pendant la phase d’habituation. Les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress et la douleur, ce geste sera effectué par une personne ayant une longue exérience de ce geste technique. Des éléments d’enrichissement seront mis en place dans la cage d’hébergement afin d’assurer leur bien-être et réduire le stress : animaux placés en groupe dans les cages, mise en place de tunnels en cartons, du papier pour faire un nid. A partir de l’âge de 12 mois, les souris seront placées dans des portoirs connectés DVC (Cage Digitales Ventilées) permettant d’identifier précocément toute perte d’activité et de prostration. Enfin, si la mise à mort a lieu dans le second Etablissement Utilisateur, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément du second Etablissement Utilisateur (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les animaux sont transportés dans leur cage d'origine et les cages seront protégées du froid ou de la chaleur dans un container souple occultant et isotherme afin de minimiser le stress, pour un transport d'une durée de moins de 10 minutes. Le choix de la mise à mort dans le premier Etablissement Utilisateur sera privilégié si l’organisation des laboratoires et des équipements au moment de la mise à mort le permet.

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous cherchons à étudier l’évolution des capacités intrinsèques (aptitudes physiques et cognitives non liées à un apprentissage ou un entrainement) d’un individu d’âge avancé et ses fonctions métaboliques en fonction d’un traitement anti-GDF15. Cela nécessite de l’étudier sur des organismes vivants, humains ou modèles animaux. La souris semble un choix plus approprié pour cette étude grâce à l’espérance de vie plus courte et des processus physiologiques similaires à l’Homme. Pour étudier les différentes trajectoires de vieillissement, une évaluation des capacités et des fonctions métaboliques sera réalisée à trois âges différents : 6, 12 et 18 mois. L’objectif est d’identifier le rôle précoce de GDF-15 et de l’action du traitement testé à long terme.

Déjà utilisés dans un projet antérieur, 18 cochons vont être soumis à la pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire puis à 14 à 16 prélèvements sanguins étalés sur 56 heures, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'objectif est de mesurer la cinétique sanguine d'une ancienne tétracycline chez le cochon pour en réajuster les doses. Chaque animal reçoit deux administrations d'antibiotique, la seconde sur animal vigile sous contention ferme, et est mis à mort à la fin pour prélever muscles, foie et reins. Le porteur présente le cochon vivant comme la seule voie possible pour suivre la cinétique du produit, dix animaux formant selon lui le minimum et huit autres servant à tester un gilet de protection des cathéters.

Objectifs

Certains antibiotiques dits « anciens » utilisés en médecine vétérinaire font partie des traitements dits de « premier recours » pour les praticiens dans toutes les espèces animales de production. Pour ces anciennes molécules, les autorisations de mise sur le marché indiquent d’utiliser la même dose, quelle que soit l’espèce animale concernée. Or, ces doses ne sont probablement pas bien adaptées, car les vitesses d'élimination (et donc la durée d'action) peuvent être très variables d'une espèce à l'autre. Ces différences peuvent aboutir à des expositions à l’antibiotique bien différentes d’une espèce animale à l’autre, et notamment à un risque d’exposition insuffisante in vivo (sur animaux vivants), diminuant les chances d’efficacité du traitement. L’objectif principal des procédures expérimentales est de générer des données pharmacocinétiques (à savoir le suivi des concentrations sanguines au cours du temps) in vivo pour une ancienne molécule antibiotique de la famille des tétracyclines couramment utilisée chez le porc. Par la suite, et à l’aide de la modélisation pharmacocinétique/pharmacodynamique (PKPD) (correspondant à un outil mathématique permettant de relier les concentrations sanguines à l’effet observé, soit ici la diminution du nombre de bactéries pathogènes), les modalités optimales d’administration de ces deux molécules seront déterminées (ajustement des doses et fréquence d'administration).

Bénéfices attendus

L’approche pharmacocinétique/pharmacodynamique pour optimiser la recherche de dose efficace en antibiothérapie est bien établie en médecine vétérinaire, et peut être utilisée pour réviser les posologies des anciens antibiotiques. Cette révision des posologies passe par une caractérisation adéquate des profils pharmacocinétiques de chaque molécule pour chaque espèce animale cible de ces traitements. Ainsi, les études pharmacocinétiques in vivo, prévues dans ce projet, couplées à des études pharmacodynamiques in vitro sur des bactéries pathogènes les plus fréquemment rencontrées, vont, à terme, permettre d’optimiser l’usage des tétracyclines (doses, posologies) chez le porc. Une utilisation plus optimale des antibiotiques permettra de : (i) augmenter les chances de succès du premier recours à l’antibiothérapie, et ainsi réduire la probabilité d’un éventuel recours à un antibiotique supplémentaire (potentiellement d’une famille d’antibiotiques classée comme critique) ; (ii) minimiser l’exposition à des concentrations sub-optimales, qui favorisent la sélection et l’émergence de la résistance aux antimicrobiens.

Procédures

Pour pouvoir prélever du sang de façon répétée, un cathéter sera posé au niveau de la veine jugulaire externe, grâce à un acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale et échoguidé. Cette technique, utilisant un échographe, permet de réduire la durée de l’intervention par rapport à une chirurgie « classique » (de 1h30-2h à 30-45 minutes par animal) tout en minimisant le risque infectieux (acte moins invasif). Cet acte chirurgical peut être source de stress et de douleur, mais une contention maîtrisée, suivie d’une anesthésie/analgésie adaptée, permettra de réduire au maximum ces désagréments. Des prélèvements sanguins répétés (14 à 16) seront réalisés sur 56 h. Une fois le cathéter posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores, sans contention particulière, et réalisés en moins d'une minute. L'hébergement individuel (10 animaux) ainsi que le port d'un gilet protecteur (pour 8 animaux) se feront sur une durée maximale de 17 jours.

Impact sur les animaux

La procédure de pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale et dans des conditions d'asepsie strictes. Pour éviter tout problème respiratoire durant l'anesthésie générale, un contrôle permanent sera effectué par un opérateur expérimenté et complété par un appareil de monitoring. Un tapis chauffant est utilisé durant l'ensemble des actes chirurgicaux afin de maintenir la température corporelle de l'animal. Lors du réveil, les animaux peuvent être désorientés et stressés. Une fois le cathéter posé, les prélèvements de sang et l'entretien des cathéters seront totalement indolores, et donc non générateurs de stress. Il n'est pas attendu d'effet indésirable, sauf un éventuel risque d'infection en cas d'erreur d'asepsie et/ou de mauvais entretien des cathéters (risque très faible). Durant l'expérimentation, une source de stress et de douleur légère viendra de l'administration de l'antibiotique, qui sera faite sur animal vigile et nécessite donc une contention ferme, mais d'une durée très brève (inférieure à 2-3 min).

Devenir

Chaque porc sera mis à mort à l’issue de l’expérimentation dans des conditions éthiques, et les tissus d’intérêt (muscles, foie, reins) seront récoltés pour le dosage de l'antibiotique.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas de méthodes non-animales de remplacement pour suivre la cinétique plasmatique (tout en incluant les variabilités inter-individuelles) des molécules, qui est une étape préliminaire à l’approche pharmacocinétique/pharmacodynamique envisagée.

Réduction

L’utilisation de 10 animaux est le strict minimum pour pouvoir correctement estimer la variabilité inter-individuelle des paramètres pharmacocinétiques, et assurer suffisamment de résultats fiables et robustes en cas de dysfonctionnement des cathéters empêchant de récolter du sang pour un ou plusieurs animaux pour l'ensemble des échéances prévues. Les 8 porcs supplémentaires permettent d'évaluer l'intérêt du gilet protecteur lors d'un hébergement collectif pour protéger les cathéters. De plus, chaque animal sera utilisé pour deux administrations d'antibiotique, ce qui permet de limiter le nombre total d'animaux. Une période de repos adaptée entre les 2 administrations permet de garantir la fiabilité des résultats et de laisser les animaux récupérer. Les résultats seront analysés grâce à une modélisation mathématique, qui permettra par la suite d’étendre l’exploration à d’autres posologies, sans la nécessité d’utiliser d’autres animaux. Enfin, ces 18 porcs seront réutilisés d'un projet antérieur, limitant ainsi le recours à des animaux supplémentaires.

Raffinement

La pose de cathéter sous échographie est très peu invasive, et l'ensemble des anesthésiques ont un effet analgésique suffisant pour ce type de procédure. Un anti-inflammatoire sera utilisé en cas de manifestation de douleur de l'animal après la pose des cathéters. Les cathéters seront protégés avec un bandage adéquat, vérifié régulièrement et changé s’il devient trop souillé. Pour 10 porcs, l'hébergement sera individuel après la pose des cathéters, afin d'éviter l'arrachement des cathéters et d'assurer un minimum strict de résultats. Des barrières entre cases permettent un contact visuel, olfactif et tactile (groin à groin) entre porcs voisins. Des enrichissements appropriés seront également présents dans l’environnement : balles ainsi que jouets à mâcher suspendus. Les 8 porcs restants seront hébergés par 2, et des gilets protecteurs seront posés sur les animaux afin de limiter les risques d’arrachement des cathéters entre individus. Cette procédure permettra d'évaluer le bénéfice-risque du port de ces gilets, et ainsi pouvoir raffiner les conditions d'hébergement lors de futurs projets. Des sessions d’interactions positives sont régulièrement effectuées lors des prélèvements sanguins, par des caresses et grattages, ce qui permet d’améliorer le bien-être des animaux et de les familiariser avec les opérateurs.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible utilisée au laboratoire pour les études de cinétique plasmatique. Au début de l’expérimentation, les porcs auront exactement 11 semaines au début de ce projet, soit un poids autour de 35 kg. Cet intervalle de poids permet une manipulation aisée des animaux (sécurité des opérateurs, diminution du stress des animaux).

Capturées, anesthésiées, puis équipées par chirurgie d'un émetteur introduit dans la cavité générale en moins de cinq minutes, 50 lamproies marines sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré avant d'être relâchées dans le cours d'eau. L'opération peut provoquer douleurs, saignements et infection, limités selon le porteur par anesthésie et antibiotiques. L'objectif est de repérer les sites de reproduction et les obstacles à la migration d'une espèce classée en danger, dont le déclin est attribué notamment à la prédation par le silure. Les lamproies marquées meurent naturellement après la reproduction, au plus tard à la mi-juillet, et les émetteurs sont récupérés sur les cadavres.

Objectifs

La lamproie marine est une espèce menacée en déclin en Europe et en particulier en France. Le manque de connaissance sur leur écologie limite les actions de gestion. On n’observe généralement plus (ou moins) de frayères en amont des bassins versants malgré la présence d’individus à l’aval, observés par comptages au niveau de stations de contrôle. Le premier objectif de ce projet est de déterminer s’il existe des sites de reproduction sur des sites inconnus, potentiellement en eau profonde où les prospections classiques à pied ou en embarcation ne sont pas possibles. Le second objectif est de vérifier si les individus dénombrés aux stations de contrôle parviennent sur des sites de reproduction et quels sont les points bloquants si des difficultés sont rencontrées.

Bénéfices attendus

Les populations de lamproie marine connaissent un fort déclin actuellement et les informations sur leur cycle de vie manquent pour prendre des mesures de conservation adaptées. Un des principaux bénéfices du projet est de connaître le devenir des individus en amont d’un bassin versant. A l’heure actuelle, les sites de reproduction des individus franchissant le barrage demeurent incertains, car on ne les observe plus ou très rarement sur les frayères historiques. Selon une première hypothèse, les individus pourraient se reproduire en milieu plus profond, en aval du bassin versant (secteurs impossible à prospecter à l’œil nu). Une autre hypothèse émise est que les individus ne parviennent plus aux sites de frai et meurent sans s’être reproduits. Des points de blocages pourraient ainsi être identifiés. La prédation par le silure a récemment été montrée. L’espèce étant largement présente sur le bassin étudié, il est vraisemblable que les lamproies soient également prédatées sur ce bassin. Mieux connaître la migration et les sites de reproduction permettra d’adapter au mieux les mesures de gestion de l’espèce.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule opération chirurgicale visant à l'introduction dans la cavité générale de matériel scientifique (émetteurs). Cette opération durera moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

L’étude implique l’insertion par chirurgie de matériel scientifique réalisée sous anesthésie. Les nuisances potentielles (douleurs, saignements, infection) sont limitées par l'utilisation de mesures prophylactiques et des traitements médicamenteux (antibiotique et antalgique) adaptés et définis avec la collaboration d'un vétérinaire spécialisé. Cette intervention est considérée comme "modérée". Les individus choisis auront un poids qui leur permettra de supporter l'insertion du matériel scientifique. Ce dernier ne dépassera pas 2% du poids de l'animal comme recommandé dans la littérature.

Devenir

L'observation s'effectue dans le milieu naturel : a l'issue de la procédure expérimentale (insertion d'émetteurs), les animaux sont relâchés dans le cours d'eau. Les lamproies meurent naturellement à l’issue de la reproduction (espèce sémelpare), soit au maximum à la mi-juillet pour les individus marqués. Les émetteurs seront récupérés après la mort.

Remplacement

L’objectif de l’étude est de connaître le comportement de migration et de reproduction de la lamproie marine en milieu naturel. Il n’est donc pas possible de remplacer l’espèce par un autre modèle d’étude ou par des alternatives non animales.

Réduction

L’effectif prévu est de 50 individus. Ce nombre est l’effectif minimal d’individus pour obtenir une vision représentative des différents comportements individuels sur les sites de reproduction et du taux de prédation par le silure sans toutefois impliquer une fraction importante de la population si l’on se base sur les effectifs comptés ces 3 dernières années. En tablant sur un taux de prédation de 80% sur les individus marqués, comme documenté dans la littérature, une dizaine d’individus pourraient atteindre les sites de reproduction. Une expérience sur un autre cours d’eau mettant en œuvre un protocole de marquage identique a montré que la mortalité liée au marquage est limitée. Les émetteurs seront récupérés après la mort des individus, pour récupérer les données enregistrées.

Raffinement

Les principales mesures de raffinement concernent la limitation des nuisances (angoisse et douleur) lors de la manipulation des animaux avant, pendant et après la chirurgie et la limitation des risques d'infection post-opératoire. La combinaison d'utilisation de produits anesthésiques de concentration adaptée (1- concentration pour l'anesthésie pré-opératoire et 2- pour le maintien de l'anesthésie pendant l'opération) et d'antalgiques limitent directement l'angoisse et la douleur pendant et après l'opération, et l'administration d'antibiotiques limite les risques d'infections liés à l'opération. Les mesures prophylactiques classiques (désinfection du matériel) limitent également les sources d'infection pouvant induire des nuisances post-opératoires. Les opérations de chirurgie seront effectuées par du personnel habilité et spécifiquement formé par un vétérinaire. Le protocole opératoire est co-construit avec un vétérinaire. Les conditions environnementales d'importance première pour les poissons (température et oxygénation de l'eau) seront contrôlées avant, pendant et après la capture et l'opération. Les individus seront placés dans un vivier et, après une période d’observation jusqu’à la reprise d’équilibre, d’un rythme de ventilation régulier et de nage active, ils seront relâchés dans la rivière.

Choix des espèces

L’espèce ciblée, la lamproie marine, est une espèce en classée en danger (EN) par l’UICN en France et dont les effectifs sont en constante diminution ces dernières années. Il est donc nécessaire d’acquérir des connaissances sur son comportement de reproduction et sur les menaces/contraintes que l’espèce est susceptible de rencontrer au cours de sa migration et de sa reproduction. Ces informations sont cruciales pour prendre les mesures de gestion et de conservation appropriées. Les individus utilisés seront des adultes capturés juste avant leur maturité (caractères sexuels secondaires encore non visibles), en début de période de migration en eau douce. C’est à ce stade que la migration de montaison a lieu, et durant laquelle les individus sont exposés à de multiples pressions qu’il est nécessaire de mieux caractériser (obstacles et prédation notamment).

3 456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, dont 1 728 recevront une injection directement dans le cerveau et 192 une double chirurgie. Elles sont soumises à un régime gras, à un gavage de tamoxifène et à un suivi en cage individuelle, puis tuées pour extraction du cerveau. L'étude porte sur les filets qui entourent certains neurones de la satiété et sur leur rôle dans l'obésité. Les retombées annoncées, de nouvelles stratégies contre l'obésité, sont renvoyées au long terme.

Objectifs

L’obésité touche aujourd’hui plus de 13 % de la population mondiale et augmente le risque de maladies graves comme le diabète ou les troubles cardiovasculaires. Pour mieux prévenir ou traiter cette maladie, il est essentiel de comprendre comment notre corps régule la faim et la sensation de satiété. Dans le cerveau, une zone appelée l’hypothalamus joue un rôle central. Elle contient des neurones spécifiques, appelés neurones POMC, qui envoient le signal de satiété (on n’a plus faim), et d'autres neurones qui provoquent l’envie de manger. Des recherches récentes montrent que les neurones POMC ne sont pas tous identiques. Certains réagissent moins bien aux signaux hormonaux et seraient plus sensibles à une alimentation trop riche en graisses, ce qui pourrait contribuer à l’installation de l’obésité. Par ailleurs, environ 30 % de ces neurones sont entourés d’une sorte de « filet » protecteur, appelé matrice extracellulaire ou filets périneuronaux (PNN). Ces structures influencent le fonctionnement des neurones et leur capacité à s’adapter. Chez les souris obèses, ces filets semblent profondément modifiés. Nous cherchons à comprendre comment les neurones POMC réagissent aux changements alimentaires (jeûne, réalimentation) et quel rôle joue leur environnement extracellulaire dans cette réponse. Nous allons : Observer ces neurones chez des souris en jeûne, après réalimentation, ou nourries avec un régime gras. Analyser l'activité des neurones et la composition de leur environnement avec des outils d’imagerie et d’électrophysiologie. Modifier directement la matrice autour des neurones pour voir si cela influence leur fonctionnement. Activer ou inhiber artificiellement ces neurones pour étudier l’effet combiné avec les changements de leur environnement. Nous pensons que les modifications de l’environnement des neurones POMC jouent un rôle important dans la dérégulation de la sensation de satiété en cas d’obésité. Mieux comprendre cette interaction entre neurones et matrice extracellulaire pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour lutter contre l’obésité.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’un milliard le nombre de personnes obèses dans le monde, faisant de l’obésité un enjeu majeur de santé publique. Malgré les efforts thérapeutiques, les traitements disponibles restent globalement peu efficaces à long terme, à l’exception de techniques invasives telles que la chirurgie bariatrique, dont les résultats ne sont pas systématiquement garantis. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à l’apparition et à la persistance de cette pathologie, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce projet, nous étudions un élément encore peu connu du contrôle de la faim : la matrice extracellulaire, et en particulier les filets périneuronaux (PNN). Ces structures entourent certains neurones du cerveau, notamment les neurones POMC, qui nous aident à ressentir la satiété. Nous pensons que ces filets pourraient réduire la souplesse des neurones, en limitant leur capacité à s’adapter aux changements liés à l’alimentation, surtout en cas d’obésité. Cela pourrait empêcher le cerveau de bien réguler l’appétit lorsque l’environnement nutritionnel change. À court terme, nous voulons comprendre comment ces filets réagissent à une alimentation trop riche ou à des changements rapides de régime, et comment cela influence les neurones qui contrôlent la faim. À plus long terme, ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour aider le cerveau à retrouver sa flexibilité, et ainsi améliorer la régulation de l’appétit chez les personnes obèses.

Procédures

4 prélèvements sera effectués au total pour le suivi de la glycémie. Lors de l'habituation au "fasting" : 24 heures après le jeûne puis 1h30 après la réintroduction à la nourriture. Lors de la phase expérimentale : 24 heures après le jeûne puis 1h30 après la réintroduction à la nourriture. A chaque prélèvement, une goutte de sang sera récoltée, soit 50 µL environ. Cela concerne toutes les souris de toutes les procédures, soit 3456 souris. Des procédures chirurgicales sont prévues. 1728 souris auront une injection intra-cérébrale dans le noyau arqué de l'hypothalamus. 192 souris subiront une double chirurgie, soit une injection de virus permettant de contrôler une sous population de neurones, puis une injection d'enzyme permettant de dégrader la matrice extracellulaire.

Impact sur les animaux

Certaines souris de l’étude recevront une administration orale de tamoxifène, connu pour induire une perte temporaire de tissu adipeux, entraînant une perte de poids transitoire. Le gavage, bien qu’indolore, implique une contention totale, source probable de stress. Des douleurs post-opératoires modérées peuvent survenir à la suite des injections stéréotaxiques bilatérales de vecteurs viraux. Ces douleurs seront prises en charge par un traitement analgésique systématique. Lorsque deux interventions seront nécessaires, un délai suffisant sera respecté entre chaque chirurgie afin de maximiser la récupération. Certaines procédures expérimentales peuvent générer un stress transitoire ou des effets physiologiques réversibles (régime hypercalorique). Ces effets ont été anticipés, et des mesures seront mises en place pour en limiter l’impact (enrichissement augmenté). Le passage en cage individuelle, requis pour un suivi précis de la prise alimentaire, pourra induire un stress lié à l’isolement. Toutefois, les cages resteront proches afin de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif entre congénères, réduisant les effets d’isolement social. L’analyse de la composition corporelle par EchoMRI nécessite une brève contention (moins de cinq minutes) dans un tube transparent. Ce stress aigu sera donc de faible intensité et de courte durée. L’administration prolongée d’un régime hypercalorique (HFD) entraînera une prise de poids progressive, ne dépassant pas 200 % du poids initial selon nos données antérieures. Un suivi rigoureux sera mis en place afin de prévenir toute dérive pathologique. Les protocoles de jeûne induiront une perte de poids modérée (inférieure à 10 % du poids initial), totalement réversible à la reprise de l’alimentation. Les chirurgies stéréotaxiques nécessaires aux injections intracérébrales provoqueront une douleur modérée liée à l’incision du scalp et du périoste. Un traitement analgésique sera systématiquement administré, avec une reprise attendue de l’activité normale et du poids en 2 à 3 jours. Enfin, certains tests comportementaux seront réalisés pour évaluer les effets fonctionnels des manipulations. Ils dureront moins d’une heure et nécessiteront une petite goutte de sang pour mesurer la glycémie avec précision.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort, les cerveaux seront alors extraits et des analyses d'imagerie, d'électrophysiologie, ou de "Single Particle Tracking" pourront être effectués ex vivo (le cas échéant).

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier la relation entre l’activité des sous-populations de neurones à POMC et les modifications de leur environnement extracellulaire, en particulier les filets péri-neuronaux (PNN), en réponse à la consommation d’un régime obésogène. Dans ce contexte, les neurones étudiés ne fonctionnent pas de manière isolée : ils interagissent avec d’autres structures cérébrales mais également avec des signaux périphériques d’origine hormonale ou nutritionnelle. La matrice extracellulaire pourrait jouer un rôle clé dans cette interface en modulant la plasticité et la réactivité neuronale. Les effets que nous cherchons à comprendre sont donc le fruit d’interactions complexes entre réseaux neuronaux et signaux métaboliques périphériques. Une telle dynamique ne peut être reproduite in vitro, car elle nécessite un système intégratif capable de refléter fidèlement les adaptations comportementales, telles que la prise alimentaire. De même, aucun modèle informatique ne permettrait aujourd’hui de simuler avec une précision suffisante les interactions entre la matrice extracellulaire, l’activité neuronale, et les réponses métaboliques de l’organisme. Seul un modèle in vivo permet de capturer l’ensemble de ces processus.

Réduction

Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux utilisant des tests statistiques. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront à l’âge de 6 semaines et seront habitués pendant au moins 2 semaines. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages sera ainsi : carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. Nous utiliserons ces tunnels pour transporter les souris, méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le risque de déshydratation post-opératoire est prévenu par injection sous-cutanée de solution saline stérile. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 5) Certains animaux de cette DAP auront un suivi chronique de leur poids, leur prise alimentaire et leur composition corporelle ainsi que le suivi de la prise alimentaire suite à certaines procédures chirurgicales (enzyme dégradant la matrice ou virus permettant le désassemblage de la matrice) nécessitera que les animaux soient placés en cage individuelle. ¬6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été́ définis : l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échéant). Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, et du comportement alimentaire sont depuis longtemps étudiés chez la souris. La souris représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité́ biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Toutes les souris de ce projet arriveront à l’âge de 6 semaines dans notre animalerie, mais nous ne débuterons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines, sur des souris adultes. Il est admis qu’à 8 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris seront logées dans des cages collectives pour favoriser les interactions sociales. Afin de permettre le suivi individuel du poids et de la prise alimentaire, uniquement quand cela sera nécessaire, les souris seront placées en cage individuelle. Ces cages vont être rapprocher le plus possible pour permettre au mieux à l’animal d’avoir une interaction visuelle, auditive et olfactive.