Oncologie

Génétiquement modifiées pour visualiser leur système nerveux, 2943 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 1020 classées sévères, toutes tuées à l'issue. Elles sont infectées par la tuberculose, une infection sous anesthésie brève, l'autre plus longue, puis reçoivent des traitements pharmacologiques jusqu'à 42 jours. Les effets attendus vont de la perte de poids à la détresse respiratoire, en passant par des troubles moteurs et l'isolement social. Les retombées annoncées contre une maladie qui reste une cause majeure de mortalité mondiale sont formulées comme un espoir, face à des atteintes immédiates et certaines sur plus d'un millier d'animaux en souffrance sévère.

Objectifs

La tuberculose pulmonaire est une maladie provoquée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis. La personne infectée développe une inflammation chronique qui change, parfois de façon irréversible, l’architecture de ses poumons. Des travaux récents ont révélé que cette infection entraîne aussi des modifications importantes dans l’organisation du système nerveux périphérique. Cependant, on ignore encore la nature exacte de ces changements. Permettent-ils une meilleure interaction avec le système immunitaire local ? Contribuent-ils à la résolution de la pathologie ? Ou à son aggravation ? L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre comment le système nerveux périphérique s’adapte à l’infection par Mycobacterium tuberculosis au niveau des poumons. Pour cela, nous utiliserons plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées permettant de visualiser et de manipuler différents compartiments du système nerveux. Ces modèles permettront d’identifier les cellules nerveuses impliquées, de suivre leur évolution pendant l’infection, et d’évaluer leur rôle fonctionnel dans la progression de la maladie. Plus précisément, nous étudierons : ● Le remodelage des fibres nerveuses autour des bronches, ● Le rôle des cellules qui les accompagnent et les soutiennent dans ce processus, ● Les interactions entre cellules nerveuses et cellules immunitaires dans le tissu pulmonaire infecté. Ces analyses utilisent des approches d’imagerie (microscopie), de biologie cellulaire (tri et culture de cellules), et des techniques avancées de séquençage pour étudier finement les réponses des cellules nerveuses et immunitaires au cours du temps. À terme, ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes de communication entre système nerveux et système immunitaire dans un contexte infectieux. Ces connaissances pourraient ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour mieux contrôler l’inflammation et les dégâts pulmonaires associés à la tuberculose.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter des bénéfices scientifiques et médicaux importants dans la lutte contre la tuberculose, une maladie qui reste aujourd’hui l’une des principales causes de mortalité infectieuse dans le monde. Les résultats attendus permettront d’améliorer notre compréhension d’un aspect encore très peu étudié de la maladie : l’implication du système nerveux dans les infections pulmonaires chroniques. En effet, il est de plus en plus évident que les nerfs présents dans les poumons ne sont pas de simples structures passives, mais qu’ils peuvent influencer l’inflammation, la réparation des tissus, et même la réponse immunitaire face aux bactéries. En étudiant précisément le rôle de différents types de nerfs et de cellules nerveuses pendant l’infection tuberculeuse, ce projet pourra : ● Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour limiter les dégâts causés aux poumons pendant la maladie, ● Mieux comprendre pourquoi certains patients développent des formes sévères de tuberculose avec des atteintes pulmonaires importantes, ● Éclairer le rôle du système nerveux dans d’autres maladies inflammatoires chroniques du poumon. À plus long terme, ces recherches pourraient contribuer au développement de stratégies dites « à visée neuro-immunologique », c’est-à-dire ciblant les interactions entre les nerfs et le système immunitaire pour mieux contrôler l’inflammation. Ce type d’approche est déjà en cours d’exploration dans d’autres pathologies (maladies auto-immunes, cancer), mais n’a jamais été appliqué à la tuberculose. Sur le plan fondamental, ce projet aidera également à mieux comprendre comment les cellules de soutien des nerfs (appelées cellules de Schwann) peuvent changer de fonction en réponse à une infection et participer aux mécanismes de défense ou de réparation. Ces connaissances pourront donc aussi bénéficier à d’autres domaines de recherche, comme la régénération nerveuse ou les maladies neuro-inflammatoires.

Procédures

Les souris utilisées dans ce projet seront soumises à plusieurs types d’interventions : ● Deux types d’infections différentes : l’une sous anesthésie générale d'une durée de 30 seconde , l’autre d’une durée de 40-45min au total. ● Des injections engendrant une contention de 1min. ● Des traitements pharmacologiques ciblés d’une durée de maximale de 42 jours. ● Des manipulations génétiques conditionnelles par administration d’une substance d’une durée maximale de 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables répertoriés précédent pourraient être en fonction des procédures : une perte de poids, une baisse d'activité, des troubles moteurs, une perte d'appétit, une altération du comportement, une détresse respiratoire modérée, une altération temporaire de l'état général, une diminution des interactions sociales.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet feront l’objet d’analyses approfondies. Ils seront donc mis à mort de manière programmée et encadrée à la fin des procédures expérimentales pour répondre au mieux aux problématiques scientifiques.

Remplacement

L’étude proposée cherche à comprendre comment les nerfs pulmonaires et les cellules du système immunitaire interagissent lors de l’infection par Mycobacterium tuberculosis. Aujourd’hui, aucun modèle de culture cellulaire ou système artificiel ne permet de reproduire fidèlement la complexité du tissu pulmonaire, notamment l’organisation des nerfs et des cellules gliales dans un environnement en 3 dimensions, avec toutes les interactions mécaniques, nerveuses, vasculaires et immunitaires qui se produisent dans un animal vivant. La bactérie responsable de la tuberculose (M. tuberculosis) se développe très lentement et son comportement dépend fortement du fonctionnement global du corps. Les alternatives existantes ne permettent pas de suivre l’évolution réelle de l’infection, ni les modifications des nerfs ou des cellules. Pour toutes ces raisons, l’utilisation de la souris reste indispensable pour répondre aux questions scientifiques du projet : identifier les types de nerfs impliqués, comprendre leur rôle pendant l’infection, et explorer la manière dont les cellules s’adaptent à la présence de la bactérie. Aucun autre modèle ne permet actuellement d’atteindre ces objectifs de manière fiable.

Réduction

Les effectifs proposés ont été définis à partir de données préliminaires, d’expériences antérieures réussies et d’outils d’analyse statistique reconnus. Les résultats seront traités avec des méthodes statistiques appropriées, permettant d’évaluer les différences entre groupes de manière rigoureuse sans multiplier inutilement les animaux. Nous avons également mis en place des approches permettant d’extraire plusieurs types d’informations à partir d’un seul animal. Par exemple, à partir d’un même poumon, nous réalisons l’analyse des bactéries présentes, l’étude de l’expression des gènes, et le dosage des molécules inflammatoires. Enfin, le projet suit une logique progressive : si une étape expérimentale ne donne pas de résultats exploitables, elle sera arrêtée immédiatement.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre afin de minimiser les nuisances pour les animaux. Les temps de contention lors des phases d’infection et d’injection seront réduits au strict minimum nécessaire. Une surveillance renforcée sera établie après chaque intervention. Une grille de scoring ainsi que des points limites précoces et adaptés à chaque procédure seront mis en place pour suivre au mieux l’évolution de l’état général des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce avec une réponse immunitaire bien caractérisée et comparable à celle de l’humain. Ce modèle permet aussi d’examiner finement les interactions entre nerfs périphériques, cellules gliales, et cellules immunitaires dans le contexte pulmonaire. De nombreuses lignées transgéniques nécessaires à ce projet sont disponibles chez la souris et permettent d’isoler, tracer ou manipuler spécifiquement les populations cellulaires ciblées. Seules des souris adultes (6 à 10 semaines) seront utilisées. Ce stade garantit une immunité pulmonaire mature, indispensable pour étudier les conséquences de la tuberculose.

À J1, une colite est déclenchée chez la moitié des 120 souris par un produit dans l'eau de boisson, à J5 vient une IRM sous anesthésie, à J6 un AVC provoqué par injection de thrombine lors d'une chirurgie d'une à deux heures, puis deux IRM à J7 et J13. Ces souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, avec diarrhées, saignements rectaux et faiblesse d'une patte. L'étude déclare n'être qu'un pilote, destiné à calibrer une expérience plus large sur les liens entre inflammation intestinale et AVC. Toutes sont tuées à J13 par exsanguination pour prélever cerveau et intestin.

Objectifs

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) constituent un enjeu majeur de santé publique. Le traitement de l’AVC ischémique repose actuellement sur la thrombolyse et/ou la thrombectomie. Cependant, ces interventions ne sont pas toujours réalisables et ne garantissent pas une récupération fonctionnelle complète. Cela justifie le développement de nouveaux outils pronostiques et thérapeutiques. Le rôle de l’inflammation intestinale dans la pathophysiologie de l’AVC suscite un intérêt croissant. Plusieurs travaux récents mettent en évidence des interactions étroites entre inflammation intestinale et neuroinflammation post-AVC. Dans ce contexte, l’objectif principal de ce projet pilote est de réaliser des expérimentations préliminaires visant à évaluer l’impact d’un état inflammatoire intestinal élevé sur la sévérité de l’AVC dans un modèle murin. Les données obtenues permettront d’optimiser les protocoles ultérieurs, en fournissant notamment les éléments statistiques nécessaires à une estimation rigoureuse du nombre d’animaux requis, dans une logique de réduction et de raffinement conformément aux principes des 3R. Ces expérimentations préliminaires aideront également à identifier d’éventuelles contraintes techniques ou biologiques, afin d’ajuster au mieux les procédures et d’améliorer le bien-être animal.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude pilote constitueront une base expérimentale pour une étude de plus grande envergure, destinée à approfondir l’analyse des interactions entre l’inflammation intestinale et la neuroinflammation post-AVC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une séquence expérimentale unique comprenant l’induction d’une inflammation intestinale, des examens IRM, l’induction d’un AVC thromboembolique et la mise à mort pour analyses histologiques. 1. Induction de l’inflammation intestinale (J1–J5) Chez la moitié des animaux (n = 60), une inflammation intestinale modérée sera induite par administration de DSS 2 % dans l’eau de boisson pendant 5 jours. Cette étape ne nécessite pas d’anesthésie. Un suivi clinique quotidien sera assuré. 2. IRM moléculaire (J5) Tous les animaux (n = 120) seront anesthésiés à l’isoflurane (2 % dans O₂/N₂O 30/70) pour un examen IRM de 30 à 45 minutes. Un cathéter sera inséré dans la veine caudale pour l’injection de MPIO, puis retiré en fin de séance. Une analgésie locale (lidocaïne/xylocaïne) sera appliquée au point d’insertion. 3. Induction du modèle d’AVC (J6) Sous anesthésie générale (isoflurane 2 % dans O₂/N₂O 30/70) et analgésie systémique (buprénorphine 0,1 mg/kg s.c. en prémédication), une chirurgie stéréotaxique sera réalisée pour induire une ischémie focale par injection de thrombine dans l’artère cérébrale moyenne. La procédure dure 60 à 90 minutes. Les animaux recevront ensuite soit du tPA (10 mg/kg i.v.), soit une solution saline. 4. IRM post-AVC (J7 et J13) Deux nouveaux examens IRM seront réalisés sous les mêmes modalités anesthésiques (isoflurane 2 %, durée 30–45 min) afin d’évaluer le volume lésionnel, la neuroinflammation et l’inflammation intestinale. 5. Mise à mort et prélèvements (J13) À l’issue du dernier examen, les animaux encore sous anesthésie générale seront mis à mort par exsanguination induite par perfusion intracardiaque de sérum physiologique (isoflurane 5 % en O₂/N₂O 30/70 ; fentanyl 0,3 mg/kg i.p. en prémédication). Les organes d’intérêt (cerveau, intestin) seront prélevés immédiatement pour analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Le modèle d’induction d’une inflammation intestinale par traitement au DSS peut entraîner une perte de poids, des diarrhées et des saignements rectaux. Ces symptômes seront suivis avec attention grâce à l’utilisation quotidienne d’échelles de scores cliniques déjà établies, permettant un ajustement rapide des soins si nécessaire. Nos travaux antérieurs ont de plus montré que la dose de 2 % utilisée dans cette étude n’entraîne que des signes modérés de colite tout en induisant une inflammation intestinale suffisante pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Concernant le modèle d’AVC, certains animaux peuvent présenter des signes transitoires de douleur dans les heures suivant la chirurgie, ainsi qu’un affaiblissement temporaire de la patte avant gauche, correspondant à la zone cérébrale lésée, qui disparaît généralement au cours de la première semaine. Afin de limiter au maximum toute forme d’inconfort ou de souffrance, des analgésiques locaux seront appliqués au niveau du site chirurgical avant l’intervention, et des analgésiques systémiques seront administrés avant et après l’intervention. La surveillance quotidienne des animaux, associée à ces conditions environnementales contrôlées et à la prise en charge analgésique, permettra de réduire autant que possible les nuisances et la douleur liées aux procédures expérimentales.

Devenir

À l’issue de la procédure expérimentale, l’ensemble des animaux (n = 120) seront mis à mort afin de permettre la réalisation d’analyses histologiques indispensables à la compréhension des mécanismes étudiés. Ces prélèvements visent notamment à confirmer et compléter les observations issues des analyses d’imagerie in vivo (IRM), en permettant une évaluation fine des lésions cérébrales, de la neuroinflammation et de l’inflammation intestinale. Les échantillons obtenus fourniront également les données quantitatives nécessaires à l’optimisation et à la standardisation des protocoles ultérieurs. La mise à mort interviendra à la fin de la procédure. La mise à mort de tous les animaux se justifie par la nécessité scientifique de disposer de tissus parfaitement préservés pour les analyses post-mortem et par le souci constant de limiter toute utilisation et toute souffrance inutile, conformément aux principes de remplacement, de réduction et de raffinement (3R).

Remplacement

Les modèles animaux constituent à ce jour les outils expérimentaux les plus pertinents pour répondre à la question scientifique posée. En effet, aucun modèle de substitution disponible actuellement ne permet de reproduire la dimension multi-organe de la pathophysiologie de l’AVC étudiée ici et, donc d’apporter une réponse adéquate à la problématique susmentionnée.

Réduction

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques ne pouvant être ici exclue, nous veillerons à en limiter le recours au strict nécessaire. La présente demande d’autorisation de projet couvre une étude pilote, dont les résultats permettront de mieux anticiper et d’optimiser l’utilisation d’animaux lors des études ultérieures. Nonobstant le caractère préliminaire de cette étude, nous nous attachons à réduire le nombre d’animaux employés, tout en conservant un effectif suffisant pour assurer la robustesse et la validité des analyses. Par ailleurs, l’utilisation de méthodologies d’imagerie in vivo autorise le suivi longitudinal des mêmes individus et contribue, de fait, à la réduction du nombre total d’animaux nécessaires. L’estimation du nombre d’animaux nécessaires tient également compte des aspects méthodologiques de la procédure expérimentale, notamment l’habileté et l’expérience de l’expérimentateur, ainsi que des risques de perte inhérents à la conduite de la procédure.

Raffinement

Au cours de la procédure expérimentale, une attention particulière sera portée au bien-être des animaux. La procédure inclut des modèles et des modalités d’imagerie susceptibles d’entraîner certaines nuisances et/ou un stress. Les animaux feront donc l’objet d’un suivi quotidien assuré par du personnel qualifié. Les symptômes intestinaux induits par le traitement au DSS seront évalués quotidiennement à l’aide d’une échelle de score spécifique, permettant d’anticiper la persistance ou l’aggravation des nuisances. Des protocoles validés d’anesthésie et d’analgésie seront également mis en œuvre, notamment lors de l’induction du modèle d’AVC et des examens IRM, afin de limiter au maximum toute forme de douleur, de détresse ou d’angoisse liées aux interventions. L’ensemble des manipulations sera réalisé par du personnel expérimenté et formé aux procédures chirurgicales et aux soins post-opératoires. Les animaux seront hébergés en petits groupes sociaux (n=5) dans des cages standard, dans des conditions conformes aux normes européennes en vigueur (température stabilisée à 21 °C, hygrométrie de 55 %, intensité lumineuse de 100 lux, et cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h), avec du matériel d’enrichissement et un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie comme espèce expérimentale pour ce projet en raison de sa pertinence scientifique et de sa faisabilité technique. La physiologie murine, notamment en ce qui concerne le système immunitaire intestinal et la réponse neuroinflammatoire post-AVC, présente des similitudes établies avec celle de l’humain, permettant ainsi d’étudier de manière appropriée les interactions entre inflammation intestinale et sévérité de l’AVC. De plus, des modèles murins bien caractérisés existent à la fois pour l’induction d’une colite expérimentale et pour l’ischémie cérébrale thromboembolique focale, avec des protocoles reproductibles et validés à l’échelle internationale. Enfin, aucune alternative in vitro ou modèle in silico ne permet aujourd’hui de reproduire de manière intégrée les interactions multi-organes dans le contexte post-AVC, rendant l’utilisation de la souris indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. L’AVC est une pathologie qui touche principalement l’adulte, le plus souvent au-delà de 65 ans, mais son incidence augmente également chez l’adulte jeune. Pour reproduire au mieux la pathophysiologie humaine, les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), stade où la maturation physiologique et la réponse neurovasculaire sont comparables à celles de l’adulte humain.

6858 souris vont être utilisées pour ce projet sur le médulloblastome, une tumeur cérébrale de l'enfant, dont 6114 classées en souffrance sévère. Des fragments de tumeur sont greffés sous la peau ou des cellules injectées dans le cerveau, suivies d'imagerie sous anesthésie, de traitements répétés et de tests de mémoire. Toutes seront tuées pour analyses. Ce chiffre de près de sept mille animaux, dont la grande majorité en souffrance sévère, accompagne des bénéfices thérapeutiques décrits au conditionnel et à long terme.

Objectifs

Le médulloblastome (MB) est une tumeur pédiatrique invasive du cervelet. Il représente la tumeur maligne du système nerveux central la plus fréquente chez l'enfant. Même si le taux de guérison a été amélioré pour atteindre 70 à 80% de survie suite aux traitements classiques, associant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie, les effets secondaires associés sont sévères et 20 à 30% des patients restent incurables et ne survivent pas. Quatre groupes de MB ont été identifiés possédant des caractéristiques moléculaires et cliniques différentes et répondant différemment aux traitements. Le groupe 3 (20 à 25% des cas), le plus problématique d'un point de vue clinique, est métastatique, de très mauvais pronostic et résistant aux thérapies actuelles. Les MB de ce groupe restent encore mal caractérisés. Il est donc urgent d'identifier les événements oncogéniques (processus capables d’induire de la tumeur) participant à leur carcinogenèse afin de proposer des stratégies thérapeutiques alternatives. In vitro, nous avons sélectionné et validé l'importance dans la progression tumorale de plusieurs gènes dont l'expression est augmentée dans le MB de groupe3 par rapport aux trois autres groupes dans nos modèles de lignées cellulaires. Nous allons implanter des cellules de MB génétiquement modifiées chez la souris pour évaluer si la modulation de l’expression de notre gène d'intérêt influence la croissance tumorale. Nous analyserons également in vivo les effets d’inhibiteurs pharmacologiques ciblant les processus dans lesquels nos gènes d’intérêt sont impliqués. Nous évaluerons si un traitement avec ces molécules conduit à une régression du MB ainsi qu’à une augmentation de la survie des souris. Au préalable, ces inhibiteurs pharmacologiques, potentiels agents thérapeutiques, seront testés in vitro dans différents modèles. Seuls les plus prometteurs seront testés in vivo. La réalisation de ce projet de recherche pourrait permettre d'identifier de nouveaux acteurs clés de la carcinogenèse du MB et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour ces MB agressifs résistants à l'ensemble des thérapies actuelles.

Bénéfices attendus

L’étude portant sur l’identification d'oncogènes et de gènes suppresseurs de tumeur dans le médulloblastome permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation des tumeurs et la rechute. Ce projet a pour but d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d’améliorer le traitement de ces cancers tout en diminuant les effets secondaires indésirables associés. Les bénéfices directs attendus sont de deux ordres : l'un cognitif pour une meilleure compréhension des mécanismes tumoraux et de résistance aux traitements, l’autre, d’ordre sociétal en santé humaine avec le potentiel développement de nouvelles thérapies plus efficaces pour soigner des patients atteints de cancers pédiatriques. En effet, la validation de cibles thérapeutiques permettra l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques notamment des thérapies ciblées qui s’inscrivent dans le développement d’une médecine personnalisée. Cette forme de médecine plus précise cible de manière spécifique le type de tumeur propre à chaque patient. Les thérapies ciblées peuvent être combinées à d’autres traitements tels que la radiothérapie ou la chimiothérapie déjà bien connus mais ayant des effets secondaires lourds. Dans le cas de combinaison de traitement, on peut envisager de diminuer les doses et ainsi réduire les effets secondaires. Cette stratégie thérapeutique permettrait donc d’améliorer l’efficacité des traitements tout en diminuant les effets délétères. De plus, les thérapies ciblées préservent davantage les cellules saines et donc impactent moins la qualité de vie des patients contrairement aux chimiothérapies ou à la radiothérapie. Les effets indirects attendus en réduisant les effets secondaires indésirables pourront donc avoir un effet sociétal en diminuant les handicaps associés et permettant une meilleure intégration des patients dans la société, mais aussi avoir un impact économique en réduisant la nécessité de soins liés aux effets secondaires. La bonne connaissance de nos modèles nous garantira une qualité au niveau de nos expériences ce qui contribuera à l’enrichissement des connaissances à travers la publication de nos résultats dans des journaux scientifiques.

Procédures

Dans un premier lot, des fragments de tumeurs seront greffés aux souris anesthésiées (1 fois par expérience/ 10 minutes/ souris) ou des cellules tumorales seront injectées aux animaux éveillés (1 fois au cours de l’expérience/ 1 minute/ souris). Les animaux seront ensuite suivis, et les tumeurs mesurées à l’aide d’un pied à coulisse (1 à 2 fois par semaine/ 1 minute/souris). Les animaux recevront un ou plusieurs traitements (7 administrations max /semaine) soit par injection soit par voie orale,. (Environ 1 minute/souris) Dans un second lot, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des souris anesthésiées (1 fois au cours de l’expérience/ 10 minutes/souris), puis suivies à l’imagerie sous anesthésie (1 fois par semaine/ environ 20 minutes/souris). Ces mêmes animaux recevront un ou plusieurs traitements (max/ 7 semaines) soit par injection soit par voie oral. (Environ 1 minute/souris) Afin d’évaluer la capacité d’apprentissage et la mémoire spatiale de ces animaux, des tests de comportement seront réalisés avec au maximum 15 séances/semaine (chaque séance ayant une durée de moins de 10min par animal).

Impact sur les animaux

À la suite de la greffe des cellules ou de fragments de tumeurs, une perte de poids peut être observée jusqu’à environ 4 jours post-greffe. Ces souris développeront des tumeurs. En fonction de la zone d’implantation, les nuisances attendues seront différentes. Pour les tumeurs se développant au niveau du flanc, les souris pourront rencontrer une gêne liée à la croissance tumorale, lors des déplacements notamment. Pour les tumeurs se développant au niveau du cerveau, les souris pourront ressentir des troubles neurologiques tels que troubles de motricité, perte d’équilibre. La tête penchée peut être un signe clinique spécifique survenant à l’injection de cellules au niveau cérébral, caractérisant une perte de l’équilibre. Les nuisances attendues lors des administrations d’agents pharmacologiques sont liées à l’administration en elle-même (douleur légère de courte durée suite aux injections, stress de courte durée lié à la contention de l’animal lors des administrations orales) ainsi qu’à la composition du solvant utilisé pouvant entraîner une sensation de brûlure. Un léger stress ou angoisse peuvent être ressentis lors des anesthésies pour les séances d’imagerie. Les nuisances attendues lors des tests comportementaux sont liées au stress provoqué par les modifications apportées à l’environnement des animaux : conditions du test, type d’hébergement, expérimentateur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Des données générées à partir d'un grand nombre d'échantillons de patients atteints de MB permettent de mettre en évidence l’importance de certains gènes régulant la progression du MB. Cependant, il reste encore à valider ces cibles in vitro puis dans un modèles intégrés in vivo comme la souris. Concernant l’étude sur le médulloblastome, nous disposons au laboratoire de nombreux modèles in vitro : des cellules neuronales en culture, des lignées cellulaires humaines sur lesquelles de nombreux résultats prometteurs in vitro ont déjà pu être obtenus. Des expériences préliminaires in vitro sur cellules tumorales seront toujours réalisées en amont de l’approche in vivo chez la souris afin de ne poursuivre qu’avec les axes de recherche les plus solides. De la même façon, tous les composés de thérapies ciblées seront testés in vitro, et ne seront testés in vivo que ceux pour lesquels les résultats seront prometteurs. Des travaux sont également en cours en ce moment dans notre laboratoire sur l’obtention d’organoïdes de cervelet à partir de cellules humaines souches induites pluripotentes (iPS) ce qui nous permettra dans l’avenir d’augmenter nos approches in vitro et de remplacer une partie des animaux utilisés à des fins expérimentales. Enfin, l’étude de la toxicité des nouveaux traitements ne peut s’envisager que sur animal. Nous chercherons en particulier à évaluer l’effet de ces traitements sur la croissance tumorale mais aussi à travers des tests comportementaux permettant de s’assurer du moindre impact sur les déficits moteurs ou cognitifs semblables à ceux observés chez les patients. Aussi, malgré le développement et l’utilisation de méthodes alternatives au laboratoire l’utilisation du modèle souris reste indispensable pour le présent projet.

Réduction

Pour minimiser le nombre d’animaux, nous aurons recours à des études longitudinales avec l’utilisation de l’imagerie du petit animal (suivi du même animal au cours du temps). Des études préliminaires (pilotes) seront réalisées pour l’administration d’agent pharmacologique en fonction des données déjà publiées ou non. Les Patient derived Xenograft de médulloblastome (PDX) sont établies à partir de tumeurs fraîchement opérées. Au contraire des lignées, ces greffes primaires sont très stables et restent très proches de la tumeur d'origine. En cancérologie, elles sont reconnues pour mimer les processus tumoraux chez l'Homme et constituent donc un modèle de choix pour valider nos traitements thérapeutiques potentiels. L’utilisation de ces PDX (maintenues sur animaux vivants) est mutualisée avec les autres projets de l’équipe ce qui contribue également à la réduction du nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux estimé dans ce projet est un nombre maximum, qui sera certainement réduit. Pour limiter le nombre d’animaux, nous travaillerons par lot de manière à avoir un nombre suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux par groupe sera de 8 souris si possible. Le nombre d’animaux par groupe devra être augmenté (12 à 15 animaux par groupe) pour les études comportementales pour atteindre une puissance statistique suffisante pour conclure. Chaque expérience sera répétée 2 fois et une 3ème si nécessaire, (dans le cas de résultats discordants entre les 2 premières expériences). Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec les tests statistiques appropriés.

Raffinement

Dès que cela n’implique pas de stress ou de l’angoisse supplémentaire, une méthode d’anesthésie sera utilisée pour réaliser le geste technique nécessaire à l’expérimentation. De plus, des méthodes analgésiques seront appliquées avec l’utilisation d’analgésiants locaux et/ou généraux pendant l’opération et si besoin en post-opératoire. Le réveil de l’animal se fera sous lampe chauffante et sera surveillé par l’expérimentateur. Des méthodes sont mises en place durant la chirurgie pour le bien-être de l’animal avec par exemple l’utilisation d’un coussin chauffant, l’utilisation de vaseline pour éviter le dessèchement des yeux, et en post-opératoire en favorisant l’accès à la nourriture molle en déposant au fond de la cage des cupules d’aliment gélifié. Nous habituerons les animaux quelques jours avant la chirurgie à se nourrir à base de ces cupules d’aliments gélifiés pour diminuer encore le stress et l’angoisse. Une surveillance accrue est mise en place post-chirurgie, avec changement des cupules d’aliments gélifiés le lendemain, ajout de croquettes humifiées au fond de la cage. L’expression d’un marqueur par les cellules tumorales permettra de suivre leur croissance dans le cerveau par une méthode non invasive d’imagerie. Les animaux greffés seront observés régulièrement par l’expérimentateur pour le suivi de la croissance tumorale soit par mesure à l’aide d’un pied à coulisse soit par imagerie en fonction du site d’implantation et pour vérifier leur état général de santé. Une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux, mettre en place les soins adaptés voire mettre à mort l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle de prédilection pour les expériences menées en recherche en thérapeutique du cancer, en particulier pour sa parenté physiologique avec l’Homme. Ce modèle est utilisé dans de nombreuses études en cancérologie, notamment pour des expériences de greffes dans des lignées murines immunodéficientes. De plus, le modèle murin est un modèle de choix puisque les tumeurs spontanées sont rares et la croissance tumorale induite par greffe est relativement rapide. Les souris arriveront à l'animalerie, âgées de 6 semaines. Après une période d'adaptation d’une semaine minimum à l'animalerie, les animaux seront alors utilisés à l'âge de 7 semaines de manière à favoriser la reproductibilité des résultats. En fonction des résultats obtenus, il est possible que nous utilisions des souriceaux à la place des adultes cependant dans un premier temps, le stade adulte semble être plus approprié pour adapter un traitement pharmacologique par exemple. Le Médulloblastome étant une tumeur pédiatrique, il se peut que nous passions sur un modèle murin au stade juvénile pour se rapprocher au mieux du microenvironnement de la tumeur étudiée.