Oncologie

Injectées avec des cellules de lymphome B, 1 300 souris sur les 1 800 du projet développent des tumeurs ganglionnaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le grossissement des ganglions peut réduire leur mobilité, voûter leur posture, accélérer leur respiration et leur faire perdre du poids. L'équipe cherche à comprendre comment les cellules tumorales produisent leur énergie, et pourquoi certains lymphomes résistent aux immunothérapies quand d'autres y répondent. Toutes les souris sont tuées à la fin pour récupérer les tumeurs, geste que le porteur présente comme la seule façon d'étudier le fonctionnement interne des cellules cancéreuses.

Objectifs

Les Lymphomes Diffus à Grandes Cellules B (LDGCB) sont des cancers du système immunitaire qui touchent les lymphocytes B, des cellules chargées de défendre l’organisme contre les infections. C’est le type de lymphome le plus fréquent dans les pays industrialisés. Ce cancer est très variable d’un patient à l’autre. Une des raisons principales est la façon dont les cellules cancéreuses produisent l'énergie pour se développer et se multiplier. Pour produire cette énergie, elles peuvent utiliser deux grands mécanismes: l'un rapide mais peu efficace, tandis que l'autre est plus complexe mais plus efficace. Des études ont montré que, chez certains patients, le lymphome dépend de l'un ou l'autre de ces mécanismes. Cette différence peut influencer leur réponse aux traitements actuelement disponibles. Notre objectif vise à mieux comprendre pourquoi ces cancers ne fonctionnent pas tous de la même manière. Nous cherchons notamment à déterminer si ces différences sont liées à des facteurs génétiques ou à l'environnement des cellules tumorales. Nous étudierons si d'autres modifications du métabolisme sont associées à la croissance des cellules cancéreuses. Pour répondre à ces questions, nous utiliserons un modèle expérimental de souris reconnu et largement utilisé pour l'étude des lymphomes en laboratoire.

Bénéfices attendus

Ce projet est à la base des recherches menées par notre équipe pour mieux comprendre pourquoi certains lymphomes sont résistants aux traitements actuels (immunothérapies et thérapies ciblées), alors que d'autres y sont sensibles. Il s'intéresse à la manière dont les cellules tumorales produisent l'énergie nécessaire à leur développement. À court terme, il permettra d'identifier les mécanismes qui favorisent la croissance des lymphomes. À plus long terme, ces travaux aideront à mieux comprendre les causes de la résistance aux traitements et pourraient permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. À terme, ces connaissances pourraient contribuer au développement de traitements plus efficaces et mieux adaptés aux caractéristiques de chaque patient.

Procédures

Dans ce projet les souris seront soumises à des contentions (environ 30 secondes, 1 à 3 fois par semaine). 1300 animaux recevront une injection de cellules tumorales (environ 30 secondes). Parmi elles, 1000 souris recevront une injection ultérieure (environ 30 secondes). 300 souris auront un prélevement de sang (environ 45 secondes), suivi de 2 injections (environ 30 secondes chacune).

Impact sur les animaux

La croissance des lymphomes dans les ganglions lymphatiques pourra entraîner une augmentation du volume des ganglions et, selon leur localisation, provoquer une gêne modérée chez les animaux. Celle-ci pourra se traduire par une diminution de la mobilité, une posture voûtée, une baisse de l'activité, une respiration plus rapide ou une perte de poids.

Devenir

Afin de mieux comprendre comment les cellules des lymphomes produisent et utilisent l'énergie nécessaire à leur survie et à leur multiplication, nous devons récupérer les tumeurs développées chez les animaux à la fin de l'expérience. Cela nécessite de procéder à la mise à mort de l'ensemble des animaux du projet. Les analyses réalisées sur ces tumeurs après leur prélèvement sont indispensables pour étudier le fonctionnement interne des cellules cancéreuses, comprendre les mécanismes biologiques qui favorisent leur développement et identifier de nouvelles caractéristiques pouvant être exploitées pour améliorer les traitements des lymphomes.

Remplacement

Les lymphomes B peuvent utiliser différentes sources d’énergie selon leur environnement, ce qui influence leur sensibilité aux traitements. Lorsqu’on étudie ces cellules cancéreuses en laboratoire dans des conditons de culture in vitro, cette diversité n'est plus observée. En effet, ces conditions sont très artificielles et ne reproduisent pas fidèlement l’environnement réel de la tumeur dans l’organisme. De plus, les milieux de culture contiennent des nutriments spécifiques présents à des concentrations élevées et non-physiologiques, qui “forcent” les cellules tumorales à utiliser certaines réactions biochimiques. Avec le temps, les cellules s’adaptent à ces conditions artificielles et finissent par se comporter différemment des celles qui évoluent dans l'organisme (in vivo). C’est pourquoi, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, notamment des souris, pour étudier correctement cette diversité métabolique et mieux comprendre le comportement biologique des lymphomes.

Réduction

Les effectifs ont été réduits au strict minimum tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement fiables et interprétables. Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé à l’aide d’un outil informatique de calcul, en tenant compte des connaissances que nous avons acquises au cours des 15 dernières années avec le modèle animal utilisé dans cette étude.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera assuré par la mise en place de mesures de raffinement adaptées au modèle de lymphome B étudié. Les animaux feront l'objet d'une surveillance régulière (une à trois fois par semaine selon la procédure expérimentale), voire quotidiennement (selon la phase expérimentale), incluant l'évaluation de leur état général, de leur comportement, de leur mobilité, de leur poids et de l'évolution du développement tumoral. La palpation régulière des ganglions lymphatiques permettra également de suivre la progression de la maladie.

Choix des espèces

La souris présente de nombreuses similitudes biologiques avec l'Homme, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté à l'étude des lymphomes. Le choix de cette espèce repose également sur l'existence de modèles murins génétiquement modifiés bien caractérisés, qui reproduisent certaines caractéristiques des lymphomes B humains et permettent d'étudier les mécanismes impliqués dans leur développement et leur réponse aux traitements. La souris présente par ailleurs l'avantage de disposer d'un système immunitaire et d'un environnement tumoral étudiables dans leur intégralité, ce qui est essentiel pour analyser les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement. De plus, comparativement au plasma humain, les concentrations en nutriments observées dans le plasma murin sont globalement conservées. Ces similitudes suggèrent que l'environnement nutritionnel disponible pour les cellules tumorales est comparable entre les modèles murins et humains, renforçant ainsi la pertinence de ce modèle pour l'étude du métabolisme tumoral. Les animaux utilisés seront des souris âgées d’environ 6 semaines au début des procédures expérimentales. Cet âge correspond à une période compatible avec les greffes cellulaires, les analyses métaboliques et le suivi du développement tumoral dans ce modèle.

Nourries pendant trente-huit semaines avec un régime riche en graisses et en cholestérol pour les rendre obèses, 30 souris sur les 40 du projet subissent en plus un jeûne nocturne pouvant atteindre quinze heures, une injection de glucose sur souris consciente et six prélèvements de sang à la queue en deux heures. Toutes sont tuées après ces trente-huit semaines pour prélever le foie, le sang et d'autres tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'obésité ainsi provoquée est décrite comme les rendant "un peu moins actives", et l'objet est de tester un composé contre la fibrose du foie, pour laquelle le porteur indique qu'aucun traitement efficace n'existe. L'effectif de 40 souris est présenté comme calculé pour obtenir un effet statistique significatif, sans que ce calcul soit rapporté.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie représentent un enjeu majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Parmi ces maladies, la stéatose hépatique non alcoolique, qui correspond à une cirrhose du foie sans consommation d’alcool, est en forte progression à cause de l’augmentation de l’obésité ou encore du diabète de type 2. Dans cette maladie, il y a une accumulation importante de graisses dans les cellules du foie ,ce qui entraine une cicatrisation du foie appelée fibrose hépatique. Cette fibrose va rigidifier des parties du foie conduisant progressivement à une perte de fonction du foie et pouvant évoluer vers une insuffisance hépatique terminale. De plus, la fibrose hépatique chronique peut être responsable du développement de cancer du foie, ce qui accentue la gravité de cette pathologie. La stéatose hépatique non alcoolique est souvent diagnostiquée à un stade avancé, lorsque les lésions dans le foie sont déjà présentes. A l’heure actuelle il n’existe aucun traitement efficace pour inverser ou ralentir cette fibrose. Le développement de traitements efficaces contre la fibrose étant un enjeu majeur en santé, l’objectif principal de ce projet est de tester chez la souris un nouveau composé pour traiter la stéatose hépatique non alcoolique.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est le développement d’un traitement efficace pour lutter contre la progression de la fibrose hépatique. De plus ce projet permettra de mieux connaitre les mécanismes biologiques encore mal connus responsables du développement de la maladie.

Procédures

Pendant 38 semaines, 30 souris seront nourries avec un régime riche en graisses et cholestérol pour les rendre obèses et 10 souris recevront un régime standard. Pour tester la glycémie au cours du régime, 20 souris parmi les 40 souris du projet seront mis à jeun sur la nuit (maximum 15h) APRES 16 SEMAINES DE REGIME. Le lendemain, une injection de glucose (moins de 20 secondes) sera réalisée sur l'animal conscient et des prélèvements de sang se feront au niveau de la queue. Les prélèvements seront réalisés sur un temps court (durée inférieure à 2 minute) et de façon répétée en 6 fois sur une période de 2h dans la même journée. APRES 37 SEMAINES DE REGIME, UN AUTRE TEST DE LE GLYCEMIE APRES UNE PERIODE DE JEUNE MAXIMALE DE 6H SERA REALISE SUR LES 30 SOURIS NOURRIES AVEC LE REGIME GRAS DONT 10 SOURIS AURONT DEJA SUBI CE TEST A LA SEMAINE 16. Un autre prélèvement sanguin au niveau de la queue (une seule prise) sur la totalité des 40 souris sera réalisé 11 semaines plus tard.

Impact sur les animaux

Les souris qui recevront sur 38 semaines le régime riche en graisses et cholestérol vont prendre du poids et devenir un peu moins actives à cause de l'obésité. Durant la période de jeûne de 14-15h sur la nuit, les souris privées de nourriture pourront ressentir une sensation de faim. Lors de l’injection de glucose, le passage de l’aiguille de petite taille au travers de la peau sera de très courte durée (moins de 20 secondes) et entrainera un inconfort chez les souris. Des prélèvements sanguins à la queue seront pratiqués sur animaux conscients après 16, 27 ET 37 semaines de régime. Ces prélèvements bien que rapides (durée < 2 minutes) sont susceptibles d’induire un stress et une légère douleur.

Devenir

Après les 38 semaines de régime, tous les animaux seront mis à mort par une méthode d'euthanasie réglementaire pour prélever les tissus et le sang. L'analyse de ces prélèvements nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de développement dans le foie de la fibrose et d'identifier les cibles thérapeutiques de notre composé.

Remplacement

ll n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire de manière fiable l’environnement in vivo que l'on retrouve dans un organisme vivant et dans lequel plusieurs types de cellules interagissent entre elles et participent au développement de la fibrose . De plus, cette maladie se développe lorsqu’il y a des problèmes métaboliques (ex hausse de la glycémie) dans l’organisme entier suralimenté, ce qui justifie l’utilisation d’animaux. Enfin il n’existe pas de méthode alternative n’utilisant pas l’animal de laboratoire pour tester l’efficacité d’un composé sur la fibrose hépatique.

Réduction

Le nombre total de souris a été calculé pour avoir un effet statistique significatif sur les paramètres étudiés. A la fin de l’étude, des tissus autres que le foie pourront être prélevés chez les animaux et utilisés dans le cadre de différents projets dans notre équipe en lien avec d’autres maladies étudiées dans notre laboratoire (obésité, pré-diabète, atteintes cardiaques, rénales). Pour l’analyse des données recueillies lors des différentes expériences nous appliquerons les tests statistiques appropriés en utilisant un logiciel d'analyse.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement et la litière des cages sera plus fréquemment changée. Les procédures expérimentales seront réalisées par du personnel expérimenté. Pour diminuer le stress lors des prélèvements de sang, les animaux seront habitués au mesure de contention quelques semaines avant la prise de sang. Pour éviter d’avoir recours au gavage source de stress, le traitement sera administré quotidiennement (5 jours sur 7) dans de la nourriture constituée de beurre de cacahuète pour l’appétence. Le traitement avec le composé a déjà été administré chez le rongeur (rat et souris) dans de précédents travaux sans entrainer d’effets indésirables

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet sont très sensibles au régime riche en graisses et développe une obésité et une stéatose hépatique non alcoolique similaire à la maladie humaine. Les souris utilisées seront de jeunes mâles âgés de 5 à 6 semaines car la plupart des études sur le modèle murin pour étudier cette maladie sur une longue période utilisent de jeunes souris adultes. Ainsi, grâce aux nombreuses études scientifiques publiées, de nombreuses informations sur la souris sont disponibles et permettront de mieux comparer les résultats obtenus dans ce projet.

Choisies pour leur système immunitaire complet et fonctionnel, 3 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, puis des injections de traitements qui peuvent être quotidiennes, et pour certains groupes une anesthésie gazeuse tous les trois à quatre jours pendant environ un mois pour suivre la croissance de la tumeur. La progression tumorale peut entraîner une perte de poids, et les mesures comme les séances d'imagerie s'accompagnent d'un isolement transitoire. Toutes sont tuées à la fin des procédures pour prélever les tumeurs, le porteur cherchant à comprendre comment les cellules cancéreuses échappent à l'immunothérapie.

Objectifs

Ces dernières années, l'immunothérapie a beaucoup amélioré le traitement de plusieurs cancers, dont le mélanome (un cancer de la peau). Elle agit en réactivant les défenses immunitaires du patient contre la tumeur. Cependant, une grande partie des patients ne répond pas à ce traitement, ou cesse d'y répondre après une amélioration initiale : c'est ce qu'on appelle la résistance à l'immunothérapie. Ce projet vise à comprendre comment les cellules tumorales modifient leur métabolisme pour échapper à l'action du système immunitaire, afin d'identifier de nouvelles stratégies permettant de restaurer l'efficacité du traitement chez les patients résistants.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de la biologie du cancer de la peau et des mécanismes métaboliques associés à la résistance aux traitements, ouvrant la voie à de nouvelles combinaisons thérapeutiques pour les patients atteints de ce cancer.

Procédures

Les principales interventions consistent en : une greffe de cellules tumorales ; des injections répétées de traitements (anticorps, molécules ciblant le métabolisme tumoral) , pouvant être quotidiennes ; et, pour certains groupes, un suivi de la croissance tumorale par imagerie (détection de la lumière émise par les cellules tumorales), nécessitant une anesthésie gazeuse de courte durée (quelques minutes), répétée tous les 3-4 jours pendant environ un mois.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : un stress lié à la manipulation et aux injections répétées ; un stress lié à l'isolement transitoire lors des mesures ou des séances d'imagerie ; une perte de poids éventuelle liée à la progression tumorale ; un inconfort léger lié aux injections quotidiennes ou répétées.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir prélever les tumeurs.

Remplacement

Il n'existe pas à ce jour de méthode de remplacement (culture cellulaire, modèles invertébrés, intelligence artificielle) qui permette de caractériser, chez un mammifère, les interactions complexes entre cellules tumorales, cellules immunitaires et système immunitaire dans son ensemble, qui sont au coeur de la résistance à l'immunothérapie. Nos travaux préliminaires réalisés en culture cellulaire ont permis de sélectionner un nombre restreint de candidats prometteurs, mais leur validation nécessite un modèle animal possédant un système immunitaire complet et fonctionnel.

Réduction

Des statistiques prédictives ont été réalisées afin de déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir un résultat scientifiquement fiable, tout en évitant d'utiliser plus d'animaux que nécessaire. Nous effectuons également un suivi des animaux afin de minimiser les nuissances.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo, tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid). Elles seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris par cage de 500 cm2. Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux qui permettra l’arrêt de l’expérience dès que les souris présenteront un mal-être ou une souffrance. Les souris utilisées dans ce projet sont maintenues dans des conditions sanitaires optimales : les animaux sont hébergés en cages ventilées, manipulés sous hotte, et les équipements, les aliments, l’eau de boisson ainsi que les enrichissements (tigettes, igloo) sont stériles. La définition précise des points limites de chaque procédure expérimentale nous permettra de limiter les nuisances subies par les animaux. Enfin, nous utilisons quand cela est possible des méthodes d'imagerie non-invasise pour le suivi des tumeurs.

Choix des espèces

La souris a été choisie car son système immunitaire présente une forte homologie avec celui de l'homme, et parce qu'il existe des outils bien établis (anticorps, techniques d'imagerie) pour étudier précisément les interactions entre cellules tumorales et système immunitaire. Les souris utilisées possèdent un système immunitaire complet et fonctionnel, indispensable pour étudier la résistance à l'immunothérapie. Des souris adultes (5 à 8 semaines) car le mélanome est un cancer de l'adulte , mâles et femelles selon les lignées tumorales utilisées, seront utilisées.

Six tests comportementaux par souris sur trois semaines, dont un labyrinthe en Y et une piscine équipée d'une plateforme de sortie, plus quatre prélèvements sanguins isolés et trois séries de prélèvements étalées sur deux heures : 288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de dix-huit jours reçoivent de l'ovalbumine par voie intrarectale sous anesthésie, puis sont tués par dislocation cervicale une heure après leur réveil. L'objet est de mesurer les effets des additifs des laits infantiles sur l'intestin et le cerveau, avec des résultats destinés à éclairer l'Efsa et l'Anses. Le porteur qualifie ces tests comportementaux de "non invasifs et n'induisant pas de stress", tout en annonçant que certaines souris pourraient développer une inflammation intestinale chronique et un comportement anxieux.

Objectifs

Le lait maternel joue un rôle essentiel dans la croissance des nouveau-nés. Il module entre autres le microbiote intestinal, qui lui-même participe au bon développement du cerveau et de la santé. De nombreux nourrissons sont alimentés avec des laits de substitution en poudre. Ces préparations contiennent des additifs, utilisés notamment pour améliorer leur texture ou leur conservation. Il a déjà été montré que certains de ces additifs peuvent perturber l’équilibre du microbiote intestinal, entraînant une dysbiose et une inflammation intestinale chez l’adulte. En revanche, leurs rôles et leurs conséquences sur le développement du cerveau durant la période néonatale sont peu explorées et leurs effets à plus long terme sur le comportement restent inconnus. Ce projet a pour objectif d'étudier chez l'animal les effets de la consommation durant la période néonatale de laits contenant ces additifs sur l’axe intestin-cerveau à différentes périodes de la vie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. Sur le plan fondamental, ce projet apportera des connaissances nouvelles sur les mécanismes par lesquels l'alimentation agit sur la santé intestinale et le développement cérébral durant la période néonatale, et sur la façon dont les perturbations précoces du microbiote peuvent influencer l’apparition d’inflammation intestinale et le comportement à long terme. Sur le plan appliqué, les résultats viendront éclairer les évaluations des risques sanitaires liés à ces additifs chez les nourrissons. Ils pourront orienter l'optimisation des formulations des laits infantiles et fournir des éléments scientifiques utiles aux instances de réglementation (Autorité européenne de sécurité des aliments (Efsa), agence nationale de sécurité sanitaire (Anses)), dans une perspective de meilleure protection de la santé des nouveau-nés. Enfin, ces travaux contribueront à enrichir les recommandations nutritionnelles destinées aux familles et aux professionnels de santé.

Procédures

Les animaux subiront 4 prélèvements uniques de sang pour une durée inférieure à 1 minute afin de mesurer la gly-cémie. Les animaux subiront 3 prélèvements multiples de sang sur une durée de 2h, chacun de ces prélèvements mul-tiples seront séparés d’au moins une semaine afin de mesure la glycémie lors d’un test de tolérance au glucose. Les animaux adultes seront impliqués dans des tests de comportement non invasifs et n'induisant pas de stress chez l'animal. Les animaux adultes seront au préalable soumis à une phase d’habituation d’une semaine qui n'induira que peu ou pas de stress chez: chaque jour, ils seront exposés à l’expérimentateur et à la salle de comportement pendant une durée de 30 minutes à 1 heure, afin de réduire le stress lié à la manipulation et à l’environnement expérimental. À l’issue de cette période, une série de tests comportementaux sera réalisée pour évaluer différents aspects tels que l’anxiété, la sociabilité, la mémoire et l’hyperactivité. Ces évaluations reposeront sur les paradigmes suivants : • tes de l’anxiété : Les dispositifs expérimentaux combineront des zones ouvertes/éclairées et des zones fermées/protégées. Le temps de présence dans chaque type de zone sera quantifié sur une période de 10 minutes • évaluation de la mémoire : phase d’habituation de 10 minutes durant laquelle l’animal est placé dans une arène contenant des objets, dans un labyrinthe en Y ou dans une piscine équipée d'une plateforme pour permettre à l'animal de sortir de l'eau. Suite à une modification de la configuration (changement d’objets ou d’accessibilité des zones), une phase de test de 10 minutes permettra de mesurer la capacité de reconnaissance ou de spatialisation de l’animal. • évaluation de la sociabilité : mesureront la préférence naturelle de l’animal à interagir ou à passer du temps à proximité d’un congénère plutôt que d’un objet inanimé, sur une durée de 10 minutes Chaque test comprendra une phase d’habituation de 10 minutes à l’arène, suivie d’une phase de test de 10 minutes par animal. La fréquence des tests est limitée à un seul test par jour et par animal au maximum, pour un total d’environ 6 tests par animal répartis sur une période de trois semaines. • animaux jeunes adultes agés de 18 jours subiront une administration intrarectale d’ovalbumine après anesthésie à l’isoflurane. Après 1h de phase de réveil, ils seront mis à mort par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Certaines procédures pourraient induire une inflammation intestinale chronique de bas bruit sans ulcération majeure et qui n’a pas de conséquences visibles sur le phénotype. De plus, certains animaux pourraient développer des dérégulations métaboliques, caractérisées notamment par une augmentation de la masse grasse ainsi que présenter un comportement anxieux. Les tests comportementaux réalisés sur animaux adultes entraineront peu ou pas de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car l’analyse de leurs organes est nécessaire pour répondre à notre hypothèse de travail.

Remplacement

Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant, le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment cerveau/intestin/microbiote en lien avec le développement d’inflammation chronique de bas bruit et de troubles du comportement. Des animaux plus simples tels que la drosophile, C. elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie du développement cérébral et du comportement de ces animaux est très différente de celle des mammifères.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 12 souris par condition et par sexe était nécessaire afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les tests statistiques envisagés dans le cadre de ce projet l’ont été après avis recueilli auprès de biostatisticiens pour des projets similaires. De plus, il s’agit d’une expérience au design longitudinal, ce qui nous permet d’observer le phénotype des souris aux différents stades de développement et donc limiter le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Dans un souci de raffinement, un suivi étroit des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. Des points limites spécifiques et précoces sont définis pour chaque protocole. Dès l’apparition d’un signe clinique, différentes méthodes de raffinement seront appliquées pour éviter ou minimiser l’inconfort ou la douleur : utilisation de gel de réhydratation, réhydratation sous-cutanée, renforcement de l’enrichissement.

Choix des espèces

Cette étude privilégie la souris comme modèle de référence pour analyser l'impact des additifs alimentaires sur le microbiote intestinal et le développement cérébral néonatal. Ce choix se justifie par la capacité à suivre précisément les interactions microbiote-système immunitaire dès la naissance grâce à des outils d'analyse avancés. Bien que simplifiée, la physiologie mu-rine offre une pertinence conceptuelle et souvent directe pour comprendre les mécanismes chez le nouveau-né humain. En pratique, la souris est indispensable : sa reproduction rapide permet d'obtenir de grandes portées pour suivre les effets à long terme d'une exposition nutritionnelle précoce, de la nais-sance à l'âge adulte. De plus, c'est l'espèce la mieux maîtrisée pour évaluer les fonctions co-gnitives et comportementales en milieu contrôlé. Ces avantages combinés garantissent une efficacité optimale dans la recherche tout en assurant une représentation physiologique fiable des processus biologiques humains. Le premier groupe sera suivi jusqu’à l’âge du sevrage, soit environ trois semaines. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le cerveau sont particulièrement sensibles à l’environnement nutritionnel. Le second groupe sera suivi jusqu’au 18ème jour de vie. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le système immunitaire sont modulés par l’environnement nutritionnel. Le troisième groupe sera maintenu dans les mêmes conditions jusqu’à l’âge adulte, l’exposition aux additifs étant limitée à la seule période néonatale. Ce suivi longitudinal permettra de vérifier si les éventuelles perturbations observées chez le jeune animal perdurent et influencent le comportement et l’état général à long terme. L’utilisation de ces deux stades est indispensable à la démarche scientifique : la période néonatale représente le moment critique de l’exposition alimentaire, tandis que l’évaluation à l’âge adulte est nécessaire pour mesurer l’existence d’effets différés.

Pour reproduire chez la souris une malformation d'une veine du cerveau qui touche les enfants, 572 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles gestantes subissent l'ouverture de l'abdomen sous anesthésie générale pendant 45 minutes, avec points de suture, puis des injections sous anesthésie une fois par jour pendant deux jours. Les embryons reçoivent dans le cerveau une injection de cinq secondes, qui peut provoquer leur mort. L'effectif n'est adossé à aucun calcul détaillé, le porteur indiquant l'avoir réduit "au minimum nécessaire" et renvoyant l'analyse à un test statistique qu'il qualifie d'"adéquat".

Objectifs

Notre projet a pour objectif de générer un modèle d’étude de la malformation anévrysmale de la veine de Galien chez la souris. Cette pathologie pédiatrique due à la connexion directe anormale entre une artère et une veine cérébrales et conduisant à un anévrysme est associée à des troubles neurologiques graves. Ce projet vise à étudier l’interaction entre le développement du cortex cérébral et du système vasculaire, en exprimant la forme humaine contrôle et des formes mutées de deux gènes impliqués dans cette pathologie chez un modèle de souris contrôle.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est de connaître l’implication du système neuronal, en particulier le rôle de certains neurones, dans l’apparition des troubles neurologiques de la malformation de la veine de Galien dans un modèle de souris contrôle. Ce projet permet également d’étendre nos connaissances sur le rôle de ces cellules d’intérêt sur le développement vasculaire cérébral et du cerveau en général.

Procédures

Les femelles gestantes subiront une anesthésie générale de 45 minutes au cours d’une chirurgie qui comprendra l’ouverture de l’abdomen et des points de suture. Certaines subiront 1 fois 1 injection intra-péritonéale sous anesthésie générale. Elles subiront des injections sous anesthésie générale, 1 fois par jour pendant 2 jours. Des embryons subiront une injection intracérébrale d’une durée de 5 secondes.

Impact sur les animaux

L’induction de l’anesthésie gazeuse et la chirurgie des femelles gestantes entrainent un stress modéré. Les injections intra-cérébrales in utero peuvent entrainer la mort de certains embryons.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure pour prélèvement d’organes et analyses phénotypiques.

Remplacement

Les questions abordées dans ce projet nécessitent un modèle animal. En effet, le développement cérébral et vasculaire ne peut être étudié qu’à l’échelle de l’organisme car aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité des interactions entre les types cellulaires du cerveau et des vaisseaux sanguins.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par des expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. Ce nombre a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre des résultats statistiquement significatifs. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.

Raffinement

Tous les animaux seront maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture à volonté. Lors des actes chirurgicaux, les souris seront anesthésiées et placées sur une plaque chauffante et régulièrement hydratées. Elles recevront des analgésiques en pré et en post-opératoire. Une litière spécifique, adaptée aux animaux opérés, sera utilisée afin de minimiser le risque d’infection post-opératoire. Un gel ophtalmique sera appliqué durant toute l’anesthésie pour prévenir le dessèchement des yeux. Après l'opération chirurgicale, la surveillance des animaux sera quotidienne afin de détecter d’éventuels signes de souffrance. Une grille de score d'évaluation des animaux sera mise en place. Une injection d'analgésique ou la mise à mort de l'animal sera réalisée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener des études sur le développement du système nerveux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral et de la vascularisation du cerveau entre les rongeurs et l’humain. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce permettant de répondre à nos questions scientifiques tels que les modèles génétiquement modifiés. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades de développement embryonnaire et postnataux où interviennent les phénomènes étudiés.

Mesurer la concentration sanguine de quatre-vingts candidats-médicaments par an, pour affiner leur posologie avant les études d'activité : 1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit de une à vingt et une administrations espacées d'au moins huit heures, subit la section de la pointe de la queue, puis jusqu'à dix micro-prélèvements sanguins sur quarante-huit heures au minimum, et une partie une chirurgie d'implantation d'un implant médicamenteux sous anesthésie. Le porteur écarte toute grille de score, au motif qu'elle "nécessite de maintenir la souffrance de l'animal pour en évaluer l'évolution", et annonce la mise à mort dès qu'apparaît une différence de poids de 2 à 5 %. L'effectif déclaré se déduit d'un calcul simple, trois souris par condition testée et quatre-vingts composés par an sur cinq ans, le porteur précisant qu'aucune comparaison statistique n'est requise.

Objectifs

Pour le développement de nouveaux médicaments, il est nécessaire d'étudier le devenir de la substance active dans l'organisme, dans le but de déterminer : l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination du composé (ADME), des propriétés qui vont influencer la posologie du candidat-médicament (dose administrée et fréquence d'administration). L’objectif scientifique est de suivre la concentration sanguine de produits pharmacologiques en cours de développement chez la souris. Les produits pourront être de différentes natures (chimique, peptidique, oligo-nucléotidique) et/ou pour diverses applications : analgésie, anti-inflammatoire, antibiotique, immunodépresseur, anticancéreux, cardio-protecteur, anti-arthrosique, antidépresseurs, neuro-protecteur…

Bénéfices attendus

La mesure de la concentration sanguine au court du temps des candidats-médicaments permettra de sélectionner les plus adaptés et d’en affiner la posologie (dose et fréquence d’administration) selon les résultats de l’ADME. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Il permet de réduire drastiquement le nombre de candidat-médicament à tester dans les études d’activité et le nombre d'études nécessaires pour mesurer ensuite l’activité des candidats-médicaments sélectionnés, tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections pour l'administrer les candidat-médicaments étudiés. Les candidat-médicaments et médicaments étudiés seront administrés 1 à 21 fois avec un minimum de 8h entre chaque administration. Une anesthésie de quelques minutes est nécessaire pour le rasage des animaux et pour les administrations ID, IN, IT. Afin de suivre la concentration sanguine du candidat médicament au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang (environ 1min) seront réalisés à l’extrémité de la queue et sur une durée minimum de 48h. Une partie des animaux pourront être soumis à une chirurgie sous anesthésie (environ 15 min) et analgésie pour l’implantation d’un implant médicamenteux.

Impact sur les animaux

Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre les prélèvements sanguins. [Modification] L’implantation chirurgicale d’un implant médicamenteux peut potentiellement induire une douleur modérée et une altération de l'état de santé général des animaux durant les 48h premières heures suivant l’implantation (sensibilité de la zone d’implantation, gène dans les déplacements, une activité moindre, une appétence modérée pour la nourriture pouvant entrainer une très légère et transitoire perte de poids…)

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l’ADME d’un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la pharmacocinétique sera réalisée chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments.

Réduction

La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 souris par condition testée. La mise en place de micro-prélèvements répétés chez un même animal permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour suivre la concentration sanguine des candidats médicaments. Les résultats sont exploités sous la forme de courbes cinétiques et aucune comparaison statistique n’est requise. Il est prévu de mesurer la pharmacocinétique de 80 composés chaque année sur une période de 5 ans soit un maximum de 1200 souris.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine minimum en cas de contraintes temporelles. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur. [Modification] La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Lorsque les caractéristiques du composé le permettront (solubilité et stabilité), l'usage d'un implant médicamenteux pourra être mis en place pour éviter le recourt à des administrations répétées génératrices de stress et de douleur. Les souris seront anesthésiées pour permettre certaines administrations (intranasale, intratrachéale, intradermique, intramusculaire) ou l’implantation d’un implant médicamenteux qui fera aussi l’objet d’une couverture analgésique pré et post opératoire. L’implantation chirurgicale sera réalisée dans des conditions d’asepsie strictes et sous un poste de sécurité microbiologique dédié. Les souris anesthésiées seront placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie. Une alimentation hydratée sera mise à disposition des animaux pour assurer une récupération postopératoire rapide. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments ou des sondes, pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue qui nécessiterait la mise à mort de l’animal. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort. Pour cette même raison, aucun « scoring » n’est envisagé, car il nécessite de maintenir la souffrance de l’animal pour en évaluer l’évolution. Il arrive cependant qu’aucun signe extérieur de douleur ne puisse être observé, et que seule une perte ou absence de prise de poids soit mise en évidence. Dans ce cas, les animaux seront mis à mort dès la mise en évidence d’une différence significative (généralement dès 2 à 5% d’écart). Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement

Choix des espèces

La mesure de la pharmacocinétique est réalisée chez la souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments. Certain candidat-médicament sont très difficile à synthétiser et la petite taille de la souris nécessite beaucoup moins de composé. Enfin, ce choix permet aussi de mesurer l’ADME d’un composé chez la même espèce que pour les futures études d’activités, elles-mêmes nécessitant le plus souvent le recourt à des animaux génétiquement modifiés, plus facile à trouver ou générer chez la souris. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’objectif scientifique et de la pathologie visée. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal.

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune subissant une implantation chirurgicale de cellules tumorales dans le poumon puis six séances d'imagerie thoracique sous anesthésie gazeuse. Chaque animal reçoit aussi une injection de chimiothérapie, trois injections d'immunothérapie par semaine pendant trois semaines et cinq injections quotidiennes d'interleukine-1 bêta, une partie d'entre elles portant une délétion du récepteur IL-1R1. La tumeur pulmonaire induite peut dégrader progressivement la respiration et l'état général, et le porteur signale des complications possibles au niveau de la cicatrice thoracique, infection, déhiscence de plaie, douleur. À long terme, il situe le bénéfice dans "l'intérêt de trouver et tester des molécules induisant cette voie chez la souris (futur projet), puis chez l'Homme".

Objectifs

Le cancer du poumon fait partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Son traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies, qui malheureusement ne conduisent que rarement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. Ainsi, l’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant, cette association n’est pas toujours efficace pour les tumeurs pulmonaires. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. L’inflammation a un rôle ambigu dans la réponse à la chimiothérapie et peut avoir des effets pro- ou anti-tumoraux. Le but du projet est d’évaluer son rôle sur l’efficacité antitumorale de la chimio-immunothérapie utilisée en clinique, dans un modèle murin de cancer du poumon chez la souris. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique. Ce projet sera réalisé dans 2 sites, avec un site pour toutes les étapes (EU1/2), excepté les imageries (EU 2/2).

Bénéfices attendus

Les traitements combinant chimiothérapie et immunothérapie ont montré une réelle efficacité pour de nombreux cancers. En ce qui concerne le cancer du poumon, leur efficacité reste hétérogène selon les contextes biologiques et immunologiques. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes responsables de la résistance dans des tumeurs pulmonaires orthotopiques.. L’identification du rôle de l’inflammation dans la résistance aux traitements aura des avantages à court terme, comme la validation (ou non) de nos résultats précédents, et à long terme en confirmant l’intérêt de trouver et tester des molécules induisant cette voie chez la souris (futur projet), puis chez l’Homme.

Procédures

5 interventions : - Implantation chirurgicale de cellules de cancer du poumon murines dans le poumon (EU1/2) : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 15 minutes - Nombre de souris : 384. - Traitements par chimiothérapie ou solution contrôle (EU1/2) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 384. - Traitements par immunothérapie ou solution contrôle (EU1/2) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 384. - - Traitements par IL-1β ou solution contrôle (EU1/2) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection quotidienne pendant 5 jours par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 384. Imagerie thoracique (EU2/2) : -Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse -1 imagerie par animal répétée 6 fois -Durée : 5 minutes -Nombre de souris : 384

Impact sur les animaux

Injection de cellules tumorales dans le poumon : croissance d’une masse tumorale intrathoracique. Une altération progressive de la fonction respiratoire peut survenir au cours de la progression tumorale. - Possible altération de l’état général du fait de la pathologie cancéreuse induite. - Éventuels effets secondaires des injections d’IL-1β : perte de poids. - Possibles complications au niveau du site opératoire et de la cicatrice thoracique : infection, déhiscence de plaie, douleur. - Effets potentiels liés aux anesthésies répétées pour l’imagerie thoracique : refroidissement, ralentissement transitoire de la respiration, récupération retardée exceptionnelle. Les souris déficientes pour IL1-R1 (Il1r1-/-) ne présentent pas de phénotype dommageable en conditions basales. Aucune nuisance spécifique liée à ce génotype n’est donc attendue dans le cadre de ce projet.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les expériences seront réalisées sur des petits effectifs, ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Les souris C57BL/6 doivent être utilisées comme contrôles des souris Il1r1-/-. Les expériences seront conduites en même temps sur les souris Il1r1-/-, afin de ne pas doubler le nombre de souris contrôles. Le test statistique utilisé sera celui de Kruskal-Wallis en raison de la présence de nombreux groupes. Le nombre de souris par groupe et le nombre de répétitions des expériences ont été déterminés afin de garantir la possibilité d’utiliser ce test statistique et sa fiabilité. Les expériences visant à étudier la charge tumorale, l’imagerie thoracique et les infiltrats immunitaires seront réalisées sur les mêmes souris. Le suivi longitudinal par imagerie micro-CT permet une mesure intra-individuelle de la charge tumorale, permettant de confirmer la prise tumorale et de déterminer le moment opportun pour débuter les traitements, participant ainsi à la réduction du nombre d’animaux nécessaires. Les différents modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements.

Raffinement

Les animaux seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3 % + oxygène 1,5 L/min) sera réalisée avant chaque chirurgie et entretenue tout au long de la procédure, avec contrôle de l’absence de réflexe de la patte, surveillance de la fréquence respiratoire et protection de la cornée avec un collyre ophtalmique. Pour l’analgésie, des anti-inflammatoires (carprofène 4 mg/kg et buprénorphine 0.05 mg/kg, une fois par jour) seront administrés en sous-cutané en pré-opératoire à distance du site opératoire et prolongés pendant 48 h après l’opération, ainsi que des anesthésiques locaux (lidocaïne 4 mg/kg + bupivacaïne 2 mg/kg) au niveau du site opératoire. La surveillance post-interventionnelle sera réalisée 2 fois par jour durant les 3 premiers jours, puis quotidiennement pendant 2 jours et enfin espacée à 3 fois par semaine. Pour chaque imagerie, les souris seront transportées d’un EU à l’autre dans leur cage emballée dans un sac opaque afin d’éviter le stress extérieur. Des anesthésies courtes supplémentaires seront réalisées pour l’imagerie thoracique micro-CT. Les animaux seront réchauffés pendant la procédure et surveillés jusqu’au réveil complet. Durant toute l’expérience, suivi du poids et évaluation de la NEC (Note d’Etat Corporel) au minimum trois fois par semaine. L’apparition d’éventuels points limites sera recherchée.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvements présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. De plus, l’existence de souris génétiquement modifiées renforce le choix de cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.