Oncologie
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Compréhension des mécanismes anti-tumoraux de la testostérone dans un modèle de corticosurrénalome chez la souris et recherche de cibles thérapeutiques alternatives
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 384 d'entre elles et sévère pour 192. Toutes subissent l'amputation d'une phalange pour le génotypage, puis reçoivent sous anesthésie un implant de testostérone, de dihydrotestostérone ou un placebo, avant un suivi échographique du corticosurrénalome qu'elles développent par construction génétique, jusqu'au stade métastatique à 18 mois. Le bénéfice avancé pour les patients, de nouvelles pistes contre un cancer dont la survie médiane reste de quinze mois, tient à des mécanismes moléculaires encore à établir. Sur le remplacement, le porteur écrit vouloir éviter les manipulations in vivo autant que possible, puis conclut que les lignées cellulaires disponibles ne répondent pas aux androgènes et que la "nécessité" du recours aux animaux se justifie.
Objectifs
Le carcinome corticosurrénalien est un cancer rare et agressif, caractérisé par un pronostic défavorable. À son diagnostic, près de 50 % des patients présentent des métastases, ce qui explique un faible taux de survie à 5 ans. Actuellement, l’unique option curative pour les patients non métastatiques repose sur une exérèse complète de la tumeur primaire. Cependant, le risque de récidive est élevé (30 à 70 %), constituant la principale cause de décès. Pour les patients métastatiques, la chirurgie est inenvisageable, et les traitements existants, bien que lourds, n’améliorent pas la survie globale médiane, qui demeure autour de 15 mois. Les essais d’immunothérapie dans le carcinome corticosurrénalien ont donné des résultats décevants, probablement en raison de l’immunosuppression induite par l’hyperactivité endocrine observée dans environ 50 % des cas. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Il a été récemment montré dans un modèle murin de carcinome corticosurrénalien, que la testostérone produite au moment de la puberté induit un recrutement de macrophages chez les souris mâles, ce qui conduit à une régression de la tumeur. De façon similaire, le traitement des souris femelles portant des carcinomes corticosurrénaliens avec de la testostérone conduit aussi à un recrutement de macrophages et à une diminution de la taille de la tumeur. Ces résultats suggèrent que la testostérone possède un fort potentiel en tant qu’agent antitumoral dans le contexte du carcinome corticosurrénalien. Dans cette étude, l’objectif est d’approfondir la compréhension du rôle antitumoral de la testostérone dans le carcinome corticosurrénalien et d’identifier les mécanismes de réponse en aval, en utilisant des implants de testostérone ou de dihydrotestostérone chez des souris femelles portant des carcinomes corticosurrénaliens. L’objectif global de ces expériences est de comprendre l’importance de la testostérone et de comprendre également comment la testostérone est capable d’avoir un puissant effet antitumoral. Finalement ce projet a pour but d’évaluer la faisabilité d’une modulation hormonale ciblée comme stratégie thérapeutique innovante. La compréhension des mécanismes d’action en aval de la testostérone permettra également de proposer différentes approches thérapeutiques pour les patients atteint de carcinomes corticosurrénalien.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de confirmer le rôle de la testostérone dans la régression du carcinome corticosurrénalien. Elle contribuera à identifier les mécanismes moléculaires antitumoraux impliqués dans cet effet protecteur. Les résultats attendus permettront d’améliorer la compréhension des voies de signalisation impliquées dans la réponse à la testostérone, ouvrant la voie au développement de nouvelles approches thérapeutiques. Ces approches pourraient reposer sur l’utilisation de la testostérone elle-même ou sur le ciblage des mécanismes moléculaires identifiés grâce à cette étude, dans le but d’améliorer la prise en charge des patients atteints de carcinomes corticosurrénaliens.
Procédures
576 souris seront soumises à une phalangectomie (durée 2 min, 1 fois). 288 souris femelles recevront des implants de testostérone ou de dihydrotestostérone sous anesthésie générale et 288 souris femelles recevront des placebos sous anesthésie générale. L'intervention sera pratiquée 1 seule fois et dure environ 7 minutes.
Impact sur les animaux
La phalangectomie, nécessaire à l’identification et au génotypage des individus, peut entraîner une douleur légère et de courte durée. Cependant, cette procédure n’induit aucune complication durant le développement des animaux et n'affecte pas leur comportement, ni celui des individus de la portée ni de leur mère. L’implantation des implants hormonaux peut entraîner une douleur modérée, localisée et transitoire au site d’insertion. L’insertion des implants pourrait également entrainer une infection locale. L’échographie, réalisée sous anesthésie générale, ne provoque pas de douleur mais peut générer un léger stress lié à la manipulation. Les modèles murins de carcinomes corticosurrénaliens présentent un développement tumoral et éventuellement des métastases.
Devenir
Tous les animaux ayant subi la procédure seront mis à mort à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses permettant d’évaluer le rôle de la testostérone et de ses mécanismes sous-jacents dans le développement du carcinome corticosurrénalien et ainsi pouvoir potentiellement identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement du carcinome corticosurrénalien.
Remplacement
Afin d’éviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux sacrifiés sans manipulation préalable. Cependant, l’ensemble des lignées de carcinome corticosurrénalien actuellement disponibles ne répondent pas aux androgènes, ce qui limite leur pertinence pour l’étude du rôle de la testostérone. De plus, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.
Réduction
Dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous mettons en œuvre plusieurs mesures. Nous planifions, lorsque c’est possible, plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque animal soient utilisées. De même, le sang des animaux mis à mort sera systématiquement recueilli pour réaliser des dosages. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration scientifique convaincante, basée sur des arguments statistiques valides et la variabilité biologique attendue. Les groupes expérimentaux comprendront au maximum 12 souris. Une phase préliminaire de mise au point des expériences sera conduite sur un petit nombre d’animaux pour valider la faisabilité des expériences. Les analyses complètes ne seront engagées qu’après validation de cette phase. Pour les souris présentant un carcinome corticosurrénalien avancé, les implants seront maintenus pendant 2 mois afin d’évaluer un effet sur la régression tumorale et la dissémination métastatique. Si des effets anti-tumoraux sont constatés, un groupe supplémentaire sera traité pendant 2 semaines, afin d’évaluer si un traitement court ralenti la croissance tumorale et permettra de caractériser les mécanismes d’action en aval sur des stades de carcinome corticosurrénalien avancés.
Raffinement
Tout au long des procédures, des mesures spécifiques seront mises en place afin d’assurer le bien-être des animaux et de minimiser toute source de stress ou d’inconfort. Du coton sera ajouté dans les cages pour favoriser le maintien de la température corporelle. Pendant la phase de réveil post-anesthésie, les cages seront placées sur un tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie. De la nourriture et du gel d’hydratation seront disposés au sol pour faciliter l’accès à l’alimentation et à l’hydratation sans effort. La réalisation de toutes les procédures sera effectuée par du personnel qualifié afin de réduire au maximum la durée de la procédure. Durant toute la procédure, les animaux seront hébergés en cages transparentes et munies d’une grille, qui permettront de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif entre les congénères, limitant ainsi l’isolement social dû à l’hébergement individuel. Les implants seront insérés avec du matériel stérile ce qui réduit fortement l’apparition d’infection chez les animaux. Une surveillance approfondie au niveau du site d’insertion des implants sera réalisée tous les jours pendant 1 semaine. Afin de limiter les nuisances associées aux implants, aux manipulations et les nuisances associés au développement tumoral (inconfort, douleur), les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel formé et expérimenté. Tout animal présentant des signes de souffrance ou atteignant un point limite précis défini sera retiré de l’expérimentation et mis à mort, si nécessaire, conformément aux procédures établies.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant le cancer de la cortico-surrénale. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Au cours de ce projet, une lignée de souris est utilisée. Cette lignée est un modèle préclinique murin de corticosurrénalome reposant sur l’invalidation de gènes suppresseurs de tumeurs mutés chez les patients. Nous réaliserons nos analyses aux 3 stades de développement tumoral identifiés chez les femelles dans ce modèle murin. Un stade d’hyperplasie à 6 semaines, un stade de corticosurrénalome avancé à 16 mois et un stade de corticosurrénalome métastatique à 18 mois.
Réalisation d’une preuve de concept sur la résorption et la tolérance d’un renfort de suture à base d’alginate sur des exérèses partielles d’organes tel que le poumon, l’estomac, le foie et la rate chez le modèle porcin (EU 3/3)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
44 porcs vont subir chacun l'ablation d'un fragment de 8 centimètres sur 3 de poumon, d'estomac, de foie ou de rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous seront tués. L'opération, à thorax ou abdomen ouvert, dure jusqu'à une heure et demie, suivie d'une analgésie de trois à cinq jours puis, à six, sept et neuf mois, de séances de scanner sous anesthésie d'environ deux heures. Le porteur décrit un risque de détresse respiratoire si le vide pleural se rompt et une douleur importante liée à l'incision des muscles abdominaux. Le bénéfice annoncé est un pansement hémostatique résorbable qui serait fabriqué en France plutôt qu'aux États-Unis ou au Japon, argument industriel autant que médical.
Objectifs
Le pansement idéal n'existe pas, mais il doit avoir certaines caractéristiques importantes : 1/Garder la plaie humide et chaude, 2/Être changé selon les étapes de la cicatrisation, 3/Laisser passer l'air mais pas les bactéries, 4/Absorber l'excès de liquide de la plaie, 5/Ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller rapidement, 6/Être facile à appliquer et confortable, 7/Ne pas être toxique et être hypoallergénique, 8/Protéger des chocs, 9/Être transparent pour voir la plaie sans retirer le pansement, 10/Être le moins cher possible et réduire le temps de traitement. Les pansements à base d'alginate de calcium répondent à ces critères, mais ils sont principalement utilisés pour les plaies cutanées et très peu pour les organes internes lors de chirurgies. Pour contrôler les saignements, les chirurgiens utilisent différentes techniques. Si ces techniques ne suffisent pas, surtout en cas de saignements continus et étendus, ils utilisent des produits hémostatiques résorbables. Ces produits sont synthétiques et mettent du temps à se résorber. Nous voulons tester un produit naturel qui devrait se résorber plus rapidement. Enrichi en calcium, zinc et magnésium, il favorise la coagulation. Ce produit est un renfort de suture utilisé avec un système d'agrafage et sera suivi par imagerie scanner à différents moments. L'objectif est de vérifier son efficacité pour arrêter les saignements, suivre sa résorption et son impact sur les tissus. La preuve de concept de ce nouveau dispositif médical hémostatique pourrait mener à un nouveau produit pour gérer les saignements lors de sutures par agrafage en chirurgie. De plus, ce produit serait fabriqué en France, contrairement aux autres dispositifs fabriqués aux États-Unis et au Japon. La biocompatibilité de ce dispositif a été testée en laboratoire. Il y aura 4 groupes de 11 porcs opérés. Chaque groupe sera divisé en 3 sous-groupes de 3 porcs, correspondant à des périodes de suivi post-opératoire de 6, 7,5 et 9 mois. Deux porcs supplémentaires par groupe sont prévus en cas de décès pendant la chirurgie ou à cause d'une mise à mort liée à un point limite. Ce projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs (EU) : 1 pour la chirurgie, 1 pour l'hébergement post opératoire longue durée et 1 pour l'imagerie.
Bénéfices attendus
Le projet vise à vérifier l'efficacité d'un nouveau pansement naturel pour arrêter les saignements lors de chirurgies. Ce pansement sera utilisé avec des agrafes pour renforcer les sutures après l'ablation partielle d'un organe. Nous voulons aussi observer comment le pansement se dissout et s'intègre dans le corps au fil du temps. L'objectif est de développer un pansement hémostatique naturel, fabriqué en France, pour remplacer les produits synthétiques actuels.
Procédures
EU 1 : Les animaux subiront une intervention chirurgicale pour permettre l’accès à l’organe d’intérêt tout en préservant les autres organes dans les cavités respectives. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie et analgésie appropriées. La durée de la chirurgie ne devra pas excéder une durée de 1h30 par animal (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour l’accès à l’organe, 25 minutes pour les temps de saignement, 10 minutes pour le contrôle final de l’arrêt du saignement, 20 minutes pour la fermeture du plan musculaire et cutané). L’animal n’aura qu’une seule intervention chirurgicale. L’animal recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Le retrait des points prendra quelques minutes (5 minutes) et se fera 15 jours minimum post-chirurgie. EU 3 : A différents temps post-opératoires, l’animal aura une imagerie pour évaluer le taux de résorption : transport, anesthésie et acquisition environ 2 h à chaque temps. EU 2 : Pour l’hébergement à long terme, les animaux seront hébergés dans des conditions proches des élevages, sans contraintes particulières. Les animaux seront pesés régulièrement. Cet acte ne dure que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Pour les chirurgies thoraciques, il est important de maintenir le vide pleural, qui permet au poumon de se gonfler et de se dégonfler correctement. Si ce vide est rompu, le poumon ne peut plus fonctionner correctement, ce qui peut entraîner une détresse respiratoire. Pour éviter cela, l'incision sera refermée hermétiquement et l'excès d'air sera aspiré de la cage thoracique pendant que le poumon est progressivement remis sous ventilation. La chirurgie sera réalisée sur le lobe accessoire droit du poumon, et la résection d'une partie de 8 cm de long sur 3 cm de large n'affectera pas la fonction respiratoire. Pour les chirurgies abdominales, comme celles impliquant l'estomac, le foie et la rate, l'incision des muscles peut causer une douleur importante. De plus, une ablation partielle d'un organe digestif peut perturber le transit intestinal. La résection des organes aura une taille de 8 cm de long sur 3 cm de large, mais cela n'affectera pas leur fonctionnalité. Des analyses biochimiques seront effectuées pour détecter toute perturbation à moyen ou long terme. C'est pourquoi un groupe d'animaux sera dédié à chaque type d'organe d'intérêt. Les procédures peuvent être douloureuses pour les animaux en post-opératoire, et des analgésiques seront administrés en fonction de leur état clinique. Après trois semaines, les animaux aptes au transport seront transférés dans une autre structure (EU 2) pour un hébergement de longue durée. À différents moments postopératoires, les animaux seront transférés vers un centre d'imagerie pour passer des scanners (EU 3). Le transport et les différentes manipulations peuvent générer du stress pour les animaux.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort soit parce qu’ils auront atteint un point limite soit qu’ils ont atteint le temps d’observation (J+6 mois, J+7,5 mois, J+9 mois). Une étude histologique de l’intégration du pansement hémostatique dans l’organe sera réalisée donc cela nécessite le prélèvement de l’organe et donc la mise à mort au prélable de l'animal.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance sur le tissu réséqué et de suivre sa résorption à différents temps post-opératoires. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements lors de résection d’organe en cours de chirurgie. Il est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduits in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.
Réduction
Nous utiliserons 44 animaux : 4 groupes de 11 animaux (9 animaux opérés et 2 animaux supplémentaires). Les animaux supplémentaires par groupe sont prévus pour compléter un groupe si nécessaire. Ce nombre a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. Étant donné que c’est une preuve de concept, nous n’avons pas besoin de plus 3 animaux par lot pour obtenir la réponse à notre questionnement. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et nécessite une intervention chirurgicale pour l’arrêter, nous stopperons le projet sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé et raffiné la voie d’abord chirurgicale ainsi que la finalisation de la prothèse dans notre structure sur des animaux mise à mort, issus de procédures antérieures.
Raffinement
La chirurgie ouverte a été retenue, avec un abord le long des côtes au niveau du 9ème espace intercostal. L’extrémité du lobe pulmonaire accessoire droit extériorisée permettra la mise en place de part et d’autre, des mors du système d’agrafage équipés du renfort. Cette résection volontairement limitée, n’empêchera pas le poumon de fonctionner correctement et n'impactera pas significativement la respiration de l'animal au réveil. Pour l’abord abdominal, choix d’une incision en suivant le bord sous costal d’une petite longueur à droite ou gauche suivant l’organe d’intérêt (estomac, foie ou rate) pour n’avoir à sortir à l’aide d’une pince atraumatique que l’extrémité de l’organe d’intérêt. Réduction taille incision : garder au maximum les autres organes dans la cavité et donc empêcher la perte de chaleur corporelle et le dessèchement des organes. Chirurgie : intubation puis ventilation avec un anesthésique gazeux, sur une table chauffante pour maintenir la température corporelle. Veille de chirurgie : injection analgésique d'action longue pour anticiper la sensation de la douleur. Jour chirurgie : anesthésie avec un hypnotique couplé à un analgésique. La plaie sera protégée à l’aide d’un pansement. L’animal sera placé dans des couvertures polaires et sous-surveillance jusqu’à son réveil complet. L’animal couvert sera remis dans l’enclos et recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit. Maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours selon les besoins de l'animal. Le soir de la chirurgie, il sera déposé dans l’enclos des légumes frais pour stimuler l’appétit de l’animal et réduire la perte de poids en post-opératoire. L’état général de l’animal et de la cicatrice seront suivis quotidiennement pendant 1 semaine, puis toutes les 48 h jusqu’au retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie. Les animaux seront hébergés collectivement. Pour le suivi post-opératoire, l’animal sera seul dans un délai de 3 à 4 jours en gardant un contact visuel et/ou olfactif avec d’autres congénères et aura de l'enrichissement compensatoire. Suivi quotidien des animaux pour détecter rapidement toute anomalie qui sera rapportée au vétérinaire pour déterminer la marche à suivre (examen clinique approfondi, soins, traitement...). La surveillance sera renforcée le temps nécessaire. Les conditions d'hébergement seront également suivies quotidiennement.
Choix des espèces
Toute étude en vue du marquage CE d’un dispositif médical existant sous plusieurs formats doit être réalisée sur le format de taille maximale, correspondant ici à un dispositif de 8 cm. Il n’existe que 2 espèces animales sur lesquelles nous pouvons trouver des organes capables d’accepter un dispositif de cette taille, le porc et le mouton. Les études initiales pour le dispositif actuellement commercialisé ayant été réalisées sur le porc, nous avons donc retenu cette espèce pour ce projet. Le modèle lapin utilisé dans le cadre d’autres projets semblables ne peut être utilisé pour ce projet car la taille des organes d’intérêt ne permet pas de faire la résection nécessaire, sous peine d'handicaper gravement l'animal en post-opératoire. Le fait que nous ne travaillons pas sur des minipigs mais sur des porcs en croissance permettra de visualiser la résorption et le comportement du dispositif à long terme. Les animaux seront réceptionnés à 29 kg environ pour atteindre 35-37 kg (jour de chirurgie). L’utilisation d’animaux de 35 kg environ permet de bénéficier d’une taille d’organe représentative de ce que nous avons en chirurgie humaine. Les organes font approximativement : -poumon : 26 cm de hauteur et 15 cm de diamètre, la résection représente 3% du volume. -estomac : 25 cm de longueur, 12 cm de largeur et 8 cm d’épaisseur, la résection représente 1% du volume. -foie : 28 cm transversale et 16 cm de hauteur, la résection représente 3% du volume. -rate : 12 cm de longueur, 7 cm de largeur et 4 cm d’épaisseur, la résection représente 2% du volume. Le volume de résection de l’organe reste inférieur à 50%. En effet, pour des organes comme le foie et les poumons, nous pouvons vivre avec 50% en moins. Pour les organes tel que l’estomac, la rate, il possible de vivre sans avec un suivi médical plus méticuleux (vaccination, poche d’alimentation). De plus, ce sont des organes de grandes tailles et qui sont très souvent impliqués dans les plaies traumatiques ou les pathologies comme le cancer. Ces tailles sont similaires à celles retrouver chez l’Homme. Il s'agit de jeunes animaux de trois à quatre mois. Le fait que nous ne travaillons pas sur des minipigs mais sur des porcs en croissance permettra de visualiser la résorption et le comportement du dispositif à long terme.
Étude de la perception et encodage du temps à court et long termes chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Pour étudier comment le cerveau perçoit le temps, 512 souris sont entraînées une à trois semaines dans des enceintes expérimentales, motivées par des récompenses alimentaires obtenues au prix d'une réduction contrôlée de leur ration. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Jusqu'à deux chirurgies de deux heures sous anesthésie générale servent à implanter le système d'imagerie que les animaux portent ensuite pendant les tests, encombrement dont le porteur reconnaît l'inconfort. Les souris qui ne peuvent pas être incluses dans les tests comportementaux seront, écrit le porteur, "valorisées" dans une expérience de mise au point d'outils d'analyse.
Objectifs
Dans notre vie quotidienne, nous évaluons constamment le temps : combien de temps avant que le feu passe au vert ? Quand avons-nous voyagé la dernière fois ? Ces processus sont fondamentaux pour notre mémoire, nos prises de décision et nos capacités d’adaptation. En effet, la perception du temps est une fonction cognitive essentielle permettant aux organismes d’interagir efficacement avec leur environnement. Que ce soit pour anticiper un événement imminent ou pour structurer des actions ou des expériences vécues sur des périodes étendues, la capacité à percevoir et encoder le temps joue un rôle clé dans la survie et l’adaptation. Des perturbations de ces processus peuvent altérer les capacités d’adaptation face au stress et contribuer à des troubles psychiatriques tels que la dépression, les troubles anxieux et de stress post-traumatique. La manière dont le cerveau représente et stocke les informations temporelles reste encore mal comprise. La perception et l’encodage du temps reposeraient sur des réseaux cérébraux complexes impliquant des régions comme l’hippocampe et le striatum. Cependant, ces régions n’encodent pas le temps comme un simple chronomètre : leur activité fluctue, se transforme au fil du temps et s’adapte en fonction de l’expérience, de l’apprentissage et de l’âge. Il est donc crucial de mieux comprendre les mécanismes associés, ceux permettant notamment d’estimer la durée de stimuli ou l’horodatage et les caractéristiques temporelles des expériences vécues. Ainsi, ce projet a pour objectif d’étudier les mécanismes cérébraux impliqués dans la perception du temps, à des échelles courtes (dizaines de secondes) et longues (heures à semaines), à travers l’étude du comportement des animaux dans différentes situations expérimentales . En outre, nous testerons dans une dernière expérience, les effets d’un mélange gazeux d'oxygène et de protoxyde d'azote, utilisé pour ses effets analgésiants, qui est actuellement développé comme alternative thérapeutique à action rapide dans certaines pathologies psychiatriques comme la dépression. Il est établi que le mélange gazeux affecte les états de conscience mais ses effets immédiats et différés sur la perception et l’encodage du temps ne sont pas connus alors qu’ils pourraient avoir un rôle important à jouer dans ses effets bénéfiques comportementaux et thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le premier objectif de ce projet est d’apporter des connaissances essentielles sur les mécanismes cérébraux sous-tendant l’encodage du temps à court-terme et dans la mémoire à long terme. Une meilleure compréhension de ces processus fondamentaux est cruciale pour comprendre les bases neuronales de la mémoire et les capacités d’adaptation cognitive. L’approche par imagerie calcique offre une précision inatteignable pour observer en temps réel le fonctionnement des populations neuronales du cerveau lors de la réalisation de tâches liées à la perception du temps et à la mémoire, permettant d’analyser des mécanismes auparavant inaccessibles. Ces découvertes seront d’autant plus précieuses que les zones du cerveau impliquées jouent un rôle central dans de nombreuses autres fonctions cognitives et sont affectés dans troubles comme la dépression, l’anxiété et les troubles de stress post-traumatiques. En outre, ce projet implique également l’évaluation des effets d’un mélange gazeux d’oxygène et protoxyde d’azote actuellement utilisé pour ces propriétés analgésiantes mais en cours de développement et d’évaluation comme alternatives thérapeutiques à action rapide dans la dépression.
Procédures
Les animaux seront soumis à des phases d’entrainement et de tests comportementaux sur des périodes allant de 1 à 3 semaines, selon l’expérience concernée. Ces phases correspondent à des explorations libres ou dirigées quotidiennes, dans différentes enceintes expérimentales (avec des récompenses alimentaires), d’une durée comprise entre 10 et 30 minutes par session et qui pourront être répétées selon l’expérience. Afin de maintenir la motivation pour la récompense alimentaire, certaines phases expérimentales incluront un contrôle alimentaire léger, consistant en une réduction contrôlée de l’apport alimentaire avant la session expérimentale sur une période de 1 à 3 semaine. La distribution est quotidienne et ajustée individuellement. Dans certaines expériences, les souris seront également soumises au maximum à 2 interventions chirurgicales, chacune d’une durée approximative de deux heures, réalisées sous anesthésie générale. Les animaux pourront être hébergés en cage individuelle de manière ponctuelle, notamment après les interventions chirurgicales (pendant 24 à 72 heures) et lors des périodes nécessitant un contrôle alimentaire individualisé (1 à 3 semaines)
Impact sur les animaux
Les différentes manipulations/contentions ainsi que l’hébergement isolé en cage, l’isolement lors des tests de comportement et la restriction alimentaire peuvent engendrer du stress pour l’animal. L’intervention chirurgicale peuvent induire des douleurs post-opératoires légères avec un impact réduit dans le temps (quelques jours) sur le bien-être animal. Les injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les souris seront encombrées d’un système d’imagerie lors des tests, ce qui peut engendrer de l’inconfort.
Devenir
La totalité des animaux de l’étude seront mis à mort. Pour les besoins de l’étude, nous devons prélever le cerveau pour vérification histologique et investigation de l’expression de protéines d’intérêt.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode in vitro n’est disponible pour répondre à la problématique posée : l’étude des bases comportementales et neurales de la perception et l’encodage du temps et de leur mémoire à différentes échelles d’analyse. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale de fonction cognitive complexe comme dans notre étude repose sur l’observation directe du comportement de l’animal et de ses performances mnésiques tout en effectuant l’enregistrement de l’activité neuronale lors de la réalisation de ces tâches comportementales et de mémoires.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique permettant une réduction des effectifs optimisée selon les recommandations éthiques.
Raffinement
Les chirurgies sont réalisées par du personnel formé et expérimenté, sous anesthésie générale afin de garantir l’absence d’inconfort pendant les gestes réalisés. Des constantes physiologiques sont suivies pendant l’intervention et des précautions sont prises pour maintenir l’animal dans les meilleures conditions. Des mesures sont mises en place avant et après les interventions afin d’assurer un confort et une récupération rapide des animaux. Les animaux font l’objet d’une surveillance régulière pendant plusieurs jours afin de vérifier leur bon état général et leur reprise d’activité normale Les expériences comportementales incluent une phase d’habituation progressive à l’expérimentateur, aux dispositifs et conditions de test afin de réduire le stress. Les manipulations ne nécessitent pas de contentions. Lorsqu’un hébergement individuel est requis, il est limité dans le temps. Des enrichissements supplémentaires sont apportés (matériel de nidification, abris, des tubes et objets à mordiller). Les animaux sont regroupés dès que les conditions le permettent. Les animaux ne pouvant pas être inclus dans les expériences comportementales seront valorisés, en intégrant une expérience permettant la création de nouveaux outils d’analyses sans recourir à des animaux supplémentaires.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, espèce modèle dans le domaine des études des bases neurobiologiques de la mémoire, de la formation des souvenirs et de dysfonctions de la mémoire. Les souris utilisées seront des individus adultes, l’étude ayant comme objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes normaux sous-tendant l’association temporelle de souvenirs et sa mise en mémoire dans des conditions normales. Il n’est pas nécessaire d’utiliser des stades plus spécifiques du développement par rapport à l'objectif scientifique de l'étude.
Evaluation de l’impact des microbiotes intestinaux « sauvage » et de « laboratoire » sur les phénotypes de la souris domestique en conditions contrôlées
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
Des mâles sauvages sont vasectomisés puis accouplés avec des femelles, chez qui des embryons de souris de laboratoire sont ensuite transférés par chirurgie. Sur les 510 souris du projet, 240 relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 150 d'un niveau modéré et 120 d'un niveau léger, toutes tuées à l'issue des expériences d'infection pour prélever leurs organes. Elles sont hébergées seules trois semaines pour que leur activité sur roue soit mesurée, puis infectées par un parasite intestinal et une bactérie administrés dans l'eau de boisson. Le porteur range parmi les bénéfices attendus une amélioration des conditions de vie des souris en animalerie et une baisse de leur anxiété.
Objectifs
L’apport de souris porteuses de microbiotes intestinaux sauvages dans les expériences étudiant l’immunité des souris est incontestable notamment en vaccinologie, et aujourd’hui la question est posée d’utiliser ce type de modèle lors des essais précliniques. Notre projet permettra de tester l’impact de ces microbiotes sur d’autres phénotypes cruciaux dans d’autres domaines de recherche (comportements, activité physique, métabolisme) ainsi que sur la résistance aux parasites et pathogènes et aux co-infections. D’un point de vue fondamental, l’étude des microbiotes intestinaux sauvages en laboratoire devrait permettre de mieux comprendre leur rôle dans l’adaptation des rongeurs à leur environnement. D’un point de vue bien-être animal, nous nous attendons à ce que ces microbiotes améliorent certains phénotypes comme la résistance aux pathogènes, et la diminution de l’anxiété. Ainsi ce projet pourrait permettre d’améliorer les conditions de vies des souris en animalerie, de limiter les épidémies au sein de ces infrastructures, et potentiellement d’améliorer certains résultats pour lesquels l’anxiété des souris ou la faible résistance aux pathogènes représente une nuisance ou un biais expérimental. Notre projet est donc conçu comme la première étape vers une utilisation plus large des microbiotes intestinaux sauvages, au sein des animaleries.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont : - Comme expliqué dans la partie « objectif du projet », plus on progresse le long du gradient d’urbanisation, plus la diversité du microbiote intestinal des souris sauvages diminue. Cette dégradation est suspectée 1. d’altérer les fonctions assurées par le microbiote intestinal au sein de son hôte, et 2. de favoriser la transmission des agents zoonotiques. Notre projet permettra d’évaluer les conséquences de la perte de diversité du microbiote intestinal de la souris domestique liée à l’artificialisation environnementale créée par l’urbanisation. - De comparer les performances des souris porteuses de microbiotes intestinaux sauvages avec celle porteuses de microbiote de laboratoire. Plusieurs articles font état de l’apport des microbiotes intestinaux sauvages dans les expériences étudiant l’immunité des souris, notamment en vaccinologie. L’utilisation de souris porteuses de microbiote sauvages est aujourd’hui posée lors des essais précliniques. Notre projet permettra de tester l’impact de ces microbiotes sur d’autres phénotypes cruciaux dans d’autres domaines de recherche (comportements, activité physique, métabolisme) ainsi que sur la résistance aux parasites et pathogènes et aux co-infections. Si, nos résultats montrent effectivement une différence entre microbiotes intestinaux sauvages et de laboratoire, ils pourront également nous permettre de comprendre si la diversité du microbiote intestinal est impliquée dans ces performances et si certaines espèces ou groupes d’espèces bactériennes sont impliquées dans ces gains de performances.
Procédures
Sur les souris sauvages un maximum de 3 prélèvements sanguins sera réalisé sur animaux vigiles. Les mâles seront stérilisés chirurgicalement avant d’être accouplés avec des femelles. Des embryons de souris de laboratoire seront transférés par chirurgie chez ces femelles. Ces interventions seront réalisées sous anesthésie générale et ne dépassent pas 30 minutes. Les animaux subiront des tests non invasifs d’activité motrice (3 fois 5 minutes) et de comportement (3 fois 5 minutes). Ils seront ensuite hébergés individuellement pendant 3 semaines pour l’étude de leur activité physique spontanée sur roues. En fin d’expérience, un parasite intestinal et/ou une bactérie seront administrés oralement par abreuvement spontané des souris au biberon contenant les bactéries. Un prélèvement sanguin sera réalisé (30 secondes) une fois par semaine sur ces souris infectées afin d’évaluer l’intensité de la réponse immunitaire soit 3 prélèvements au total.
Impact sur les animaux
La méthode de transfert de microbiote utilisée nécessite des interventions chirurgicales sur quelques individus sauvages, notamment la vasectomie, et le transfert d’embryons de souris de laboratoire. Ces procédures peuvent entrainer des nuisances post opératoires (douleur, et dans de très rares cas fièvre, infection). Les expériences de phénotypage des comportements, de l’activité physique, et du métabolisme peuvent induire un léger stress. L’infection par un parasite intestinal semble être sans réel effet sur le bien-être des souris d’élevage. En revanche, l’infection par ingestion d’un pathogène bactérien, peut induire des nuisances plus importantes. De plus, lors des expériences d’infections, des prises de sangs seront réalisées régulièrement afin de mesurer l’efficacité de la réponse immunitaire, ce qui induit des souffrances légères de courte durée aux animaux.
Devenir
Durant la dernière expérience du protocole, les souris sont infectées par un pathogène et/ou un parasite intestinal, et des prélèvements d'organes devront être réalisés sur ces individus. Ces individus devront donc être euthanasiés.
Remplacement
Le projet vise à étudier l’impact des Microbiotes intestinaux sauvages sur les phénotypes de la souris hôte. Le remplacement n’est pas possible car il n’est pas possible d’utiliser un modèle in vitro ou informatique capable de modéliser des interactions biologiques aussi complexes.
Réduction
Nous avons pour objectif de réaliser ce projet en suivant la recommandation d’étudier les deux sexes, tout en réduisant au maximum le nombre d’individus utilisés et cela sans compromettre la puissance statistique de nos analyses. La personnalité des individus, l’effet du sexe et l’effet du microbiote intestinal, sont des facteurs qui augmentent la variabilité des résultats. Selon des données préliminaires, réaliser nos expériences avec des groupes de 12 individus, permettra d’avoir des données suffisamment robustes pour être exploitées statistiquement. Par ailleurs, le fait d’étudier les mêmes individus dans l’ensemble des expériences (mesure du comportement, de l’activité physique, de l’efficacité du métabolisme et de la résistance aux infections), plutôt que des individus différents pour chacune des expériences, permet de réduire considérablement le nombre d’individus utilisés.
Raffinement
Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le début de nos expérimentations. Une grille de score/suivi sera mise en place. Concernant l’accueil des souris sauvages en conditions d’élevages, elles recevront un enrichissement supplémentaire au sein des cages (batônnets de bois à ronger, igloos en carton pour permettre la nichée que les individus sauvages affectionnent particulièrement), afin de prendre en compte leur caractère sauvage / non habitué aux conditions d’élevage. Pour les chirurgies décrites dans le projet, les animaux seront placés sur tapis chauffant dès l’endormissement (anesthésie) et jusqu’au réveil. Une analgésie est prévue avant la chirurgie et pendant le post-opératoire. De l’onguent ophtalmique sera déposé sur les yeux afin d’éviter le dessèchement de la cornée. Le suivi post opératoire permettra de prendre en charge les douleurs potentielles subies par l’animal. Une surveillance accrue de la souffrance des animaux sera également réalisée pendant l’expérience d’infection expérimentale. En cas de souffrance trop importante (estimée grâce à grille d’évaluation), les souris seront euthanasiées.
Choix des espèces
Le modèle souris est choisi car il est le modèle de prédilection pour l’étude du microbiote intestinal en conditions contrôlées. C’est également le modèle biologique utilisé par les différents membres du consortium de laboratoires amenés à exploiter les données de ce projet. Enfin, les MI sauvages préalablement collectés sont des MI de souris. Des mâles et femelles juvéniles (4 semaines) seront utilisées pour le transfert de microbiote par gavage. Après 6 semaines supplémentaires, ces femelles porteuses du MI greffé, seront mises en présence d’un mâle de manière à produire une descendence. Ainsi à la naissance des petits, la composition du MI greffé sera stabilisée et le MI transmis dès leur naissance. Dans toutes les autres procédures, seuls des individus adultes seront utilisés (à partir de 12 semaines).
Evaluation de la réponse immunitaire antitumorale après radiofréquence de tumeurs colorectales chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales ou l'implantation d'un fragment de tumeur, subissent une intervention de vingt minutes pendant laquelle la tumeur est brûlée par radiofréquence, puis quatre injections de médicaments et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur prévoit des douleurs modérées, des infections locales, des saignements et des douleurs persistantes après l'opération. L'effectif de 2 744 souris n'est adossé à aucun calcul détaillé, le porteur indiquant seulement que le nombre réellement utilisé sera probablement inférieur, les conditions jugées non optimales étant abandonnées en cours de route.
Objectifs
Le cancer colorectal est le 3e cancer le plus fréquent dans le monde, les métastases hépatiques qui apparaissent chez 50% des patients, sont responsables de la forte mortalité. Le traitement chirurgical de référence, la chimiothérapie et les biothérapies ciblées, ont une efficacité limitée par leur toxicité et par l’acquisition d’une résistance au traitement. Depuis quelques années, les traitements thermiques comme les radiofréquences sont très utilisés pour traiter métastases hépatiques. Ce traitement a l’avantage d’augmenter également la réponse immunitaire chez des patients mais insuffisamment. Dans ce projet, nous évaluerons, chez la souris, des formulations gélifiantes immunomodulatrices associées aux radiofréquences. Les résultats de ce projet permettront d’optimiser et de choisir la formulation, la plus efficace pour stimuler la réponse immune antitumorale et ainsi réduire le risque de récidive.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus chez la souris seront le socle d’un essai clinique de phase I ; qui a terme pourrait offrir une alternative thérapeutique innovante pour les patients atteints de cancer colorectal métastatique en combinant radiofréquences et immunothérapie.
Procédures
Injection de cellules tumorales ou implantation de fragments tumoraux après analgésie – durée 1min. Intervention chirurgicale sous anesthésie application des radiofréquences et injection des formulations des médicaments -durée 20 min. 4 Injections des médicaments - durée 1 min. Imagerie sous anesthésie – durée 5 min.
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales peut induire un léger inconfort ou une irritation locale. Les implantations de fragments entraînent des douleurs modérées. L’intervention chirurgicale peut induire une réaction inflammatoire locale entraînant des douleurs modérées. Il existe un risque de complications post-opératoires telles que des infections locales, des saignements ou des douleurs persistantes. Les radiofréquences peuvent entraîner des douleurs locales et un inconfort au site d’intervention. Les Injections peuvent provoquer une douleur modérée ou de légères irritations, pouvant provoquer une gêne temporaire
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour étudier l’effet du traitement sur la survie et analyser son impact sur les organes.
Remplacement
L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet car elle constitue un organisme modèle fiable pour mimer le cancer colorectal humain. Il n’existe actuellement aucune alternative capable de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Le recours aux modèles animaux demeure dans notre cas essentiel pour garantir la validité et la transposabilité des résultats avant toute application clinique potentielle.
Réduction
Afin de maximiser la significativité et la robustesse de notre étude, les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Les expériences sont conçues de manière à ce chaque étape nous donne des informations permettant de réduire le nombre de souris utilisées dans l’étape qui suit. De plus, il est fort probable que le nombre de souris réellement utilisées soit inférieur à celui initialement prévu, car si certaines conditions ne sont pas optimales, elles ne seront pas retenues, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Une grille d'évaluation du bien être des souris spécifiques a été élaborée pour assurer un suivi rigoureux de l’état général des animaux. Une surveillance quotidienne sera réalisée. Cette grille comprend la détermination de points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter le stress et la douleur à son minimum. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînera la mise à mort anticipée de l'animal.
Choix des espèces
La souris représente le modèle le plus adapté à l’étude de la réponse immunitaire en raison des nombreuses données disponibles dans la littérature et des travaux antérieurs du laboratoire. Nous utiliserons de souris de 7-8 semaines chez lesquelles le système immunitaire est mature et permet de refléter ce qui se passe chez l’Humain.
Évaluation du risque à long terme de l’utilisation d’opioïdes chez les adolescents pour traiter la douleur induite par la chimiothérapie, dans un modèle rongeur. MODIFICATION.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Traitées par chimiothérapie puis par morphine pendant leur adolescence, à partir de cinq semaines, 920 souris reçoivent vingt injections quotidiennes sur animal vigile, dont une injection sous la plante de la patte que le porteur décrit comme aiguë et inflammatoire. 600 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 320 d'un niveau sévère, et toutes sont tuées pour analyse post-mortem. Il s'agit de mesurer, une fois adultes, leur sensibilité à la douleur, leur humeur et leurs comportements de dépendance, la morphine induisant l'état de dépendance physique que le protocole cherche précisément à provoquer. Les tests comportementaux sont annoncés par grandes catégories, seuils nociceptifs, anxiété, récompense, sans qu'aucun soit nommé.
Objectifs
Environ 70 % des jeunes patients souffrant de cancers pédiatriques rapportent également des douleurs sévères. Ces dernières peuvent être le résultat des traitements destinés à éliminer les cellules cancéreuses. En effet, la plupart des agents chimiothérapeutiques détruisent les microtubules dans les nerfs périphériques, favorisent les processus inflammatoires et le dysfonctionnement axonal, provoquant ainsi des douleurs neuropathiques et des douleurs musculaires ou osseuses qui sont fréquemment décrites 4 à 5 jours après les cycles de traitement. Pour soulager ces douleurs, pour l’heure, les opioïdes tels que le tramadol ou la morphine restent le traitement de référence. Cependant, nous ne savons que peu de choses sur les effets à long terme de l'utilisation répétée d'opioïdes à un stade précoce de la vie. Il est donc urgent de mieux comprendre les effets à long terme de l'utilisation d'opioïdes chez les enfants atteints de cancer et ce sous différents angles. Il semble notamment crucial de comprendre les effets sur la sensibilité à la douleur, l'humeur et l'utilisation abusive d'opioïdes une fois que ces jeunes enfants atteignent l’âge adulte. Ainsi, ce projet pilote, réalisé sur un modèle murin, sera développé autour de deux objectifs principaux : (i) évaluer l'impact de l'utilisation répétée d'opioïdes au début de la vie (adolescence), suite à des traitements chimiothérapeutiques, sur la nociception, l'humeur et les comportements d’addiction à l'âge adulte ; (ii) identifier les régions du cerveau affectées par l'utilisation d'opioïdes au début de la vie (adolescence) en se concentrant particulièrement sur les structures impliquées dans la matrice de la douleur et le traitement de la récompense.
Bénéfices attendus
Ce projet, validé par un comité d’évaluation scientifique, a le potentiel d'apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur les effets comportementaux à long terme d’une traitement anti-cancéreux combiné à la prise de morphine à un stade précoce de la vie. De plus, ce projet apportera les premières informations permettant de comprendre les mécanismes cérébraux impliqués dans ces effets et permettra de mettre en évidence de potentielles différences sexuelles, souvent sous-estimées dans les études axées sur les adolescents. A long-terme, ce projet permettra d’améliorer le soin des cancers pédiatriques et surtout la gestion de la douleur associée aux traitements utilisés.
Procédures
Le but de ce projet est d’étudier l’effet à long terme d’un traitement anti-cancéreux combiné à des morphiniques effectué lors de l’adolescence. Nous évaluerons les effets nociceptifs, émotionnels et en lien avec les comportements d’addiction. Ainsi des groupes de souris seront traitées avec ce traitement [20 injections au total (1/jour), sur animal vigile; durée d'une injection ~10sec]. Les différentes procédures expérimentales mettront en jeu des tests comportementaux (de 5 min à 30 min de test) évaluant les seuils nociceptifs, les comportements anxiodépressifs et les en lien avec la récompense. Un seul test sera réalisé par jour et un délai minimal de 24h sera respecté entre chaque test. MODIFICATION : UNE INJECTION SUR ANIMAL VIGILE D'UNE DUREE DE 10 SECONDES SERA EFFECTUEE. Des chirurgies sur animal anesthésié seront nécessaires (1 chirurgie d'une heure maximum / animail). La combinaison du traitement anti-cancéreux et l'étude de la chornification de la douleur peut entrainer une nuisance sévère pour les animaux.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures nécessitent un traitement anti-cancéreux qui peut provoquer une douleur modérée aux animaux. L’administration aigue ou répétée de morphine peut induire un état de dépendance physique. De plus, la répétition des injections peut provoquer une douleur aigue transitoire, une inflammation locale au niveau du site d’injection, voire une induration. Certaines des procédures de ce projet nécessitent des chirurgies sur animal anesthésié (1 chirurgie d'une heure maximum / animal) pouvant induire une douleur modérée, une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux. MODIFICATION : L'INJECTION SOUS CUTANEE AU NIVEAU PLANTAIRE induit UNE DOULEUR AIGUE AINSI QU’UNE POTENTIELLE INFLAMMATION AU NIVEAU DU SITE D’INJECTION nécessaires à l'étude réalisée. La combinaison du traitement anti-cancéreux et l'étude de la chornification de la douleur peut entrainer une nuisance sévère pour les animaux.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.
Remplacement
Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l’évaluation de réponses nociceptives, de comportement émotionnels et de type addictifs nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vigile.
Réduction
Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance (power analysis) qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 20 animaux/groupe pour le comportement et 10 pour les analyses immunohistologiques. Bien que de nombreux groupes contrôles soient nécessaires pour ce projet et que les deux sexes soient utilisés, les expériences seront toujours réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, nous composerons donc toujours nos groupes dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Notamment, l’utilisation d’enregistrement longitudinaux permettra de réduire grandement le nombre d’animaux nécessaire pour notre projet et les approches sur cerveau entier permettront d’identifier un grand nombre de cibles potentielles sans avoir à répéter les expériences.
Raffinement
Tout au long des expériences, les souris sont hébergées en cage collective, dans un milieu enrichi (matériel de nidification et bâton), et observées quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis. Pour le suivi du bien-être animal lors du traitement à la vincristine, une grille de score sera utilisée permettant d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale. Cette grille de score visera également à évaluer la zone d’injection et d’ainsi vérifier l’absence d’inflammation locale, d’induration ou de dommages cutanés. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie per et post opératoire. De plus, en complément de la grille de score du suivi, après chaque chirurgie, l’état de santé des animaux sera évalué à l‘aide d’une grille de score spécifique à la procédure chirurgicale permettant d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale.
Choix des espèces
Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, entier et complexe afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’humain, le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences. Enfin, les outils viraux nécessaires à ce projet ont été développés et validés chez la souris, qui apparait encore donc comme le modèle le plus adapté à ce projet. Par ailleurs, d’autres expérimentations portant sur les conséquences d’une douleur neuropathiques ont déjà été réalisées par notre équipe sur des souris mâles et femelles. De ce fait, par soucis de cohérence et reproductibilité, nous souhaitons conserver la même souche de souris pour ce projet. Des animaux adolescents seront utilisés (début des procédures à 5 semaines pour le traitement anti-cancéreux/morphine) car l’objectif de l’étude est d’évaluer l’effet à long terme des traitements subis à un stade précoce de la vie.
Mise au point d’un modèle murin d’hyperparathyroïdie primaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Les souris dont l'état général se dégrade au-delà de seuils fixés à l'avance sont mises à mort avant la fin du protocole. 173 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et tissus. Chacune subit jusqu'à deux opérations du cou de quinze minutes sous anesthésie, la seconde retirant la ou les glandes parathyroïdes rendues malades, avec des douleurs cervicales attendues pendant les cinq jours suivants, et une prise de sang à la queue toutes les quatre semaines pendant six mois. Le porteur affirme qu'il est "absolument nécessaire" de comprendre l'ensemble du retentissement de l'hyperparathyroïdie et qu'aucune méthode in vitro ne remplace l'animal dans ce domaine.
Objectifs
L’hyperparathyroïdie primaire est la troisième maladie hormonale en termes de fréquence après le diabète et les pathologies thyroïdiennes. Elle est due à un défaut de sécrétion de parathormone (PTH) et se manifeste sur le plan biologique par une augmentation de la concentration en calcium sanguin. Ses conséquences cliniques sont nombreuses : osseuses, rénales, métaboliques, cognitives. L’ablation de la ou des glandes malades est le seul traitement curateur de cette maladie. L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle d’hyperparathyroïdie primaire réversible après chirurgie chez la souris (élimination de la/des glandes atteintes), afin d’étudier les conséquences de cette pathologie et de sa guérison.
Bénéfices attendus
Les retombées attendues de notre projet au-delà du modèle murin sont de mieux comprendre les conséquences et mécanismes impliqués : 1) dans le développement de cette maladie et 2) les bénéfices de l’ablation chirurgicale de la glande malade. Ces informations nous permettront de mieux soigner les patients atteints de cette maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis au maximum à deux procédures chirurgicales (Durée : 15 minutes) sous anesthésie générale gazeuse et analgésie. Un prélèvement de sang à l’extrémité de la queue sur animaux vigiles sera réalisé avant la première chirurgie, une fois toutes les 4 semaines pendant 24 semaines jusqu’à la seconde chirurgie, puis une fois toutes les semaines pendant 4 semaines (durée par prélèvement : 1 min). Enfin, un prélèvement de sang par ponction cardiaque lors de l’euthanasie (animal sous anesthésie générale pendant le prélèvement : durée 5 minutes).
Impact sur les animaux
Il s’agit de procédures modérées, et aucune mortalité n’est attendue après les différentes chirurgies. Les principaux effets indésirables attendus pourraient concerner : une douleur faible au site d’incision réalisé pour les prélèvements sanguins ; des douleurs au niveau du cou pendant les cinq premiers jours après chirurgie.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés sera mis à mort à l’issu des expérimentations pour collecter des échantillons sanguins et tissulaires nécessaire à la mesure de l’efficacité de la transduction et des conséquences de l’hyperparathyroïdie primaire.
Remplacement
L’hyperparathyroïdie induit de profondes modifications du métabolisme énergétique qui font intervenir des conséquences entremêlées et en cascade sur de nombreux tissus. Les mécanismes moléculaires sont très mal connus et il est absolument nécessaire de comprendre l’impact physiologique dans son ensemble pour développer par la suite d’autres approches. ll n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes ex vivo / in vitro de remplacement à l’expérimentation animale dans le domaine de l’hyperparathyroïdie.
Réduction
Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.
Raffinement
Nous avons pris en compte le bien-être animal, une visite quotidienne des animaux par les zootechniciens formés permettra de prévenir les risques de stress et de souffrance. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant des procédures adaptées, notamment un protocole péri-opératoire afin de limiter la douleur et la souffrance de l’animal, basé sur nos précédentes expériences de chirurgie chez la souris. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale. Les animaux reçoivent avant la chirurgie puis pendant une durée de 3 jours une analgésie. Les souris reprendront une alimentation normale dès le jour de la chirurgie. Les souris seront placées en couveuse à 30°C pendant 5 jours post-chirurgie et leur cage sera enrichie par des frisottis et un dôme ou un tube tunnel en polycarbonate rouge. Afin de limiter les souffrances post-expérimentales, une surveillance attentive des animaux sera réalisée par l'expérimentateur (toutes les 2 heures pendant premières heures post-chirurgie, 2 fois par jour pendant les 5 jours, puis une fois par jour jusqu'à la fin de l’étude). Des signes cliniques définissant les points limites, au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal mis à mort, ont été fixés.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix, il est utilisé depuis de longue date dans l’étude des maladies cardiaques et métaboliques. Il est largement reconnu pour sa pertinence dans la recherche biomédicale et les études précliniques en raison de sa similitude génétique avec l'humain. Les procédures débuteront chez des animaux à 8 semaines de vie, pour travailler sur des adultes jeunes mais matures sexuellement.
Mise au point d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïétiques dans des souris immunodéficientes MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Greffées de cellules humaines par injection dans la veine de la queue, ou dans le cœur pour les souriceaux de deux jours, 450 souris immunodéficientes subissent ensuite des prises de sang toutes les deux semaines, des greffes de tumeurs et parfois des traitements anti-lymphocytaires. Quatre cents d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, cinquante d'un niveau modéré, et toutes sont tuées pour prélever rate et ganglions. L'objectif est de faire fabriquer un anticorps antitumoral par des lymphocytes B humains, dans des souris dépourvues de défenses immunitaires et donc exposées à tout pathogène de leur environnement. Le porteur annonce que peu de nuisances sont à attendre, tout en listant la maladie du greffon contre l'hôte, la fièvre, les vomissements, les diarrhées et les tremblements liés aux traitements.
Objectifs
L'objectif de ce projet est la mise au point d’une stratégie permettant de faire produire aux lymphocytes B un anticorps choisi, ciblant spécifiquement une protéine exprimée par les cellules tumorales. Ce système permettra alors d’induire une réponse immunitaire spécifique contre les tumeurs. Nous allons donc modifier génétiquement les lymphocytes B humains ou leurs précurseurs puis injecter ces cellules à des souris immunodéficientes, souris qui ne pourront pas rejeter les cellules humaines. Nous quantifierons alors la production des anticorps dans les souris et implanteront les tumeurs spécifiques des anticorps induits pour évaluer la capacité antitumorale de nos anticorps.
Bénéfices attendus
L'utilisation des souris immunodéficientes est un excellent modèle pour notre projet. En effet, ces souris ne possèdent plus de lymphocytes et ne peuvent alors plus détruire les cellules étrangères injectées. Elles sont donc capables de recevoir différentes cellules humaines, comme des lymphocytes B qui produiront des anticorps ou même des cellules précurseuses des lymphocytes, qui pourront alors produire des lymphocytes B humains dans les souris. Avec ce projet, nous testerons donc la faisabilité d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à faire produire par des lymphocytes B des anticorps thérapeutiques. Ce projet pourra ensuite être valorisé (essai clinique de phase I) et potentiellement ouvrir une autre voie dans les traitements d'immunothérapie.
Procédures
La greffe des cellules sera unique et se fera soit par injection intraveineuse dans la veine de la queue chez les souris adultes soit par injection intracardiaque chez les souriceaux nouveau-nés. Des prélèvements sanguins itératifs (toutes les 2 semaines) seront ensuite réalisés sur tous les animaux et dans toutes les procédures afin d'évaluer et de suivre la reconstitution immunologique au cours du temps. Ensuite, des immunisations et des greffes de cellules tumorales pourront être appliquées sur les animaux si la reconstitution immunitaire a été jugé optimale. Des Lipid NanoParticules pourront également être injectés aux souris reconstituées afin d'explorer la possibilité de modifier le génome de nos cellules d'intérêt directement in vivo. Enfin, des traitements anti-lymphocytaire pourront être administrés aux animaux en cas d'apparition de la maladie du greffon contre l'hôte.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont à attendre à la suite d'injection intraveineuse de cellules. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention afin de chauffer leur queue avant l'injection. Un léger inconfort pourra être ressenti à cause de la chaleur et une douleur pourra être ressentie lors de la piqure dans la queue au moment de l'injection. Les autres nuisances attendues viendront de l'injection intracardiaque du nouveau-né. En effet, la mère pourrait ne pas vouloir récupérer son souriceau si celui a été trop manipulé. Des efforts afin de masquer les odeurs liées à la manipulation seront réalisés pour favoriser la réadoption des souriceaux par leur mère. Des effets indésirables pourront également survenir après les greffes de tumeurs, des points limites concernant la taille des tumeurs seront mis en place afin d'éviter trop d'inconfort et de souffrance aux souris. Des nuisances pourraient aussi survenir après l'injection de LNP par voie intraveineuse (perte de poid essentiellement) mais aussi après l'administration de traitements anti-lymphocytaires (fièvre, frissons, vomissements, flush, diarrhées et tremblements).
Devenir
A l'issue de chaque expérimentation, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité, ganglions, rate notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution du système immunitaire humain dans la souris ainsi que sur le développement de la réponse immunitaire.
Remplacement
Le projet est basé sur le pouvoir de reconstitution des cellules précurseuses du système immunitaire. Ces dernières sont en effet capables de se différencier dans la moelle osseuse de la souris après injection et de fabriquer dans ces souris diverses populations immunitaires humaines, dont les lymphocytes B. Il est actuellement possible de différencier ces précurseurs in vitro mais uniquement vers quelques voies données, et non vers la différenciation en lymphocyte. Aucun modèle in vitro ne permet une différenciation complète vers toutes les lignées du système immunitaire. Seul un environnement complet (moelle osseuse, facteurs de croissance, signaux de survie, organes du système immunitaire…) permettra d’obtenir les conditions idéales pour reconstituer un système immunitaire compétent. C’est pourquoi l’utilisation de souris immunodéficientes reste l’unique modèle utilisable aujourd’hui.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes de cellules, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal (notamment vérification in vitro des mutations). Lors de chaque expérimentation, des groupes de 5 souris seront formés afin de comparer les différentes conditions utilisées ou de comparer l'effet des mutations réalisées sur les CSH avant l'injection. Si une différence apparaît mais qu'elle n'est pas significative, l'expérimentation sera répétée afin d'obtenir une significativité.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel. Toutes les procédures ne seront réalisées que par des personnes ayant une excellente maîtrise des gestes. Les animaux seront suivis quotidiennement selon une surveillance de l’état général des animaux par le personnel de l’établissement ou le responsable du projet. De plus, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par le responsable du projet selon des critères généraux permettant de quantifier le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes choisies pour ce projet sont complètement dépourvues de lymphocytes, ce qui permet donc d'éviter le rejet des cellules humaines. Elles sont donc parfaitement adaptées à la nature de ce projet de par leur taux élevé de prise de xénogreffes, que ce soit des lymphocytes B humains ou leurs précurseurs. Cependant, l’utilisation d’animaux immunodéprimés exposent au risque de contamination par divers pathogènes car les souris ne sont plus capables de combattre les pathogènes environnementaux. Ce risque sera parfaitement maîtrisé par la mise en place de précautions sanitaires adaptées. Dans un premier temps, l’expérimentation sera commencée chez des animaux de 4 à 6 semaines. En effet, une meilleure prise de greffe des cellules humaines a lieu chez les animaux jeunes, en particulier pour les lymphocytes. Dans un second temps, l’expérimentation sera commencée chez les souriceaux nouveau-nés de 2 jours. En effet, il est maintenant démontré que la prise de greffe des cellules humaines est meilleure quand les cellules sont injectées chez les nouveau-nés, ceci rendant nos expérimentations plus faciles à réaliser et nos résultats plus faciles à analyser (plus de cellules humaines dans la souris donc des effets plus facilement monitorables).
Rôle du Granzyme A sur l’immunité anti tumorale et le développement du lymphome sur un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
84 souris développent chacune une tumeur au flanc après une injection unique de trente secondes de cellules de lymphome, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées ensuite sous anesthésie pour prélever la tumeur et d'autres organes. Les atteintes attendues tiennent en une phrase, la multiplication des cellules cancéreuses au point d'injection, sans que soit décrit ce que la croissance de la tumeur fait subir aux souris ni indiqué de taille limite. Le bénéfice annoncé se réduit à comprendre le rôle d'une enzyme dans le développement du lymphome, le porteur affirmant que le remplacement par des méthodes sans animaux n'est plus possible à ce stade.
Objectifs
Le lymphome est un cancer des cellules du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération excessive des cellules matures cancéreuses. Les lymphomes se caractérisent par la prolifération excessive des lymphocytes au niveau des ganglions, du foie, de la rate, plus rarement d'autres organes. Ils provoquent une augmentation de leur taille. Malgré les améliorations des traitements actuels chez l’homme, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de comprendre l’évolution de ce développement tumoral. Nous avons identifié sur plusieurs modèles in vitro (lignées cellulaires humaines) que les cellules lymphomateuses expriment une enzyme, pour laquelle le rôle n’a pas encore été établi. Une lignée cellulaire murine exprime également la Granzyme A et nous souhaitons dans ce projet, à travers l’utilisation d’un modèle murin comprendre son rôle sur la croissance tumorale et les perturbations de l’immunité intratumorale. Pour cela, nous allons utiliser des greffes de différentes cellules cancéreuses murines (lignées cellulaires de Lymphome murins déjà établies) dans des souris.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal concerne la compréhension du rôle d’une enzyme dans le développement du lymphome et son rôle sur l’immunité intratumorale.
Procédures
Les animaux seront soumis à des transplantations de cellules de lymphome dans leur flanc. Une seule injection est prévue par souris, durée de 30 secondes par injection.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules lymphomateuses au niveau de la zone d’injection du flanc de l’animal.
Devenir
Les animaux seront sous anesthésie mis à mort à l’issue des expériences, dans le but de récupérer les tumeurs ainsi que des organes pour des analyses biologiques.
Remplacement
Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Nous avons d’ores et déjà testé in vitro par des méthodes alternatives, l’expression du GzmA sur des lignées cellulaires. Il nous faut maintenant valider sur une étude préclinique in vivo le rôle du GzmA sur la croissance tumorale et l’immunité anti-tumorale et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.
Réduction
Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possible, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour cette étude, nous utiliserons des groupes de 7 souris afin de réaliser des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles et nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupes de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie.
Choix des espèces
Cette étude ne peut se réaliser que sur le modèle murin. L’étude sur l’immunité anti tumorale des souris est en effet celle qui se rapproche le plus de l’homme et c’est ce modèle qui est choisi dans la littérature afin de réaliser des études précliniques sur les lymphomes et l’immunité en général. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules lymphomateuses sur le flanc des animaux.
Etude des effets d’inhibiteurs de la voie IL-1 sur la réponse à la chimio-immunothérapie dans des modèles orthotopiques de cancer du pancréas
- Recherche fondamentale
- Oncologie
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune recevant treize injections après une opération de dix minutes qui implante des cellules de cancer du pancréas dans son pancréas. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, avec une masse tumorale intra-abdominale, des risques d'infection et de réouverture de la plaie, et une altération possible de l'état général. Le porteur écrit que l'association chimiothérapie et immunothérapie est "totalement" inefficace contre le cancer du pancréas chez l'être humain, et cherche à comprendre cette résistance en bloquant une molécule inflammatoire, l'IL-1β. Le passage à l'humain est renvoyé au long terme, le gain annoncé à court terme étant de justifier de nouveaux tests de molécules chez la souris.
Objectifs
Le cancer du pancréas fait partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Son traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies, qui malheureusement ne conduisent que rarement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. Ainsi, l’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant, cette association n’est pas efficace pour le cancer du pancréas. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. Une molécule, l'IL-1β, est impliquée dans les réponses inflammatoires et peut influencer la façon dont les traitements contre le cancer fonctionnent. Son rôle dans la réponse aux traitements est complexe et n’est pas totalement compris. Le but du projet est d’évaluer l’impact d’inhibiteurs de l’IL-1β sur l’efficacité antitumorale des chimio-immunothérapies utilisées en clinique. Ainsi nous pourrons évaluer l’efficacité des traitements et déterminer si certaines cellules immunitaires voient leur nombre et leur activité modifiés en présence ou non d’inhibiteurs de l’IL-1. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.
Bénéfices attendus
Les traitements combinant chimiothérapie et immunothérapie ont montré une réelle efficacité pour de nombreux cancers. En ce qui concerne le cancer du pancréas ces traitements sont totalement inefficaces chez l’Homme. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes responsables de cette résistance dans les tumeurs générées dans le pancréas. Notre travail précédent sur des tumeurs du pancréas orthotopiques montre un réel impact de cette voie sur la réponse à la chimio-immunothérapie. Mais ces résultats ont été obtenu avec des souris n’exprimant pas l’IL-1β ou son récepteur et doivent être complétés par une évaluation des effets d’inhibiteurs, pour pouvoir être transposés chez l’Homme. L’identification du rôle de l’inflammation dans la résistance aux traitements aura des avantages, comme valider l’intérêt de trouver et tester des molécules bloquant cette voie chez la souris (court terme) et d’envisager leur utilisation chez l’Homme (long terme).
Procédures
4 interventions : - Implantation chirurgicale de cellules de cancer du pancréas murines dans le pancréas : - Geste réalisé sous anesthésie - Une seule implantation chirurgicale par animal - Durée : 10 minutes - Nombre de souris : 540 souris - Traitements par chimiothérapie ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigile - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 540 souris - Traitements par immunothérapie ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - 6 injections par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 540 souris - Traitements par inhibiteur ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - 6 injections par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 540 souris
Impact sur les animaux
- Injection de cellules tumorales dans le pancréas : croissance d’une masse tumorale intra-abdominale. -Possible altération de l’état général du fait de la pathologie cancéreuse induite. - Possibles complications au niveau du site opératoire et de la cicatrice : infection, déhiscence de la plaie, douleur. -Des effets cumulés liés à la chirurgie, l’implantation des cellules tumorales, le développement des tumeurs et les traitements ne sont pas attendus étant donné la chronologie et le temps écoulé entre chaque événement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les tumeurs et réaliser des expériences.
Remplacement
L’adénocarcinome pancréatique est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.
Réduction
- Les expériences seront réalisées sur des petits effectifs ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus, une étape de faisabilité pour évaluer la pertinence des modèles a déjà été réalisée dans le laboratoire. - Les expériences visant à étudier la taille des tumeurs et les infiltrats immunitaires seront réalisées sur les mêmes souris. - Les différents modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements.
Raffinement
Les animaux seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe et entretenue tout au long de la procédure, avec contrôle de l’absence de réflexe de la patte et surveillance de la fréquence respiratoire et protection de la cornée avec un collyre ophtalmique. Pour l’analgésie, des anti-inflammatoires (Ketoprofen 4mg/kg-une fois par jour) seront administrés en sous-cutanée en pré-opératoire à distance du site opératoire et prolongé pendant 48h après l’opération, ainsi que des anesthésiques locaux (lidocaïne 4mg/kg + bupivacaine 2mg/kg) au niveau du site opératoire. La surveillance post-interventionnelle sera réalisée 2 fois par jour durant les 3 premiers jours, puis quotidiennement pendant 2 jours et enfin espacée à 3 fois par semaine. Durant toute l’expérience, suivi du poids et évaluation de la NEC (Note d’Etat Corporel) au minimum trois fois par semaine. L’apparition d’éventuels points limites sera recherchée.
Choix des espèces
Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvements présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.
Détermination de l’implication des neutrophiles dans l’activité anti-tumorale d’une combinaison thérapeutiques anti-cancéreuse à base de ligands de TLR chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées sous anesthésie, puis elles reçoivent jusqu'à cinq injections d'une combinaison de molécules activant les récepteurs TLR et jusqu'à dix injections d'un agent qui bloque l'arrivée des neutrophiles, avec quatre prises de sang à la mandibule. Les tumeurs peuvent atteindre 1 500 mm³ avant la mise à mort et se nécroser, et les molécules testées peuvent provoquer un épisode de fièvre. Le porteur affirme avoir déjà guéri des souris avec cette combinaison, et conclut que déterminer le rôle des neutrophiles "nous oblige à utiliser l'organisme vivant entier".
Objectifs
Dans une DAP précédente, nous avons pu démontrer l’efficacité thérapeutique d’une combinaison de molécules activant des récepteurs (TLR) dans un modèle de cancer du côlon. Comme attendu, la réponse anti-tumorale était dépendante de l’activation du système immunitaire et nous avons pu démontrer que très rapidement après le début du traitement, les tumeurs étaient envahies par des cellules de l’immunité, les neutrophiles. Afin de pouvoir valider l’implication des neutrophiles dans l’activité anti-tumorale de cette combinaison de molécules activant les TLRs, nous devons inhiber leur infiltration tumorale et regarder si nous conservons ou non cette activité thérapeutique. Le but de ce projet consiste donc à inhiber l’infiltration tumorale des neutrophiles et d’investiguer l’efficacité thérapeutique de notre combinaison de molécules activant les TLRs.
Bénéfices attendus
Cette étude a pour but de mieux comprendre le mécanisme anti-tumoral de notre combinaison thérapeutique à base de molécules activant les TLRs. Connaitre le rôle des neutrophiles dans l’efficacité thérapeutique de la combinaison est essentielle pour que les oncologues puissent déterminer quels sont les patients pouvant recevoir ce traitement, le but étant de pouvoir rapidement proposer cette thérapie aux patients porteurs de tumeurs du côlon.
Procédures
Les souris recevront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale. Les traitements reçus par les souris seront : - injection (1 minute – 200 µL maximum) de combinaison de molécules activant les TLRs au maximum 2 fois par semaine, 5 injections maximum. - injection pendant 1 minute maximumde 200 µL de l’agent 1 (tous les 2 jours sur 20 jours maximum) ou de l’agent 2 (2X par semaine, maximum 5 injections) inhibant le recrutement des neutrophiles dans les tumeurs. Les prélèvements de sang à la mandibulaire (100 µL maximum pendant une durée maximale de 1 minute) seront réalisés sous anesthésie générale, 4 fois sur 3 semaines et en faisant bien attention à ce qu’il y ait une alternance de côté de prélèvement.
Impact sur les animaux
- Les souris seront anesthésiées lors de l’injection des cellules tumorales et lors des prélèvements sanguins , , ce qui peut provoquer un stress de quelques minutes une fois dans la chambre d’endormissement, un léger refroidissement, ainsi qu’un léger stress et des vacillements au moment du réveil. - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs et des traitements pourrait provoquer un léger stress. - Le volume tumoral peut générer une gêne au mouvement et donc impacter son état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - Les injections répétées et les prélèvements sanguins à la mandibule) pourraient provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les molécules activant les TLR sont utilisés à des doses déjà bien établies dans les modèles murins. Ces molécules peuvent induire un léger épisode fébrile (
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences et leur tumeur sera prélevée.
Remplacement
Une grande partie de nos démonstrations a été réalisée in vitro avant de tester notre combinaison thérapeutique chez la souris et de constater sa très grande efficacité (souris guéries). La compréhension du mode d’action de cette thérapie et plus particulièrement la détermination du rôle des neutrophiles dans celle-ci nous oblige à utiliser l’organisme vivant entier.
Réduction
Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, les croissances tumorales seront réalisées sur des groupes de 8 souris. Nous répèterons l’expérience 1 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques, comme nous avons déjà pu le déterminer dans des expériences antérieures.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour éviter le stress. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour tous les animaux, une semaine d’acclimatation sera respectée avant le début de l’expérimentation. Ces animaux seront habitués aux gestes techniques (contention, injections…) avant toute expérimentation. Les injections se feront au même moment de la journée, pour perturber au minimum le cycle des souris. Les souris ayant un système immunitaire déficient (déplétion des neutrophiles), elles sont donc plus sensibles aux infections et seront hébergées sous couvercle filtrant. L’injection des cellules tumorales et les prélèvements de sang à la mandibule seront réalisés sous anesthésie et en tenant compte d’une alternance pour la mandibule prélevée. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude, la fréquence de surveillance étant augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux tels qu’une perte de poids (maximum 15%), des modifications du comportement, l’apparition de nécroses sur les tumeurs ou d’une période de fébrilité. En cas de changement de comportement ou d’apparence physique, une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage et les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas d’apparition de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront mises à mort. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant. En cas d’épisode fébrile de plus 24h post-injection des molécules activant les TLRs, les souris recevront 1 injection d’analgésique en sous-cutané toutes les 12h jusqu’à disparition des symptômes (le maximum retrouvé étant de 48h dans de très rares cas). Si la tumeur atteint une taille supérieure à 1500 mm3, en cas de perte de poids supérieure à 15% ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie.
Choix des espèces
Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. L’efficacité anti-tumorale de la combinaison de molécules activant les TLRs ayant été démontrée dans la souris, nous utiliserons la même souche de souris. Les animaux devront avoir au moins 8 semaines pour que leur système immunitaire soit mature.
Suivi des comportements de l’alose feinte de Méditerranée dans un fleuve côtier et en milieu marin
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Pêchées à la ligne dans un fleuve côtier méditerranéen juste avant leur reproduction, 50 aloses feintes sauvages vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Anesthésiées, elles reçoivent un émetteur acoustique implanté par chirurgie et subissent des prélèvements d'écailles et de nageoire, le tout en moins de trois minutes, avant d'être remises à l'eau vivantes. L'espèce est menacée, et le porteur attend de la télémétrie qu'elle indique si le zonage des aires marines protégées la protège réellement. Il écrit que le remplacement est impossible parce que l'étude porte sur le comportement d'individus vivants dans leur milieu, et table sur une mortalité post-opératoire pouvant atteindre 3 %.
Objectifs
L’étude vise à acquérir des connaissances sur le comportement d’une espèce de poisson migratrice menacée, l’Alose de Méditerranée. Ce poisson vit en mer et remonte se reproduire dans les fleuves. Il s’agira d’évaluer la faisabilité d’un suivi des déplacements des individus entre la mer et un fleuve en utilisant une technologie de suivi à distance (télémétrie acoustique). Des émetteurs seront implantés dans les poissons avant leur reproduction, de manière à les localiser ensuite à l’aide de récepteurs répartis dans l’aire d’étude pour mieux comprendre l’écologie de cette espèce.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’améliorer les connaissances sur le comportement de l’alose de Méditerranée, avant, pendant et après sa reproduction, entre le milieu marin et le milieu continental (fleuve côtier), et d'améliorer ensuite la gestion et la conservation de cette espèce menacée.
Procédures
Les aloses capturées seront anesthésiées puis marquées par implantation chirurgicale d'émetteur acoustique (50 individus), et feront l’objet de prélèvements d’écailles et de nageoire. La manipulation n’excédera pas 3 minutes.
Impact sur les animaux
La capture, le transport, la stabulation, le marquage ainsi que les prélèvements d’écailles et de nageoires sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Le marquage chirurgical génère un stress supplémentaire lors de la préhension, l’anesthésie et l’incision, et un risque de douleur post-implantation.
Devenir
Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement dans le milieu naturel.
Remplacement
Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. Nous attendons des données sur la propension des individus à se déplacer, poursuivre leur migration jusqu’aux frayères accessibles, dévaler en mer et se déplacer à proximité de l’embouchure. Il est donc nécessaire d'avoir recours à des animaux sauvages pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Le projet est prévu en principe sur une durée d’une année, mais sera reconductible l’année suivante et jusqu’à 3 ans en cas de difficultés de capture. Il prévoit le marquage de 50 aloses, ce qui est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire les comportements. Cet effectif tient compte d’un taux de mortalité post-opératoire assez faible (jusqu’à 3% généralement), de la prédation potentielle, et de la capture par la pêche. Grâce au réseau de récepteurs déployés, les détections des individus marqués seront a priori importantes, d’où une limitation à un maximum de 50 poissons. Cet objectif apparaît comme une cible réaliste au vu des effectifs en migration sur le fleuve étudié. Des analyses descriptives seront réalisées (taux de redétection, distances de déplacement, vitesses de déplacement, …).
Raffinement
Le protocole a été pensé pour tenir compte de la grande sensibilité des aloses, particulièrement aux opérations de capture-biométrie-marquage. La pêche à la ligne a été utilisée dans une autre étude sur l’alose feinte de Méditerranée et s’est révélée adaptée. Le transport des aloses sera limité et réalisé dans des conditions permettant de réduire le stress. Toutes les étapes du protocole, de la capture au réveil, seront réalisées précisément sur le même site, à proximité de la rivière. La manipulation s’effectuera à l’aide d’une épuisette non abrasive. L’utilisation d’un brancard pour l’anesthésie permet de placer le poisson dans l’obscurité, ce qui permet de réduire son stress. Le marquage est réalisé dans un bac spécifique avec recirculation de solution anesthésiante. Les poissons seront régulièrement observés et la qualité de l’eau surveillée. La méthode de marquage tient compte des spécificités et de la sensibilité de l’espèce, afin d’éviter les impacts sur la survie et le comportement de l’animal. Enfin, la phase de réveil se déroule dans des cages flottantes positionnées dans la rivière. Ceci permet de limiter les manipulations des poissons. Dès reprise de la nage, les aloses seront relâchées. Le temps de surveillance est volontairement réduit pour minimiser le stress lié à la stabulation.
Choix des espèces
L’espèce cible est l’alose de Méditerranée. Cette espèce migratrice peut être considérée comme un indicateur de la bonne connectivité des grands cours d’eau. Le projet porte plus spécifiquement sur la phase marine de l’espèce, l’idée étant d’évaluer à terme si la zonation des aires marines protégées permet une bonne protection de cette espèce. Les poissons seront marqués au stade adulte reproducteur, juste avant la reproduction (début mai).