Oncologie

84 souris développent chacune une tumeur au flanc après une injection unique de trente secondes de cellules de lymphome, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées ensuite sous anesthésie pour prélever la tumeur et d'autres organes. Les atteintes attendues tiennent en une phrase, la multiplication des cellules cancéreuses au point d'injection, sans que soit décrit ce que la croissance de la tumeur fait subir aux souris ni indiqué de taille limite. Le bénéfice annoncé se réduit à comprendre le rôle d'une enzyme dans le développement du lymphome, le porteur affirmant que le remplacement par des méthodes sans animaux n'est plus possible à ce stade.

Objectifs

Le lymphome est un cancer des cellules du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération excessive des cellules matures cancéreuses. Les lymphomes se caractérisent par la prolifération excessive des lymphocytes au niveau des ganglions, du foie, de la rate, plus rarement d'autres organes. Ils provoquent une augmentation de leur taille. Malgré les améliorations des traitements actuels chez l’homme, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de comprendre l’évolution de ce développement tumoral. Nous avons identifié sur plusieurs modèles in vitro (lignées cellulaires humaines) que les cellules lymphomateuses expriment une enzyme, pour laquelle le rôle n’a pas encore été établi. Une lignée cellulaire murine exprime également la Granzyme A et nous souhaitons dans ce projet, à travers l’utilisation d’un modèle murin comprendre son rôle sur la croissance tumorale et les perturbations de l’immunité intratumorale. Pour cela, nous allons utiliser des greffes de différentes cellules cancéreuses murines (lignées cellulaires de Lymphome murins déjà établies) dans des souris.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal concerne la compréhension du rôle d’une enzyme dans le développement du lymphome et son rôle sur l’immunité intratumorale.

Procédures

Les animaux seront soumis à des transplantations de cellules de lymphome dans leur flanc. Une seule injection est prévue par souris, durée de 30 secondes par injection.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules lymphomateuses au niveau de la zone d’injection du flanc de l’animal.

Devenir

Les animaux seront sous anesthésie mis à mort à l’issue des expériences, dans le but de récupérer les tumeurs ainsi que des organes pour des analyses biologiques.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Nous avons d’ores et déjà testé in vitro par des méthodes alternatives, l’expression du GzmA sur des lignées cellulaires. Il nous faut maintenant valider sur une étude préclinique in vivo le rôle du GzmA sur la croissance tumorale et l’immunité anti-tumorale et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possible, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour cette étude, nous utiliserons des groupes de 7 souris afin de réaliser des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles et nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupes de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie.

Choix des espèces

Cette étude ne peut se réaliser que sur le modèle murin. L’étude sur l’immunité anti tumorale des souris est en effet celle qui se rapproche le plus de l’homme et c’est ce modèle qui est choisi dans la littérature afin de réaliser des études précliniques sur les lymphomes et l’immunité en général. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules lymphomateuses sur le flanc des animaux.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune recevant treize injections après une opération de dix minutes qui implante des cellules de cancer du pancréas dans son pancréas. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, avec une masse tumorale intra-abdominale, des risques d'infection et de réouverture de la plaie, et une altération possible de l'état général. Le porteur écrit que l'association chimiothérapie et immunothérapie est "totalement" inefficace contre le cancer du pancréas chez l'être humain, et cherche à comprendre cette résistance en bloquant une molécule inflammatoire, l'IL-1β. Le passage à l'humain est renvoyé au long terme, le gain annoncé à court terme étant de justifier de nouveaux tests de molécules chez la souris.

Objectifs

Le cancer du pancréas fait partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Son traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies, qui malheureusement ne conduisent que rarement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. Ainsi, l’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant, cette association n’est pas efficace pour le cancer du pancréas. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. Une molécule, l'IL-1β, est impliquée dans les réponses inflammatoires et peut influencer la façon dont les traitements contre le cancer fonctionnent. Son rôle dans la réponse aux traitements est complexe et n’est pas totalement compris. Le but du projet est d’évaluer l’impact d’inhibiteurs de l’IL-1β sur l’efficacité antitumorale des chimio-immunothérapies utilisées en clinique. Ainsi nous pourrons évaluer l’efficacité des traitements et déterminer si certaines cellules immunitaires voient leur nombre et leur activité modifiés en présence ou non d’inhibiteurs de l’IL-1. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

Les traitements combinant chimiothérapie et immunothérapie ont montré une réelle efficacité pour de nombreux cancers. En ce qui concerne le cancer du pancréas ces traitements sont totalement inefficaces chez l’Homme. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes responsables de cette résistance dans les tumeurs générées dans le pancréas. Notre travail précédent sur des tumeurs du pancréas orthotopiques montre un réel impact de cette voie sur la réponse à la chimio-immunothérapie. Mais ces résultats ont été obtenu avec des souris n’exprimant pas l’IL-1β ou son récepteur et doivent être complétés par une évaluation des effets d’inhibiteurs, pour pouvoir être transposés chez l’Homme. L’identification du rôle de l’inflammation dans la résistance aux traitements aura des avantages, comme valider l’intérêt de trouver et tester des molécules bloquant cette voie chez la souris (court terme) et d’envisager leur utilisation chez l’Homme (long terme).

Procédures

4 interventions : - Implantation chirurgicale de cellules de cancer du pancréas murines dans le pancréas : - Geste réalisé sous anesthésie - Une seule implantation chirurgicale par animal - Durée : 10 minutes - Nombre de souris : 540 souris - Traitements par chimiothérapie ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigile - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 540 souris - Traitements par immunothérapie ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - 6 injections par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 540 souris - Traitements par inhibiteur ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - 6 injections par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 540 souris

Impact sur les animaux

- Injection de cellules tumorales dans le pancréas : croissance d’une masse tumorale intra-abdominale. -Possible altération de l’état général du fait de la pathologie cancéreuse induite. - Possibles complications au niveau du site opératoire et de la cicatrice : infection, déhiscence de la plaie, douleur. -Des effets cumulés liés à la chirurgie, l’implantation des cellules tumorales, le développement des tumeurs et les traitements ne sont pas attendus étant donné la chronologie et le temps écoulé entre chaque événement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les tumeurs et réaliser des expériences.

Remplacement

L’adénocarcinome pancréatique est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

- Les expériences seront réalisées sur des petits effectifs ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus, une étape de faisabilité pour évaluer la pertinence des modèles a déjà été réalisée dans le laboratoire. - Les expériences visant à étudier la taille des tumeurs et les infiltrats immunitaires seront réalisées sur les mêmes souris. - Les différents modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements.

Raffinement

Les animaux seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe et entretenue tout au long de la procédure, avec contrôle de l’absence de réflexe de la patte et surveillance de la fréquence respiratoire et protection de la cornée avec un collyre ophtalmique. Pour l’analgésie, des anti-inflammatoires (Ketoprofen 4mg/kg-une fois par jour) seront administrés en sous-cutanée en pré-opératoire à distance du site opératoire et prolongé pendant 48h après l’opération, ainsi que des anesthésiques locaux (lidocaïne 4mg/kg + bupivacaine 2mg/kg) au niveau du site opératoire. La surveillance post-interventionnelle sera réalisée 2 fois par jour durant les 3 premiers jours, puis quotidiennement pendant 2 jours et enfin espacée à 3 fois par semaine. Durant toute l’expérience, suivi du poids et évaluation de la NEC (Note d’Etat Corporel) au minimum trois fois par semaine. L’apparition d’éventuels points limites sera recherchée.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvements présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées sous anesthésie, puis elles reçoivent jusqu'à cinq injections d'une combinaison de molécules activant les récepteurs TLR et jusqu'à dix injections d'un agent qui bloque l'arrivée des neutrophiles, avec quatre prises de sang à la mandibule. Les tumeurs peuvent atteindre 1 500 mm³ avant la mise à mort et se nécroser, et les molécules testées peuvent provoquer un épisode de fièvre. Le porteur affirme avoir déjà guéri des souris avec cette combinaison, et conclut que déterminer le rôle des neutrophiles "nous oblige à utiliser l'organisme vivant entier".

Objectifs

Dans une DAP précédente, nous avons pu démontrer l’efficacité thérapeutique d’une combinaison de molécules activant des récepteurs (TLR) dans un modèle de cancer du côlon. Comme attendu, la réponse anti-tumorale était dépendante de l’activation du système immunitaire et nous avons pu démontrer que très rapidement après le début du traitement, les tumeurs étaient envahies par des cellules de l’immunité, les neutrophiles. Afin de pouvoir valider l’implication des neutrophiles dans l’activité anti-tumorale de cette combinaison de molécules activant les TLRs, nous devons inhiber leur infiltration tumorale et regarder si nous conservons ou non cette activité thérapeutique. Le but de ce projet consiste donc à inhiber l’infiltration tumorale des neutrophiles et d’investiguer l’efficacité thérapeutique de notre combinaison de molécules activant les TLRs.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour but de mieux comprendre le mécanisme anti-tumoral de notre combinaison thérapeutique à base de molécules activant les TLRs. Connaitre le rôle des neutrophiles dans l’efficacité thérapeutique de la combinaison est essentielle pour que les oncologues puissent déterminer quels sont les patients pouvant recevoir ce traitement, le but étant de pouvoir rapidement proposer cette thérapie aux patients porteurs de tumeurs du côlon.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale. Les traitements reçus par les souris seront : - injection (1 minute – 200 µL maximum) de combinaison de molécules activant les TLRs au maximum 2 fois par semaine, 5 injections maximum. - injection pendant 1 minute maximumde 200 µL de l’agent 1 (tous les 2 jours sur 20 jours maximum) ou de l’agent 2 (2X par semaine, maximum 5 injections) inhibant le recrutement des neutrophiles dans les tumeurs. Les prélèvements de sang à la mandibulaire (100 µL maximum pendant une durée maximale de 1 minute) seront réalisés sous anesthésie générale, 4 fois sur 3 semaines et en faisant bien attention à ce qu’il y ait une alternance de côté de prélèvement.

Impact sur les animaux

- Les souris seront anesthésiées lors de l’injection des cellules tumorales et lors des prélèvements sanguins , , ce qui peut provoquer un stress de quelques minutes une fois dans la chambre d’endormissement, un léger refroidissement, ainsi qu’un léger stress et des vacillements au moment du réveil. - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs et des traitements pourrait provoquer un léger stress. - Le volume tumoral peut générer une gêne au mouvement et donc impacter son état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - Les injections répétées et les prélèvements sanguins à la mandibule) pourraient provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les molécules activant les TLR sont utilisés à des doses déjà bien établies dans les modèles murins. Ces molécules peuvent induire un léger épisode fébrile (

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences et leur tumeur sera prélevée.

Remplacement

Une grande partie de nos démonstrations a été réalisée in vitro avant de tester notre combinaison thérapeutique chez la souris et de constater sa très grande efficacité (souris guéries). La compréhension du mode d’action de cette thérapie et plus particulièrement la détermination du rôle des neutrophiles dans celle-ci nous oblige à utiliser l’organisme vivant entier.

Réduction

Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, les croissances tumorales seront réalisées sur des groupes de 8 souris. Nous répèterons l’expérience 1 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques, comme nous avons déjà pu le déterminer dans des expériences antérieures.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour éviter le stress. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour tous les animaux, une semaine d’acclimatation sera respectée avant le début de l’expérimentation. Ces animaux seront habitués aux gestes techniques (contention, injections…) avant toute expérimentation. Les injections se feront au même moment de la journée, pour perturber au minimum le cycle des souris. Les souris ayant un système immunitaire déficient (déplétion des neutrophiles), elles sont donc plus sensibles aux infections et seront hébergées sous couvercle filtrant. L’injection des cellules tumorales et les prélèvements de sang à la mandibule seront réalisés sous anesthésie et en tenant compte d’une alternance pour la mandibule prélevée. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude, la fréquence de surveillance étant augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux tels qu’une perte de poids (maximum 15%), des modifications du comportement, l’apparition de nécroses sur les tumeurs ou d’une période de fébrilité. En cas de changement de comportement ou d’apparence physique, une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage et les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas d’apparition de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront mises à mort. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant. En cas d’épisode fébrile de plus 24h post-injection des molécules activant les TLRs, les souris recevront 1 injection d’analgésique en sous-cutané toutes les 12h jusqu’à disparition des symptômes (le maximum retrouvé étant de 48h dans de très rares cas). Si la tumeur atteint une taille supérieure à 1500 mm3, en cas de perte de poids supérieure à 15% ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. L’efficacité anti-tumorale de la combinaison de molécules activant les TLRs ayant été démontrée dans la souris, nous utiliserons la même souche de souris. Les animaux devront avoir au moins 8 semaines pour que leur système immunitaire soit mature.

Pêchées à la ligne dans un fleuve côtier méditerranéen juste avant leur reproduction, 50 aloses feintes sauvages vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Anesthésiées, elles reçoivent un émetteur acoustique implanté par chirurgie et subissent des prélèvements d'écailles et de nageoire, le tout en moins de trois minutes, avant d'être remises à l'eau vivantes. L'espèce est menacée, et le porteur attend de la télémétrie qu'elle indique si le zonage des aires marines protégées la protège réellement. Il écrit que le remplacement est impossible parce que l'étude porte sur le comportement d'individus vivants dans leur milieu, et table sur une mortalité post-opératoire pouvant atteindre 3 %.

Objectifs

L’étude vise à acquérir des connaissances sur le comportement d’une espèce de poisson migratrice menacée, l’Alose de Méditerranée. Ce poisson vit en mer et remonte se reproduire dans les fleuves. Il s’agira d’évaluer la faisabilité d’un suivi des déplacements des individus entre la mer et un fleuve en utilisant une technologie de suivi à distance (télémétrie acoustique). Des émetteurs seront implantés dans les poissons avant leur reproduction, de manière à les localiser ensuite à l’aide de récepteurs répartis dans l’aire d’étude pour mieux comprendre l’écologie de cette espèce.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’améliorer les connaissances sur le comportement de l’alose de Méditerranée, avant, pendant et après sa reproduction, entre le milieu marin et le milieu continental (fleuve côtier), et d'améliorer ensuite la gestion et la conservation de cette espèce menacée.

Procédures

Les aloses capturées seront anesthésiées puis marquées par implantation chirurgicale d'émetteur acoustique (50 individus), et feront l’objet de prélèvements d’écailles et de nageoire. La manipulation n’excédera pas 3 minutes.

Impact sur les animaux

La capture, le transport, la stabulation, le marquage ainsi que les prélèvements d’écailles et de nageoires sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Le marquage chirurgical génère un stress supplémentaire lors de la préhension, l’anesthésie et l’incision, et un risque de douleur post-implantation.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement dans le milieu naturel.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. Nous attendons des données sur la propension des individus à se déplacer, poursuivre leur migration jusqu’aux frayères accessibles, dévaler en mer et se déplacer à proximité de l’embouchure. Il est donc nécessaire d'avoir recours à des animaux sauvages pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Le projet est prévu en principe sur une durée d’une année, mais sera reconductible l’année suivante et jusqu’à 3 ans en cas de difficultés de capture. Il prévoit le marquage de 50 aloses, ce qui est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire les comportements. Cet effectif tient compte d’un taux de mortalité post-opératoire assez faible (jusqu’à 3% généralement), de la prédation potentielle, et de la capture par la pêche. Grâce au réseau de récepteurs déployés, les détections des individus marqués seront a priori importantes, d’où une limitation à un maximum de 50 poissons. Cet objectif apparaît comme une cible réaliste au vu des effectifs en migration sur le fleuve étudié. Des analyses descriptives seront réalisées (taux de redétection, distances de déplacement, vitesses de déplacement, …).

Raffinement

Le protocole a été pensé pour tenir compte de la grande sensibilité des aloses, particulièrement aux opérations de capture-biométrie-marquage. La pêche à la ligne a été utilisée dans une autre étude sur l’alose feinte de Méditerranée et s’est révélée adaptée. Le transport des aloses sera limité et réalisé dans des conditions permettant de réduire le stress. Toutes les étapes du protocole, de la capture au réveil, seront réalisées précisément sur le même site, à proximité de la rivière. La manipulation s’effectuera à l’aide d’une épuisette non abrasive. L’utilisation d’un brancard pour l’anesthésie permet de placer le poisson dans l’obscurité, ce qui permet de réduire son stress. Le marquage est réalisé dans un bac spécifique avec recirculation de solution anesthésiante. Les poissons seront régulièrement observés et la qualité de l’eau surveillée. La méthode de marquage tient compte des spécificités et de la sensibilité de l’espèce, afin d’éviter les impacts sur la survie et le comportement de l’animal. Enfin, la phase de réveil se déroule dans des cages flottantes positionnées dans la rivière. Ceci permet de limiter les manipulations des poissons. Dès reprise de la nage, les aloses seront relâchées. Le temps de surveillance est volontairement réduit pour minimiser le stress lié à la stabulation.

Choix des espèces

L’espèce cible est l’alose de Méditerranée. Cette espèce migratrice peut être considérée comme un indicateur de la bonne connectivité des grands cours d’eau. Le projet porte plus spécifiquement sur la phase marine de l’espèce, l’idée étant d’évaluer à terme si la zonation des aires marines protégées permet une bonne protection de cette espèce. Les poissons seront marqués au stade adulte reproducteur, juste avant la reproduction (début mai).

Cinq gavages et cinq injections dans l'abdomen chaque semaine, jusqu'à ce qu'un point limite soit atteint : 5 898 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou, par chirurgie, directement dans le tube digestif, puis des injections hebdomadaires de bactéries dans la veine de la queue ou dans la tumeur, avec des prélèvements de sang à l'œil et au cœur. L'objet est de comparer des souches de bactéries probiotiques modifiées pour libérer des anticancéreux à l'intérieur des tumeurs colorectales. Le porteur décrit ces procédures comme des "expériences pilotes" dont les données "ne seront pas utilisées pour tirer des conclusions définitives", et annonce ensuite d'autres études, avec un effectif statistiquement pertinent.

Objectifs

Notre équipe travaille sur le développement de bactéries probiotiques modifiées afin d’agir comme agents thérapeutiques contre le cancer. Grâce à leur capacité naturelle à cibler spécifiquement les tumeurs et à stimuler la réponse immunitaire, ces bactéries constituent des candidats particulièrement prometteurs pour les thérapies contre le cancer. Notre projet consiste donc à introduire différentes thérapies dans ces bactéries dont la libération peut être contrôlées par l’administration de produits. Sur la base d’études antérieures, nous avons déjà déterminé les doses optimales de bactéries à administrer par différentes voies de manière à assurer une bonne tolérance sans induire de mortalité. Nous poursuivons désormais nos recherches en comparant plusieurs souches, incluant différentes thérapies, sur diverses lignées cellulaires de cancer colorectal. Pour ce faire, les différentes bactéries thérapeutiques seront tout d’abord testées dans des modèles de greffes sous cutanées ce qui permettra d’identifier le candidat le plus performant. Ce dernier sera alors ensuite testé dans un modèle de greffe dans le tube digestif afin d’évaluer leur efficacité et leur potentiel clinique dans un contexte plus proche de la réalité.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectif de développer de nouvelles approches de thérapies antitumorales. Plus précisément, nous visons à valider l’efficacité de nos bactéries thérapeutiques sécrétant des anti-cancéreux dans des modèles de cancer colorectal. Un second objectif est d’approfondir la compréhension des mécanismes de colonisation tumorale des bactéries thérapeutiques et de la réponse immunitaire en les testant sur des souris porteuses de greffes tumorales bilatérales. Enfin, l’élargissement du projet à un modèle de tumeur greffé directement dans le tube digestif permettra d‘approfondir nos connaissances des bactéries thérapeutiques dans un contexte clinique plus proche encore de la réalité médicale.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules sous la peau (30 secondes par souris) / Une fois par semaine et jusqu’à l’apparition de point limite, une injection de bactéries par la queue (30 secondes par souris) / une fois par semaine et jusqu’à l’apparition de point limite, une injection de bactérie à l’intérieure de la tumeur (15 secondes par souris) / un prélèvement de sang par l’oeuil (15 secondes par souris) / un prélèvement de sang par le coeur (30 secondes par souris) / 5 gavages par semaines jusqu’à l’apparition d’un point limite (5 secondes par souris) 5 injections par semaine dans l’abdomen par semaine jusqu’à apparition d’un point limite (5 secondes par souris) / une injection de cellules dans le tube digestif par chirurgie (30 minutes par souris)

Impact sur les animaux

Nous avons classé l’ensemble des procédures décrites dans cette DAP en niveau de gravité modéré. Les greffes, le développement tumoral et l’administration des bactéries thérapeutiques peuvent entraîner différents effets indésirables, tels qu’une diminution de l’activité des animaux, une perte de poids, ou encore des troubles du transit (diarrhée, constipation, présence de sang dans les selles, prolapsus, abdomen dur ou distendu, etc.). Les tumeurs sous-cutanées peuvent également présenter des zones d’irritation. Pour la procédure impliquant des chirurgies, des douleurs postopératoires sont possibles, se manifestant notamment par un dos voûté, une pilo-érection ou des signes de déshydratation. Enfin, sur la base d’études antérieures, la dose optimale de bactéries a déjà été déterminée, ce qui permet d’écarter tout risque de septicémie liée à leur administration.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour effectuer des analyses complémentaires sur les prélèvements réalisés.

Remplacement

L’efficacité des bactéries thérapeutiques a déjà été largement démontrée au laboratoire, dans des systèmes cellulaires simplifiés. Cependant, pour valider leur potentiel thérapeutique, il est indispensable de passer à une évaluation sur l'animal afin d’établir une première preuve de concept de l’utilisation de différentes souches bactériennes comme agents thérapeutiques anticancéreux. L’évaluation de l’efficacité thérapeutique de ces souches nécessite un système biologique complexe, reproduisant les interactions tumorales, immunitaires et microbiennes présentes dans un organisme entier. Cette complexité ne peut être reproduite de manière fiable au laboratoire ou sur modèles alternatifs à ce jour, ce qui justifie le recours à un modèle murin pour cette étape cruciale de validation.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons choisi des modèles murins bien caractérisés, permettant de réduire la variabilité expérimentale. Par ailleurs, des tests préliminaires ont permis de sélectionner les souches bactériennes les plus prometteuses, évitant ainsi l’utilisation d’animaux pour des souches moins efficaces. Enfin, l’ensemble de ces procédures correspond à des expériences pilotes : ces expériences préliminaires permettront d’observer l’existence d’une tendance d’effet en testant plusieurs bactéries dans différentes conditions. Le recours à un effectif réduit permet de limiter le nombre d’animaux utilisés à ce stade exploratoire. Les données obtenues serviront uniquement à estimer la taille d’échantillon nécessaire et à optimiser le design expérimental. Elles ne seront pas utilisées pour tirer des conclusions définitives. En fonction des résultats de ces expériences pilotes, de nouvelles études pourront être mises en place avec un effectif d’animaux statistiquement pertinent.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, un suivi clinique quotidien et minutieux des animaux sera assuré afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. Si des signes de mal-être sont observés, alors ils seront reportés dans une fiche de suivi clinique. Les résultats de scoring de la fiche de suivi clinique pourront conduire à la mise en place de soin ou une décision d’euthanasier l’animal. Le suivi tumoral sera réalisé trois fois par semaine. Si le volume tumoral dépasse 1500 mm³, l’animal sera euthanasié immédiatement. Par ailleurs, une grille d’évaluation des nécroses à quatre niveaux sera utilisée : des soins pourront être réalisés et si la nécrose atteint un niveau 3, cela déclenchera également une euthanasie immédiate. En cas de perte de poids ou de signes de déshydratation, une alimentation riche gélifiée ainsi que de l’eau gélifiée seront mises directement à disposition dans la cage pour faciliter l’accès. Si nécessaire, des injections sous-cutanées de sérum physiologique seront administrées pour prévenir la déshydratation. Enfin, pour limiter la douleur, notamment après chirurgie, une analgésie sera assurée 2 fois par jour, pendant une durée maximale de 5 jours. Si au bout de 5 jours, aucun signe d’amélioration n’est visible, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris comme modèle expérimental se justifie par sa proximité biologique et génétique avec l’homme, ce qui en fait un organisme de choix pour l’étude des mécanismes du cancer. Cela va nous permettre d’évaluer la complexité des interactions cellulaires, immunitaires et tissulaires dans un contexte physiologique complet qui ne peut pas être reproduit par des modèles in vitro. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 semaines. Elles seront receptionnées à l’âge de 6 semaines puis greffées une semaine plus tard (temps d’acclimation). Nous utilisons des souris jeunes adultes car leur croissance est stabilisée et leur système immunitaire est pleinement développé et fonctionnel ce qui nous permettra d’obtenir des résultats fiables.

Toutes tuées pour prélever leur foie et d'autres organes, 1 749 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une opération au cours de laquelle des cellules tumorales lui sont injectées dans la rate, dont la moitié est parfois retirée, la peau du flanc étant refermée par des agrafes gardées sept à dix jours. Suivent jusqu'à vingt et un traitements intraveineux, quinze séances d'imagerie sous anesthésie précédées chacune d'une injection de luciférine, et neuf prises de sang à la queue sur animal maintenu éveillé. Le porteur renvoie l'amélioration de la prise en charge des malades du cancer colorectal au long terme, et annonce comme retombée immédiate des "données de haute qualité" sur l'ingénierie cellulaire in vivo.

Objectifs

Lorsque les cancers métastasent, ils deviennent beaucoup plus difficiles à traiter et la mortalité augmente. Le foie est un site fréquent de métastases et 30 à 50 % des patients atteints d'un carcinome colorectal présenteront des métastases hépatiques. Le cancer colorectal est la deuxième cause de décès par cancer dans le monde, et son incidence est en augmentation. Lorsque le cancer colorectal se propage au foie, la résection des lésions est une bonne option thérapeutique, mais seuls 10 à 20 % des patients sont éligibles. Pour ceux qui ne sont pas éligibles à la chirurgie, le taux de survie à 5 ans est inférieur à 10 %, ce qui indique que les options thérapeutiques actuelles ne sont pas suffisamment efficaces. Par conséquent, les métastases hépatiques du cancer du côlon restent un enjeu médical majeur non satisfait qui nécessite des recherches supplémentaires. Grâce aux récentes avancées dans le domaine de la technologie de l'ARN messager (ARNm), de nouvelles options thérapeutiques voient le jour. L'administration d'ARNm à des cellules spécifiques permet de modifier les cellules immunitaires ou même les cellules tumorales à l'intérieur de l'organisme, ce que l'on appelle également l'ingénierie cellulaire in vivo. Nous souhaitons ici explorer différentes possibilités d'ingénierie cellulaire in vivo afin d'améliorer l'activité antitumorale des cellules effectrices immunitaires, telles que les cellules NK et les cellules T. À des fins d'ingénierie in vivo, nous utiliserons des nanoparticules lipidiques (LNP), dans lesquelles l'ARNm peut être encapsulé et délivré spécifiquement aux cellules tumorales ou immunitaires, respectivement. En résumé, notre objectif est de développer des approches pour traiter le cancer du côlon métastatique, une maladie difficile à traiter et dont le pronostic est mauvais, en utilisant l'ingénierie cellulaire in vivo avec des LNP ciblées à ARNm.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter de nouvelles perspectives dans le domaine des traitements innovants contre les métastases hépatiques du cancer du côlon, qui font cruellement défaut. L'ingénierie cellulaire in vivo offre des possibilités que les traitements conventionnels ne permettent pas, comme la modification spécifique des cellules tumorales afin d'altérer leur immunogénicité. Nos recherches pourraient donc améliorer à long terme la prise en charge des patients atteints de cancer, mais elles aideront également la communauté scientifique en fournissant des données de haute qualité sur l'ingénierie cellulaire in vivo à court terme.

Procédures

Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale au cours de laquelle des cellules tumorales seront injectées dans la demi-rate (cellules tumorales MC38) ou dans la rate (cellules tumorales AKTPF). Dans le cas de la procédure sur la demi-rate, la moitié de la rate sera retirée, tandis que l'autre moitié restera en place pour continuer à remplir sa fonction. Afin de mesurer la charge tumorale, les souris seront imagées par bioluminescence, ce qui comprend une injection péritonéale de luciférine sur animaux vigiles et une anesthésie gazeuse pour immobiliser les souris pendant l'imagerie (2x/ semaine). Pour les groupes témoins, le jour prévu pour l'euthanasie est le jour 28, ce qui correspond à 7 imageries. Pour les souris ayant reçu une injection de ARNm-LNP, le jour maximum pour l'euthanasie est le jour 56, ce qui correspond à un nombre maximum de 15 imageries. Le traitement par ARNm-LNP ou les traitements témoins seront administrés par injection intraveineuse (3x/ semaine). Le nombre prévu est 10 injections intraveineuses pour les groupes témoins (PBS, ARNm-LNP constructions contrôles) et un nombre maximal de 21 traitements ARNm-LNP pour les groupes traités par ARNm-LNP. Les animaux vigiles subiront un prélèvement sanguin dans la veine caudale (100 µl 1 fois par semaine) en contention. 5 prélèvements sanguins pour les groupes témoins et un nombre maximum de 9 pour les groupes traités ARNm-LNP seront ainsi réalisés.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales sera effectuée dans l'hémi-rate (MC38) ou la rate (AKTPF). Cette injection est réalisée au cours d'une intervention chirurgicale, ce qui constitue une contrainte importante, mais de courte durée. L'intervention chirurgicale peut être douloureuse pour les animaux ; elle est donc réalisée sous anesthésie gazeuse et les souris recevront des analgésiques avant, pendant et après l'intervention. Le développement de métastases hépatiques est une contrainte qui peut entraîner des douleurs ou une perte de poids. Après l'intervention chirurgicale, la peau du flanc droit est refermée à l'aide d'agrafes, ce qui peut causer une gêne aux animaux. Les agrafes seront retirées une fois l'incision cicatrisée (entre le 7e et le 10e jour après l'intervention). Les ARNm-LNP ou les traitements témoins seront injectés par voie intraveineuse (3 fois par semaine) sur animaux vigiles en contention, ce qui peut engendrer un stress et une douleur modérée de courte durée. Afin de mesurer la charge tumorale des cellules tumorales exprimant la luciférase (2 fois par semaine), les souris recevront une injection intrapéritonéale de luciférine. Ensuite, les souris seront anesthésiées à l'isoflurane et imagées par bioluminescence. Cette procédure peut entraîner une douleur et un stress modérés de courte durée. Pour le prélèvement sanguin dans la veine caudale (1 fois par semaine) réalisé sur animaux vigiles en contention, les animaux pourront ressentir un stress et une douleur modérée de courte durée. Pour induire l'expression transgénique de lignées cellulaires tumorales transduites in vitro (système d’expression inductible activable par ajout d’un antibiotique), les souris recevront l’antibiotique dans leur eau de boisson, ce qui peut générer un goût amer.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure ou lorsque les critères terminaux seront atteints. L'euthanasie est nécessaire pour prélever le foie et autres organes des animaux.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons modéliser les métastases hépatiques, mais également le ciblage de cellules spécifiques par les LNP. Le microenvironnement tumoral des métastases hépatiques est complexe et se compose d'une variété de cellules parenchymateuses ainsi que de cellules immunitaires résidentes et infiltrantes. Bien que des modèles in vitro avancés tels que les organoïdes puissent modéliser certains aspects des métastases hépatiques, la complexité des cellules impliquées et d'autres facteurs nécessite un modèle animal. En ce qui concerne le ciblage des LNP sur des types de cellules spécifiques, nous réaliserons des expériences in vitro initiales afin d'optimiser autant de facteurs que possible avant de passer aux expériences in vivo, afin d'éviter des expériences in vivo inutiles. Cependant, des expériences in vivo sont nécessaires pour évaluer la toxicité, la biodistribution et la spécificité des types de tissus et de cellules.

Réduction

Nous réalisons des expériences d'optimisation in vitro initiales afin d'identifier les constructions de protéines thérapeutiques et les formulations LNP les plus prometteuses avant de passer aux expériences in vivo. Avant l'évaluation expérimentale des traitements avec les candidats ARNm-LNP, nous réalisons des expériences de recherche de dose. Grâce à cette approche, nous pouvons éviter d'appliquer plusieurs doses dans les expériences d'évaluation expérimentale, ce qui participe à la réduction du nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris bénéficient d'une période d'adaptation au minimum de 7 jours après leur arrivée dans l'animalerie avant le début des expériences. Les animaux sont hébergés conformément aux normes requises par la réglementation, en groupes sociaux, dans un environnement approprié et enrichi. Les souris seront manipulées à l'aide de la méthode « cup handling » dans la mesure du possible. Les souris sont surveillées régulièrement par le personnel selon la fiche de score. Cela permet de détecter rapidement les signes de douleur ou de souffrance et de mettre en place les traitements appropriés (analgésique pré et post opératoire, traitement analgésique si signe de douleur, nourriture humide si perte de poids importante, administration de sérum physiologique si déshydratation, ponction de l’ascite si trop important). L’antibiotique est administré dans l'eau de boisson plutôt que par injection afin de réduire le stress et la douleur et pour atténuer générant son goût amer, du saccharose sera ajouté à l'eau. Dans les procédures impliquant des tumeurs, les cellules tumorales sont porteuses de luciférase afin de permettre le suivi in vivo de la charge métastatique hépatique par bioluminescence, ce qui permet d'acquérir des points de données sans avoir à euthanasier les animaux.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle très couramment utilisé pour étudier l'immunologie en raison de la grande similitude entre les systèmes immunitaires murin et humain. Malgré les différences entre les systèmes immunitaires des deux espèces, les souris ont été d'une aide précieuse pour de nombreuses découvertes qui ont pu être transposées à l'être humain. Les outils que nous utilisons, tels que les cellules murines MC38 et la génération de métastases hépatiques, sont très bien établis et caractérisés. Les souris seront utilisées dans les expériences entre 7 et 16 semaines. À cet âge, leur système immunitaire est pleinement développé.

1 400 poissons sauvages de treize espèces vont être capturés, anesthésiés trois à cinq minutes, incisés sur trois à cinq millimètres et maintenus hors de l'eau jusqu'à une minute, le temps qu'une puce leur soit implantée dans l'abdomen. Tous sont ensuite relâchés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet est de vérifier qu'une passe à poissons construite sur un grand fleuve fonctionne, donc de contrôler sur ces animaux un aménagement humain qui les a d'abord empêchés de circuler. Sept individus sur dix seront pêchés en amont puis transportés en aval avant d'être relâchés, pour ne retenir que des poissons enclins à migrer, et le porteur prévient que certains perdront leur puce dans les semaines qui suivent, sans qu'aucun calcul ne vienne étayer le chiffre de 1 400.

Objectifs

Suite à différents aménagements au niveau des fleuves et des cours d'eau plus petits, la migration des poissons n'est plus possible. Ainsi des "passes à poissons" sont mises en place pour aider le passage des poissons au niveau de ces ouvrages et ainsi permettre notamment leur reproduction. L'objectif de ce projet est de vérifier l'efficacité d'une "passe à poisson" en suivant le passage des individus au travers de celle-ci. Pour ce faire, un éventail des poissons représentatifs du cours d'eau correspondant est pêché par différentes techniques. Les caractéristiques des poissons sont rapportées (taille, poids, sexe) sous-anesthésie générale et une puce, dont la taille est adaptée aux mensurations du poisson est implantée dans la cavité abdominale par chirurgie. Le poisson est ensuite remis en eau sous surveillance avant d'être relâché. Le poisson portant la puce pourra être détecté s’il passe au travers de la passe à poissons, ce qui permettra de vérifier que l'aménagement réalisé est bien efficace pour permettre le passage des individus au travers de l'ouvrage.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de vérifier l’efficacité de la passe à poissons pour les espèces présentes. Il est indispensable de réaliser ce type de suivi biologique en milieu naturel pour vérifier s’il est nécessaire de réaliser des travaux d’amélioration de la passe à poissons, pour que les poissons puissent librement circuler.

Procédures

Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale de 3 à 5 mm sera réalisée et une puce électronique sera implantée manuellement sur 1400 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, le transport, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress modéré sur les animaux. Il existe également un risque de douleur légère post-anesthésie suite à l’incision.

Devenir

Tous les individus seront replacés dans leur habitat naturel

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement d’un aménagement (ici une passe à poissons) doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées.

Réduction

L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire les comportements des poissons par espèce et par stade, et évaluer la franchissabilité de la passe à poissons. Il est adapté au gabarit du milieu (grand fleuve) et à la diversité spécifique et la densité de population. L’effectif tient compte de plusieurs facteurs, pour garantir un certain nombre de détections : - L’implantation des puces ne génère en principe pas ou très peu de mortalité post-opératoire en respectant les préconisations de tailles minimales. Toutefois, certains individus peuvent perdre leur puce dans les semaines suivant l'implantation. - Certaines femelles peuvent également expulser la puce lors de la reproduction. Tous les individus d'une même espèce ne vont pas forcément migrer. Les individus pêchés en amont de la passe à poissons (70%), seront transportés en aval de la passe, où ils seront pucés puis relâchés, de manière à privilégier l'étude sur des individus enclins à migrer et in fine réduire le nombre d'individus marqués. Les analyses porteront sur le nombre et le pourcentage de franchissement de la passe à poissons par espèce marquée.

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. L’eau des bacs dans lesquels seront conservés les poissons le temps des différentes opérations fera l’objet d’attention pour le suivi de sa température et de son niveau d’oxygénation. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac d’eau de rivière oxygénée et refroidie. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. La solution d'anesthésie sera renouvelée toutes les 20 minutes, pour éviter que la température du bain augmente et permettre qu’elle soit toujours suffisamment fraiche pour ne pas stresser les poissons. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures (taille, poids) et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie, sachant que les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. La taille des puces sera adaptée à la taille de l’animal. Un chiffon humide sera placé sur la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus (couche protectrice recouvrant les écailles des poissons). Seuls les individus jugés visuellement en bonne santé seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un vivier placé dans la rivière. L’application des mesures prises (retrait du poisson de l’expérimentation, mise en surveillance, mise à mort) en cas d’apparition de points-limites rigoureusement définis à l’avance (exemples : changement de position de l’animal dans l’eau, respiration irrégulière,…) limitera les risques de douleur tout au long de la procédure.

Choix des espèces

13 espèces de poissons sont ciblées car elles sont représentatives du fleuve et de la zone concernée : - Poissons d’eau courante : barbeau fluviatile, hotu, chevaine - Poissons d’eau calme : brème, gardon, spirlin, ablette - Carnassiers : Brochet, silure, perche - Migrateurs : alose, mulet porc, anguille 1 stade de développement est retenu pour la plupart des espèces (subadultes-adultes), excepté pour l’anguille dont la migration vers l’amont des cours d’eau s’effectue au stade juvénile. Les subadultes-adultes seront prioritairement marqués, la configuration de la passe étant inadaptée à la franchissabilité par les juvéniles (vitesse de courant d’attrait trop élevée). Les adultes migrent généralement avant ou après leur reproduction. Seules les anguilles juvéniles seront marquées du fait de leur écologie (montaison au stade juvénile).

Les souris utilisées portent une mutation déclenchée par gavage, sur une lignée déjà détenue par l'établissement. 2 496 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un perturbateur endocrinien par voie orale, puis deux injections sous anesthésie leur déclenchent une thyroïdite ou une myasthénie auto-immune, avant cinq prises de sang sur animal éveillé, cinq tests cliniques et une évaluation de la fonction musculaire. Le porteur indique que le gavage répété peut blesser l'œsophage et faire perdre du poids, et que ces modèles entraînent une perte de mobilité, les tissus étant prélevés après la mise à mort pour des analyses biochimiques et histologiques.

Objectifs

Dans les pays développés, les maladies auto-immunes touchent 5 à 10 pour cent de la population et représentent la troisième cause de morbidité. Elles sont dues à une déregulation du système immunitaire, qui ne discrimine plus le soi du non soi. L'exposition (via alimentation, air, eau) à des perturbateurs endocriniens s'accroit. Ce projet a pour but de comprendre le rôle joué par ces molécules dans le développement de pathologies auto-immunes. Ce projet va décrypter, au sein du thymus, les modulations cellulaires et moléculaires induites par ces molécules qui participeraient à altérer la tolérance immunitaire au soi et au développement de pathologies auto-immunes.

Bénéfices attendus

Les maladies auto immunes telle que la myasthénie sont des maladies chroniques invalidantes. Les causes de développement de ces pathologies demeurent inconnues. Dans ce projet, nous souhaitons démontrer qu’un facteur de l’environnement peut induire des perturbations au niveau de la mise en place de la tolérance immunitaire et par conséquence serait à l’origine de dysfonctionnement thymique conduisant au développement d'une pathologie auto-immune. Aussi, la compréhension des mécanismes étiologiques est donc importante pour proposer des mesures de prévention et adapter les traitements des personnes affectées par une pathologie auto-immune.

Procédures

Des animaux seront soumis à une induction de la mutation génique par voie orale (3 fois, 1 minute sur 5 jours). Des animaux seront exposés à l’état vigile au perturbateur endocrinien ou une solution contrôle par voie orale (1 fois, 1 minute). Les animaux seront soumis à une induction de la pathologie par des injections sur animal anesthésié (2 fois par animal sur 21 à 30 jours, 10-15 minutes pour les injections). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile (5 fois pendant le projet, moins d’une minute). Les tests cliniques de suivi des pathologies seront réalisés sur animal vigile (5 fois -15 minutes). L’évaluation de la fonction musculaire se fera sur animal anesthésié (1 fois-15 minutes)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : Premièrement, pour le gavage, a- une possible douleur au niveau de l’œsophage due à l’insertion répétée de la sonde dans le système digestif. b- Une perte de poids pour les animaux recevant le perturbateur endocrinien. Deuxièmement : Les animaux incluent dans le modèle de pathologie auto-immune pourraient subir a-Un risque d’hypothermie ou de détresse respiratoire suite à l’anesthésie générale pour l’immunisation. b-sensation d’irritation ou la gêne induite par le produit immunisant. c-un risque de douleur et un inconfort post-immunisation. d-Un stress lié à l’analyse comportementale et une perte de mobilité inhérente aux modèles. Troisièmement : une légère et brève douleur lors du prélèvement sanguin et une perte de sang ainsi qu’un stress lors des manipulations nécessitant une contention des animaux.

Devenir

A l’issue de l’expérience, les animaux sont euthanasiés par une euthanasie réglementaire et les tissus d’intérêt seront prélevés pour des analyses biochimiques, histologiques et moléculaires.

Remplacement

Des etudes, au préalable, sur des modèles cellulaires ont été ménées. Nous souhaitons valider nos observations avec des modèles in vivo, afin de démontrer l’impact d’une exposition aux molécules identifiées comme perturbateurs endocriniens sur la physiologie thymique et les conséquences sur la susceptibilité au développement de pathologie auto-immunes.

Réduction

Le nombre total d'animaux dans ce projet est 2496. Pour chaque procédure 1248 animaux seront utilisés pour permettre une analyse statistique des données tout en utilisant le minimum d'animaux. Le nombre de souris par condition expérimentale est déterminé pour permettre une bonne analyse statistique des données tout en utilisant le minimum d'animaux. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous analyserons les variances et différences entre les groupes testés.

Raffinement

Les animaux obtenus par le fournisseur agrée observeront une période d’acclimatation/adaptation de 7 jours. Tous les animaux sont hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (cotons, tunnel en carton, bâton en bois) et un accès à l’alimentation et un abreuvement à volonté. Une litière en aoute pour limiter l’inconfort des animaux au niveau des coussinets plantaires. Lorsqu'il y a apparition de signe clinique de la maladie, de la nourriture humidifiée est mise dans la cage pour éviter aux souris, si elles sont faibles, d'aller chercher la nourriture en hauteur. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie et d'une analgésie pré et post immunisation. Les souris sont surveillées quotidiennement par les animaliers. Les souris sont pesées 2 à 3 fois par semaine et regardées attentivement par la personne menant le projet. Les points limites ont été préalablement définis pour limiter la contrainte et permettre une prise de décision rapide en cas de nécessité.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle murin car il est bien caractérisé pour les maladies auto-immunes. Il permet d’étudier dans un organisme global, les effets de composés sur les différentes populations cellulaires immunes et leur interaction et conséquence sur la physiologie globale de manière fiable. Ces observations sur organisme entier ne sont pas possibles sur des modèles in vitro ou ex vivo. De plus, une lignée murine pour le gène d’intérêt est disponible à l'établissement. Les modèles de thyroïdite et myasthénie auto-immune sont maitrisés par l’équipe et reconnus par la communauté scientifique. Ces modèles sont comparables sur certains points avec la pathologie humaine. Les expériences seront effectuées sur des souris ayant 4 à 7 semaines et 10 à 12 semaines au début de l’expérience ce qui correspond à l’adolescence et au stade adulte, périodes d’apparition des maladies auto-immunes chez l’homme.