Oncologie

Une biopsie de la queue, quatre prélèvements sanguins et jusqu'à sept injections par animal, puis un diabète déclenché par une molécule synthétique : 3 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les manipulations commencent dès l'âge de dix jours, et les animaux qui présentent déjà des signes de la maladie sont mis à mort. L'objectif déclaré est une thérapie cellulaire, des cellules injectées venant compenser un défaut immunitaire. La maladie n'est nommée nulle part dans la description, réduite à "la maladie métabolique d'intérêt", pas davantage que les cellules thérapeutiques ou la molécule qui déclenche l'hyperglycémie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer une thérapie cellulaire contre contre le diabète, une maladie métabolique pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitement permettant une guérison des patients. Le développement d’une thérapie pour cette maladie est important car elle est de plus en plus fréquente, en particulier chez les enfants, et affecte très négativement la qualité de vie des individus atteints. Il a été montré que certaines cellules fonctionnaient de manière anormale dans cette maladie. Il est donc possible que l’injection de cellules compensant pour ces défauts puissent guérir cette maladie. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris développant cette maladie pour mieux caractériser les mécanismes impliqués dans cette maladie, et pour développer une thérapie cellulaire. Les résultats obtenus doivent permettent de développer une thérapie cellulaire pour cette maladie chez l’humain.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est le développement d'une thérapie cellulaire pour la maladie métabolique d'intérêt.

Procédures

Identification d'un animal : 1 fois ~10 secondes et 1 fois ~5 secondes. Prélèvement sanguin : 4 fois ~15 secondes. Anesthésie (lors de la mise à mort): 1 fois ~15 minutes. Injections de deux types: répétées (7 fois) ~10 secondes/injection ou 1 fois ~45 secondes. Ces interventions se font sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Injection intra-péritonéale = douleur légère, de courte durée et localisée. Injection intra-veineuse = douleur légère, de courte durée et localisée. Contention dans un tube adapté à la taille de la souris pouvant induire un léger stress de manière transitoire. Prélèvement sanguin = douleur légère, de courte durée et localisée. Biopsie caudale = douleur modérée, de courte durée et localisée. Identification = douleur légère, de courte durée et localisée. Nuisance liée au modèle : développement du diabète immuno-dépendant: hyperglycémie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecte des tissus d'intérêt.

Remplacement

Pour étudier la physiopathologie du de la maladie métabolique d'intérêt, seuls les modèles souris sont capables de refléter la complexité de la maladie et notamment les interactions entre les cellules circulant dans le sang et l'organe métabolique cible. Une veille bibliographique sera mise en place pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques. Les molécules qui seront utilisées pour produire les cellules thérapeutiques ont été soumises à de nombreux tests pour sélectionner les plus prometteuses. Le protocole de production de ces cellules thérapeutiques a été optimisé.

Réduction

Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Des approches sophistiquées d’analyse ont été établies pour réduire le nombre d’animaux à utiliser pour obtenir un maximum d’information. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Le protocole d'induction de la maladie métabolique été raffiné et permet de ne pas utiliser d'immunisation mais seulement une injection de molécule synthétique afin de réduire la souffrance des souris. Dans ce projet, ce protocole sera raffiné davantage pour minimiser la dose de molécule synthétique à injecter. L’induction simultanée de la maladie chez les animaux permet un suivi plus précis des animaux en cours de procédure et permet une détection précoce pour éviter toute souffrance. Nous avons établi pour chaque procédure des points limites qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés par groupe de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés dans leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés tous les jours par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal, et les expérimentateurs.

Choix des espèces

La souris est le plus petit mammifère permettant d’étudier le développement de la maladie métabolique d’intérêt. C’est également l’espèce dont la connaissance génétique approfondie permet les modifications nécessaires à la création d’un modèle présentant des caractéristiques biologiques proches de celles de l’humain. Ce modèle expérimental permet de tester une approche thérapeutique pouvant être rapidement appliquée chez l’Homme. Par ailleurs, la large gamme d’outils disponibles pour analyser précisément les réponses observées fait de la souris l’espèce la plus appropriée pour ces recherches. Les animaux sont utilisés à partir de l’âge de dix jours pour réaliser les gestes d’identification ainsi que les prélèvements nécessaires à certaines analyses. À partir de quatre semaines, un prélèvement sanguin est effectué afin de confirmer les caractéristiques génétiques des individus. Cet âge est choisi pour garantir que les animaux aient une taille suffisante et que ces manipulations puissent être réalisées sans compromettre leur bien-être. Entre sept et quatorze semaines, les souris peuvent recevoir un traitement destiné à induire la maladie étudiée, période correspondant à une phase de maturité adaptée à l’analyse des mécanismes impliqués. Les animaux présentant déjà des signes de la maladie seront mis à mort.

Une échographie par semaine sous anesthésie, deux IRM d'une heure chacune, une imagerie optique et un prélèvement sanguin hebdomadaires : 3 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales pancréatiques leur sont injectées sous la peau ou implantées chirurgicalement dans le pancréas, avant les chimiothérapies hebdomadaires et les produits de thérapie génique. Le porteur décrit une douleur liée à la croissance tumorale qui apparaît dans les 12 à 48 heures après l'implantation puis s'intensifie, avec une perte de poids pouvant atteindre 20 %. Le choix se porte sur des lignées immunodéficientes permettant la greffe de tumeurs humaines, que le porteur présente comme des approches de référence en préclinique.

Objectifs

Le cancer du pancréas (adénocarcinome canalaire) représente la troisième cause de mortalité par cancer dans les pays occidentaux. Son pronostic reste très défavorable, en raison de l'absence de biomarqueurs permettant un diagnostic précoce et du manque d'alternatives thérapeutiques efficaces lorsque la chirurgie curative n’est pas possible. Les chimiothérapies actuelles n’offrent qu’un bénéfice limité en termes de survie, et les thérapies ciblées ou immunothérapies n’ont pas encore démontré d’impact clinique significatif. Dans ce contexte, notre équipe mène depuis plusieurs années des recherches fondamentales et translationnelles, avec pour objectifs de mieux comprendre les mécanismes d’initiation de la maladie, d’identifier les patients à risque ou porteurs de lésions précoces, de surmonter la résistance aux traitements et de développer des stratégies thérapeutiques personnalisées.

Bénéfices attendus

Notre recherche vise à mieux comprendre le cancer du pancréas afin de développer des traitements plus efficaces et mieux adaptés à chaque patient. Nous étudions les mécanismes à l’origine du développement de la tumeur et de sa résistance aux traitements, en particulier le rôle des gènes, des protéines et de leurs interactions. Nous nous intéressons également à de nouvelles approches thérapeutiques, comme l’utilisation de virus capables de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses, ainsi qu’au développement de tests de diagnostic non invasifs à partir de biomarqueurs présents dans le sang. L’objectif est de transformer ces découvertes en solutions thérapeutiques innovantes et personnalisées, avec l’espoir d’améliorer à terme la prise en charge des patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

Sur la période considérée, les souris recevront une injection sous-cutanée de cellules tumorales pancréatiques. D’autres feront l’objet d’une implantation de cellules tumorales directement dans le pancréas, réalisée par voie chirurgicale. La transplantation sera réalisée en une seule intervention par animal, sous anesthésie générale, pour une durée d’environ 15 à 20 minutes. Un traitement antidouleur adapté sera administré afin de prévenir et de réduire toute douleur après l’opération. Les chimiothérapies seront administrées une fois par semaine, pour une durée maximale de trois semaines, par voie intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée, en fonction des propriétés de la molécule testée. Les produits de thérapie génique seront administrés soit directement au niveau de la tumeur, soit par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, en fonction du type de vecteur utilisé et des objectifs de l’étude. Lorsque nécessaire pour garantir la précision du geste et le bien-être des animaux, les administrations seront réalisées sous anesthésie et en présence d’antalgique. Dans certains cas, des prélèvements sanguins pourront être réalisés chez des animaux vigiles au cours du développement tumoral. Ces prélèvements servent à détecter des signes précoces de la maladie, à mieux comprendre la progression du cancer et à suivre l’efficacité de traitements expérimentaux. Ils seront limités à un seul prélèvement avant l’apparition de la tumeur, puis à une fréquence maximale d’un prélèvement hebdomadaire pendant la durée de l’expérimentation. Un suivi régulier de la croissance tumorale sera assuré par imagerie non invasive. Des échographies seront réalisées une fois par semaine sous anesthésie générale légère. Des examens d’imagerie par résonance magnétique (IRM) seront effectués sous anesthésie générale à deux reprises : avant administration du traitement puis 1 à 2 semaines après. Chaque examen d’IRM durera environ une heure. Un suivi complémentaire par imagerie optique (environ 5 minutes) pourra également être réalisé avant traitement puis hebdomadairement. L’ensemble des animaux fera l’objet d’une surveillance clinique régulière incluant l’évaluation de l’état général, du poids et de la taille tumorale. Des points limites prédéfinis seront appliqués afin d’éviter toute souffrance inutile, et les animaux atteignant ces critères seront retirés de l’étude et euthanasiés selon des méthodes réglementaires.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales peuvent entraîner une altération de l’état général des animaux, se traduisant par des modifications comportementales (diminution ou augmentation de l’activité, agitation, agressivité, léchage excessif, automutilation), observables généralement dans les 24 à 72 heures suivant l’intervention ou l’administration expérimentale et pouvant persister de quelques heures à plusieurs jours selon la sévérité de l’atteinte et la réponse individuelle. Des changements de l’aspect physique (perte de poids atteignant 20 %, pilo-érection, variations de la température cutanée), peuvent apparaître de manière progressive entre 48 heures et plusieurs jours après le début de la procédure et se maintenir pendant plusieurs jours à une à deux semaines selon l’évolution clinique et la prise en charge mise en place. Des troubles moteurs peuvent survenir dans un délai de 24 à 96 heures selon la nature du protocole et durer de quelques heures à plusieurs jours. Des douleurs liées à l’implantation et à la croissance des tumeurs peuvent apparaître précocement dans les 12 à 48 heures suivant l’implantation, puis s’intensifier progressivement au cours des jours ou semaines suivants en fonction du développement tumoral. Par ailleurs, l’IRM est susceptible d’induire des effets indésirables indirects liés au stress et à la contention, ainsi qu’à l’anesthésie nécessaire à l’examen (hypothermie transitoire, dépression respiratoire, retard au réveil), ces effets étant généralement de courte durée et réversibles en quelques heures après la fin de l’examen. Des effets liés de manière plus générale au stress (anxiété, agitation), à l’anesthésie (hypothermie, dépression respiratoire, retard au réveil) et aux injections (douleur, réactions locales, inconfort transitoire) peuvent également contribuer à l’altération de l’état général des animaux, avec une durée habituellement limitée à quelques minutes à quelques heures pour les réactions aiguës, et jusqu’à 24 à 48 heures pour certaines réactions locales ou effets résiduels de l’anesthésie.

Devenir

La mise à mort des animaux en fin de procédure est indispensable afin de permettre des analyses comparatives post-mortem nécessaires à l’identification et à la compréhension des mécanismes antitumoraux mis en jeu. À l’issue de la procédure, des prélèvements biologiques multiples seront réalisés afin de maximiser les données obtenues à partir de chaque animal et de limiter le recours à de nouveaux animaux, conformément au principe de réduction. Les organes et tissus prélevés seront soit fixés, soit congelés. Les tissus fixés permettront la réalisation d’analyses histologiques et histochimiques destinées à évaluer l’architecture tissulaire, l’évolution tumorale et l’impact des traitements au niveau cellulaire. Les tissus congelés seront utilisés pour des analyses biochimiques, notamment l’étude de l’expression et de l’activation de protéines d’intérêt impliquées dans les voies antitumorales. Des prélèvements seront également effectués pour l’extraction d’ARN afin d’analyser les niveaux d’expression des gènes d’intérêt et de caractériser les mécanismes moléculaires modulés par les traitements. Des prélèvements sanguins seront réalisés et congelés afin de permettre l’analyse de paramètres circulants et de biomarqueurs reflétant la réponse systémique des animaux. L’ensemble des échantillons sera stocké et répertorié dans une base de données interne à l’équipe, assurant leur traçabilité et leur utilisation dans le cadre des analyses prévues par le projet.

Remplacement

Notre projet sur le cancer du pancréas utilise en priorité des modèles cellulaires et des organoïdes afin de limiter le recours aux animaux. Les cellules tumorales cultivées en laboratoire sont utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires, identifier des biomarqueurs et tester de premières stratégies thérapeutiques. Les organoïdes, qui sont des structures tridimensionnelles dérivées de tumeurs, reproduisent mieux certaines caractéristiques des tumeurs humaines, notamment leur organisation et leur hétérogénéité. Ils permettent d’évaluer plus finement l’efficacité de traitements dans un système proche de la réalité biologique. Ces approches in vitro sont systématiquement utilisées pour sélectionner et valider les hypothèses avant toute expérimentation animale. Toutefois, certaines questions, comme l’étude des interactions avec le système immunitaire, la dissémination métastatique ou les effets globaux d’un traitement sur l’organisme, nécessitent l’utilisation de modèles murins. Notre recours à l'expérimentation animale est limitée aux situations où les modèles cellulaires et les organoïdes ne permettent pas de répondre à nos objectifs scientifiques.

Réduction

La taille des groupes de souris est déterminée à partir de nos données antérieures, de la littérature utilisant des modèles tumoraux comparables et d’une estimation statistique préalable. Celle-ci indique qu’un minimum de 6 à 8 animaux analysables par groupe est nécessaire pour détecter une différence biologiquement pertinente dans la progression tumorale. Afin de tenir compte de la variabilité inter-individuelle, de l’hétérogénéité de la prise de greffe, ainsi que d’éventuels décès ou arrêts anticipés pour raisons éthiques, un effectif majoré d’environ 10 % est prévu. Ainsi, 10 souris par groupe recevront une greffe tumorale expérimentale, permettant d’obtenir in fine 6 à 8 individus analysables sans devoir répéter l’étude. Ce dimensionnement garantit la robustesse statistique des résultats tout en respectant le principe de Réduction des 3R. Au cours de l’expérimentation, un maximum de mesures fonctionnelles et de paramètres biologiques sera réalisé de manière longitudinale et non invasive, sans compromettre la finalité scientifique. Les effets et paliers de douleur liés à l’évolution de la pathologie seront pris en compte, avec application stricte des critères d’arrêt et des mesures de bien-être animal. L’enrichissement de l’environnement et le maintien en groupes sociaux seront assurés tout au long de l’étude.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux sont hébergés en salle d’acclimatation et bénéficient d’un examen clinique réalisé par un personnel compétent afin d’évaluer leur état général. Leur bien-être est ensuite surveillé quotidiennement tout au long de l’étude à l’aide d’une grille d’observation spécifique, sous la responsabilité de la structure en charge du bien-être animal. Les actes susceptibles d’induire une douleur (interventions chirurgicales, prélèvements, injections intratumorales) sont effectués par des opérateurs qualifiés, avec une gestion appropriée de la douleur et un suivi post-opératoire rigoureux. L’étude est interrompue lorsque les critères d’arrêt prédéfinis sont atteints, notamment en cas de volume tumoral excessif ou de signes de détresse, après avis du vétérinaire référent. Les déplacements entre les zones d’hébergement et les espaces expérimentaux sont organisés de manière à préserver la santé et le confort des animaux. Des mesures d’accompagnement, telles que l’analgésie ou un accès facilité à la nourriture, sont mises en œuvre si nécessaire. Toute manifestation de souffrance est évaluée par le responsable du projet en concertation avec le vétérinaire référent et peut conduire, le cas échéant, à une interruption anticipée de l’expérimentation, conformément aux points limites définis dans le protocole et précisés dans la grille de scoring associée.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent pour ce projet, en particulier les lignées immunodéficientes permettant les allo- et xénogreffes, qui sont des approches de référence en préclinique oncologique. Ces modèles reproduisent de manière fiable des aspects essentiels de la pathologie humaine et offrent une transposabilité pertinente vers la clinique. De plus, les protocoles expérimentaux sont bien établis, standardisés et partagés, ce qui assure la robustesse des résultats et permet de limiter le nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R. Les animaux pourront être mis à l'étude à partir de 6 à 8 semaines d'âge car ils bénéficient d'un système immunitaire et métabolique matures. Ils seront donc commandés à l'âge de 5 semaines pour prendre en compte la phase d'acclimatation.

Toutes tuées pour prélever leurs organes, 800 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit l'ablation de l'extrémité de la queue pour établir son génotype, puis une injection quotidienne pendant sept jours. Le porteur indique que les souris de plus de 90 jours développent des signes de douleur et choisit pour cette raison d'étudier les stades qui précèdent, à 30, 60 et 90 jours, quand l'atteinte s'installe sans encore se voir. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires ne reconstituent pas la diversité des neurones moteurs et des fibres musculaires associées.

Objectifs

Le système neuromusculaire permet de respirer, marcher, manger, sourire. Les muscles squelettiques et les neurones associés s’atrophient au cours du vieillissement, lors d’hospitalisation prolongée, au cours du cancer, et dans nombreuses myopathies d’origine génétique. Dans ce dernier cas les interactions entre les neurones et les fibres musculaires se détériorent conduisant à des défauts de contraction des myofibres. Différents modèles de souris génétiquement modifiées permettent de mieux comprendre les propriétés des différents types de fibres musculaires et de neurones et de leur environnement, et du dialogue entre les neurones et les fibres musculaires. L’objectif principal de cette étude sera de caractériser les interactions nerf-fibres musculaires, d’identifier les mécanismes mis en jeu dans le maintien de l’axe neuromusculaire.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les bases du système neuromusculaire, et d’en comprendre ses atteintes est un enjeu majeur. Cette étude sur la vulnérabilité neuromusculaire devrait aussi permettre de mieux comprendre les bases moléculaires qui contrôlent la formation de l’appareil neuromusculaire, en fonction des muscles étudiés. En effet mieux comprendre les interactions entre neurones et fibres musculaires dans le but de caractériser, grâce à des approches techniques innovantes, de nouveaux gènes qui contrôlent son intégrité est essentiel pour un jour permettre de guérir les malades atteints de défauts nuromusculaires. En conclusion, les études menées amélioreront nos connaissances sur les propriétés de l’axe neuromusculaire, en prenant en compte les neurones, et la fibre musculaire.

Procédures

Sur animaux vigiles : le prélèvement unique d'une biopsie de l'extrémité de la queue pour génotypage (5 secondes). L'injection quotidienne sur 7 jours, durée de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une douleur légère et de courte durée est occasionnée lors de la biopsie de l’extrémité de la queue des animaux en vue de leur génotypage. Une douleur passagère et de courte durée est occasionnée lors des contentions et injection en IP, geste qui dure 30 secondes. Avant 90 jours, les douleurs observées chez les souris sont souvent discrètes et difficiles à évaluer objectivement. À ce stade, l’atteinte motrice initiale peut s’accompagner de légers inconforts musculaires, mais la douleur n’est pas un symptôme majeur ou invalidant.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour des analyses.

Remplacement

Le modèle de souris mime les interactions entre neurones et muscles chez l'homme, et renseigne de manière unique sur le dialogue et les les propriétés de l'interaction nerf-muscle. Les modèles cellulaires ne permettent pas à ce jour de comprendre la diversité de ce dialogue et ne permettent pas de reconstituer la diversité des types de neurones moteurs permettant le mouvement et des fibres musculaires associées.

Réduction

Nous prélèverons le maximum de tissus sur les animaux mis à mort, pour éviter l’utilisation ultérieure de nouveaux lots d’animaux. Les effectifs sont déterminés et les résultas analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Le milieu est enrichi d’une roue d’activité. Les animaux sont surveillés 2 fois par semaine par le porteur du projet. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les animaux de plus de 90 jours développent des signes de douleur, aussi nous nous intéresserons aux stades de dévelopement qui précèdent P90, stades asymptomatiques avant que les animaux développent des signes de douleur. Cette période est instructive car c’est pendant cette période que se met en place progressivement un phénotype. Néannmoins si nous observons des signes de souffrance chez les animaux avant ce stade P90, les animaux recevront une analgésie pendant 48h. Des points limites ont été définis, et en absence d'amélioration les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les muscles et les nerfs moteurs humains sont bien conservés chez la souris, qui est de ce fait un bon modèle. Le modèle de souris permet d’accéder à tous les acteurs qui contrôlent la formation des muscles et des nerfs moteurs associés, sa diversité et sa physiopathologie. Les souris à 30 jours (1 mois), 60 jours (2 mois) et 90 jours (3 mois) sont utilisés pour mieux comprendre le dialogue entre les différents muscles et leurs nerfs moteurs associés.

Neuf tests comportementaux répartis sur deux semaines, deux gavages de glucose, une injection d'insuline, dix-neuf prélèvements de sang et un jeûne pouvant aller jusqu'à seize heures sont infligés à 96 souris génétiquement modifiées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever cerveau, pancréas, foie, intestin et contenu du cæcum. L'étude cherche à établir si le fond génétique modifie la réponse des souris au fructose, étape que le porteur présente comme préalable à une future étude sur les mécanismes d'action. Les neuf tests censés mesurer l'anxiété, l'humeur dépressive et la mémoire ne sont pas nommés.

Objectifs

La consommation de fructose a fortement augmenté au cours des dernières décennies, notamment par le biais des produits alimentaires ultratransformés et par les boissons sucrées. Plusieurs études ont montré l’impact négatif de cette surconsommation sur la santé (obésité, diabète de type 2, etc.), troubles de l’humeur (anxiété, dépression). On ne sait pas comment le fructose provoque ces effets néfastes. Dans l’intestin grêle, il est peu absorbé par rapport au glucose. Son excès provoque sa présence en quantités anormales dans le gros intestin et y altère la flore bactérienne. Ce phénomène est amplifié chez près de la moitié de la population qui présente des problèmes d’absorption intestinale du fructose, pathologie encore mal diagnostiquée. Des travaux préliminaires sur la souris montrent que les cellules immunitaires du cerveau sont activées par l’excès de fructose indiquant un état inflammatoire néfaste à long terme. De plus, des tests de comportement révèlent un état dépressif de ces animaux. Mais on ne sait pas si le fructose agit directement sur le cerveau ou/et si ses effets sont la conséquence d’un dysfonctionnement intestinal ou sanguin. Cette étude va nous permettre de déterminer si les différences génétiques ont un impact sur les effets du fructose chez la souris.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’évaluer dans quelle mesure le fond génétique des souris et leurs conditions d’hébergement influencent leur réponse au fructose, tant sur le plan comportemental que physiologique. Ces données sont cruciales pour mettre en place une étude sur les mécanismes d’action du fructose.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des tests de comportement durant 5 à 20 minutes pour permettre d’analyser des comportements émotionnels et de mémoire : 4 tests différents répartis sur 4 jours une semaine (jour de repos le mercredi) et 5 tests différents répartis sur 5 jours une autre semaine. Trois semaines sépareront les 2 semaines de tests. Au cours du protocole expérimental, les animaux vigiles seront soumis à 2 reprises à un test de tolérance au glucose et une fois à un test de résistance à l’insuline. Ils recevront au total 2 gavages de glucose et 1 injection d’insuline pour un suivi de la glycémie pendant 2 heures (glycémie mesurée à 7 et 5 temps différents par prélèvement d’une goutte de sang d’une durée inférieure à 10 secondes, soit un total de 19 prélèvements). Les gavages et injections ne durent qu’une dizaine de secondes, maximum 20 secondes. Les animaux seront mis à jeun 16 heures maximum une fois, et 6h deux fois, une fois 4h, puis 2h en fin de protocole. Un prélèvement sanguin sera effectué une fois, d’une durée d’environ 20 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress sur des temps très courts au cours de la contention nécessaire lors des gavages et des prélèvements (moins de 20 secondes). Les animaux seront soumis à un stress durant les tests de comportement (10 minutes maximum). Les animaux seront soumis à une légère douleur lors des prélèvements sanguins. Les souris seront soumises à des périodes de jeûne (16 heures, 6 heures et 4 heures) ce qui n’entraine qu’une diminution modérée de la glycémie et aucune hypoglycémie.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever et analyser certains tissus (cerveau, pancréas, foie, intestin et contenu de caecum).

Remplacement

L’étude des comportements de type anxieux et dépressif, des performances cognitives ne peut être faite que sur des animaux vivants, tout comme l’étude des effets physiologiques d’un changement de consommation alimentaire. Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant les remplacer. Enfin, les analyses tissulaires doivent être réalisées sur des organes entiers qui tiennent compte de l’anatomie réelle qui existe chez les individus, en particulier le cerveau constitué d’un réseau de voies nerveuses encore impossible à reproduire.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. D’après de précédentes études, 12 animaux par groupe expérimental semblent nécessaires pour obtenir des résultats rigoureux suite aux tests comportementaux.

Raffinement

Pour réduire au maximum le stress des animaux, une semaine avant le début du protocole, ils seront habitués à être pris de leur cage au moyen d’un tunnel en plastique et à être manipulés pour les gestes de contention. Un suivi visuel quotidien des animaux sera opéré et leur poids sera mesuré 1 fois par semaine. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués pour limiter au mieux la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris, qui est un mammifère comme l’Homme. Les tests de glycémie et de comportement sont bien connus chez ces rongeurs et nous pourrons comparer nos résultats à ceux d’études antérieures. Elles seront étudiées à l’âge adulte (10 semaines) pour reproduire la malabsorption intestinale du fructose observée chez l’Homme lorsque la flore intestinale est mature et évaluer leur santé mentale. Nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés qui seront nécessaires pour la poursuite de notre projet, où le transporteur au fructose sera invalidé spécifiquement dans le cerveau ou l’intestin afin de déterminer si l’effet du fructose est du à son action directe au niveau du cerveau ou à sa malabsorption au niveau intestinal.

Plus petites, dotées d'un cerveau plus petit, les souris double mutantes de ce projet peinent à se déplacer et à communiquer avec le reste de la portée, et leur mortalité augmente vers trois semaines de vie. 942 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le cerveau, à des stades allant de l'embryon à vingt jours de vie. Le porteur écrit pourtant qu'elles "ne subiront aucune procédure expérimentale". Tout animal délaissé par sa mère ou sans poche à lait visible pendant vingt-quatre heures est tué, et les collectes s'arrêtent à vingt jours pour devancer la mortalité.

Objectifs

Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Des mutations dans de nombreux gènes ont été identifiées chez des patients avec des troubles du neurodéveloppement. Notre objectif est de comprendre le rôle de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques associés à ces maladies. Plusieurs patients avec des troubles du neurodéveloppement présentent une mutation dans le gène d’intérêt. La protéine issue de ce gène (gène 1) forme un complexe avec une autre protéine (encodée par le gène 2). Ce complexe est indispensable au décodage de certains gènes. Notre collaboration avec des généticiens et d’autres équipes de recherche a permis de mettre en avant l’importance du gène d’étude dans le développement du cerveau. La technique utilisée lors de ces précedentes études nous a permis de moduler l’expression dans une partie des cellules de cortex (environ 1%) et de visualiser un défaut de migration. Nous souhaitons à présent moduler cette expression dans toutes les cellules du cortex pour comprendre les mécanismes impliqués dans les troubles du neurodeveloppement. Afin d’avoir toute la population de cellules du cortex à analyser (et non 1% comme les expériences précédentes), nous avons étudié des souris cKO (Knock-Out conditionnel, c’est-à-dire que le gène d’intérêt est absent uniquement dans le cortex des souris) soit pour le gène 1 soit pour le gène 2. Ces souris ne présentent aucune anomalie au niveau du cerveau. Nous souhaitons à présent étudier les souris cKO pour les deux gènes du complexe (perte de l’expression des gènes 1 et 2 simultanément), ici encore en limitant l’excision des gènes au cortex cérébral des souris. Cette étude permettra de comprendre par quels mécanismes moléculaires le complexe influe sur le développement du cortex.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de comprendre la fonction du complexe étudié dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquels sa déplétion conduit à des troubles du neurodéveloppement, plus précisément au niveau moléculaire.

Procédures

Ils ne subiront aucune procédure expérimentale.

Impact sur les animaux

Les animaux mutants sont plus petits et ont un cerveau plus petit. Ils pourront avoir du mal à se déplacer et à communiquer avec le reste de la portée, notamment dans le cas des études post-natales. Vers 3 semaines après la naissance, les animaux présentent une mortalité qui semble augmentée d’après nos premières données préliminaires. Dans ce projet, nous n’étudions pas les animaux agès de plus de 3 semaines.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet afin de prélever les cerveaux et de réaliser les analyses sur ceux-ci.

Remplacement

L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex cérébral en développement qui ne peut pas totalement être recréé par des approches in vitro. Nous incluons d’ailleurs dans cette étude des méthodes de culture cellulaire, mais qui nécessitent tout de même des embryons « donneurs ». Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération de gènes sur le développement embryonnaire cortical.

Réduction

Notre projet est composé de trois études dont la première a pour but de déterminer les stades clés pour les études suivantes, afin de limiter le nombre de stades étudiés en détail et de limiter le nombre d’animaux générés. De plus, nous allons combiner les analyses de protéines et d’ARN sur une même portée (1 hémisphère pour chaque étude au lieu du cerveau entier). Nous utilisons les test statistique adaptés afin d’évaluer différents paramètres chez les animaux portant la mutation par rapport aux contrôles (embryons non porteurs de la mutation de la même portée). Nous avons aussi adapté le nombre de portées à analyser en fonction des expériences à réaliser.

Raffinement

Nous prenons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal, notamment avec l’ajout de nid et de tunnel dans les cages d’hébergement. La mise à mort est faite par du personnel qualifié. Pour les animaux à 3 semaines de vie (21-22 jours après la naissance), bien qu’ils soient plus petits et aient un cerveau plus petit, nous n’avons jusqu’à présent pas détecté de signe de détresse ou de souffrance. Aucun point limite (maigreur, absence de lait maternel dans l’estomac) n’a été constaté dans les premières portées. Nous faisons toutefois nos collectes les plus tardives à 20 jours de vie, avant l’apparition de la mortalité. Nous effectuons le prélèvement pour le génotypage en post-mortem pour éviter une douleur inutile. En post-natal, pour les animaux étudiés le jour de la naissance ou à 6 jours de vie : nous comptons les nouveaux nés à la naissance et nous nous assurons qu’ils sont bien en groupe dans le nid, attestant que la mère s’occupe de tous ses petits. Tout animal délaissé sera euthanasié pour éviter hypothermie et hypoglycémie. 3 fois par semaine, nous apportons une attention particulière aux points limites suivants : i) l’absence de prise alimentaire par observation de la poche à lait : tout animal sans poche à lait visible pendant 24h est euthanasié ; ii) cyanose: les animaux étant glabres jusqu’à 6 jours de vie, nous observons la couleur de la peau : tout animal cyanosé est euthanasié. Entre 6 et 20 jours de vie: Nous surveillons l’attitude de la mère et tout animal délaissé sera euthanasié pour éviter hypothermie et hypoglycémie. L’apparence du pelage des petits est également un bon indice du soin apporté par la mère. Nous avons noté une taille des nouveaux nés double mutants plus petite (mais de corpulence normale, c’est-à-dire qu’ils ne sont pas anomalement maigres), des cerveaux plus petits et des animaux moins vifs. Le point limite étant une perte anormale de poids, les animaux sont pesés 3 fois par semaine. Si une perte de poids ou un état de maigreur est observé, l’animal est euthanasié. Les animaux ne réagissant pas à une stimulation lors de l’ouverture du nid sont euthanasiés.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour étudier les gènes impliqués chez des patients souffrant de troubles neurodéveloppementaux. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris, ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neurodéveloppementales chez l’homme. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par portée est couramment modifié génétiquement, ce qui nous permet de mimer les mutations observées chez l’homme. De plus la culture de cellules souches neurales et la culture primaire de neurones à partir de cortex murins sont des techniques bien établies au laboratoire. Selon nos études préliminaires, les très jeunes embryons mutants (avant 2/3 de gestation) ne présentent aucune différence avec les embryons sauvages. A la naissance, nous notons une taille légèrement inférieure et juste avant le sevrage, cette taille ainsi que la taille du cerveau, sont très inférieures chez les double cKO. A deux semaines de vie, on observe également une diminution de la taille (corps et tête) chez les animaux avec une seule copie d’un des deux gènes. Nous souhaitons dans un premier temps étudier tous les stades du développement du cerveau afin de déterminer précisement la dynamique d’apparition des phénotypes et d’identifier le timing précis auquel réaliser la caractérisation moléculaire qui permettra de comprendre les mécanismes qui mènent à l’apparition des phénotypes : stades embryonnaires 14.5 jours, 15.5 jours, 16.5 jours et 18.5 jours post-fécondation et stades postnataux jour de la naissance et 6, 14 et 20 jours de vie. Dans les études suivantes, nous étudierons plus en détail uniquement les stades clé.

Une perte de 10 à 15 % du poids en quarante-huit heures, une masse tumorale qui gêne les déplacements, la prostration ou le décubitus déclenchent la mise à mort. 812 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le cerveau. Un glioblastome leur est induit par injection de lentivirus dans un ventricule cérébral au cours d'une chirurgie de trente à quarante minutes, suivie de cinq jours d'injections quotidiennes, de jusqu'à cinq cycles de traitement, de quatre injections d'anticorps par cycle et d'un suivi par bioluminescence deux fois par semaine sous anesthésie. Le porteur décrit un projet collaboratif d'organoïdes de glioblastome incluant microglie et monocytes, et écrit qu'il pourra remplacer une partie des expériences in vivo selon les résultats obtenus ici.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l'effet de drogues dites sénolytiques (drogues qui éliminent les cellules sénescentes) seules ou en combinaison avec d'autres traitements, dans un nouveau modèle immunocompétent de tumeur cérébrale de type glial appelée glioblastome. Le modèle de glioblastome de type mésenchymateux proposé dans le projet récapitule au mieux les altérations moléculaires identifées chez les patients notamment la perte des suppresseurs de tumeur PTEN, p53 et NF1 en utilisant la technologie d'invalidation de l'expression de gènes Crispr-Cas9. Ce projet est multisite car un équipement spécifique se trouve dans un autre établissement utilisateur et c'est la raison de ce dossier. Ce projet est la suite d'un autre projet autorisé qui ne nécessite pas d’augmentation du nombre d’animaux.

Bénéfices attendus

Le glioblastome est la tumeur cérébrale adulte primaire la plus fréquente et agressive dont les patients ne survivent pas plus de 15 mois en moyenne à ce jour. Ce projet devrait générer un modèle préclinique immunocompétent de glioblastome de type mésenchymateux qui récapitule au plus près les altérations moléculaires des glioblastomes de patient. En effet, afin de traduire de façon efficace nos résultats de recherche fondamentale à la clinique il est indispensable de s'approcher au plus près de la pathologie humaine. Nos résultats devraient permettre de proposer des nouvelles approches thérapeutiques pour la prise en charge des patients avec un glioblastome.

Procédures

La procédure expérimentale sera réalisée sur des souris adultes agées de 6-8 semaines et comprend 7 actes techniques incluant une injection intra-crâniale de lentivirus nécessitant un acte chirurgical, une série d'injections, un suivi de la croissance tumorale par utilisation d’imagerie par bioluminescence, une mesure du flux sanguin cérébral par examen Doppler, des traitements, des prélèvements sanguins puis finalement une euthanasie. La chirurgie prendra environ 30-40min sur animal anesthésié et analgésié en pré et post-opératoire (établissement 1). Les injections d'une durée de 10-20 secondes, seront réalisées 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs sur animal vigil (établissement 1). La quantification de bioluminescence sera réalisée deux fois par semaine, toutes les semaines sur animal anesthésié. Cette mesure est indolore et dure selon l'intensité de la bioluminescence entre 1 et 4 min (établissements 1 ou 2). Les traitements d'une durée de 10-20 secondes, seront administrés sur souris vigiles pendant 5 jours consécutifs et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines. Les animaux recevront au maximum 5 cycles de traitement (établissement 1). L'administration d'anticorps bloquants se fera en 4 injections espacées de deux jours et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines sur souris vigile (établissement 1). Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigil (durée de quelques secondes, 4 fois par animal) (établissement 1). L'examen Doppler d'une durée d'1h30, sera réalisé tous les 5 jours sur des animaux anesthésiés (établissement 2).

Impact sur les animaux

Ce projet comporte deux étapes où des effets indésirables sont attendus sur les animaux, la procédure chirurgicale et la charge tumorale. La procédure chirurgicale est invasive, il s'agit d'une injection stéréotaxique de lentivirus dans le ventricule latéral effectué sous anesthésie/analgésie mais qui entraîne des nuisances (risques anesthésiques, douleur post-opératoire, risque infectieux). Concernant la charge tumorale, les nuisances sont une variation du poids corporel notamment une perte de masse musculaire, le développement d'une masse tumorale gênant la mobilité ou les fonctions normales de l'animal, une dégradation de l'état général de l'animal (signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration ou décubitus, déshydratation, lésions cutanées). Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et les animaux seront pesés quotidiennement pendant les 5 jours suivant la chirurgie et deux fois par semaine par la suite. De la douleur légère de courte durée pourrait être ressentie lors des prélèvements sanguins. Dans de très rares cas un hématome ou une perte de sang hémorragique pourrait être observée. L’imagerie Doppler mesure la perfusion sanguine cérébrale et tumorale de manière non invasive et nécessite une anesthésie qui peut engendrer une hypothermie et des difficultés respiratoires.

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées en fin de procédure. En effet, l'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever le cerveau des souris et d'analyser la tumeur cérébrale induite pendant la procédure, au niveau moléculaire et histologique.

Remplacement

En parallèle de ce projet in vivo, nous caractériserons des prélèvements chirurgicaux de glioblastomes de patient collectés avant et après traitement. Ce matériel est rare car la survie des patients après diagnostic est inférieure à 15 mois. Cette étude fondamentale demeurera néanmoins descriptive ; pour avancer dans le développement de nouveaux traitements nous devons réaliser des études fonctionnelles dans un modèle animal préclinique. Dans un souci de remplacement et réduction, nous projetons de générer des organoides à partir de glioblastomes de patient afin de tester de nouveaux traitements in vitro. Cependant, l'environnement tumoral, et notamment le système immunitaire, est essentiel à la réponse aux traitements et à ce jour, il n'existe pas encore de modèle d'organoides conservant le microenvironnement global (notamment, la microglie, les monocytes et les cellules T infiltrants, les cellules endothéliales et les péricytes). Notre équipe de recherche participe activement à un projet collaboratif visant à générer des organoides de glioblastome incluant de la microglie et des monocytes infiltrants. Selon les résultats obtenus sur ce projet, nous pourrons remplacer une partie de nos expériences in vivo par des expériences réalisées sur ces organoides.

Réduction

Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences, nous utiliserons dans ce projet 812 souris. Nous utiliserons pour chaque type d’expérience 18 animaux. Ce nombre, qui peut paraître élevé, est nécessaire pour l’obtention de résultats reproductibles et statistiquement significatifs car les gliomes sont par nature très hétérogènes. Afin d'éviter l'euthanasie séquentielle d’animaux au cours du temps pour évaluer l’apparition de la tumeur, son volume et sa croissance, nous utiliserons la méthode de suivi in vivo par bioluminescence grâce à l'expression de la luciférase dans les cellules tumorales. A chaque euthanasie des animaux afin d'éviter tout double emploi des animaux, nous collecterons divers tissus sur un même animal (cerveau, ganglions, rate, sang). De plus, la tumeur fluorescence sera localisée dans le cerveau disséqué à la loupe binoculaire et nous réaliserons plusieurs types d'analyses sur chaque tumeur. Immédiatement après son prélèvement, la tumeur sera séparée en deux parties, une pour les analyses histologiques et immunologiques et une autre pour les analyses moléculaires et biochimiques. Pour les animaux du lot 2, de l'imagerie permettra de quantifier les flux sanguins cérébral et intratumoral au cours de la croissance tumorale permettant d’accumuler un grand nombre de résultats pertinents par animal.

Raffinement

Pour réduire le stress post-opératoire, les animaux seront logées par groupes de 5 souris par cage pendant une période d'acclimatation de 7 jours minimum avant la procédure chirurgicale. Tous les animaux auront un enrichissement: carré de coton et bâton à ronger. Les animaux seront analgésiés et anesthésiés avant et pendant toute la procédure chirurgicale. Pendant la chirurgie et l'examen Doppler, les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de prévenir l'hypothermie, un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter leur déshydratation. Post-chirurgie, les animaux seront placés dans une salle de réveil chauffée, la qualité du réveil sera observée pour détecter toute anomalie potentielle de la procédure anesthésique. Pendant 48 heures post-chirurgie, nous administrerons un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement et euthanasiés dès que les points limites seront atteints. Ceux-ci comprennent une variation relative du poids corporel comprise entre 10 et 15% en 48h, une masse tumorale gênant la mobilité ou les fonctions normales de l’animal et une dégradation de l’état général de l’animal comprenant des signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration ou décubitus, déshydratation, lésions cutanées. Nous avons établi dans l’équipe une grille de suivi post-opératoire (annexe) pour les animaux pouvant développer des tumeurs cérébrales. Cette grille sera consultée et une fiche de suivi de l’animal sera remplie à chaque examen, présente au dos de l'étiquette de cage. Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et le poids des animaux deux fois par semaine. En fin de processus d’expérimentation, si une souris est isolée nous regrouperons cet animal avec des animaux sujets au même traitement et lorsque cela ne sera pas possible nous apporterons de l’enrichissement supplémentaire dans la cage sous forme de maisonnette. Lors des prélèvements sanguins, si le saignement ne stoppe pas rapidement, une compression plus longue avec un papier essuie tout propre sera directement effectuée sur le point de prélèvement. En cas d'apparition de prostration et de difficulté à récupérer (anomalie cardiorespiratoire), l'animal sera pris en main pour effectuer des frictions afin de le stimuler. De la nourriture hydratée sera déposée à côté de lui dans la cage. Si cet état perdure plus de quelques minutes, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Les nombreux outils génétiques développés et caractérisés chez la souris font de cette espèce un modèle de choix pour l’étude in vivo des tumeurs. De plus, les modèles les plus représentatifs de la biologie et de la génétique des tumeurs humaines sont établis chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes de 6-8 semaines pour induire de novo des glioblastomes. En effet ce type de tumeur est diagnostiqué chez des sujets adultes d'âge médian de 59 ans, cette tumeur se développe donc à l'âge adulte. Notre projet, qui vise à évaluer l'effet de drogues sénolytiques dans un nouveau modèle immunocompétent de glioblastome, utilisera uniquement des souris femelles. En effet, les modèles de glioblastomes murins se développent de façon similaire chez les mâles et les femelles. De façon plus importante dans une étude récente, nous avons montré que l’enrichissement de la signature murine de sénescence chez les patients avec un glioblastome est un facteur de mauvais pronostique quel que soit le sexe. Ces résultats montrent donc que l’étude de la sénescence dans le contexte des glioblastomes peut être réalisée sur un seul sexe. Nous avons choisi pour ce projet de travailler sur des femelles.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous anesthésie générale, puis cinq ou neuf injections sous anesthésie locale, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse ou suivie par imagerie tous les trois jours. La croissance des tumeurs sous la peau provoque des douleurs locales modérées, et les traitements une perte d'appétit et de poids. Le porteur retient la souris parce que sa génétique est la mieux connue, que l'oncologie en fournit déjà beaucoup de données, et que son équipe a "acquis une pratique expérimentale sur cette espèce".

Objectifs

Les inhibiteurs de la tyrosine kinase ont été approuvés pour le traitement de routine des patients atteints de cancer. Ils agissent de façon autonome uniquement sur la croissance de cellules cancéreuses génétiquement modifiées. Cependant, cette fonction a récemment été remise en question par des découvertes montrant des effets immunostimulateurs directs de ces molécules. Il a été montré que certaines sont dotées de la capacité d'induire la mort cellulaire immunogène dans les cellules cancéreuses, stimulant ainsi les cellules cancéreuses à émettre des signaux qui les rendent détectables par le système immunitaire. De plus, il existe des preuves précliniques solides selon lesquelles ces molécules peuvent être avantageusement combinés avec une chimiothérapie et une immunothérapie standard, pour traiter le cancer du poumon non à petites cellules. Plus globalement, nous disposons donc de preuves solides selon lesquelles certaines ont la capacité d'agir comme inducteurs de la mort cellulaire immunogène sur les cancers, agissant ainsi, aussi, comme des activateurs de la mort cellulaire. Dans un précédent projet, un de ces produits, a été testé seul ou en combinaison avec une chimiothérapie et/ou une immunothérapie standard dans des modèles précliniques immunocompétents ou immunodéficients. Les résultats étant prometteurs, nous souhaitons aller plus loin en déterminant quelles cellules immunitaires sont importantes pour permettre la traduction des présents résultats en applications cliniques.

Bénéfices attendus

Si ce projet confirme nos résultats in vitro et in vivo précédents, ces inhibiteurs de tyrosine kinase permettront de proposer de nouvelles combinaisons de traitements anti-tumoraux beaucoup plus performantes pour les patients.

Procédures

Les animaux recevront une injection sous anesthésie générale (2min) puis cinq injections sous anesthésie locale (vigile,

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et des greffes de cellules tumorales sous anesthésie générale, des injections de traitements, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse ou d’imagerie tous les trois jours. Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress chez l’animal et les croissances tumorales en sous- cutanées peuvent entraîner des douleurs locales , transitoires et modérées. Une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids modérée peut apparaître chez la souris suite aux traitements médicamenteux.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées pour analyse des tumeurs et des cellules immunitaires après traitement, post-mortem.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation du système immunitaire dans l'organisme entier et son effet sur la croissance tumorale.

Réduction

Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail. Les résultats seront analysés avec des outils statistiques.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (examen clinique quotidien, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout changement.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Par ailleurs, il s’agit d’un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés au stade adulte afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé, correspondant à la population de patients.

10 660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à trente-cinq injections sur animal vigile, une biopsie d'oreille, trois tests de mémoire épisodique, trois tests de mémoire spatiale et un test d'épilepsie de deux heures. Certaines molécules administrées provoquent un état cataleptique et épileptique, et les souris mutantes développent une mâchoire proéminente qui allonge les dents, coupées si besoin. Le projet porte sur un gène du nanisme et sur des molécules candidates, sans qu'aucun élément n'explique comment un effectif de 10 660 individus a été arrêté.

Objectifs

Le nanisme, caractérisé par une petite taille disproportionnée et des difficultés d'apprentissage, est dû à une mutation dans un gène appartenant à une famille de récepteur. L'objectif de ce projet est d'étudier le rôle de ce gène au cours du développement squelettique, du vieillissement et son implication sur la cognition afin de mieux comprendre la pathologie humaine et de tester in vivo des molécules "médicament candidat".

Bénéfices attendus

Les principaux bénéfices attendus pour ce projet sont de proposer aux patients une solution thérapeutique pour traiter le nanisme et de déchiffrer la fonction du gène d'intérêt au cours de la croissance, du vieillissement et son implication dans la cognition.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : injection sur animaux vigiles (35 fois max; 30sec), prélèvement de tissu à l'oreille (1 fois; 5sec), test mémoire épisodique (3 fois;5-10 et 15 minutes),test mémoire spatiale (3 fois;5-10 et 15 minutes), test épilepsie (1 fois;2heures).

Impact sur les animaux

Les injections induisent une douleur légère et brève. La biopsie à d'oreille entraine une douleur légére et brève. Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent provoquer egalement un stress chez l’animal. Certaines molécules causent un état cataleptique et épileptique. Les souris mutantes peuvent avoir une proéminence anormale de la mâchoire vers l’avant avec pour conséquence des dents longues. Les tests de comportement peuvent induire du stress également.

Devenir

Chaque souris sera mise à mort et de nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques.

Remplacement

L'objectif étant de comprendre la physiopathologie du nanisme et d'identifier des molécules susceptibles de corriger un défaut de croissance, seuls les modèles animaux peuvent apporter des réponses à nos hypothèses de travail. La souris est un modèle largement utilisé et pertinent en raison de ses similitudes physiologiques et génétiques avec l'humain. Pour les tests de comportement, il n'existe pas d'alternative à l'utilisation d'animaux décrite actuellement dans la littérature.

Réduction

Chaque souris fournira des données détaillées sur plusieurs aspects de la physiopathologie. En effet, de nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques. Les effectifs ont été déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Le nombre de souris par groupe a été déterminé afin de pouvoir réaliser une analyse statistique en tenant compte de la variabilité intra-groupe.

Raffinement

Pour les tests de comportement les souris auront 3 jours minimum entre chaque test pour réduire le stress. Les souris seront sous surveillance quotidienne et des points limites ont été établis. Elles vivront en groupe avec des matériaux pour construire un nid. Elles seront anesthésiées avec des produits adaptés. Afin de limiter l'impact de l'avancement des dents, les souris seront observées tous les trois jours et une coupe des dents sera réalisée si nécessaire. La grille des scores est remplie tous les trois jours pour les souris 16,24 et 32 jours et hebdomadaire pour les souris 3,12,18 et 24 mois.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix pour étudier le développement squelettique. En effet, les processus d’ossification chez l’homme et la souris sont similaires. Le modèle de souris de nanisme utilisé reproduit assez fidèlement la pathologie osseuse et est un modèle de choix pour tester des molécules à visée thérapeutique. Le phénotype squelettique est évolutif au cours du développement d'où la nécessité d'étudier des moments bien précis du développement. Le phénotype osseux sera étudié au cours de la période post-natale à différents stades de la vie des souris (16-24-32 jours et 3 -12-18 et 24 mois). Etude de la plaque de croissance à 16 jours. Etude de l'ossification secondaire à 24 jours. Etude de l'os trabéculaire et cortical à 32 jours. Etude de la formation et résorption osseuse à 3 et 12 mois.- Etude du vieillissement à 2 différents temps: 18 mois et 24.

Cinq jours d'injections quotidiennes, une échographie de vingt minutes sous anesthésie, une chirurgie de quinze minutes, une injection de cellules tumorales, trois mesures de composition corporelle par RMN sur animal éveillé, deux gavages suivis de huit puis quatre prélèvements sanguins à la queue : 530 souris femelles enchaînent ces actes entre cinq et vingt-deux semaines d'âge, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La dernière étape, une lymphographie sous anesthésie générale, se termine sans réveil. Le projet cherche le rôle des œstrogènes dans le lymphœdème et la dissémination métastatique, maladie que le porteur décrit comme incurable et touchant majoritairement les femmes. Toutes les souris sont mises à mort à la fin de chaque procédure pour récolter les tissus.

Objectifs

Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Lors de la formation d’une tumeur solide, il représente la première voie de dissémination métastatique vers les ganglions. Egalement, une dysfonction de ce système abouti à la formation de lymphoedème, une accumulation massive de de fluide et tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoèdèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs. L’AJOUT DE DEUX TECHNIQUES NÉCESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISÉ (MESURE DE LA COMPOSITION CORPORELLE ET TEST DE TOLÉRANCE ORALE AUX LIPIDES).

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le lymphoedème, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateurs seront réalisées les procédures suivantes : dans un premier temps, une injection quotidienne pendant 5 jours sera effectuée. Ensuite, sous anesthésie générale, une échographie de suivi (20min), ou une intervention chirurgicale (15min) et/ou une injection de cellules tumorales seront réalisées (2min). TROIS FOIS AU COURS DU PROTOCOLE, UNE MESURE DE LA COMPOSITION CORPORELLE, un test de tolérance au glucose et UN TEST DE TOLÉRANCE LIPIDIQUE SERONT RÉALISÉS, ESPACÉS DE DEUX JOURS. LA COMPOSITION CORPORELLE SERA ÉVALUÉE PAR RMN (MINISPEC, BRUKER) CHEZ DES SOURIS ÉVEILLÉES (2 MINS). LES TESTS DE TOLÉRANCE AU GLUCOSE ET LIPIDES IMPLIQUENT UN GAVAGE (20 SEC), SUIVI DE PRÉLÈVEMENTS SANGUINS SÉQUENTIELS À LA QUEUE (8 POUR LE TEST DE TOLÉRANCE AU GLUCOSE ET 4 POUR LE TEST DE TOLÉRANCE LIPIDIQUE). Dans le second établissement utilisateur, les animaux peuvent être soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure. Au maximum, les souris subiront 2 interventions

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le developpement de tumeurs vont engendrer des douleurs moderees et un leger stress sur l'animal. La chirurgie du lymphoedème ne génère pas d'effet indésirable majeur chez l'animal. Toutefois, si l'animal présente des signes de souffrance (dos vouté, yeux plissés, absence de toilettage), un traitement avec un analgésique sera mis en place. LE MINISPEC PEUT PROVOQUER UN STRESS LÉGER ET TEMPORAIRE DÛ AU CONFINEMENT. LE GAVAGE PEUT CAUSER UN STRESS TEMPORAIRE, UNE LÉGÈRE IRRITATION DE L’ŒSOPHAGE ET UN RISQUE D’ASPIRATION, AVEC UN RISQUE MINIME DE LÉSIONS SI LA TECHNIQUE EST CORRECTE.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Les effets pleiotropies des oestrogenes, synthetisees majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modelisables par des approches in vitro. D’autre part, la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours a l’experimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De meme, la croissance tumorale et le developpement de lymphoedeme secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endotheliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune strategie de remplacement pour l'etude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune strategie de remplacement du modele animal qui permet de repondre aux questions adressees par ce projet.

Réduction

Afin de reduire le nombre d'animaux utilises dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorite uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est reduit a son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calcule de maniere a donner des resultats statistiquement significatifs afin de delimiter l'effet du genotype, du temps et/ou du traitement

Raffinement

Les animaux sont places en piece d'acclimatation lors de leur arrivee a la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie competent qui verifie leur etat et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de differents cartons de transport ne sont jamais melanges lors de la repartition dans les cages d'hebergement. Les animaux seront heberges en cage de 4 ou 5 et seront acclimates pendant une periode de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-etre de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillees quotidiennement selon les directives europeennes relatives a l'hebergement des animaux de laboratoire. Cela permettra de réagir rapidement si un animal atteint un des points limites détaillés dans chaque procédure. De plus, pour chaque procedure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthesie generale avec analgesique sont realisees pour une meilleure prise en compte de la douleur.Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car c’est le seul modele pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la croissance tumorale avec formation de metastases ou l'apparition du lymphoedeme secondaire apres curage ganglionnaire. De plus, l'invalidation genique du recepteur aux oestrogenes ERα a ete genere seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet : - des souris conduisant a une invalidation du ERα de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 5 semaines. Les procedures seront realisees de 5 a 22 semaines

Pour mesurer si des LED rouges ou proches infrarouges soulagent la neuropathie provoquée par les anticancéreux, 96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent huit injections de paclitaxel en vingt-cinq jours sous sédation légère, puis passent cinq minutes par séance dans un box de plexiglas, appareil allumé pour la moitié des groupes et éteint pour l'autre. Le porteur écrit que l'induction de la neuropathie est "une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l'étude", et suit chaque semaine par des tests comportementaux l'allodynie tactile et thermique qu'elle provoque. Une grille de points limites explore diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratation, perte de poids, pelage et locomotion, et retire du projet pour mise à mort rapide les rats dont le score l'exige.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite est un effet indésirable caractéristique des anticancéreux neurotoxiques (taxanes, sels de platine…). La neuropathie périphérique chimio-induite se caractérise par des symptômes sensitifs distales et symétriques (picotement, douleur neuropathique, engourdissement), altérant la qualité de vie des patients, et pouvant perdurer longtemps après la fin des traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique est très limitée, car aucun traitement préventif n’est recommandé et seule la duloxétine est modérément recommandée pour traiter les douleurs neuropathiques associées. La littérature scientifique souligne aujourd’hui l’intérêt de la photobiomodulation dans le traitement des douleurs neuropathiques et de la neuropathie périphérique chimio-induite. La photobiomodulation est une technique non invasive qui utilise des lumières rouges ou proches infrarouges de faible intensité (LED), pour stimuler l’activité cellulaire en agissant principalement sur les mitochondries ; cette lumière déclenche une série de réactions biochimiques bénéfiques telles que l’augmentation de la production d’énergie cellulaire, la modulation de l’inflammation, la stimulation de la régénération tissulaire et de la synthèse de collagène, sans effet thermique ni endommagement des tissus. L’objectif du projet sera de mesurer les effets préventifs et analgésiques de la photobiomodulation sur un modèle animal de neuropathie périphérique chimio-induite.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier une nouvelle stratégie de prise en charge de la neuropathie périphérique chimio-induite utilisant la photobiomodulation. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge de la neuropathie périphérique chimio-induite est très limitée, avec aucune stratégie préventive recommandée et seule la duloxétine avec un niveau de recommandation modérée pour le traitement des douleurs neuropathiques associées. Ainsi ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement et de prévention des neuropathie périphérique chimio-induite, avec une technique non-invasive.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections intraveineuses sous sédation légère. Le nombre total d’injections sera de 8 sur 25 jours, et pour une durée des injections de 10 secondes (max). Tous les animaux seront exposés à la procédure de photobiomodulation (2 groupes d’animaux avec un appareil éteint et 2 groupes d’animaux avec un appareil allumé). La procédure de photobiomodulation durera 5 min, et durée pendant laquelle les animaux seront dans des box en plexiglass transparent permettant aux animaux de se toiletter, de se voir et de se sentir. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à la fin des injections. Les tests comportementaux dureront en moyenne 5 à 10 min par animal. Il n’y aura aucun prélèvement sanguin durant les procédures. Un seul prélèvement sanguin total sera réalisé en fin de procédure sous anesthésie profonde et avec analgésie, à la suite de quoi les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

L’induction de la neuropathie périphérique chimio-induite chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La neuropathie périphérique chimio-induite sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (allodynie tactile et thermique). Les administrations répétées de paclitaxel seront responsables d’une réduction du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg et mesure bi-hebdomadaire), et permettra de contrôler la tolérance des animaux au paclitaxel. Pour chaque animal, les points limites seront contrôlés à l’aide d’une grille (voir annexe), et explorant : diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratations, point d’injection, perte de poids par rapport à la dernière mesure, yeux, pelage, activité spontanée, et locomotion. Selon le score obtenu par l’animal (points limites), l’animal sera retiré du projet pour une euthanasie rapide.

Devenir

Les expérimentations conduiront à l'euthanasie des animaux pour permettre des analyses biologiques sanguines et tissulaires afin d'optimiser l'emploi des animaux à des fins de recherche.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de neuropathie périphérique chimio-induite n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur des cellules souches humaines de neurones ou organoïdes. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie périphérique chimio-induite, qui n'est-elle-même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'une étude sur la douleur neuropathique, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer, évaluer et valider les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité à 12 par groupe, afin de respecter le principe de réduction tout en garantissant la robustesse scientifique de l’étude. Dans ce type d’étude exploratoire, une diminution plus importante du nombre d’animaux ferait courir un risque élevé de ne pas pouvoir conclure, ce qui entraînerait une perte de valeur scientifique et une utilisation inutile des animaux. Le nombre retenu permet de réaliser des analyses statistiques fiables, fondées sur des tailles d’effet attendues suffisamment larges pour mettre en évidence des différences pertinentes entre les groupes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe avec un enrichissement de l’environnement (cylindres en plastique et en carton) afin de favoriser les interactions sociales et les comportements de jeu, contribuant ainsi à améliorer leur bien-être tout au long de l’étude. Les injections de produits à l’étude seront réalisées sous sédation légère. L’exposition des animaux à la photobiomodulation n’imposera aucune contention. Les animaux seront dans des box individuels en plexiglass et sans contention pendant 5 minutes. Les box seront transparents et ouverts, permettant aux animaux de se voir et se sentir, ce qui limitera l’isolement des animaux. Enfin, lors du prélèvement sanguin en point final, les animaux seront sédatés profondément avec une analgésie.

Choix des espèces

Le choix du rat plutôt que la souris se justifie d’abord par sa taille, qui permet de prélever une quantité plus importante de matériel biologique par individu et donc de limiter le nombre total d’animaux nécessaires tout en répondant aux objectifs scientifiques. La souche Sprague-Dawley, connue pour son comportement calme et sa bonne maniabilité, est particulièrement adaptée aux tests comportementaux de la douleur, contrairement à des souches plus actives comme Lou ou Wistar qui peuvent introduire davantage de variabilité dans les mesures. L’utilisation de cette souche s’appuie également sur l’expertise existante et des données antérieures au sein du laboratoire, ce qui renforce la robustesse et la comparabilité des résultats. Les animaux seront utilisés à un âge correspondant à de jeunes adultes (environ 9 semaines), ce qui est cohérent avec la plupart des études publiées et facilite la comparaison avec la littérature ainsi qu’avec les données internes. Le recours à des animaux plus âgés pourrait mieux refléter la situation clinique en oncologie (cancers touchant majoritairement des sujets seniors), mais leur coût élevé et leur moindre utilisation dans les modèles précliniques limitent cette option. Des mâles et des femelles seront inclus afin de refléter la réalité clinique des traitements par paclitaxel, administrés aussi bien chez les hommes que chez les femmes, et de prendre en compte d’éventuelles différences liées au sexe dans les réponses aux traitements.