Oncologie

Tuées pour des prélèvements analysés plus tard, 284 souris immunodéficientes vont être utilisées dans la seconde partie de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux tumeurs sont greffées sous la peau de chaque animal, puis viennent les injections de liposomes photosensibles, les prélèvements sanguins hebdomadaires, l'éclairage des tumeurs pendant dix à soixante minutes et jusqu'à quinze séances d'imagerie. Le porteur annonce une gêne, une douleur légère, une brûlure cutanée possible et un risque d'infection lié à l'immunodéficience des souris. La preuve de concept visée reste une étape de laboratoire, l'usage en thérapie humaine étant renvoyé au "plus long terme".

Objectifs

La vectorisation, c'est-à-dire le transport, des médicaments à l’aide de véhicule est une alternative thérapeutique très prometteuse, car elle présente plusieurs avantages par rapport aux produits non-vectorisés: (1) une meilleure biodisponibilité des médicaments ; (2) une meilleure accumulation dans les tumeurs ; (3) une meilleure biocompatibilité : grâce à une accumulation privilégiée dans les tumeurs par rapport aux tissus sains, les effets nocifs sont diminués ; et (4) une libération prolongée des médicaments. Dans le cas des véhicules sensibles à la lumière, le relargage des molécules transportées peut être contrôlé par la lumière. L'objectif est de montrer l'efficacité des véhicules sensibles à la lumière que nous avons développés dans le cadre du traitement de tumeurs cutanées. Ce projet sera réalisés dans 2 établissement utilisateurs : EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Preuve de concept de l'efficacité du relargage contrôlé par la lumière des produits anticancéreux, à partir de véhicules sensibles à la lumière. A plus long terme, cette technologie pourrait être utilisée en thérapie chez l'homme.

Procédures

Injection dans la veine sur animal anesthésié : 1 à 3 fois, durée inférieure à 1 minute, dans l'EU2. Injection dans le ventre sur animal vigile : 1 à 3 fois, durée 10 secondes, dans l'EU 2. Prélèvement de sang sur animal anesthésié : une fois par semaine , 2 ou 3 fois, durée 1 minute, dans l'EU 2. Injection sous la peau sur animal anesthésié : 1 fois, durée 1 minute, dans l'EU 1. Eclairage d'une tumeur sur animal anesthésié : 1 à 3 fois, durée entre 10 et 60 minutes, dans l'EU 2. Imagerie sur animal anesthésié : 9 à 15 fois, durée entre 1 à 5 min, dans l'EU 2. Anesthésie : 11 à 20 fois, durée entre 5 et 10 min, dans l'EU 1 et EU 2.

Impact sur les animaux

L’injection des cellules cancéreuses en sous cutané peut provoquer une infection au niveau du site d’injection. La présence d’une tumeur sous cutanée peut engendrer une légère douleur, une gêne. Une perte de poids liée à la croissance tumorale peut survenir. Le suivi en imagerie peut fatiguer les animaux à cause des anesthésies répétées. L’injection du véhicule peut provoquer une mauvaise réaction chez l’animal, une douleur au niveau du site d’injection. L’irradiation peut engendrer une légère brulure cutanée. L’immunodéficience des animaux peut entrainer une infection par des pathogènes.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de récupérer des prélèvements qui seront analysés ultérieurement.

Remplacement

Malgré la possibilité de valider sur des cellules in vitro l’efficacité des molécules, nous souhaitons montrer l’intérêt de notre technologie dans le traitement des tumeurs qui sont des structures dont la composition est hétérogène. De plus l’objectif est d'injecter ces molécules dans la circulation sanguine ce qui est à l’heure actuelle quelque chose de difficile à reproduire sur des modèles in vitro. Nous souhaitons tester notre approche thérapeutique dans un contexte tumoral sachant que le microenvironnement joue un rôle primordial, le modèle animal reste donc nécessaire.

Réduction

L’efficacité des molécules et leur toxicité seront en amont testées sur des cellules en culture. Nous avons prévu des étapes de décision entre les différentes procédures en fonction des résultats obtenus. Les souris seront porteuses de 2 tumeurs sous la peau afin d’avoir sur la même souris une tumeur traitée et une tumeur non traitée. Le suivi du devenir des molécules une fois injectées dans l’animal est réalisé par imagerie non invasive permettant un suivi dans le temps sur un même animal. L’éclairage des tumeurs se fera par une source lumineuse externe ce qui nous permettra, si besoin, d’éclairer plusieurs fois la même tumeur sans être invasif. Le nombre d’animaux (284) a été déterminé en utilisant une application dédiée et un test statistique sera réalisé.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 3 jours après leur arrivée dans l'établissement. Les souris seront hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel ou maison, paille, bâton à ronger) sur un portoir ventilé. L’hébergement en portoir ventilé permet de limiter les risques d’infection des animaux par des pathogènes et/ou des opportunistes. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur. Une feuille de score est utilisée pour le suivi de l’animal et pour scorer des points limites adaptés au projet. La feuille de score permet de définir des critères d’arrêt des souffrances et propose des mesures conservatoires bien déterminées.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix en imagerie optique de par sa petite taille. La souris étant un animal de petit gabarit, nous sommes capables de détecter des signaux faibles et profonds en imagerie optique. Le bioimageur utilisé pour l’imagerie de fluorescence est adapté à la souris. Les modèles de tumeurs sous cutanées utilisés dans ce projet ont été établis chez la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation et l’imagerie optique.

284 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune porte deux tumeurs greffées sous la peau, l'une traitée et l'autre non, subit de neuf à quinze séances d'imagerie, de onze à vingt anesthésies, et des éclairages de tumeur pouvant durer une heure. Le porteur annonce une possible brûlure cutanée liée à l'irradiation, une perte de poids liée à la croissance tumorale et une fatigue liée aux anesthésies répétées. Il reconnaît que l'efficacité des molécules peut être validée sur cellules, et justifie le recours aux souris par l'hétérogénéité des tumeurs et la difficulté de reproduire une injection dans la circulation sanguine.

Objectifs

La vectorisation, c'est-à-dire le transport, des médicaments à l’aide de véhicule est une alternative thérapeutique très prometteuse, car elle présente plusieurs avantages par rapport aux produits non-vectorisés: (1) une meilleure biodisponibilité des médicaments ; (2) une meilleure accumulation dans les tumeurs ; (3) une meilleure biocompatibilité : grâce à une accumulation privilégiée dans les tumeurs par rapport aux tissus sains, les effets nocifs sont diminués ; et (4) une libération prolongée des médicaments. Dans le cas des véhicules sensibles à la lumière, le relargage des molécules transportées peut être contrôlé par la lumière. L'objectif est de montrer l'efficacité des véhicules sensibles à la lumière que nous avons développés dans le cadre du traitement de tumeurs cutanées. Ce projet sera réalisés dans 2 établissement utilisateurs : EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Preuve de concept de l'efficacité du relargage contrôlé par la lumière des produits anticancéreux, à partir de véhicules sensibles à la lumière. A plus long terme, cette technologie pourrait être utilisée en thérapie chez l'homme.

Procédures

Injection dans la veine sur animal anesthésié : 1 à 3 fois, durée inférieure à 1 minute, dans l'EU2. Injection dans le ventre sur animal vigile : 1 à 3 fois, durée 10 secondes, dans l'EU 2. Prélèvement de sang sur animal anesthésié : une fois par semaine , 2 ou 3 fois, durée 1 minute, dans l'EU 2. Injection sous la peau sur animal anesthésié : 1 fois, durée 1 minute, dans l'EU 1. Eclairage d'une tumeur sur animal anesthésié : 1 à 3 fois, durée entre 10 et 60 minutes, dans l'EU 2. Imagerie sur animal anesthésié : 9 à 15 fois, durée entre 1 à 5 min, dans l'EU 2. Anesthésie : 11 à 20 fois, durée entre 5 et 10 min, dans l'EU 1 et EU 2.

Impact sur les animaux

L’injection des cellules cancéreuses en sous cutané peut provoquer une infection au niveau du site d’injection. La présence d’une tumeur sous cutanée peut engendrer une légère douleur, une gêne. Une perte de poids liée à la croissance tumorale peut survenir. Le suivi en imagerie peut fatiguer les animaux à cause des anesthésies répétées. L’injection du véhicule peut provoquer une mauvaise réaction chez l’animal, une douleur au niveau du site d’injection. L’irradiation peut engendrer une légère brulure cutanée. L’immunodéficience des animaux peut entrainer une infection par des pathogènes.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de récupérer des prélèvements qui seront analysés ultérieurement.

Remplacement

Malgré la possibilité de valider sur des cellules in vitro l’efficacité des molécules, nous souhaitons montrer l’intérêt de notre technologie dans le traitement des tumeurs qui sont des structures dont la composition est hétérogène. De plus l’objectif est d'injecter ces molécules dans la circulation sanguine ce qui est à l’heure actuelle quelque chose de difficile à reproduire sur des modèles in vitro. Nous souhaitons tester notre approche thérapeutique dans un contexte tumoral sachant que le microenvironnement joue un rôle primordial, le modèle animal reste donc nécessaire.

Réduction

L’efficacité des molécules et leur toxicité seront en amont testées sur des cellules en culture. Nous avons prévu des étapes de décision entre les différentes procédures en fonction des résultats obtenus. Les souris seront porteuses de 2 tumeurs sous la peau afin d’avoir sur la même souris une tumeur traitée et une tumeur non traitée. Le suivi du devenir des molécules une fois injectées dans l’animal est réalisé par imagerie non invasive permettant un suivi dans le temps sur un même animal. L’éclairage des tumeurs se fera par une source lumineuse externe ce qui nous permettra, si besoin, d’éclairer plusieurs fois la même tumeur sans être invasif. Le nombre d’animaux (284) a été déterminé en utilisant une application dédiée et un test statistique sera réalisé.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 3 jours après leur arrivée dans l'établissement. Les souris seront hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel ou maison, paille, bâton à ronger) sur un portoir ventilé. L’hébergement en portoir ventilé permet de limiter les risques d’infection des animaux par des pathogènes et/ou des opportunistes. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur. Une feuille de score est utilisée pour le suivi de l’animal et pour scorer des points limites adaptés au projet. La feuille de score permet de définir des critères d’arrêt des souffrances et propose des mesures conservatoires bien déterminées.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix en imagerie optique de par sa petite taille. La souris étant un animal de petit gabarit, nous sommes capables de détecter des signaux faibles et profonds en imagerie optique. Le bioimageur utilisé pour l’imagerie de fluorescence est adapté à la souris. Les modèles de tumeurs sous cutanées utilisés dans ce projet ont été établis chez la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation et l’imagerie optique.

Opérées à douze semaines pendant une heure sous anesthésie gazeuse pour recevoir une sonde télémétrique dans un vaisseau sanguin, puis mises à jeun six heures à plusieurs reprises et piquées à la queue deux fois par semaine, 130 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quatre-vingt-seize d'entre elles reçoivent en plus cinq injections sous-cutanées quotidiennes. Toutes sont tuées pour autopsie. Une partie sont des animaux de réforme, que le porteur décrit comme des souris transgéniques de génotype non pertinent "systématiquement euthanasiées en dehors de ce projet", et il annonce 130 souris sur quatre ans pour ce qu'il qualifie lui-même d'étude de faisabilité.

Objectifs

Les objectifs de cette étude sont : - de maîtriser la méthode d’utilisation d’une sonde de mesure de glucose posée dans l’artère carotide d’une souris. - de développer chez la souris une technique chirurgicale permettant de mesurer la glycémie en continu dans le sang entre l’intestin et le foie grâce à cette sonde télémétrique. Cette mesure de glucose se réalise habituellement dans le sang périphérique, il est donc nécessaire de réaliser des adaptations pour pouvoir la mesurer dans le sang qui sort de l’intestin. Cette étude permettra également de vérifier si cette sonde permet de mesurer une production de glucose par l’intestin. Pour cela, les souris seront soumises à des courtes périodes de jeûnes et des régimes variés pour suivre en continu les variations de cette glycémie.

Bénéfices attendus

L’intérêt de développer la surveillance continue du glucose par télémétrie dans les circulations sanguines artérielle et veineuse est de fournir un suivi en temps réel avec une haute précision des variations subtiles du glucose sans avoir à intervenir sur l’animal. L’innovation tient au développement de la mesure continue du glucose dans la veine porte, située entre l’intestin et le foie. La présence de glucose et de nutriments dans la veine porte contrôle le fonctionnement du foie et la régulation de l’appétit. A court terme, cette mesure continue du glucose au niveau de la veine porte aidera à comprendre la régulation de la prise alimentaire et le fonctionnement du foie. Elle offrira la possibilité de comprendre la dynamique du glucose dans des modèles de souris reproduisant diverses maladies : obésité, diabète, maladies cardiovasculaires, cancer.

Procédures

Les souris de cette étude seront soumises à une procédure chirurgicale sous anesthésie gazeuse pour implanter la sonde télémétrique dans les vaisseaux sanguins (durée 1h). En pré-médication, 2 injections d’analgésiques sous la peau seront effectuées (2x 15 secondes) et au moment de la chirurgie, une injection d’analgésie locale sera rajoutée (30 secondes). Pour gérer la douleur post-opératoire une injection sous la peau d’un analgésique sera effectuée 1 fois/jour pendant 3 jours (3x 15secondes). Pour 6 souris : une mise à jeun pendant 6 heures sera réalisé avant une injection de glucose. Le geste nécessaire à l’injection dure 20 à 30 secondes et la mesure de glycémie quelques secondes. Pour cela, une goutte de sang sera prélevée (au total 7 fois au cours du test) à l’extrémité de la queue. Une seule incision initiale de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une crème anesthésiante. Des prélèvements 2 fois/semaine sur 2,5 semaines soit 5 prélèvements de 30 secondes chacun seront ensuite réalisés. Pour 96 souris, 5 injections journalières sous la peau à différents endroits (durée 15 secondes) à l’âge de 13 semaines seront réalisées et ces souris seront mises à jeun pendant 6h à 4 reprises. Un prélèvement de sang à la queue sera réalisé 2 fois/semaine pendant 4 semaines (8x30 secondes) Pour diminuer la douleur, une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements. Une anesthésie gazeuse sera mise en place avant la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

A l’âge de 12 semaines, les souris subiront une chirurgie permettant la pose d’un capteur de glucose dans un vaisseau sanguin. Les chirurgies sont susceptibles de provoquer de la douleur post-opératoire, notamment au niveau des sutures de l’abdomen. Le prélèvement d’une goutte de sang à la queue, peut provoquer du stress et une douleur transitoire. Les mise à jeun pendant 6H chez ces souris opérées peuvent induire un stress. A l’âge de 13 semaines, 96 souris recevront une injection sous-cutanée, qui peut induire un stress lié à la contention et une douleur au point d’injection. Les points d’injection seront différents tous les jours afin d’éviter une douleur au point d’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour autopsie.

Remplacement

L’objectif de cette étude est de suivre en continu la glycémie d’un organisme entier, en fonction de ses états physiopathologiques. La régulation de la glycémie dépend de la coopération de différents organes et ne peut pas être reproduite sur cellules ou organoïdes. Actuellement il n’existe pas de modèle informatique de la régulation du glucose sanguin.

Réduction

Une partie des animaux utilisés sont des animaux de réforme, c’est-à-dire des souris transgéniques de génotype non pertinent non utilisables en protocole et non replaçables, systématiquement euthanasiées en dehors de ce projet. L’utilisation de ces animaux contribue à la réduction du nombre d’animaux, en évitant de produire des animaux uniquement pour les étapes de mises au point. Le nombre de souris utilisées dans la procédure d’étude a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux, du métabolisme du glucose et des connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 16 souris maximum par génotype et par sexe seront utilisés pour déterminer si la production de glucose par l’intestin peut être mesurée par une sonde télémétrique placée en veine porte. Au total, ce projet réalisé sur 4 ans nécessitera 130 souris transgéniques.

Raffinement

Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Ces interventions seront réalisées par des personnes expérimentées avec du matériel biocompatible et adapté à la souris. Pendant l’intervention chirurgicale, les souris seront placées sur un tapis chauffant afin de maintenir leur température corporelle entre 36 et 38°C et un gel lubrifiant sera déposé sur les yeux. En fin d’intervention, les animaux seront réhydratés par une injection sous-cutanée de solution physiologique et surveillés dans une pièce chauffée à 28°C pour faciliter leur récupération. Le suivi post-opératoire se fera dans une pièce dont la température sera réglée à 24°C pendant une semaine pour favoriser la reprise de poids des souris. De l’aliment hydraté sera également mis à disposition dans la cage les jours suivants. Les injections répétées sous la peau seront réalisées en changeant de point d’injection pour éviter des inflammations locales. La mise en place d’une grille de score pendant toute la durée du projet permet d’adapter la surveillance et l’utilisation d’antalgiques selon l’état de l’animal. Cette grille de score et l’utilisation de points limites adaptés ont permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet.

Choix des espèces

En ce qui concerne la régulation de la glycémie, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux, comme la souris, dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le protocole sera réalisé chez des souris adultes âgées de 12 semaines, âge auquel les animaux ont un meilleur rétablissement post-chirurgical.

Gavage quotidien pendant cinq jours, chirurgie du lymphœdème, injection de cellules tumorales, puis jusqu'à huit prélèvements sanguins à la queue par test de tolérance : 530 souris, en grande majorité des femelles, subissent ces actes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet porte sur le rôle des hormones féminines dans le système lymphatique et la diffusion métastatique, et se déroule dans deux établissements entre lesquels les animaux sont transportés. Le porteur écrit que la chirurgie du lymphœdème ne génère pas d'effet indésirable majeur, tout en listant les signes qui déclencheraient un analgésique, dos voûté, yeux plissés, absence de toilettage. Les souris sont tuées à la fin de chaque procédure pour récolter les tissus.

Objectifs

Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Lors de la formation d’une tumeur solide, il représente la première voie de dissémination métastatique vers les ganglions. Egalement, une dysfonction de ce système abouti à la formation de lymphoedème, une accumulation massive de de fluide et tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoèdèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs. L’AJOUT DE DEUX TECHNIQUES NÉCESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISÉ (MESURE DE LA COMPOSITION CORPORELLE ET TEST DE TOLÉRANCE ORALE AUX LIPIDES).

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le lymphoedème, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.

Procédures

Dans le premier établissements utilisateur : dans un premier temps, une gavage quotidienne pendant 5 jours sera effectuée. Ensuite, sous anesthésie générale, une échographie de suivi (20min), ou une intervention chirurgicale (15min) et/ou une injection de cellules tumorales seront réalisées (2min). TROIS FOIS AU COURS DU PROTOCOLE, UNE MESURE DE LA COMPOSITION CORPORELLE, un test de tolérance au glucose et UN TEST DE TOLÉRANCE LIPIDIQUE SERONT RÉALISÉS, ESPACÉS DE DEUX JOURS. LA COMPOSITION CORPORELLE SERA ÉVALUÉE PAR RMN (MINISPEC, BRUKER) CHEZ DES SOURIS ÉVEILLÉES (2 MINS). LES TESTS DE TOLÉRANCE AU GLUCOSE ET LIPIDES IMPLIQUENT UN GAVAGE (20 SEC), SUIVI DE PRÉLÈVEMENTS SANGUINS SÉQUENTIELS À LA QUEUE (8 POUR LE TEST DE TOLÉRANCE AU GLUCOSE ET 4 POUR LE TEST DE TOLÉRANCE LIPIDIQUE). Dans le second établissement utilisateur : les animaux peuvent être soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie juste avant la mise à mort. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure.

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal. La chirurgie du lymphoedème ne génère pas d'effet indésirable majeur chez l'animal. Toutefois, si l'animal présente des signes de souffrance (dos vouté, yeux plissés, absence de toilettage), un traitement avec un analgésique sera mis en place. LE MINISPEC PEUT PROVOQUER UN STRESS LÉGER ET TEMPORAIRE DÛ AU CONFINEMENT. LE GAVAGE PEUT CAUSER UN STRESS TEMPORAIRE, UNE LÉGÈRE IRRITATION DE L’ŒSOPHAGE ET UN RISQUE D’ASPIRATION, AVEC UN RISQUE MINIME DE LÉSIONS SI LA TECHNIQUE EST CORRECTE.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. D’autre part, la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cela permettra de réagir rapidement si un animal atteint un des points limites détaillés dans chaque procédure. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la croissance tumorale avec formation de métastases ou l'apparition du lymphoedème secondaire après curage ganglionnaire. De plus, l'invalidation génique du récepteur aux oestrogènes ERα a été généré seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet : - des souris conduisant à une invalidation du ERα de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 22 semaines.

Toutes tuées à l'issue, tumeur et intestin prélevés pour analyse, 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau des cellules d'une lignée tumorale colorectale, qui forment une masse en trois semaines, puis des traitements d'immunothérapie ou de chimiothérapie censés la réduire. Une nécrose apparaît parfois et entraînerait la mise à mort des souris concernées, ce que le porteur relativise en indiquant que le modèle sous-cutané n'entraîne jamais de métastases et atténue "une possible souffrance". Il conclut au caractère "indispensable" du modèle in vivo pour évaluer l'efficacité dans un "contexte physiologique complet".

Objectifs

Il s'agit d'approfondir la connaissance des mécanismes impliqués dans la résistance aux immunothérapies et chimiothérapies du cancer colorectal et d'explorer de nouvelles pistes thérapeutiques, afin de limiter la progression du cancer et le sensibiliser au traitement d'immunothérapie ou de chimiothérapie dans un modèle de souris porteuse de tumeur.

Bénéfices attendus

Ce projet veut apporter la preuve de concept que la résistance au traitement d'immunothérapie ou de chimiothérapie peut être levé avec l'administration d’un anticorps thérapeutique contre Reg3b.

Procédures

Le modèle expérimental consiste à injecter sous la peau des cellules d'une lignée tumorale d'origine colorectale. Ces cellules vont se multiplier pour former une masse tumorale qui reste cependant limitée (

Impact sur les animaux

Le modèle tumoral sous-cutané qui sera utilisé induit après 3 semaines une tumeur s’accompagnant parfois d’une nécrose qui dans la plupart des cas n’entraine ni saignement, ni ulcération. Le développement de nécrose entrainerait l’euthanasie des souris concernées. Il faut noter que pour les modèles utilisés, la masse de cellules tumorales reste délimitée au niveau sous-cutané et n'entraine jamais d'envahissement ou de métastases, ce qui limite les effets chez les animaux et attenue une possible souffrance.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés et différents organes analysés (tumeur, intestin...)

Remplacement

L’utilisation d’un modèle in vivo est indispensable dans ce projet pour évaluer l’efficacité thérapeutique dans un contexte physiologique complet. Contrairement aux modèles in vitro, qui permettent uniquement une analyse partielle et simplifiée des mécanismes cellulaires, le modèle in vivo reproduit la complexité du microenvironnement tumoral, incluant les interactions entre cellules tumorales, cellules immunitaires et signaux microbiens.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux tout en garantissant une puissance statistique suffisante, des groupes de 6-8 souris seront constitués pour chaque condition expérimentale. Ce choix repose sur des expériences préliminaires ayant mis en évidence une variabilité interindividuelle de la croissance tumorale.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un environnement présentant des enrichissements dans les conditions usuelles prévues par la législation. Ils seront manipulés par des personnes formées dans une salle dédiée séparée de la zone d’hébergement. Au maximum, deux manipulateurs différents s'occuperont des animaux tout au long du protocole. Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront surveillés par du personnel formé avec un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (changement de comportement et perte de réponse comportementale au stimulus externe). Une semaine après injection des cellules tumorales, les animaux sont suivies tous les 2-3 jours (Lu, Me, Ve) avec mesure des tumeurs ce qui permet d'intervenir rapidement en cas d'évolution anormale.

Choix des espèces

Les lignées de souris utilisées sont tolérantes aux cellules tumorales injectées ce qui permet leur croissance (pas de phénomène de rejet). Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8-16 semaines) pour permettre au microbiote intestinal de se stabiliser et au système immunitaire d’être à maturité.

Un virus est injecté dans le cerveau au cours d'une chirurgie d'environ une heure, puis chaque souris reçoit une injection intrapéritonéale par jour pendant quatre semaines et vit deux mois sous rationnement alimentaire, maintenue à 90 à 95 % de son poids. 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour vérification anatomique et analyse de marqueurs biologiques. L'objectif déclaré est de comprendre le rôle de deux structures cérébrales dans la transition attentionnelle, avec une perspective annoncée vers les troubles du spectre autistique. La tâche comportementale, présentée comme n'induisant ni douleur ni stress, est seulement décrite comme "choisie parmi deux possibilités", sans que le RNT dise lesquelles.

Objectifs

Les déficits attentionnels affectent une large proportion des personnes atteintes d’un syndrome autistique (jusqu’à 80%). De récentes études suggèrent que les difficultés sensorielles et attentionnelles dans le trouble du spectre autistique seraient étroitement liées. Ainsi, ces personnes auraient des difficultés à sélectionner les stimuli sensoriels appropriés, ce qui entrainerait une surcharge cognitive. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle que joue l’attention dans le trouble du spectre autistique. Plus précisément, ce projet examinera l’implication de deux structures cérébrales ainsi que leur interaction lors d’une tâche comportementale permettant d’évaluer la capacité de transition attentionnelle chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure connaissance des structures et circuits impliqués dans l’attention. Ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle, en particulier pour le trouble du spectre autistique.

Procédures

Les animaux seront soumis à une tâche comportementale n'induisant ni douleur ni stress, choisie parmi deux possibilités. Ils auront un rationnement alimentaire qui n'excédera pas deux mois. Ils subiront une chirurgie qui dure en moyenne 1h. Ils recevront une injection i.p. quotidienne pendant 4 semaines maximum.

Impact sur les animaux

Les chirurgies d’injection intra cérébrale de virus présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en rationnement alimentaire léger (pour les maintenir à 90-95% de leur poids corporel initial) ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire). Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale. Les animaux recevront des injections i.p. une fois par jour pendant la durée de la restriction alimentaire (maximum quatre semaines). Cela peut entrainer un léger stress ainsi qu’une légère douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour l’analyse des marqueurs biologiques et les vérifications anatomiques.

Remplacement

Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’humain n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs et exploitables. Le nombre d’animaux par groupe est le minimum requis pour que nos tests conservent assez de puissance en tenant compte des pertes inévitables.

Raffinement

Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables dans notre recherche, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté et seront hébergés en cage collective. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales. Le suivi post-opératoire sera effectué quotidiennement pendant 7 jours pour s’assurer de la récupération complète des souris. Des points limites généraux et spécifiques ont été mis en place afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort. Tous les expérimentateurs et soigneurs sont formés et compétents dans les procédures requises pour ce projet et ont suivi les formations obligatoires.

Choix des espèces

D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez la souris des aptitudes cognitives complexes que l’on retrouve chez l’humain. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes âgés de 6-8 semaines au début des expérimentations. Ils atteindront 10-12 semaines avant le début des chirurgies et des protocoles comportementaux afin de limiter la variabilité de taille. Cet âge a également été choisi pour être cohérent avec les données de la littérature.

Soumises à un régime riche en lipides qui, selon le porteur, peut les empêcher de se mouvoir normalement, puis opérées pour recevoir une greffe de cellules tumorales, 645 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite des injections d'anticorps deux fois par semaine, un substrat lumineux destiné à rendre les tumeurs visibles à l'imagerie, et un prélèvement sanguin toutes les quatre semaines sous anesthésie. Toutes sont tuées pour le prélèvement de leurs organes. L'objectif déclaré reste fondamental, décrire le comportement d'un type de lymphocyte dans un foie malade, alors que le résumé s'ouvre sur l'absence de tout traitement de la fibrose hépatique et de la stéatohépatite.

Objectifs

Nous avons étudié des métastases hépatiques de cancer colorectal chez l’homme et découvert qu’un type de cellules immunitaires, les cellules T résidentes mémoires (Trm), était lié à une meilleure survie des patients. Cependant, leur présence est associée à un moins bon pronostic dans la progression du cancer. Ces cellules pourraient même favoriser la tumeur dans le contexte d’une stéatohépatite non alcoolique (NASH). Pour comprendre leur rôle, nous développons un modèle de souris atteintes de NASH et y introduisons différents types de tumeurs, afin d’étudier le comportement des Trm avec ou sans immunothérapie au sein de ces tumeurs.

Bénéfices attendus

Malgré les progrès sur la compréhension des mécanismes physiopathologiques de la NASH, actuellement il n’existe aucune thérapie permettant de traiter la fibrose hépatique et/ou la NASH. Le but de ce travail est de déterminer l’impact de la NASH sur la différenciation et le rôle des Trm dans un contexte tumoral.

Procédures

Prélèvement sanguin : cela concerne tous les animaux 1 fois toutes les 4 semaines et sera réalisé sous anesthésie. Application des traitements : cela concerne les animaux appartenants aux groupes nécessitant un traitement. Le traitement par anticorps se fera 2 fois par semaine pendant 2 semaines via une injection. Greffe de cellules tumorales par chirurgie sous anesthésie : cela concerne les animaux pour lesquels un développement de tumeurs métastatiques est souhaité et ne sera réalisé qu’une fois. Injection d’un susbtrat lumineux sous anesthésie afin de détecter les cellules tumorales : cela concerne les animaux pour lesquels un développement de tumeurs sera métastatique. Ces injections se feront 2 fois par semaine pendant 2 semaines.

Impact sur les animaux

Une période d’acclimatation d’une semaine est prévue avant le démarrage de l’expérimentation afin de réduire le stress des animaux à leur arrivée à l’animalerie. L’utilisation du régime alimentaire riche en lipide va engendrer une prise de poids qui pourra engendrer des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Pour reproduire chez la souris la formation de métastases provenant d’un cancer, il faut réaliser une intervention chirurgicale. Ces manipulations peuvent provoquer de la douleur, une perte de poids ou parfois des infections liées à la chirurgie. Les métastases qui se développent ensuite peuvent aussi entraîner de l’inconfort chez les animaux. Pour surveiller leur état, ils seront observés régulièrement et la progression des tumeurs sera suivie grâce à une imagerie. Cette imagerie est rapide et réalisée sous anesthésie, ce qui évite tout stress supplémentaire pour les animaux.

Devenir

A la fin des procédures, toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement des organes et analyses.

Remplacement

La stéato-hépatite non alcoolique (NASH) est une maladie complexe causée par un déséquilibre du métabolisme des graisses, associé à une inflammation et à la formation de fibrose. À ce jour, aucun modèle de laboratoire ne permet de reproduire de manière complète ces interactions multiples malgré le développement des modèles de culture de plusieurs types de cellules. Ainsi, le recours à un modèle animal reste nécessaire pour étudier sur le long terme la progression de la NASH et son influence sur le développement tumoral afin de tester de nouveaux traitements.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide de l’outil EDA (The Experimental Design Assistant). Cet outil développé par le NC3Rs, une organisation scientifique basée au Royaume-Uni aide les chercheurs du monde entier à appliquer les principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner). L’EDA calcule le nombre minimum nécessaire d’animaux pour obtenir des résultats fiables et mettre en évidence l’efficacité des traitements tout en limitant l’utilisation d’animaux.

Raffinement

Les souris seront habituées aux manipulations dès leur arrivée pour réduire le stress. Elles vivront en groupe dans des cages enrichies avec abris, matériel de nidification, température et lumière contrôlées, et auront accès libre à la nourriture et à l’eau. Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées par un chirurgien. Les chirurgies se feront sous anesthésie, avec prévention des infections, tapis chauffants à 37°C pour éviter l’hypothermie, et surveillance continue des signes vitaux. Les souris recevront des antidouleurs ainsi qu’une réhydratation avant et après la chirurgie. Enfin, le suivi des tumeurs se fera par imagerie sous anesthésie légère, une méthode non douloureuse et non invasive.

Choix des espèces

Chez la souris, les modèles de NASH sont bien standardisés et reproductibles via une alimentation adéquate. La majorité des études fondamentales et précliniques sur la NASH sont faites chez la souris. La souris présente un système immuno-physiologique très proche de celui de l’Homme. La progression vers la fibrose et le cancer du foie sont mieux décris chez la souris et la validation de biomarqueurs est également mieux décrite. Dans ces modèles, les animaux sont utilisés à l’âge adulte, entre 6 semaines et 8 semaines. Du fait que la mise en place du modèle prend 9 à 25 semaines, des animaux d’âge supérieur ne seront pas utilisés dans ces modèles.