Oncologie

Injection dans l'utérus de femelles gestantes après ouverture de l'abdomen, injection déclenchant une naissance prématurée, transfert des nouveau-nés prématurés à une mère adoptive, anesthésie de souriceaux sur la glace, chirurgie stéréotaxique de deux heures sur adultes : 4 185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur prévoit des saignements vaginaux, des mises bas prématurées difficiles et le rejet possible des petits par la mère adoptive. Le projet cherche comment une inflammation pendant la gestation ou une naissance prématurée perturbent la construction du cerveau, croisées avec des risques génétiques de troubles neuropsychiatriques. Il annonce des procédures "établies afin de limiter la douleur, l'angoisse ou le stress", après avoir décrit un protocole qui provoque délibérément des naissances prématurées et sépare des nouveau-nés de leur mère.

Objectifs

L’objectif de notre projet est de mieux comprendre la mise en place d’un organe complexe tel que le cerveau des mammifères. En effet, il a été montré que des défauts de son développement, contribuent à l’étiologie de plusieurs maladies neurologiques et psychiatriques (troubles du spectres autistique, schizophrénie ou troubles bipolaires). Il apparaît donc essentiel mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent le développement du cerveau. En particulier nous voulons comprendre comment des changements environnementaux au cours du développement (inflammation pendant la gestation et chez le juvénil, naissance prématurée ou absence de cellules immunitaires embryonnaire) perturbent l’élaboration du cerveau. De plus, nous analyserons l'impact additif, convergent ou synergique des perturbations environnementales avec des risques génétiques associés aux troubles neuropsychiatriques. Notre projet vise à déterminer le lien entre environnement et prédisposition génétique sur la mise en place du cerveau chez la souris. En combinant la génétique de la souris avec un ensemble d’outil d’analyses biologiques disponible nous souhaitons comprendre comment la naissance prématurée ou les fonctions immunitaires au cours de la gestation provoquent des perturbations pouvant causer de défauts de développement du cerveau associés à des pathologies.

Bénéfices attendus

Les maladies neuropsychiatriques trouvent souvent leur origine dans des perturbations du développement du cerveau, notamment au cours de périodes critiques allant de la vie prénatale à l'adolescence. Cette complexité provient d'une combinaison de facteurs génétiques et d'influences environnementales incluant des perturbations immunitaires (inflammations) lors des étapes cruciales du développement ou une naissance prématurée. Des études ont montré qu’une grande prématurité et des perturbations immunitaires modifient non seulement directement le développement, mais ont également un impact sur les cellules immunitaires du cerveau. De plus, nous analyserons l'impact additif, convergent ou synergique des perturbations environnementales avec des risques génétiques qui ont été identifiés dans divers troubles neuropsychiatriques chez l’homme. Ainsi, comprendre comment des perturbations gène/environnement impact sur les processus développementaux entourant la naissance et sur la formation du cerveau représente un intérêt majeur de santé publique.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à différents gestes techniques selon les questions scientifiques : 1) Chirurgie sur femelle gestante analgésiées et anesthésiées pour procéder à une injection in utero de molécules dans des embyrons (20 minutes). 2) Injection unique sur femelle gestante ou animal juvenil vigiles d’une solution induisant une inflammation (quelques secondes). 3) Injection unique sur femelle gestante vigile d’une solution permettant d’induire une naissance prématurée par voie basse (quelques secondes). 4) Adoption de nouveaux nés prématurés par une mère adoptive issué d’un autre croisement. 5) Injection répétée quotidiennement d’une substance permettant de moduler les niveaux de sérotonine dans des nouveaux nés (quelques secondes). 6) Anesthésie sur glace et injections de marqueurs neuronaux sur souriceaux (environ 10 min). 7) Chirurgie sur animaux adultes analégésiés et anesthésiés pour injections stéréotaxiques de traceurs axonaux (max 2h).

Impact sur les animaux

Les contentions nécessaires à la réalisation d'une injection peuvent induire un stress chez les animaux, principalement en raison de la manipulation et de la restriction physique temporaire imposées. Ce stress, bien que transitoire, peut perturber le comportement normal des animaux et provoquer des réactions physiologiques liées à l’anxiété. De plus, elles peuvent engendrer une douleur légère de courte durée consécutive à l’introduction de l’aiguille ainsi que la possibilité de saignement. L’anesthésie peut quant à elle provoquer des effets secondaires comme : un stress thermique, une hypotension ou une détresse respiratoire. Plus spécifiquement : 1) La chirurgie requise sur femelle gestante analgésiée et anaesthésiée pour l’injection in utero de molécules peut avoir un impact sur i) le déroulement de la gestation des femelles en provoquant des saignements vaginaux ou au site d’incision abdominale ; ii) sur le développement des embryons conduisants à des mises bas prématurées et des difficultés de mise bas. 2) Les injections sur femelle gestantes pour déclencher une naissance prématurée ou sur nouveaux-nés pour moduler la sérotonine peuvent engendrer un stress lié à la contention, provoquer un léger saigenement au site d’injection. 3) Le transfert de nouveaux nés prématurés à une mère adoptive peut engendrer un stress chez les petits ou chez la mère pouvant conduire à une reget de celle-ci. 4) Les injections de molécules inflammatoires sur femelles gestantes ou animal juvenile peuvent engendrer un stress lié à la contention, un léger saigenement ainsi qu’une réaction inflammatoire transitoire au site d’injection. 5) Les chirurgies requisent pour es injections de traceurs axonaux i) chez les nouveaux-nés, peuvent provoquer des saignements au point d’incision et d’injection ; ii) chez l’adulte, nécessite une chirurgie de l’animal analgésié sous anesthesie gazeuse qui peut conduire à des effets secondaires lié à l’anesthesie (stress thermique ou respiratoire) ainsi qu’à des saignements au site d’incision.

Devenir

L'ensemble des animaux impliqués dans ce projet (4185) seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites. Pour l'ensemble du projet, les cerveaux des souris seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques, immunohistochimiques ou transcriptomique.

Remplacement

L’étude des interactions des gènes et de l’environnements dans l’élaboration cerveau en cours de développement nécessite impérativement l’utilisation d’un organisme complet. Ce processus dépend en effet d’une multitude de signaux corporels qui influencent directement le comportement des cellules et leurs interactions avec le tissu. Des signaux hormonaux, immunitaires, de tensions des tissus, de la circulation sanguine, de l’environnement de la mère ou des neurones en développement. Ces processus, hautement coordonnés, ne peuvent être reproduits ni par des systèmes de culture (in vitro), qui présentent des limitations spatiales et temporelles, ni par des organoïdes, qui manquent de la diversité et des interactions cellulaire nécessaires. Les simulations informatiques, quant à elles, se limitent aux molécules bien caractérisées et ne permettent pas d’étudier les mécanismes encore largement inconnus qui régissent les phases précoces de développement du cerveau. De plus, nos travaux s’inscrivent dans la continuité de nos recherches antérieures. L’utilisation d’un modèle mammifère in vivo est indispensable pour observer ces mécanismes dans leur environnement physiologique

Réduction

Un total de 4185 animaux sera nécessaire à la réalisation de ce projet. Notre projet est conçu pour minimiser le nombre de souris utilisées tout en garantissant des résultats scientifiquement robustes. La taille de chaque stade d’analyse a été optimisée pour pouvoir utiliser le test statistique approprié et obtenir des résultats statistiquement fiables. En effet, à cause des variabilités inter-animal et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Ainsi, grâce à notre expérience préalable dans des projets similaires, nous avons déterminé que 8 animaux (4 de chaque sexe) constituent la taille optimale par groupe expérimental. Cela équilibre le besoin de robustesse statistique et la réduction du nombre d'animaux. Les procédures expérimentales ont été établies pour éviter l’utilisation inutile de souris. De plus, après le sevrage des souriceaux, les mères non traitées pourront être réutilisées dans de nouveaux accouplements. Enfin, dans nos différentes conditions expérimentales, si un résultat n’est pas concluant lors de la première analyse (immunohistochimie), alors les autres expériences prévues ne seront pas réalisées. Cette stratégie contribue significativement à la réduction du nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les mesures de raffinement qui seront mises en œuvre sont liés aux aspects des procédures et concernent l’établissement de points limites, l’hébergement et l’enrichissement de l’environnement des souris. Nous réduirons au maximum l’inconfort ces souris car les procédures que nous mettons en œuvre sont établies afin de limiter la douleur, l’angoisse ou le stress. Nous appliquerons des soins et ou actes nécessaires. Durant les procédures, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux et des séances d’habituation à la manipulation des animaux pourront être anticipées afin de limiter le stress de contention lors des injections. Nous examinerons le comportement et l’apparence des souris ayant subi une procédure ou dont la mère aura subi un traitement pour détecter tout inconfort et un analgésique pourra être injecté. La présence de points limites définis et adaptés pour chacune des procédures nous permettra de détecter toute souffrance chez la souris. En cas d’atteinte de points limites et de souffrance grave ne pouvant être traitée, l’animal sera immédiatement retiré du projet et euthanasié sur décision de l’expérimentateur ou du personnel de l’animalerie, si l’expérimentateur n’est pas joignable. Les animaux sont hébergés dans des conditions respectant la réglementation en vigueur : hébergement en surpression, portoirs avec des cages ventilées individuellement, stabulation en nombre limité par cage, eau et nourriture à volonté, change litière et biberons hebdomadaires, vérification quotidienne, température et hygrométrie contrôlées, intensité et durée d’éclairage définies, enrichissement du milieu : papier kraft, coton et maison en carton. L’ensemble des procédures seront toujours réalisées par des personnes formées et compétentes.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de laboratoire largement utilisées pour étudier le fonctionnement du corps et les effets de ses dysfonctionnements à différents niveaux, que ce soit au niveau du comportement, du fonctionnement physiologique ou des organes. Elles sont également essentielles pour créer des modèles qui nous aident à mieux comprendre certaines maladies humaines. Leur grande similarité génétique avec l'homme, combinée à la possibilité d'utiliser un grand nombre de souris modifiées génétiquement, en fait un excellent choix pour répondre à nos questions de recherche. En outre, leur cycle de reproduction rapide et leur petite taille facilitent leur gestion tout en permettant d’étudier une espèce ayant un développement proche de celui des humains. La courte période de gestation des souris, ainsi que le nombre élevé d’embryons, nous permettent de générer suffisamment d'animaux pour mener plusieurs expériences à partir de quelques parents seulement. Dans le cadre de nos recherches en cours et pour tirer parti des outils génétiques disponibles dans notre laboratoire, nous continuerons à utiliser ce modèle de souris. Dans le cadre de notre projet, les animaux seront utilisés à différents stades de développement, adaptés aux objectifs expérimentaux spécifiques allant de l’embryon jusqu’à l’adulte. Ainsi, les cerveaux seront analysés à 2 stades embryonnaires, en fin de gestation, stades critiques pour l‘élaboration du cerveau. Les cerveaux des souriceaux seront étudiés à diiférents stades après la naissance, des périodes critiques pour la maturation du cerveau. Enfin, les souris juvéniles et adultes seront utilisées pour explorer la persistance et les conséquences à long terme Ce choix stratégique garantit une compréhension globale des processus allant de la formation fœtale à la maturation et au maintien des circuits dans des contextes normaux et pathologiques.

À huit semaines, 48 souris passent à un régime hypercalorique pour 21 semaines, qui les rend diabétiques vers la seizième. À vingt semaines, elles reçoivent une injection quotidienne pendant cinq jours pour bloquer une voie de production du glucose par le foie. Suivent deux tests de glycémie sous contention, quatorze prélèvements de sang à la queue, une mesure de composition corporelle et 72 heures seules en cage métabolique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un dernier prélèvement de sang après six heures de jeûne, puis la mise à mort immédiate, pour prélever les tissus sensibles à l'insuline.

Objectifs

L’obésité et le diabète sont actuellement reconnus comme des épidémies mondiales et nécessitent de proposer de nouvelles stratégies de traitement. Diminuer la production de sucre (glucose) par le foie est une stratégie efficace de traitement du diabète de type 2. Cependant, les médicaments utilisés et prescrits en première intention induisent des effets secondaires et ne peuvent pas être utilisés par l’ensemble des patients. La production de sucre par le foie dépend de deux mécanismes : une sortie dans le sang par un transporteur et une sortie par des vésicules. L’inhibition de la production de glucose par les vésicules permet de protéger du développement du diabète. L’objectif de ce projet réalisé dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2) est de déterminer si l’inhibition de la production de glucose par les vésicules permet de traiter le diabète de type 2, une fois qu’il est installé. L’inhibition de cette production de glucose spécifique sera réalisée grâce à des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de déterminer si l’inhibition de la production de glucose par des vésicules dans le foie est efficace pour traiter le diabète de type 2, lorsqu’il est induit par un régime hypercalorique chez la souris. Ces résultats permettront de mettre en évidence une nouvelle stratégie de traitement du diabète de type 2 et ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements efficaces, et présentant potentiellement moins d’effets secondaires que les médicaments actuels.

Procédures

Toutes les souris : - seront soumises à un régime hypercalorique dès l’âge de 8 semaines et pendant 21 semaines. Ce régime est connu pour induire un état diabétique à partir de la 16ième semaine de régime chez des souris témoins (EU1 + EU2). - recevront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes par souris) pour inhiber la voie de production vésiculaire de glucose par le foie (EU1). - subiront 2 tests pour analyser la régulation de leur glycémie pendant 2h après l’injection de glucose ou d’insuline (injections réalisées en 20 à 30 secondes chez la souris maintenues en contention) chez des animaux mis à jeun pendant 6h (EU1). Pour chaque test, 7 prélèvements de sang seront réalisés à l’extrémité de la queue en 15 secondes à 1 min maximum sur des souris libres de mouvement. Une seule incision de l’extrémité de la queue sera réalisée avant le premier prélèvement de sang. - seront soumises à mesure de la composition corporelle par un analyseur dédié (EU2). Cette mesure sera réalisée chez l’animal éveillé mais maintenu immobile. Elle est rapide (2 minutes) et non invasive, - seront isolées pendant 72h dans des cages spécifiques pour mesurer leur dépense énergétique (EU2). On mesurera leurs échanges gazeux (respiration), leur prise alimentaire et hydrique et leur activité physique. Cette mesure se fait de manière non-invasive. En fin d’expérience, une prise de sang terminale sera faite rapidement (en moins de 15-20 secondes) après une mise à jeun pendant 6h (EU1). L’animal sera mis à mort immédiatement après la prise de sang pour permettre le prélèvement de certains organes, qui seront ensuite étudiés en laboratoire (EU1).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : - un léger stress lors de leurs immobilisations nécessaires pour la réalisation de certains gestes (biopsie, injections), - une légère douleur lors des injections - une possible inflammation localisée au niveau de la zone d’injection - une soif augmentée, une envie fréquente d’uriner, de la fatigue, et éventuellement le développement d’un état légèrement anxieux, symptômes précoces liés au développement du diabète. - une douleur lors de l’incision de l’extrémité de la queue - les symptômes liés à une hypoglycémie liée à l’injection d’insuline, c’est-à-dire une baisse de leur activation jusqu’à leur prostration, un mal-être, voir des convulsions et un coma si l’hypoglycémie est sévère. -un stress léger dû à la privation de nourriture pendant 6h. - un stress lié à l’immobilisation pour la mesure de la composition corporelle et pendant l’isolement de 72h pour la dépense énergétique

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes afin d’analyser si l’amélioration de l’état diabétique est observée dans les différents tissus sensibles à l’insuline.

Remplacement

L’objectif de cette étude est d’évaluer l’impact de la modification d’une fonction hépatique sur la physiologie de l’organisme entier. Cette réponse physiologique dépend de plusieurs dialogues inter-organes complexes (entre le foie, les reins, l’intestin, les muscles, le cerveau) qui ne peuvent actuellement pas être reproduits par des modèles cellulaires ou virtuels.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire pour observer une amélioration de la réponse à l’apport important (bolus) de glucose, qui est affectée chez les patients diabétiques de type 2, est le paramètre pris en compte pour calculer le nombre d’individus nécessaire. Ce nombre a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des résultats d’études précédentes : soit un maximum de 12 individus par groupe. Cette étude sera réalisée en comparant des souris témoins (sans modification de leurs gènes), qui développent un diabète lorsqu’elles sont nourries avec un régime hypercalorique, et des souris modifiées génétiquement dont la production de glucose par le foie est réduite de moitié. L’étude sera réalisée chez des mâles et chez des femelles. Au total, ce projet nécessitera 48 souris (24 mâles et 24 femelles).

Raffinement

- Pour éviter les inflammations des organes causées par les injections dans l’abdomen, la modification génique sera réalisée par une injection d’un produit sous la peau à différents endroits. - La préhension des souris sera réalisée par transfert à l’aide d’un tunnel pour réduire le stress. - Pour les mesures répétées de la glycémie, une petite incision de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une pommade anesthésiante. Le sang sera ensuite prélevé sans autre incision en grattant la croute et en massant la queue pour éviter toute autre incision. Les volumes de sang prélevés resteront très limités conformément aux recommandations internationales sur le bien-être animal. - Afin de limiter l’état légèrement anxieux développé par les souris rendues diabétiques, leur hébergement sera très enrichi pour leur permettre de s’isoler, de se cacher. - Le changement de la litière et la surveillance de leur consommation d’eau seront plus fréquents après 16 semaines de régime hypercalorique. - Le stress lié à l’isolement pour la mesure du métabolisme énergétique sera atténué en plaçant de la litière souillée de la cage d’origine des souris et par l’ajout d’un tube leur permettant de se cacher. Une période de découverte de ce nouvel environnement sera réalisée pendant 3 h, puis une période d’acclimatation de 24h précédera les mesures. - Les animaux seront pesés toutes les semaines et seront observés pour détecter tout signe de mal-être, souffrance, lésions ou de détérioration de l’état de santé général avec la mise en place de points limites précoces. Les souris seront euthanasiées soit à la fin de l’étude ou plus tôt si leur état de santé se dégrade, afin de prélever différents organes pour des analyses moléculaires.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris pour notre projet de recherche car, contrairement à d’autres espèces comme le poisson, elle possède des mécanismes de régulation de la glycémie similaires à ceux de l’être humain. De plus, il est possible dans cette espèce de désactiver précisément un gène important dans le foie grâce à des techniques génétiques avancées. Enfin, les outils d’analyses moléculaires, comme des anticorps, spécifiques de la souris sont disponibles en laboratoire. Le modèle de souris génétiquement modifié est unique et original car il permet de réduire de moitié la production de glucose par le foie. Les manipulations sur les souris seront limitées et réalisées à différents âges : La biopsie de tissu pour caractériser les gènes des souris sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7-10 jours. Les souris seront nourries avec un régime hypercalorique à l’âge adulte (8 semaines) pendant 8 semaines pour induire un état prédiabétique. La modification génique sera induite à ce stade (20 semaines), et son impact sera mesurée par différentes approches métaboliques nécessitant environ 9 semaines avant la mise à mort des souris.

Rendues diabétiques par 21 semaines de régime hypercalorique, 48 souris reçoivent des injections d'insuline dont le porteur indique qu'elles peuvent provoquer prostration, convulsions et coma. Elles subissent aussi quatorze prélèvements de sang à l'extrémité de la queue, une mesure de composition corporelle sous contention et 72 heures d'isolement en cage métabolique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réparties entre deux établissements. Le porteur qualifie ces deux dernières mesures de non invasives, tout en listant le stress qu'elles causent. Les 48 souris sont tuées après un dernier prélèvement de sang, pour prélever les tissus sensibles à l'insuline et vérifier si l'état diabétique s'améliore.

Objectifs

L’obésité et le diabète sont actuellement reconnus comme des épidémies mondiales et nécessitent de proposer de nouvelles stratégies de traitement. Diminuer la production de sucre (glucose) par le foie est une stratégie efficace de traitement du diabète de type 2. Cependant, les médicaments utilisés et prescrits en première intention induisent des effets secondaires et ne peuvent pas être utilisés par l’ensemble des patients. La production de sucre par le foie dépend de deux mécanismes : une sortie dans le sang par un transporteur et une sortie par des vésicules. L’inhibition de la production de glucose par les vésicules permet de protéger du développement du diabète. L’objectif de ce projet réalisé dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2) est de déterminer si l’inhibition de la production de glucose par les vésicules permet de traiter le diabète de type 2, une fois qu’il est installé. L’inhibition de cette production de glucose spécifique sera réalisée grâce à des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de déterminer si l’inhibition de la production de glucose par des vésicules dans le foie est efficace pour traiter le diabète de type 2, lorsqu’il est induit par un régime hypercalorique chez la souris. Ces résultats permettront de mettre en évidence une nouvelle stratégie de traitement du diabète de type 2 et ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements efficaces, et présentant potentiellement moins d’effets secondaires que les médicaments actuels.

Procédures

Toutes les souris : - seront soumises à un régime hypercalorique dès l’âge de 8 semaines et pendant 21 semaines (EU1 + EU2). Ce régime est connu pour induire un état diabétique à partir de la 16ième semaine de régime chez des souris témoins. - recevront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes par souris) pour inhiber la voie de production vésiculaire de glucose par le foie (EU1). - subiront 2 tests pour analyser la régulation de leur glycémie pendant 2h après l’injection de glucose ou d’insuline (injections réalisées en 20 à 30 secondes chez la souris maintenues en contention) chez des animaux mis à jeun pendant 6h (EU1). Pour chaque test, 7 prélèvements de sang seront réalisés à l’extrémité de la queue en 15 secondes à 1 min maximum sur des souris libres de mouvement. Une seule incision de l’extrémité de la queue sera réalisée avant le premier prélèvement de sang. - seront soumises à mesure de la composition corporelle par un analyseur dédié (EU2). Cette mesure sera réalisée chez l’animal éveillé mais maintenu immobile. Elle est rapide (2 minutes) et non invasive, - seront isolées pendant 72h dans des cages spécifiques pour mesurer leur dépense énergétique (EU2). On mesurera leurs échanges gazeux (respiration), leur prise alimentaire et hydrique et leur activité physique. Cette mesure se fait de manière non-invasive. En fin d’expérience, une prise de sang terminale sera faite rapidement (en moins de 15-20 secondes) après une mise à jeun pendant 6h (EU1). L’animal sera mis à mort immédiatement après la prise de sang pour permettre le prélèvement de certains organes, qui seront ensuite étudiés en laboratoire (EU1).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : - un léger stress lors de leurs immobilisations nécessaires pour la réalisation de certains gestes (biopsie, injections), - une légère douleur lors des injections - une possible inflammation localisée au niveau de la zone d’injection - une soif augmentée, une envie fréquente d’uriner, de la fatigue, et éventuellement le développement d’un état légèrement anxieux, symptômes précoces liés au développement du diabète. - une douleur lors de l’incision de l’extrémité de la queue - les symptômes liés à une hypoglycémie liée à l’injection d’insuline, c’est-à-dire une baisse de leur activation jusqu’à leur prostration, un mal-être, voir des convulsions et un coma si l’hypoglycémie est sévère. -un stress léger dû à la privation de nourriture pendant 6h. - un stress lié à l’immobilisation pour la mesure de la composition corporelle et pendant l’isolement de 72h pour la dépense énergétique

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes afin d’analyser si l’amélioration de l’état diabétique est observée dans les différents tissus sensibles à l’insuline.

Remplacement

L’objectif de cette étude est d’évaluer l’impact de la modification d’une fonction hépatique sur la physiologie de l’organisme entier. Cette réponse physiologique dépend de plusieurs dialogues inter-organes complexes (entre le foie, les reins, l’intestin, les muscles, le cerveau) qui ne peuvent actuellement pas être reproduits par des modèles cellulaires ou virtuels.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire pour observer une amélioration de la réponse à l’apport important (bolus) de glucose, qui est affectée chez les patients diabétiques de type 2, est le paramètre pris en compte pour calculer le nombre d’individus nécessaire. Ce nombre a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des résultats d’études précédentes : soit un maximum de 12 individus par groupe. Cette étude sera réalisée en comparant des souris témoins (sans modification de leurs gènes), qui développent un diabète lorsqu’elles sont nourries avec un régime hypercalorique, et des souris modifiées génétiquement dont la production de glucose par le foie est réduite de moitié. L’étude sera réalisée chez des mâles et chez des femelles. Au total, ce projet nécessitera 48 souris (24 mâles et 24 femelles).

Raffinement

- Pour éviter les inflammations des organes causées par les injections dans l’abdomen, la modification génique sera réalisée par une injection d’un produit sous la peau à différents endroits. - La préhension des souris sera réalisée par transfert à l’aide d’un tunnel pour réduire le stress. - Pour les mesures répétées de la glycémie, une petite incision de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une pommade anesthésiante. Le sang sera ensuite prélevé sans autre incision en grattant la croute et en massant la queue pour éviter toute autre incision. Les volumes de sang prélevés resteront très limités conformément aux recommandations internationales sur le bien-être animal. - Afin de limiter l’état légèrement anxieux développé par les souris rendues diabétiques, leur hébergement sera très enrichi pour leur permettre de s’isoler, de se cacher. - Le changement de la litière et la surveillance de leur consommation d’eau seront plus fréquents après 16 semaines de régime hypercalorique. - Le stress lié à l’isolement pour la mesure du métabolisme énergétique sera atténué en plaçant de la litière souillée de la cage d’origine des souris et par l’ajout d’un tube leur permettant de se cacher. Une période de découverte de ce nouvel environnement sera réalisée pendant 3 h, puis une période d’acclimatation de 24h précédera les mesures. - Les animaux seront pesés toutes les semaines et seront observés pour détecter tout signe de mal-être, souffrance, lésions ou de détérioration de l’état de santé général avec la mise en place de points limites précoces. Les souris seront euthanasiées soit à la fin de l’étude ou plus tôt si leur état de santé se dégrade, afin de prélever différents organes pour des analyses moléculaires.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris pour notre projet de recherche car, contrairement à d’autres espèces comme le poisson, elle possède des mécanismes de régulation de la glycémie similaires à ceux de l’être humain. De plus, il est possible dans cette espèce de désactiver précisément un gène important dans le foie grâce à des techniques génétiques avancées. Enfin, les outils d’analyses moléculaires, comme des anticorps, spécifiques de la souris sont disponibles en laboratoire. Le modèle de souris génétiquement modifié est unique et original car il permet de réduire de moitié la production de glucose par le foie. Les manipulations sur les souris seront limitées et réalisées à différents âges : La biopsie de tissu pour caractériser les gènes des souris sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7-10 jours. Les souris seront nourries avec un régime hypercalorique à l’âge adulte (8 semaines) pendant 8 semaines pour induire un état prédiabétique. La modification génique sera induite à ce stade (20 semaines), et son impact sera mesurée par différentes approches métaboliques nécessitant environ 9 semaines avant la mise à mort des souris.

924 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur leur est implantée dans la patte arrière droite, ce qui selon le porteur peut réduire leur mobilité au point de gêner leur accès à la nourriture, et peut se nécroser en provoquant une douleur. Suivent cinq gavages, une injection dans l'abdomen, puis la mise à mort échelonnée un, trois, cinq, huit et dix jours après traitement, pour prélever tumeurs, poumons, rates et ganglions. L'objectif est de savoir si ajouter une chimiothérapie au régorafénib élimine les cellules immunosuppressives que ce médicament fait apparaître, le porteur concluant que "les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d'un organisme".

Objectifs

Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de trouver des traitements afin de le soigner. Le régorafénib est un traitement utilisé dans le traitement de multiples cancers solides. En dépit des conséquences bénéfiques connues contre la tumeur après ce traitement, nous avons observé l’augmentation d’une population de cellules immunosuppressives. Le but de ce projet est d’évaluer si la combinaison du Régorafénib avec un autre traitement couramment utilisé contre le cancer, une chimiothérapie connue pour éliminer ce type de cellules immunosuppressives, permettrait d’obtenir une meilleure efficacité antitumorale et de comprendre pourquoi. Nous regarderons les conséquences de cette combothérapie sur la croissance tumorale et sur l’infiltrat immunitaire au cours du temps avec l’espoir de pouvoir prochainement proposer une nouvelle combinaison thérapeutique à tester en étude clinique.

Bénéfices attendus

Le cancer représente un enjeu majeur de santé publique, nécessitant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces et mieux tolérées par les patients. Ce projet s'inscrit dans une démarche appliquée visant à évaluer l'intérêt de la combothérapie associant le Régorafénib et le 5-FU dans le modèle murin de cancer colorectal MC38. L'objectif est de déterminer si cette approche combinée permet d'améliorer l'efficacité du traitement en modulant favorablement l'environnement tumoral et en renforçant la réponse immunitaire antitumorale. En validant cette stratégie thérapeutique dans un modèle préclinique, ce projet pourrait contribuer à l'optimisation des traitements actuels et ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques plus performantes et mieux tolérées en clinique.

Procédures

Les animaux sont injectés en sous-cutané dans la patte inférieure droite sous anesthésie gazeuse avec les cellules tumorales (5 minutes pour l’anesthésie et 30 secondes pour l’injection). Par la suite, un suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine : les souris seront traitées en intra-péritonéale (30 secondes), une seule fois. Le gavage aura lieu 5 fois avec des sondes souples pour limiter le risque de blessures à l’œsophage. 1,3,5,8 et 10 jours après les traitements par chimiothérapie et Régorafénib, les souris sont mises à mort sous anesthésie générale à l’isoflurane (5 minutes pour l’anesthésie et 10 secondes pour la mise à mort). Par la suite, les tumeurs, les ganglions drainants et rates sont récupérés (2 minutes).

Impact sur les animaux

L’injection des cellules tumorales au niveau patte inférieur droite pourrait entrainer une diminution de la mobilité des souris. Cette diminution de mobilité pourrait diminuer la capacité des souris à se nourrir. L’injection des cellules tumorales se fait en sous-cutanée. De ce fait, nous pourrions observer des nécroses au niveau de la tumeur conduisant à une douleur chez l’animal. Les chimiothérapies utilisées peuvent entrainer une perte de poids chez les souris.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les poumons, tumeurs, rates et ganglions.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=7 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 3 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections sous-cutanées (cellules tumorales), intra-péritonéales (traitements) et intra-veineuse (cellules tumorales) seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les modèles expérimentaux pour lesquels on trouve plus facilement et en plus grand nombre des réactifs spécifiques à l’espèce. Les souris sont l’espèce de référence pour les études précliniques en cancérologie, permettant la reproduction et la validation des résultats facilement pas la communauté scientifique. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.

Laissées vieillir jusqu'à dix-huit ou vingt et un mois, les souris de ce projet développent tumeurs, fibroses rénales, cataractes, alopécies et plaies cutanées, et le porteur anticipe qu'un cinquième d'entre elles mourra de mort naturelle avant la fin. 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des organes. Chacune reçoit six injections en trois mois, trois prélèvements sanguins de 200 microlitres, trois collectes d'urine, de fèces et de poils, et douze pesées. Des points limites précoces sont annoncés dès les premiers signes de souffrance, alors que la dégradation liée à l'âge constitue ici le matériau même de l'expérience.

Objectifs

Ce projet fait partie d'une étude plus globale de caractérisation du rôle d’une réponse immunitaire face à des cellules abîmées ou stressées par le vieillissement dites sénescentes. Nous avons observé que bloquer un composé présent sur les cellules sénescentes par un anticorps avait un effet bénéfique sur la survie des animaux et le développement des maladies liées à l’âge, notamment la fibrose pulmonaire. Cet effet est conservé jusqu’à un an après l’arrêt du traitement. Le sujet de cette étude est de comprendre le mécanisme de maintien de l’effet vaccinal induit par cet anticorps.

Bénéfices attendus

Par cette étude on s’attend à avoir une meilleure compréhension mécanistique des interactions entre le système immunitaire et les cellules sénescentes au cours du vieillissement. Cela pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement les cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âge incluant le cancer. Les résultats de cette étude devraient nous permettre de mieux développer l’anticorps et d’envisager des essais cliniques de phase précoce chez l’homme.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injections: chaque animal recevra 6 injections, réalisées toutes les deux semaines pendant une durée de 3 mois. Prélèvements sanguins : chaque animal fera l’objet de 3 prélèvements de 200 µL, réalisés une fois par mois pendant la durée de l’étude (3 mois). Collecte d’urine, de fèces et de poils : chaque animal sera soumis à une collecte mensuelle, soit 3 collectes au total. Pesées : chaque animal sera pesé une fois par semaine, soit 12 pesées sur la durée de l’étude. Ces interventions sont réalisées sur l’ensemble des 200 animaux inclus dans le projet.

Impact sur les animaux

Le phénotype âgé favorise l’apparition de nombreuses maladies. Entre 18 et 21 mois, nous anticipons une perte de 20 % des animaux par mort naturelle. Les souris âgées peuvent ainsi développer : des tumeurs, de la fibrose rénales, des cataractes, des alopécies et des plaies cutanées Les injections peuvent provoquer une très légère douleur et de l’inflammation sur le site d’injection et l’animal peut ressentir un stress au moment de la contention.

Devenir

Afin de caractériser l'effet de notre vaccination notamment l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les différents organes des animaux traités et non traités. Nous devons pour cela procéder à l’euthanasie de l'ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire, cellulaire et histologique est indispensable pour évaluer les effets de notre anticorps sur le vieillissement cellulaire.

Remplacement

Nous avons montré in vitro que certaines cellules sénescentes (cellules stressées ou endommagées qui s’accumulent avec le vieillissement) produisent des molécules capables de bloquer l’action du système immunitaire. L’utilisation d’un anticorps spécifique a permis de restaurer cette action et de limiter le développement de la fibrose, avec un effet bénéfique sur la survie des souris. Ces résultats ont été observés à la fois dans des modèles de fibrose induite et chez des souris âgées. Ces expériences ont permis d’identifier les doses efficaces et le bon moment d’action de l’anticorps. Nous souhaitons désormais comprendre comment ce traitement agit dans un organisme complet, en particulier chez des animaux âgés, où les cellules sénescentes apparaissent naturellement. Les interactions entre cellules immunitaires et cellules sénescentes sont complexes et impliquent plusieurs organes. Aucune méthode in vitro ne peut reproduire cette complexité. Seule une étude chez l’animal permet de savoir si le traitement réduit bien la présence de cellules sénescentes, réactive le système immunitaire, et limite les maladies liées à l’âge tout en améliorant la santé à long terme.

Réduction

Pour cette étude, nous avons dimensionné les groupes d’animaux en utilisant un plan d’expérimentation permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer une taille d'effet attendue et ajuster en conséquence le nombre d'animaux nécessaires en utilisant des données préliminaires. Cela garantit des résultats fiables, tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous mettons en place plusieurs mesures pour réduire la douleur, le stress et la souffrance : Suivi quotidien : Les animaux seront observés chaque jour à l’aide d’une grille clinique. En cas de dégradation de leur état, la fréquence du suivi sera augmentée. Cohésion sociale : Les animaux seront hébergés par petits groupes compatibles, afin de préserver leur bien-être social tout au long de l’étude. Habituation : Une phase d’habituation à la manipulation est prévue avant les interventions, afin de limiter le stress lors des gestes expérimentaux. Points limites précoces : Des seuils d’arrêt clairement définis seront appliqués dès l’apparition des premiers signes de souffrance, pour éviter toute douleur inutile. Suivi longitudinal : Un suivi dans le temps permettra de détecter précocement d’éventuels signes de mal-être, notamment par le contrôle du poids, du comportement et de l’état général. Alimentation adaptée : En cas de difficultés de déplacement ou de prise alimentaire, de la nourriture humidifiée sera mise à disposition directement dans la cage. Utilisation d'une méthode d'anesthésie (la plupart des animaux expérimentaux). Enrichissements supplémentaires : matériaux à manipuler (copeaux de bois compacts) et des objets à déplacer (bâtonnets) Toutes ces mesures sont mises en place pour limiter la souffrance, améliorer le confort des animaux, et garantir des conditions expérimentales éthiques et rigoureuses.

Choix des espèces

Le modèle murin a une physiologie proche de l’homme (squelette osseux, poumons) et un cycle de vie relativement court. Chez la souris, les mécanismes de réparation et de dérégulation de la physiologie des tissus sont très bien décrits. Ils permettent une analyse précise de l'ensemble des phases mises en jeu au cours de ces évènements biologiques. Le modèle murin choisi est le seul nous permettant une approche intégrative des processus impliqués dans les maladies liées à l’âge. En effet, il permet d’étudier de façon concomitante les cellules immunitaires, les cellules sénescentes et l’avancement des maladies.

Une pince arrache une petite touffe de poils à chaque animal, souriceau compris, pour vérifier que la modification génétique a bien pris. 1 225 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec un traitement d'induction administré dès l'âge de un à sept jours ou à des femelles gestantes et allaitantes, six prélèvements sanguins sur les jeunes, des immobilisations en tube de moins de trois minutes et deux injections dans la semaine précédant la mise à mort. Le porteur compare la douleur de l'arrachage de poils à "celle des interactions sociales entre deux souriceaux". Toutes seront tuées pour que leurs os soient examinés en histologie et que le taux d'inactivation du gène cible soit mesuré.

Objectifs

La croissance chez l’humain est un phénomène complexe, influencé à la fois par la génétique, l’épigénétique, l’environnement et les interactions entre ces facteurs. Les mécanismes régulant ce développement ne sont pas tous complètement connus notamment lorsque leurs dérégulations conduisent à des retards de croissance. Une meilleure compréhension des causes de déficits de croissance chez l’enfant en période périnatale permettrait à la médecine de mieux accompagner les familles concernées par ce problème chez leurs enfants et de leur proposer un traitement adapté le cas échéant. L’axe hormonal somatotrope coordonne la croissance fœtale, post-natale, le métabolisme, et le vieillissement chez les humains ainsi que chez les rongeurs. L’inactivation de cet axe hormonal impacte la durée de vie et affecte l’ossature globale des souris en conduisant à de petites tailles. La possibilité de provoquer un retard de croissance en période périnatale au sein d’un modèle animal permettra de mieux définir d’éventuelles pistes thérapeutiques dans le contexte de la croissance de l’enfant. Notre projet vise donc à contribuer à la compréhension de l’impact de l’axe hormonal somatotrope sur la croissance périnatale.

Bénéfices attendus

Cette étude renforcera les connaissances de bases sur les défauts de croissance osseuse observés chez les enfants qui ont un faible poids de naissance et conservent un retard de croissance. Dans la population, le petit poids de naissance représente 9 pourcents de l’ensemble des naissances. Leur croissance est le plus souvent rattrapée dans les deux premières années de vie, mais seulement 10 pourcents de ces enfants restent petits. Cette étude montrera le rôle essentiel des facteurs de croissance dans la croissance osseuse. Les connaissances acquises grâce à ces travaux seront utiles en clinique pour proposer de nouveaux traitements contre les retards persistants de croissance chez l’enfant.

Procédures

Les animaux seront soumis à un traitement afin d’induire la modification génétique. Plusieurs modes d’administration et stades de développement au moment de l’administration seront possibles selon la question scientifique : par l’alimentation (prise spontanée durant 1 à 3 jours), par injection selon différentes voies (pendant 3 jours, 10 secondes sur animal vigile), par administration orale (1 fois par jour pendant 3 jours, 10 secondes sur animal vigile). Tous les animaux se verront prélever une petite touffe de poils pour la vérification de l’induction du modèle à l’aide d’une pince (animal vigile, quelques secondes par animal). Les animaux seront ensuite pesés/mesurés régulièrement pour suivre la croissance. Les animaux seront impliqués dans une détermination longitudinale de composition corporelle (masse grasse, masse maigre, eau) à l’aide d’un équipement d’imagerie en plaçant l’animal vigile dans un tube et en l’immobilisant durant moins de 3 minutes. Certains jeunes animaux subiront des prélèvements sanguins de faible quantités (6 fois, moins de 30 secondes, animal vigile). D’autres prélèvements sur adultes seront effectués sur 2 mois afin de réaliser des dosages hormonaux (4 fois, moins de 30 secondes, animal vigile - espacés de 2 semaines entre chaque prélèvement). Une semaine avant l’euthanasie, une partie des animaux recevront deux injections espacées d’une semaine nécessaire pour visualiser la croissance osseuse (animal vigile, quelques secondes par animal). Enfin, une partie des animaux subiront une injection unique au niveau de l’abdomen quelques minutes avant l’euthanasie. L’injection sera effectuée sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. L’ensemble des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Impact sur les animaux

Le traitement nécessaire à l’induction du modèle implique l’administration d’une molécule aux animaux. Ainsi, une contention est nécessaire, ce qui peut entrainer un léger stress et une douleur/irritation de courte durée au site d’administration. En cas de répétition des injections, il y a un risque (rare) de péritonite. La prise d’aliments contenant cette molécule pourra aussi être source d’un léger stress lors du changement d’aliment car les souris sont de nature néophobe (peur de la nouveauté) et une perte de poids. Les prélèvements de sang nécessaires aux dosages d’hormones seront source d’un stress et d’une douleur de courte durée. Un risque de saignement ou d’hématome existe à l’issu du prélèvement. Le prélèvement de poils pour la vérification de l’induction du modèle sera effectué par prise de très petites touffes de poils. Ce type de prélèvement induit une légère douleur similaire à celle des interactions sociales entre deux souriceaux. Les animaux seront impliqués régulièrement dans un suivi impliquant une pesée, une mesure de la taille, une mesure de la composition corporelle, ce qui pourra induire un stress de courte durée lié à la contention manuelle ou dans un tube pour maintenir l’animal (inférieur à 3 minutes). Une semaine avant l’euthanasie, une partie des animaux recevront deux injections espacées d’une semaine nécessaire pour visualiser la croissance osseuse. Ces deux injections peuvent induire un stress en raison de la contention et une douleur de courte durée liée à la piqûre. Enfin, l’anesthésie précédant certaines euthanasies implique une injection pouvant induire un stress en raison de la contention et une douleur de courte durée liée à la piqûre.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issue des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour l’étude histologique ou biochimique des tissus osseux. La récupération des tissus post-mortem permettra une analyse des taux d’inactivation du gène cible.

Remplacement

Ce projet a pour but d’étudier comment les différents organes communiquent lors de la croissance d’un individu. Pour cela, il utilise un organisme vivant et complet, qui permet de modéliser la croissance humaine. En effet, aucun modèle cellulaire ne peut reproduire les interactions complexes entre les organes d’un corps entier. Les souris sont choisies pour ce projet car leur croissance est influencée par des facteurs hormonaux similaires à ceux des humains. Elles permettent donc de mieux comprendre la croissance, notamment en observant l’impact de l'arrêt de certains gènes dans un contexte hormonal. L’utilisation de modèles vivants (in vivo) est essentielle, car seule cette approche permet de suivre l’effet des hormones sur la croissance. En plus, les recherches sur les souris bénéficient d’outils et de protocoles bien établis. Les études faites sur ces animaux ont permis d’obtenir des informations cruciales sur le fonctionnement des organes, que l’on ne pourrait pas obtenir à partir de cellules seules, car elles manquent de régulation hormonale.

Réduction

Le projet impliquera un total de 1225 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte-tenu des données de la littérature et des effets espérés, un test de puissance statistique a été́ utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour cette étude. Des tests statistiques seront également utilisés pour les analyses des résultats. Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Les procédures expérimentales sont affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. L’utilisation de l’ensemble des animaux issu d’une portée qui inclue les mutants et les contrôles permet de réduire substantiellement le nombre de souris nécessaire pour l’étude proposée. Le nombre d’animaux par groupe testés dans chaque expérience nous permettra donc une comparaison statistique adaptée tout en tenant compte des impératifs de réduction.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi en continu à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures et nos gestes expérimentaux afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive des naissances et de la croissance post-natale. Les pesées seront réalisées dans les premiers jours de vie par préhension avec les mains en forme de coupelle pour minimiser le stress de l’animal. Nous avons inclus dans les protocoles de mesure de croissance une grille d’évaluation des animaux, incluant des observations cliniques et le suivi de poids des animaux. Nous prenons soin de constituer des groupes où des individus de petite taille sont accompagnés d’individus de taille normale afin d’assurer une bonne maintenance de leur température corporelle. Les animaux fragiles identifiés seront soumis à une vigilance accrue et des décisions appropriées seront prises afin de minimiser une éventuelle douleur de l’animal. Des soins adaptés quand cela est possible/nécessaire seront prodigués voire une euthanasie compassionnelle si cela est requis. Les administrations seront réalisées avec du matériel adapté à l’âge des animaux et par du personnel formé/compétent pour les actes mis en œuvre.

Choix des espèces

JJustification de l’espèce : Le récepteur aux facteurs de croissance est spécifique des mammifères et ne permet pas l’utilisation d’autres organismes plus simples. La régulation de la croissance chez la souris est similaire à celle de l’homme. Dans une étude intégrée des phénomènes de perturbation de la croissance, la souris représente un modèle idéal puisqu’elle est un des seuls mammifères qui permet assez facilement une approche par transgénèse avec élaboration de modèles génétiques complexes. Justification des stades de développement : Les traitements au tamoxifène seront initiés sur des animaux âgés de 1 à 7 jours, ou sur des femelles de 2 mois allaitantes ou gestantes. Nous analyserons les effets de ce traitement sur les premières phases de croissance pré-pubertaire. Le suivi des animaux sera poursuivi sur 6 mois au maximum. L’objectif du projet est d’étudier les répercussions sur la morphologie de la structure osseuse dès les premiers jours de vie et jusqu’à l’âge adulte.

304 souris génétiquement modifiées pour développer un cancer de la glande surrénale vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 192 d'entre elles sont gavées tous les jours pendant deux mois, 144 reçoivent des injections dans l'abdomen deux jours par semaine sur la même durée, et les 304 sont rasées sur les flancs pour quatre échographies sous anesthésie gazeuse. Le porteur revendique une réduction du nombre d'animaux en exploitant les deux surrénales de chaque individu, l'une pour l'analyse moléculaire, l'autre pour l'histologie, et affirme qu'aucune nuisance n'est attendue de la tumeur puisque les souris seront tuées avant qu'elle ne les gêne. Le cancer visé frappe 0,5 à 2 personnes par million et par an, et le bénéfice annoncé se limite à démontrer, chez la souris, le potentiel de deux approches thérapeutiques.

Objectifs

Avec un dimorphisme sexuel présentant un ratio femmes/homme de 1.5 à 2.5 :1, et une incidence annuelle de seulement 0,5 à 2,0 cas par million d'individus, le carcinome corticosurrénalien est considéré comme un cancer agressif, environ 35 % des patients présentant des métastases lors du diagnostic initial. Le mauvais pronostic du carcinome corticosurrénalien peut être attribué au manque de thérapies efficaces. En effet, un traitement curatif n'existe que pour les patients porteurs de carcinome corticosurrénalien à faible agressivité qui subissent une résection chirurgicale complète. Par conséquent, les patients présentant une récidive ou une maladie métastatique, pour lesquels la chirurgie n’est pas une option, n’ont pratiquement aucune chance de survie à long terme. L'immunothérapie a sans aucun doute révolutionné le traitement du cancer au cours des années précédentes. Cependant, les résultats des essais d'immunothérapie pour le carcinome corticosurrénalien ont été modestes, probablement à cause de l’hyperactivité endrocrine trouvée dans 50 à 60% des carcinome corticosurrénalien qui induit une immunosuppression. Des approches alternatives visant à augmenter l’efficacité des immunothérapies doivent donc être envisagées. Une option c’est de lever cette immunosuppression en modulant l’activité endocrine, plus spécifiquement en inhibant les glucocorticoïdes, afin de pouvoir favoriser l’activité anti-tumorale de différents acteurs du système immunitaire, notament les lymphocytes T et les macrophages. En utilisant un modèle de souris génétiquement modifiée, reproduisant des altérations génétiques identifiées chez les patients poteurs de carcinome corticosurrénalien, nous allons donc évaluer le potentiel thérapeutique de l’inhibition des glucocorticoïdes sur des carcinomes corticosurrénaliens avancés, seule ou en co-thérapie avec les différentes immunothérapies afin de stimuler l’activation des différents acteurs anti-tumoraux du système immunitaire et augmenter l’efficacité du traitement. De même, l’échec des immunothérapies peut s’associer à la présence de macrophages pro-tumoraux, qui vont eux aussi induire une immunosuppression. Ainsi, ce projet vise aussi à évaluer l’impact de la déplétion des macrophages pro-tumoraux sur le système immunitaire et la progression tumorale, afin d’évaluer la possibilité de la combiner avec des immunothérapies.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet nous permettra de démontrer le potentiel thérapeutique de l’inhibition des glucocorticoïdes ou de la déplétion des macrophages pro-tumoraux dans un modèle murin de carcinome corticosurrénalien avancé, avec l’objectif d’améliorer le pronostic du carcinome corticosurrénalien.

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivantes : - - Technique d’administration de médicaments guidée par micropipette (MDA) : cette technique ne nécessite pas d’anesthésie préalable. 192 souris (mâles et femelles confondues, âgés de 4 mois), seront gavées au quotidien pendant 2 mois avec des inhibiteurs de glucocorticoïdes ou le solvant correspondant. Le geste sera réalisé une fois par jour et ne durera que quelques secondes. - Injections intrapéritoneales : cette technique ne nécessite pas d’anesthésie préalable. 144 souris (mâles et femelles confondues, âgées de 4 mois), seront injectées deux jours par semaine pendant 2 mois avec des anticorps communément utilisés en immunothérapie, soit seuls (48 souris) , soit en combinaison avec l’inhibition des glucocorticoïdes (réalisée par gavage, 96 souris). 32 souris (mâles et femelles confondues, âgées de 4 mois), seront injectées une fois par semaine pendant 2 mois avec un anticorps neutralisant ou son contrôle pour éliminer les macrophages pro-tumoraux. Le geste sera réalisé une fois par jour et ne durera que quelques secondes. - Alimentation supplementée avec ou sans inhibiteur des macrophages : 32 souris, mâles et femelles confondues, âgées de 4 mois, seront nourries pendant 2 mois avec de la nourriture standard ou formulée avec l’inhibiteur de macrophages. - Échographie : realisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, 304 souris de 4 mois, mâles et femelles confondus, seront rasées sur les flancs et la taille de la tumeur sera mesurée à l’aide d’un échographe. Ce geste sera réalisé 4 fois par souris : une fois au début du traitement, une fois après un mois de traitement, et puis à 72 et 48h avant la mise à mort de la souris, et ne durera que 30 minutes à chaque fois.

Impact sur les animaux

L’administration de traitements par MDA (Administration de médicaments guidée par micropipette) est une technique de courte durée qui requiert seulement la contention des animaux. De même, les injections intrapéritoneales requierent seulement une brève contention des animaux (technique de courte durée). Pour cela, ces techniques réalisées de façon isolée n’induisent qu’un stress léger. Cependant, vu que les procédures décrites dans cette demande impliquent la répétition des MDAs tous les jours et des injections péritonéales plusieurs fois pas semaine pendant plusieurs semaines, ceci peut conduire à l’apparition d’un stress modéré et une douleur de faible intensité. Finalement, le modèle murin de CCS avancé (les souris dKO) présente un développement tumoral et éventuellement des métastases. Cependant, on n’attend pas de nuissances associés au dévelopement tumoral, puisque tous les animaux seront mis à mort avant que le développement tumoral n’induise une gêne.

Devenir

Tous les animaux ayant subi la procédure seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de réaliser les prélèvements nécessaires à la réalisation de différentes analyses ciblant le potentiel de l’inhibition des glucococorticoîdes ou l’élimination des macrophages pro-tumoraux comme nouvelles approches térapeutiques dans le traitement de corticosurrénalomes métastatiques.

Remplacement

Afin d’eviter la douleur et l’inconfort de l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux euthanasiés sans manipulation préalable. Cette technique est un bon modèle alternatif pour tester des facteurs clés ayant un potentiel comme agent antitumoral. Cependant, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.

Réduction

Dans l’optique de réduire de nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour une extraction d’ARN pour une analyse moléculaire et l’autre pour des analyses d’immunohistochimie. De même, le sang des animaux euthanasiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales ou de detection de cellules tumorales circulants. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimun nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 8 souris. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests adaptés.

Raffinement

L’administration répetée des différents traitements experimentaux peut entrainer une augmentation du stress chez les animaux. Afin de diminuer au maximum le stress de l’animal, on utilisera des techniques de manipulation non aversives, tels que la manipulation par tunnel, l’administration des médicaments par micropipette, ou la mise en place de procédures d’habituation à la contention nécessaire pour les injections intrapéritoneales. De même, nous donnerons un morceau de fromage à la fin de la manipulation en guise de récompense. En plus de la surveillance quotidienne par du personnel qualifié, une surveillance accrue sera réalisée pendant les 30 minutes suivant la manipulation des souris afin de vérifier l’absence de signes de douleur tels que comportements anormaux (léchage, grattage) ou altération des expressions faciales (changement dans la position du nez ou les oreilles), sur la base des points limites adaptés à la recherche animale en cancérologie. En cas des signes de douleur ou souffrance, des analgésiques seront administrés.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant les corticosurrénalomes. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Afin d’évaluer le potentiel de l’inhibition de glucocorticoïdes et de l’élimination des macrophages pro-tumoraux, en combinaison avec des immunothérapies, comme nouvelles approches thérapeutiques pour les carcinomes corticosurrénaliens métastatiques, nous utiliserons un modèle murin tumoral à 4 mois, moment où les premiers signes de malignité ont été détectés.

Une injection dans le ventre chaque jour, pendant toute la durée de l'étude, plus une greffe de tumeur sous la peau du flanc réalisée sous anesthésie : 80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse du microenvironnement tumoral, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit ces administrations comme non douloureuses et indique que le traitement peut accélérer la pousse tumorale, tout en jugeant que les tumeurs ne devraient pas entraver la vie des animaux. L'objectif reste de confirmer dans un corps vivant un mécanisme déjà identifié en culture cellulaire, la retombée thérapeutique étant renvoyée au plus long terme. Le choix de la souris tient à la modification génétique elle-même, le porteur affirmant qu'aucune autre espèce de rongeur ne la porte.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de trouver des traitements afin de le soigner. Plusieurs études se sont déjà attachées à identifier le rôle des différents globules blancs au cours d’un cancer. Parmi eux, les lymphocytes T CD8 ont un rôle majeur mais ils sont très souvent peu présents dans les tumeurs. Ce projet s’appuie sur des observations réalisées au cours desquelles nous avons observé qu’un gène particulier bloque la présence des CD8 dans les tumeurs. In vitro, nous avons identifié un mécanisme d’action et nous voulons aujourd’hui valider in vivo ce mécanisme.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de confirmer nos résultats préliminaires et apporterait des informations nouvelles et inattendues sur les CD8. De plus, Ces données permettront à plus long terme de proposer une nouvelle cible thérapeutique dans les cancers soit dans un contexte de thérapie cellules ou dans le développement de nouvelles molécules.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - des injections dans le ventre de quelques secondes - une injection sous cutanée de 30 secondes sous anesthésie afin de permettre le développement d’une tumeur

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à 1 injection de traitement dans le ventre (de quelques secondes) par jour sur toute la durée de l’étude. Ils seront également soumis à 1 injection sous cutanée (30 secondes) sous anesthésie à l’isoflurane afin de mettre en place une tumeur. Ces administrations ne sont pas douloureuses mais la contention peut induire un peu de stress. Le traitement peut entrainer une pousse tumorale plus rapide. Mais la taille des tumeurs sera évaluée tous les jours. Les tumeurs se développerons sur le flanc des animaux. Du fait de leur faible taille et de leur localisation, elles ne devraient pas entraver la vie des animaux. De plus, ces tumeurs ne forment pas de métastases et ne nécrosent pas.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux (80) pour analyse du microenvironnement tumoral.

Remplacement

Les expériences réalisées préalablement in vitro nous ont permis d’identifier un mécanisme d’action responsable de l’accumulation des CD8 dans les tumeurs. Néanmoins, les expériences in vitro ne peuvent pas mimer la complexité d’un organisme vivant. De ce fait, nous avons besoin de valider nos observations in vivo.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. 10 animaux par groupe seront utilisés pour évaluer le recrutement des CD8 dans les tumeurs. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, nous réaliserons les expériences 2 fois de manières indépendantes pour augmenter la force statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en zone conventionnelle à 10 par cage dans un environnement adapté et enrichi (tunnels, cachettes, matériaux pour leur permettre de faire leurs nids). De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Les injections SC (cellules tumorales) seront réalisées sous anesthésie. Aucune douleur associée à ce geste n’est donc attendue. Les injections IP seront réalisées sur des souris vigiles. Lors des l’injections nous utiliserons des seringues à insuline, comportant les aiguilles les plus fines disponibles permettra de réduire la douleur chez l’animal. Chaque animal sera observé quotidiennement, tout le long de l’expérimentation. Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

Ce projet nécessite des animaux transgéniques afin de pouvoir étudier le recrutement des CD8 dans les tumeurs. Les souris sont la seule espèce de rongeur existante avec cette modification génétique. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 14 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature