Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Étude du rôle du gène H13 au cours du développement chez la souris pour évaluer son implication dans une maladie rare, le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Colin.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Des souris construites pour porter l'anomalie d'empreinte parentale en cause dans le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin peuvent présenter un retard de croissance, un museau déformé, des troubles de l'alimentation et un tonus musculaire faible. 740 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont une lignée jamais étudiée pour laquelle 40 animaux font l'objet d'une surveillance renforcée. 240 sont pesées chaque semaine de 2 à 12 semaines, 120 embryons sont prélevés 14 jours et demi après la fécondation, 144 passent jusqu'à six tests moteurs et de mémoire, et 60 subissent deux prélèvements sanguins sans anesthésie. Toutes sont tuées à la fin du protocole, la majorité de leurs organes étant disséquée pour des analyses moléculaires et anatomopathologiques.
Objectifs
A la fécondation, nous héritons de deux copies de chaque gène, une de notre mère et une de notre père. Contrairement à la plupart des gènes qui sont activés de façon identique sur les deux copies, certains gènes sont activés différemment selon qu'ils proviennent du père ou de la mère. Ce phénomène, appelé "empreinte parentale", joue un rôle essentiel dans le bon déroulement de la croissance et du développement. Ainsi, lorsqu'une erreur survient dans ce mécanisme, cela peut entraîner des maladies rares. C’est le cas du syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin, qui se traduit par un retard de croissance, des difficultés pour s’alimenter et d’autres troubles du développement. Cette maladie est liée à une anomalie où un enfant reçoit deux copies d'un même chromosome uniquement de sa mère, au lieu d'une copie de chaque parent, ce qui perturbe l'équilibre nécessaire à une croissance normale. Afin de mieux comprendre les conséquences de ces erreurs d’empreinte, ce projet utilisera des lignées de cellules et de souris génétiquement modifiées. Plus précisément, les souris permettront d’étudier comment la transmission d’une modification génétique par la mère ou par le père influence la croissance, l’alimentation, le métabolisme et le développement général de l’animal. En comparant les effets selon l’origine maternelle ou paternelle, nous pourrons mieux cerner les mécanismes qui conduisent à l’apparition de troubles du développement. Ces recherches visent à améliorer la compréhension de ces maladies rares et pourraient, à long terme, aider à mettre en place de nouvelles stratégies de diagnostic et de traitement pour les patients.
Bénéfices attendus
Les maladies rares touchent environ 6 % de la population mondiale, ce qui constitue un enjeu important pour la santé humaine. La majorité d’entre elles sont dues à des anomalies génétiques et comprendre les causes de ces maladies est essentiel pour pouvoir mieux les diagnostiquer et, à terme, proposer des traitements plus adaptés. Ce projet s’intéresse à une maladie rare identifiée récemment, qui s’appelle le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin. Cette maladie provoque notamment des troubles de la croissance et du développement. Pour mieux comprendre ses origines, nous allons étudier une région de l’ADN, qui pourrait être impliquée dans son apparition. Grâce à des expériences menées chez la souris, nous allons analyser si des anomalies dans cette zone peuvent provoquer des symptômes similaires à ceux observés chez les patients. Si c’est le cas, cela permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de cette maladie. Cela pourrait aussi aider à identifier d'autres personnes atteintes de symptômes proches, mais dont la cause génétique n’a pas encore été trouvée. À terme, ce travail pourra contribuer à améliorer le diagnostic des maladies rares liées à la croissance et au développement, et ouvrir de nouvelles pistes pour aider les patients.
Procédures
Dans ce projet, plusieurs interventions seront réalisées afin d'étudier la croissance et le développement de différent modèle de souris. Pour l’une des lignées qui n’a jamais encore été étudiée, 40 animaux seront suivis de manière renforcée pour détecter tout signe de mal-être. Pour le suivi de la croissance après la naissance, 240 souris seront pesées une fois par semaine, de l’âge de 2 semaines à 12 semaines. Pour l’étude de la croissance embryonnaire, 120 embryons seront prélevés 14,5 jours après la fécondation (et 120 embryons à un autre stade si nécessaire) pour mesurer leur taille et leur poids. Parmi les souris dont la croissance aura été suivie, 144 seront soumises à des tests moteurs et neurodéveloppementaux, de difficulté légère à modérée, pour évaluer leurs capacités motrices, leur mémoire et leur niveau d'anxiété. Les nouveau-nés seront testés pour leur tonus musculaire entre 5 et 10 jours après la naissance. Ces manipulations seront brèves et limitées à 3 fois par animal. Chez les souris plus âgées, entre l’âge de 2 et 6 mois environ 144 souris seront observées pour évaluer leur activité motrice, leur équilibre, leur comportement face à des situations nouvelles ou légèrement stressantes, ainsi que leur capacité à mémoriser de simples trajets. Chaque animal réalisera jusqu’à 3 sessions d’observations espacées dans le temps (une toutes les 6 à 8 semaines environ), pour un total de 6 tests maximum par animal. Chaque session durera entre 5 et 30 minutes. Deux prélèvements sanguins (4 et 8 semaines) seront effectués sur 60 souris pour mesurer les hormones de croissance. Les prélèvements seront effectués sans anesthésie mais avec contention adaptée, par des personnes expérimentées.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés pourraient présenter certains signes observés dans une étude précédente, et proches de ceux décrits chez les personnes atteintes de la maladie étudiée. Cela peut inclure un retard de croissance, une augmentation du contenu minéral des os, une forme anormale du museau, des difficultés à bien réguler le taux de sucre après les repas, ainsi que des troubles de l’alimentation ou un tonus musculaire plus faible. Les interventions réalisées sur les animaux seront toutes effectués pour limiter l’inconfort des animaux. L’identification et le prélèvement pour analyse génétique seront réalisés une seule fois pour chaque animal. Cela pourra entraîner une gêne passagère et un stress très léger. Le suivi du poids, qui sera effectué chaque semaine, est une manipulation simple et rapide. Elle pourra générer un stress léger lié à la manipulation répétée. Les prélèvements sanguins, qui seront effectués au maximum deux fois dans la vie des animaux, pourra provoquer une gêne temporaire lors du prélèvement et un léger stress lié à la contention. Le test pour vérifier le tonus musculaire des nouveau-nés pourra entraîner un inconfort très bref dû à la manipulation. Les tests comportementaux réalisés sur les animaux plus âgés consisteront à observer leur activité, leur réaction à des environnements nouveaux ou leur capacité de mémoire. Ces observations, espacées dans le temps et limitées en nombre, pourront provoquer un stress passager lié à la nouveauté ou à une situation inhabituelle mais ne causeront pas de douleur.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés au cours des différentes procédures du projet décrit ici sera mis à mort à la fin du protocole. La majorité des organes sera disséquée et prélevée afin de poursuivre les études moléculaires et anatomo-pathologiques après avoir caractérisé le phénotype global des animaux.
Remplacement
Ce projet a pour but de mieux comprendre la fonction d’une région particulière de l’ADN, afin de savoir si elle joue un rôle dans une maladie rare qui affecte la croissance et le développement. Cette maladie entraîne notamment un retard de croissance, des difficultés de développement, et des problèmes touchant les muscles et les os. Pour répondre à cette question, nous utiliserons comme modèle la souris. Ce choix est nécessaire, car certains signes de la maladie – comme les retards de croissance ou les effets sur le développement de l’embryon – ne peuvent être étudiés que dans un organisme complet, en développement. Par exemple, pour savoir si un retard de croissance est lié à un problème de placenta (organe qui nourrit le bébé pendant la grossesse), il faut observer l’embryon au cours de son développement dans l’utérus, ce qui n’est pas possible sans utiliser un animal entier. En parallèle, certaines analyses plus fines, qui concernent l’activité de cette région de l’ADN seront faites en laboratoire sur des cellules. Ces cellules sont soit déjà disponibles, soit seront prélevées sur les animaux pour être étudiées sans avoir besoin d’utiliser à nouveau un animal entier.
Réduction
Le projet a été conçu pour utiliser le plus petit nombre d’animaux possible, tout en obtenant des résultats fiables et exploitables. Pour cela, les animaux sont élevés de manière optimisée : certaines portées contiendront à la fois les animaux à étudier ainsi que des contrôles, ce qui réduit le nombre total nécessaire. Les animaux participeront à plusieurs étapes de l’étude afin d’éviter les doublons : par exemple, les mêmes souris seront suivies pour leur croissance, soumises à des tests neuro développementaux simples, et recevront des prises de sang espacées. À la fin de l’étude, leurs organes seront conservés pour de futures analyses en laboratoire, ce qui permettra de continuer les recherches sans utiliser d'autres animaux.
Raffinement
Les animaux seront surveillés tous les jours par l’expérimentateur ou le personnel de l’animalerie afin de détecter rapidement tout signe de souffrance, et d’intervenir si nécessaire. Pour identifier les animaux, un prélèvement sera réalisé sur l’oreille. Cette procédure, effectuée par du personnel expérimenté, sera aussi rapide que possible pour limiter l’inconfort. La zone sera ensuite surveillée pendant deux jours afin de s’assurer qu’il n’y ait pas de complication. Certains animaux pourraient présenter des difficultés de croissance ou d’alimentation. Dans ce cas, un suivi renforcé sera mis en place, notamment par une surveillance régulière du poids. Si une perte de poids importante est constatée ou si l’animal montre des signes de difficulté à se nourrir, une alimentation spéciale et enrichie sera proposée. Pour l’un des modèles, pour lequel aucune donnée n’est disponible, une attention particulière sera portée sur deux générations. Des grilles d’observation standardisées permettront de décider si une surveillance renforcée est nécessaire ou, en cas de signes trop sévères, si l’animal doit être euthanasié. Enfin, tous les animaux vivront dans des cages spacieuses, en petits groupes, avec des éléments pour les stimuler et leur offrir du confort (abris en carton, papier pour faire des nids), conformément aux règles en vigueur.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle pour cette étude car elle partage avec l’être humain certains mécanismes importants (tel que celui étudié ici, l’empreinte parentale), ce qui permet d’étudier leur rôle dans des maladies humaines rares. Un modèle de souris spécialement conçu pour cette recherche existe déjà, ce qui permet de gagner du temps et d’utiliser des données déjà disponibles. La souris est aussi une espèce bien connue des chercheurs, pour laquelle de nombreux outils facilitent les analyses. Les souris utilisées seront âgées de quelques semaines à un an. Les études sur les jeunes souris commenceront à partir de 2 semaines après la naissance, pour suivre leur croissance et leurs comportements jusqu’à l’âge adulte. Pour comprendre les effets pendant la grossesse, certaines observations seront aussi faites sur les fœtus à différents moments de leur développement, en commençant par un stade précis et en adaptant ensuite si besoin.
Étude de la réponse immunitaire associée aux cellules dendritiques et lymphocytes T dans le microenvironnement tumoral du mélanome cutané
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
1 244 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, presque toutes tuées à l'issue, quinze restant en accouplement continu pour entretenir les lignées. 148 reçoivent sur les oreilles un analogue de la vitamine D pendant trois jours pour déclencher un mélanome, 540 une injection intradermique de cellules dendritiques dans les deux oreilles, 556 des injections intrapéritonéales d'immunothérapie deux fois par semaine pendant deux semaines. Le porteur annonce inflammation, démangeaisons et rougeur des oreilles, et une mise à mort dès que la tumeur atteint un centimètre cube. Il justifie le recours aux souris par le fait que le microenvironnement tumoral engage plusieurs organes, ce qui rend selon lui l'expérience in vivo "nécessaire", onze lignées génétiquement modifiées étant mobilisées.
Objectifs
Le mélanome cutané est un cancer se développant à partir de mélanocytes cancéreux, les cellules pigmentées de la peau. Le système immunitaire est généralement en mesure d’éliminer les cellules tumorales. Toutefois, les cellules tumorales peuvent perturber la réponse immunitaire de manière à favoriser leur propre croissance, ce qui impacte négativement le pronostic des patients atteints de mélanome cutané. Ce cancer de la peau est hautement agressif, premièrement à cause de son potentiel à métastaser, et deuxièmement par sa fréquente résistance à la plupart des immunothérapies et thérapies ciblées utilisées aujourd’hui. Notre laboratoire s'intéresse à une molécule qui possède un rôle pro-tumoral dans le microenvironnement tumoral associé au mélanome cutané. Cependant, les cellules et molécules impliquées dans la réponse immunitaire pro-tumorale sont encore mal connues. Le projet vise donc (1) à étudier dans un modèle murin de mélanome cutané, l’impact de cette molécule sur les différentes sous-populations cellulaires immunitaires ; (2) à identifier et étudier la fonction des sous-populations cellulaires immunitaire induite par cette molécule ; et enfin (3) à évaluer et améliorer l’effet du blocage de cette molécule associée à une thérapie déjà utilisée pour soigner les mélanomes cutanés chez l'humain. Afin de répondre à ces questionnements, nous étudierons la réponse immunitaire au niveau du microenvironnement tumoral associé au mélanome cutané ainsi que dans les ganglions lymphatiques drainant la tumeur et dans le sang.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à approfondir notre compréhension de la réponse immunitaire impliquée dans le développement du mélanome cutané. Par ailleurs, ces nouvelles connaissances sur les différentes sous-populations cellulaires immunitaires dans le microenvironnement tumoral pourraient nous permettre éventuellement de la moduler en agissant sur ces types cellulaires spécifiques. De plus, cette étude permettra également d'évaluer le potentiel d’une nouvelle cible thérapeutique afin d’améliorer la survie des patients atteints de mélanome cutané.
Procédures
Lors de la 1ère partie, 148 souris au maximum seront anesthésiée par voie gazeuse et traitées pendant une durée de 3 jours (le traitement est d'une durée d'environ 30 secondes) afin d'induire un mélanome cutané. Pour la 2ème partie du projet, 540 souris seront anesthésiées et injectées par voie intradermique avec des cellules immunitaires au niveau des deux oreilles, et gardés pendant 7 jours (l'injection est d'une durée de 6 minutes). Enfin, la 3ème partie concernera 556 souris qui seront injectées par voie intrapéritonéale 2 fois par semaine pendant 2 semaines (durée de 20 secondes) avec une immunothérapie combinée.
Impact sur les animaux
Une minorité des animaux de 2 lignées de souris utilisées (moins de 30% des effectifs) est susceptible de développer un phénotype dommageable se traduisant par l'apparition de tumeurs spontanées non pigmentées et à croissance rapide, un suivi particulièrement attentif sera mis en place. L'application d'analogue de ka vitamine D sur les oreilles des animaux sous anesthésie gazeuse légère engendrera un léger stress d'une courte durée. (Lors des transferts des cellules dendritiques, les animaux donneurs seront de la même espèce, du même sexe et du même fond génétique que les animaux receveurs (qui recevront l'injection de ces cellules) éliminant les risques de rejet. Néanmoins, cette procédure engendrera un léger stress et douleur d'une courte durée sur les animaux receveurs et une inflammation au niveau des oreilles, accompagnées de démangeaisons et d'une rougeur. Les injections intrapéritonéales d'anticorps sur d'autres modèles ont déjà été réalisées par le passé dans notre équipe, et nous n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection et un stress du à la contention sera ressenti pendant un temps court ( quelques secondes). Le traitement avec des anticorps devrait faire régresser la tumeur mais une rougeur pourrait apparaitre sur la peau recouvrant la tumeur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales afin de prélever les différents organes ou tissus nécessaires à l'étude de la réponse immunitaire dans le mélanome cutané. permettent de maintenir les lignées utilisées dans ce projet de recherche. Au maximum 15 animaux seront utilisés pour les expérimentations en utilisation continue, pour avoir 5 accouplements en continu.
Remplacement
Les lignées de souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet vont nous permettre d'étudier des gènes ou des cellules dont l'implication dans le mélanome a été suggéré in vitro par notre laboratoire ainsi que d'autres. Les phénomènes impliqués dans le mélanome cutané mettent en jeu différents organes et des réseaux impliquant plusieurs types cellulaires qui composent l'ensemble du microenvironnement tumoral. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Afin de différencier les rôles de différentes cellules et molécules pouvant être impliquées dans le développement du mélanome, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 11 lignées de souris différentes et d'un maximum de 1204 animaux. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions statistiquement significatives. Par ailleurs, des études préliminaires in vitro ont été réalisées afin d’éliminer certaines hypothèses et de mieux définir les expériences à effectuer sur les modèles in vivo.
Raffinement
Tous les animaux feront l'objet d'une observation quotidienne basée sur leur apparence générale, leur posture et leur comportement. Tous les animaux intégrés dans une procédure expérimentale seront soumis à l'application de points limites définis, stricts et spécifiques de ce projet. En cas de signes cliniques tels qu'un dos courbé, un pelage ébouriffé, une absence de réaction aux stimuli ou encore une inflammation ou une infection au niveau des sites d'injection, l'animal sera retiré de l'étude et pourra recevoir des soins selon l'avis du vétérinaire. Si l'état de l'animal est jugé critique (blessure importante par exemple), une euthanasie immédiate sera pratiquée. Pour les souris développant des tumeurs cutanées, un suivi renforcé sera assuré quotidiennement. Le volume tumoral sera mesuré à l'aide d'un pied à coulisse et l'euthanasie sera réalisée si la taille de la tumeur atteint 1 cm3. Toutes procédures pouvant induire douleur ou stress chez l'animal sera effectuée sous anesthésie légère gazeuse, n'engendrant qu'un stress léger de courte durée dû à la contention. Les animaux seront hébergés en groupe et auront un accès constant à de l'eau et de la nourriture pendant toute la durée de l'expérience.
Choix des espèces
Les mécanismes cellulaires dans le microenvironnement tumoral du mélanome cutané impliquent plusieurs organes différents (peau, ganglions lymphatiques, etc.) et ces interactions inter-organes nécessitent plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre la croissance tumorale, l'implication du système immunitaire et à terme, identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.
Etude de l’effet du pâturage séquentiel alterné mixte ovins/bovins sur le bien-être et le parasitisme des animaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Bovins : 22
Comparer deux conduites de pâturage, l'une mêlant ovins et bovins, l'autre spécialisée en ovins, place 292 brebis, agneaux et génisses dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Prélèvements de fèces par stimulation rectale chaque mois pendant quatre mois, prises de sang de 10 mL à la veine jugulaire ou caudale en début et en fin d'essai. Le porteur reconnaît qu'une très forte infestation parasitaire pourrait survenir, surtout chez les agneaux du lot spécialisé, ceux-là mêmes qui tiennent le rôle de point de comparaison. Aucun animal n'est tué dans le cadre du projet. Les brebis et les génisses rejoignent le troupeau de l'établissement, les agneaux repartent vers l'engraissement.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier les effets du pâturage séquentiel alterné entre ovins et bovins au printemps sur le parasitisme et le bien-être des animaux. Une de nos hypothèses de travail est que les bovins apportent un bénéfice aux ovins en termes de parasitisme, y compris lors de pâturage séquentiel alterné. L’expérimentation analytique vise donc à mesurer les effets de l’introduction d’un troupeau de bovins dans le cycle de pâturage d’un troupeau ovin. Pour cela, un système mixte sera comparé à un système ovins spécialisé pris comme témoin. Seront notamment abordées les questions de la conduite au pâturage des deux espèces et la gestion des lots. L’excrétion parasitaire, les performances zootechniques du troupeau, ainsi que les conditions de travail seront observées.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus sont dans un premier temps une réduction du parasitisme chez les ovins du système mixte par rapport à ceux du système spécialisé, particulièrement chez les agneaux plus sensibles que les agnelles ou les brebis. L’objectif sera de suivre l’excrétion parasitaire du troupeau d’ovins et du troupeau de bovins (strongles, douves) et de déterminer si cette pratique peut être une alternative à la résistance au traitement anthelminthique. En ce sens elle s’insère pleinement dans la transition agroécologique en mentant à profit des processus biologiques en remplacement de molécules chimiques (anthelminthiques) dont l’efficacité est de plus en plus limitée compte tenu du développement rapide de résistances dans les populations de parasites. D’un point de vue sanitaire, les anthelminthiques de synthèse sont les médicaments couramment utilisés en médecine vétérinaire pour gérer les infestations parasitaires. Cependant, des métabolites ou des molécules non dégradées se retrouvent dans les produits dédiés à la consommation humaine (viande, lait, fromage), et peuvent impacter indirectement la santé humaine. Pour certaines molécules, des conséquences environnementales ont aussi été signalées. Des temps d’attente sont donc à respecter avant de commercialiser et consommer ces denrées alimentaires. De plus, depuis ces dernières années, une multiplication des résistances aux anthelminthiques de synthèse est observée dans les élevages ovins et caprins. Pour pallier à ces problèmes, l’exploitation dans la ration de métabolites secondaires bioactifs naturellement présents dans certains végétaux ou ressources végétales serait une méthode alternative à l’emploi des traitements chimiques. Enfin, l’aspect innovant de ce projet tient également à l’étude de la mixité en pâturage séquentiel, qui a l’intérêt de faciliter la gestion des lots au quotidien (pas de mélange simultané des espèces) et pourrait en ce sens aider au développement de la mixité ovin/bovin pour plus de résilience.
Procédures
Deux types de prélèvements sont prévus sur les animaux : i) Des prélèvements de fèces (5 grammes) auront lieu tous les mois durant les 4 mois de l’expérimentation, sur 60 brebis et 60 agneaux préférentiellement mâles (30 brebis et 30 agneaux de chaque troupeau ovin, 40 agneaux l'année 2), ainsi que sur les 11 génisses. ii) Des prises de sang (10mL) seront réalisées sur les 11 génisses et sur 20 brebis (10 brebis de chaque troupeau ovin) en début et fin d’expérimentation. Les interventions n'excéderont pas 1 à 2 minutes par animal, et elles seront regroupées dès que cela est possible afin de limiter la manipulation et la contention des animaux.
Impact sur les animaux
On peut noter 3 types de nuisances attendues : tout d’abord pour effectuer des sérologies, des prises de sang seront réalisées à la veine jugulaire (ovin) ou caudale (bovin). Des hématomes peuvent apparaitre en cas de prélèvements répétés mais ceux-ci n’auront lieux qu’en début et fin d’essai soit un espacement de plus de 3 mois. Ensuite afin de réaliser des coprologies, des prélèvements de fèces auront lieu par stimulation rectale en évitant au maximum le prélèvement direct par fouille. L’ensemble des prélèvements (prise de sang + fèces) ne dure que 1 à 3 minutes par animal, et elles seront réalisées par du personnel compétent et formé. Enfin, une très forte infestation parasitaire pourrait survenir dans les troupeaux ovins, particulièrement chez les agneaux du système spécialisé. Pour cela le suivi régulier des performances et la de la santé des animaux, couplé à une surveillance quotidienne par le personnel animalier qualifié, permettra de déceler suffisamment précocement les animaux à traiter.
Devenir
Les agneaux poursuivront leur engraissement dans un schéma classique d’élevage ovin. Les brebis et les génisses retourneront dans le troupeau d’élevage de l’établissement utilisateur.
Remplacement
Aucun essai in vitro ni modélisation n’existe à ce jour pour une telle étude. L’étude in vivo est indispensable pour étudier le lien entre le parasitisme et pratiques de pâturage. De nombreuses mesures ne sont possibles qu’en expérimentation in vivo : mesures de parasitologie (évaluation de la charge parasitaire par analyses coproscopiques sur les fèces et sérologie sur prise de sang), étude des performances zootechniques (gain de poids, note d’état corporel). Ces analyses fines permettront de produire des références.
Réduction
Le nombre d’animaux a été optimisé et réduit au minimum pour i) s’assurer d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour des analyses statistiques fiables des paramètres de parasitologie (mesure de coproscopie) sur les 2 lots infestés et ii) assurer des répétitions pour obtenir la puissance statistique nécessaire pour arriver à faire le lien entre infestation parasitaire et pratiques de pâturage. Ainsi le dimensionnement a cherché à être minimaliste tout en veillant à avoir des effectifs minimaux pour reproduire les effets troupeaux. Par ailleurs, les surfaces des parcelles doivent être suffisamment grandes pour être représentatives de la diversité et capter la variabilité des prairies permanentes de montagne ici étudiées. Le nombre d’animaux permet également d’avoir un chargement adapté au potentiel de production des prairies.
Raffinement
Les animaux se trouveront dans le cadre d’une conduite d’élevage classique (pâturage à l’herbe). Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été définis (cf. 4.2.1) et l’état de santé des animaux sera suivie de manière rapprochée par une méthode de scoring. L’état de santé des animaux sera évalué tous les jours lors de la surveillance sur les parcelles par un animalier habilité, responsable de la mise en œuvre du protocole. Tout changement de comportement (isolement, abattement, baisse d’appétit ou refus de s’alimenter) ou tout autre comportement anormal sera signalé et pris en charge, consigné dans le cahier d’expérimentation. Les évaluations des performances zootechniques et du bien-être animal serviront également à surveiller la santé des animaux. Un diagnostic approfondi de l’animal malade sera réalisé, et si nécessaire un traitement adéquat sera administré sur avis du vétérinaire. Si aucune amélioration n’est constatée dans les jours suivants, l’animal sera sorti de la procédure.
Choix des espèces
L’étude vise à étudier la mixité ovin/bovin au pâturage. Les bovins seront de race charolaise et les ovins de race limousine et sont actuellement présentes sur la ferme expérimentale. Ces deux espèces sont l’objet d’élevage de rente et font parties des productions de viande majoritaire en France. Les suivis sur le parasitisme sont impossibles à réaliser sans l’utilisation d’animaux. Les agneaux mâles seront suivis préférentiellement car ils plus sensibles au parasitisme. Brebis allaitantes et agneaux en croissance avant sevrage
Rôle de la communication cytokine-microbiote dans l’homéostasie intestinale : étude de la physiologie et de la régénération de l’intestin du poisson zèbre
- Conservation des espèces
- Enquêtes médicolégales
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
À quatre jours de développement, des larves de poisson zèbre ont l'intestin sectionné en deux sous anesthésie, geste que le porteur chiffre à dix secondes. 29 200 poissons zèbres vont être utilisés, 16 645 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 11 205 un niveau modéré et 1 350 un niveau sévère. La mortalité annoncée après cette section intestinale atteint environ 20 %, et le porteur prévoit que certains inhibiteurs testés altèrent la régénération, ce qui pourrait encore l'augmenter. 16 725 individus restent vivants au titre de l'élevage des lignées, les autres sont tués par surdose d'anesthésique après cinq séances d'observation au microscope, pour analyse post mortem.
Objectifs
Les cytokines sont des acteurs essentiels du système immunitaire, assurant la communication intercellulaire grâce à des récepteurs spécifiques situés à la surface des cellules cibles, qui transmettent leur signal. Produites principalement en réponse à un agent infectieux (virus, bactérie ou constituant) par les cellules lympoides innées (ILC), elles agissent comme médiateurs de l’immunité. La colonisation intestinale par les micro-organismes commensaux (organismes vivant dans l’hôte sans lui nuire) débute avec l’ingestion de nourriture et s’intensifie avec l’introduction d’aliments secs dans l’alimentation des poissons. Cytokines et microbiote participent à des processus cellulaires comme la prolifération, la mort et la migration des cellules. Ils jouent aussi un rôle clé dans l’inflammation et la fonction de barrière intestinale, qui empêche le passage du contenu (microbes, toxines, etc) de l’intestin vers l’intérieur du corps. Cependant, leurs interactions restent mal comprises, notamment durant la physiologie normale et la régénération après une lésion grave de l’intestin. L'objectif principal du projet est d'étudier le rôle de l'interaction entre les cytokines et le microbiote dans la physiologie et la régénération de l'intestin après une blessure qui laisse l'intestin non fonctionnel. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons le poisson-zèbre, qui est largement utilisé dans les études biologiques. Ce modèle offre des avantages uniques, tels que sa transparence durant les premiers stades de développement, permettant d’observer les conséquences des interactions entre le microbiote et les cytokines dès les premiers jours de vie. Il présente également une grande capacité de régénération, ce qui en fait un outil précieux pour étudier les facteurs déterminant une régénération tissulaire réussie. L’identification de ces facteurs et la compréhension de leurs mécanismes moléculaires ont pour but d’apporter des connaissances utiles à la régénération intestinale humaine après une lésion.
Bénéfices attendus
La régénération est la capacité à restaurer un organe ou un tissu endommagé par une blessure ou une dégénérescence. Cependant, les mammifères, y compris les humains, ont un potentiel régénératif limité, qui diminue avec l'âge. En conséquence, les dommages graves subis par de nombreux organes essentiels sont irréversibles, ce qui entraîne des problèmes de santé potentiellement mortels. Bien que l'on ait longtemps pensé qu'il avait été perdu au cours de l'évolution, le potentiel régénératif semble persister à l'état latent et pourrait être réactivé. Il est donc très important et utile d'identifier les mécanismes fondamentaux de la régénération chez les espèces qui sont naturellement capables de se régénérer efficacement. Le poisson zèbre, en raison de sa remarquable capacité à régénérer la plupart de ses organes, est devenu un modèle de référence en biologie régénérative. Il a révélé que certains mécanismes de régénération sont conservés chez les mammifères et pourraient être réactivés, ouvrant la voie à des approches innovantes en médecine humaine (doi: 10.3390) Ce projet vise des avancées significatives pour la santé humaine et la médecine régénérative en étudiant le rôle clé des cytokines et du microbiote dans la guérison intestinale. À court terme, il pourrait améliorer notre compréhension des maladies intestinales telles que les MICI (maladies inflammatoires chroniques de l’intestin) et, à long terme, inspirer des traitements innovants pour les lésions graves, réduisant la nécessité d'interventions chirurgicales complexes. Cela bénéficierait non seulement aux humains mais aussi à d'autres espèces, tout en approfondissant nos connaissances scientifiques sur les interactions entre notre corps et les micro-organismes.
Procédures
À 4 jours après la fécondation, les larves subiront une intervention : une partie de leur tube digestif, située près de leur sortie uro-génitale, sera coupée en deux parties après qu’elles aient été profondément anesthésiées (La coupe de l’intestin ne prend pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Une fois remises, les larves seront de nouveau anesthésiées (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) pour être observées au microscope sans stress. Cette observation sera répétée 5 fois jusqu’à leurs 10 jours de développement. Certaines larves seront prélevées après observation et euthanasiées avec une forte dose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. D’autres larves recevront des substances (appelées "drogues" en termes scientifiques) qui pourraient influencer la régénération de l’intestin. Ces drogues seront directement administrées dans l’eau des larves pendant une durée qui est fonction de la drogue mais connue de la littérature. Ensuite, les larves sont remises dans une eau sans droque. Elles seront également observées par imagerie pour voir si ces substances ont un effet (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) Au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. Enfin, nous ferons grandir des larves dans un environnement stérile, sans microbes grâce à un milieu contenant des antibiotiques. À 5 jours, elles subiront aussi une coupure de l’intestin sous anesthésie (pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Ces larves seront ensuite placées avec d’autres larves élevées dans un environnement normal (sans antibiotique), contenant des microbes. Ces larves seront observées 5 fois sous le microscope sous anesthésie (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) jusqu’à leurs 10 jours de développement. Comme précédemment, au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem.
Impact sur les animaux
Il est possible que certaines lignées créées présentent des phénotypes dommageables entraînant par exemple des scolioses prématurées ou des problèmes de reproduction. Pour génotyper le poisson, il est nécessaire de prélever du tissu par biopsie (ici, un prélèvement de quelques millimètres de la queue), ce qui induit une douleur légère lors de l’incision. L’intervention ne dure pas plus de 30 secondes. Le prélèvement de très faible taille induit une gêne légère dans le déplacement, la régénération de la nageoire étant complète en moins de 5 jours. Suite à la coupe de l’intestin, les poissons peuvent ressentir une gêne pour la nage. Le taux de mortalité est autour de 20% suite à cette chirurgie. Les concentrations d’antibiotiques dans lesquels les larves vont se développer sont adaptées pour leur développement Suite à nos travaux issus d’une autre autorisation, nous ne rencontrons pas de mortalité dû aux antibiotiques présents dans le milieu.dû aux antibiotiques présents dans le milieu. En ce qui concerne l'utilisation d'inhibiteurs, leur utilisation a déjà été rapportée dans des articles de recherche utilisant des larves de poisson zèbre. Nous appliquerons donc les traitements (concentration et durée d'exposition) décrits dans la littérature. Nous nous attendons à ce que certains inhibiteurs altèrent le processus de régénération, ce qui pourrait potentiellement entraîner une augmentation de la mortalité après une blessure.
Devenir
A l’exception de la première procédure d’élevage de poissons utilisés ensuite dans les procédures suivantes, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem.
Remplacement
Pour notre projet, nous nous appuyonsà la fois sur sur des données déjà accessibles au public et sur nos propres données de séquençage de l’ARN issues du modèle poisson-zèbre. Cettetechnique permet d’identifier et de quantifier le matériel génétique à un moment précis Actuellement, la culture in vitro de l’intestin et sa colonisation par un microbiote restent actuellement impossibles. Par ailleurs, la régénération est une interaction complexe entre les éléments moléculaires, cellulaires et environnementaux. Ceci ne peut pas être transposé dans les cellules et il n’existe pas d’alternative non animale. Il est donc difficile de trouver un remplacement efficace et suffisamment proche des mécanismes que nous souhaitons étudier.
Réduction
Nous combinons, autant que possible, des méthodes d’analyse multiples à partir des mêmes animaux (les animaux observés en microscopie seront mis à mort pour utiliser leur intestin pour extraire l’ARN.) de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Les tailles des lots ont été déterminées en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. Les prélèvements seront réalisés de manière à pouvoir mettre en œuvre le maximum d’analyses pour une larve donnée (études génomiques, cellulaires, histologiques). Cette optimisation des échantillons permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet.
Raffinement
Les observations ont été définies selon notre expérience et celle de collaborateurs. Les expériences sont généralement courtes, et les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute intervention, chirurgicale (biopsie de la queue pour l’identification, coupe de l’intestin pour le projet) ou non chirurgicale (imagerie). Pour déterminer le génotype, nous mettons en place l’écouvillonnage (prélèvement d’ADN contenu dans le mucus par frottement de la peau avec un coton) en parallèle de la coupe de queue. Cela permettra de comparer les résultats et d’évaluer si cette méthode, moins invasive, est aussi fiable. À terme, elle pourrait remplacer le finclip. Tout le matériel utilisé sera stérilisé ou décontaminé pour limiter les risques d’infection et favoriser la cicatrisation. Après intervention, les poissons seront placés 24 h dans un bac équipé d’un séparateur transparent, sur fond de galets, contenant un milieu avec analgésique et antifongique. La cicatrisation est obtenue en 1 jour et la régénération de la queue en 5 jours. La coupe prend moins de 30 secondes hors de l’eau. Un suivi du réveil et du bien-être est réalisé selon une grille validée par l’animalerie. Pour la coupe intestinale, la larve est anesthésiée. L’intervention dure 10 secondes. Du matériel stérile à usage unique est utilisé. Après la chirurgie, l’animal est placé dans un milieu contenant un antiseptique. La cicatrisation s’observe en 2 jours, avec un suivi selon une grille établie avec le SBEA. En cas de signe de mal-être d’un poisson, nous agirons pour réduire le stress / douleur.. L’animal est mis à mort si son état le nécessite. De plus, nous aurons souvent recours à des méthodes d’analyse non-invasives grâce à des marqueurs fluorescents pouvant être suivis facilement du vivant de l’animal. Grâce à cela, les animaux n’ont pas besoin d’être génotypés. Il suffit d’observer les larves très jeunes (autour de 4 jours après la fertilisation des oeufs) pour visualiser l’expression du gène d’intérêt et sélectionner ainsi les animaux.
Choix des espèces
Notre compréhension du rôle des cellules, des gènes de l'hôte et du microbiote dans le développement des organes des vertébrés reste limitée chez les mammifères. Ces modèles rendent difficile la manipulation précise de l'environnement et le suivi en temps réel du développement intestinal. Pour dépasser ces obstacles, nous utilisons le poisson zèbre, un modèle qui allie ses atouts naturels aux avancées technologiques. Partageant 70 % de ses gènes avec l'Homme, le poisson zèbre est idéal pour étudier le développement des vertébrés grâce à sa facilité de manipulation génétique, sa descendance abondante, sa transparence et son développement rapide hors de l’organisme maternel. Ce modèle permet également d'explorer les interactions spécifiques au microbiote et les mécanismes de régénération cellulaire. Enfin, les similitudes immunitaires entre poissons et mammifères renforcent son intérêt scientifique. Pour l’élevage, nous aurons besoin d’animaux de 5j jusqu’à 18 mois. Des protocoles expérimentaux autres que les techniques d’élevage s’effectueront sur des larves de 4 jours jusqu’à 10 jours. Nous avons choisi cet espace du stade de développement car nous souhaitons caractériser l’expression de ces cytokines au cours des stades du développement précoce.
Evaluation de radiotraceurs dans des modèles de mélanome chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
Toutes tuées en fin d'expérience pour que leurs tumeurs et leurs organes soient prélevés, 2 160 souris vont être utilisées dans l'évaluation de radiotraceurs contre le mélanome. 1 560 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 600 d'un niveau sévère. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous anesthésie, une injection de radiotraceur et jusqu'à quatre examens d'imagerie nucléaire de 45 minutes, nuisances que le porteur qualifie toutes de légères, y compris la gêne fonctionnelle liée à la tumeur. Sur le remplacement, il affirme qu'une étude in vitro "ne peut représenter la complexité du vivant", et prévoit d'utiliser les animaux sans prise tumorale pour la formation du personnel ou pour constituer une banque d'organes.
Objectifs
Les mélanomes avancés demeurent associés à un sombre pronostic et la recherche de nouvelles thérapies plus efficaces est plus que jamais d’actualité. Notre projet a pour but de développer des radiotraceurs spécifiques des cellules tumorales pigmentées associant des ligands de la mélanine à un isotope radioactif. Ainsi, leur profil de biodistribution sur modèles murins de mélanome sera évalué. Les radiotraceurs les plus pertinents en termes de stabilité et de profil de biodistribution (fortes affinité et spécificité pour la cible tumorale, faible accumulation dans les organes sains) feront l’objet d’une étude d’efficacité antitumorale in vivo afin de démontrer la pertinence de notre approche en vue d’un transfert clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à établir une preuve de concept préclinique de l’intérêt d’un radiotraceur pour la radiothérapie interne vectorisée des mélanomes avancés. Ce traitement ciblé, qui s’adresse à la maladie disséminée, est particulièrement bien adapté à cette pathologie et pourrait apporter une réponse efficace aux patients en échec thérapeutique ou non éligibles aux traitements actuels.
Procédures
- 1 injection de cellules (durée
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : - Une douleur ou inflammation locale liée à l’inoculation des cellules tumorales sous anesthésie, réduite à une dizaine de secondes (nuisance légère). - Une gêne fonctionnelle liée à la présence de la tumeur (nuisance légère). - Le stress modéré lors de l’injection de la molécule radioactive dans un appareil de contention, réduite à une dizaine de secondes car réalisée par un expérimentateur expert (nuisance légère). - Le stress léger dû à l’induction de l’anesthésie (nuisance légère).
Devenir
Afin de caractériser l'effet de nos traitements notamment l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs des animaux traités et non traités. Nous devons pour cela procéder à l’euthanasie de l'ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire des tumeurs, ainsi que celles des tissus des autres organes est indispensable pour évaluer les effets anti tumoraux mais également la toxicité des traitements testés.
Remplacement
Les molécules seront sélectionnées en amont selon leur affinité à la mélanine et leur stabilité dans du sérum de souris. Le développement et la validation préclinique de nouvelles molécules diagnostiques et/ou thérapeutiques requièrent la détermination de paramètres de biodistribution des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.
Réduction
Selon nos expériences antérieures, le modèle tumoral présente dans 20% des cas aucune ou peu de prise tumorale, cela a donc été intégré dans nos calculs de taille. De plus, le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. L'approche statistique consistera en une analyse non paramétrique suivant le nombre de groupe à comparer. De plus, les examens d’imagerie sont des méthodes non invasives qui permettent également de réduire le nombre d’animaux grâce à la possibilité d’un suivi longitudinal où un animal est son propre contrôle au cours du temps. Les animaux non inclus dans les procédures (pas de prise tumorale…) seront utilisés pour la formation du personnel ou la création de banque d’organes pour des mises au point techniques.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux inclus dans ce projet, nous mettons à disposition un enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette dans chacune des cages. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Après leur arrivée à l’animalerie, une période d’acclimatation de 5 jours est définie afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils seront habitués à la contention et à l’appareillage de contention pour les injections intraveineuses dès la fin de la période d’acclimatation. De plus, certains gestes seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Ils seront habitués à la présence de nourriture humide dans le fond de la cage pour une meilleure prise en charge non médicamenteuse des éventuelles gênes liées à l’inoculation des cellules. La surveillance quotidienne permettra de visualiser l’état général des animaux et de réagir rapidement en cas de signe d'inconfort, de stress ou de souffrance grâce à l’évaluation des points limites. Des mesures de poids et de taille tumorale seront réalisées 2 fois par semaine. Si besoin, une injection d'antalgiques sera réalisée. En cas d'atteinte d'un des points limites, l'animal sera mis à mort. Les gestes techniques sont optimisés grâce à un programme de formation et de tutorat ainsi qu’au suivi des compétences techniques du personnel ce qui permet de limiter le stress des animaux et augmenter la précision et la rapidité des gestes.
Choix des espèces
Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer pour lequel on peut avoir un suivi de la croissance tumorale et une évaluation de la biodistribution des radiotraceurs. Les animaux, âgés de 5 semaines, seront réceptionnés dans l’animalerie, les expérimentations seront réalisées après une période d’acclimatation de 5 jours.
Evaluation pré-clinique de thérapies innovantes dans des modèles précliniques de glioblastome chez les rongeurs EU 1/2 MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 705
Greffe d'une tumeur dans le cerveau, jusqu'à 51 séances d'imagerie, 28 prélèvements de sang, 56 injections, 8 ouvertures de la barrière hémato-encéphalique, une résection tumorale et de la radiothérapie : un même animal peut subir tout cela. 3 510 souris et 705 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 3 015 d'entre eux et modéré pour 1 200. Le porteur décrit pourtant un hébergement assurant "une qualité de vie optimale tout au long de l'étude", chez des animaux immunodéficients dont la tumeur cérébrale provoque des troubles neurologiques et des difficultés de déplacement. Tous sont tués à un temps défini ou dès l'atteinte des points limites, pour des prélèvements post mortem, certains ayant été transportés vivants entre deux établissements pour accéder aux appareils d'imagerie.
Objectifs
Les tumeurs cérébrales primitives et en particulier les glioblastomes sont des cancers très résistants aux traitements anti-tumoraux conventionnels (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie cytotoxique). En effet, la survie globale médiane des patients est comprise entre 12 et 24 mois. De nouveaux traitements sont donc indispensables pour améliorer le pronostic des patients souffrant de glioblastome. Les traitements candidats sont évalués dans le cadre d’essais cliniques longs et coûteux, et le plus souvent négatifs, avant leur approbation pour une utilisation en pratique clinique chez les patients. Compte tenu du nombre important de traitements candidats, notre projet vise l’accélération de l’évaluation de ces traitements innovants candidats et leur hiérarchisation en vue d’essais cliniques chez l’Homme. En effet, une évaluation préclinique rigoureuse permet de réduire le taux d’attrition des essais cliniques. (MODIFICATION) Le projet nécessite une modification sans augmentation du nombre d'animaux car le projet se déroulera dans deux établissements en raison de la nécessité d'utiliser des appareils d'imagerie spécifiques disponibles seulement dans le second établissement.
Bénéfices attendus
Les gliomes et en particulier les glioblastomes (GBM) sont les cancers cérébraux les plus fréquents et les plus graves chez l’adulte. Le pronostic des patients souffrant de glioblastome est réservé (12-24 mois de survie médiane) malgré des traitements lourds. De nouveaux traitements sont donc nécessaires. Le projet présenté ici vise donc à évaluer de nouvelles thérapies dans un contexte le plus biologiquement pertinent grâce à nos modèles de glioblastome qui sont en quelque sorte des avatars de patients atteint de cette maladie. Ultimement, nous visons à identifier de nouveaux traitements actifs contre le glioblastome qui pourront être évalués dans le cadre d'études cliniques chez l'homme.
Procédures
Les animaux auront tous une greffe tumorale cérébrale (30minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) ou une greffe tumorale cutanée (1minute, 1x, animal anesthésié). Tous les animaux auront un suivi par prélèvement sanguin (2minutes, 28x maximum, animal vigile ou anesthésié et analgésié si l'animal est en fin de procédure) et certains par imagerie également (5minutes à 4h, 51x maximum, animal anesthésié). (MODIFICATION) Certaines imageries nécessiteront un transfert d'un établissement à un autre (transfert de 10 minutes, 1 fois, animal vigile). Une partie des animaux auront également des traitements administrés par injections simples (1min, 56x maximum, animal vigile) ou par injections nécessitant une chirurgie (30min maximum, 1x, animal anesthésié et analgésié). Les administrations pourront être couplées à une ouverture de la barrière hémato encéphalique (pour que le traitement atteigne le cerveau) (1h maximum, 8x, animal anesthésié) ou à une résection tumorale (30 minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) et;ou à de la radiothérapie (10 minutes, 1 fois, animal anesthésié).
Impact sur les animaux
La greffe de cellule tumorale induit une croissance tumorale qui peut donner des troubles neurologiques ou des difficultés de déplacement. Les chirurgies pourront engendrer une douleur modérée post opératoire ainsi que des risques d’infection. Les anesthésies peuvent engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire. Les traitements pourront avoir des effets secondaires comme des diarrhées ou des inflammations aux sites d’injection engendrant une perte de poids. Les piqûres peuvent induire une douleur légère de courte durée au point d’injection. Les prélèvements sanguins pourraient induire une douleur légère de courte durée ainsi qu’un hématome. Les imageries pourront induire un léger stress chez les animaux. (MODIFICATION) Certaines imageries devront être réalisées dans un autre établissement, les animaux pourront ressentir un stress lié au transport entre les deux établissements et aux changements d'environnement. Le phénotype dommageable des animaux immunodéficients ou immunodéprimés induit une sensibilité accrue aux infections.
Devenir
Pour toutes les procédures, tous les animaux sont euthanasiés à un temps défini (ie quelques jours/heures post traitement etc) ou dès qu’ils atteignent les points limites décrits afin de faire des prélèvements post mortem.
Remplacement
Chez l’Homme, les tumeurs cérébrales sont des tumeurs complexes. Il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement qui joue un rôle clé dans le comportement spontané ou sous traitement des cellules tumorales. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Il est impossible de reconstituer ce contexte (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales in vitro ; que ce soit par le biais de cultures de cellules tumorales issues de patients ou bien de culture 2D ou encore 3D. Ces approches in vitro sont réalisées en amont des procédures in vivo pour justifier l'intérêt scientifique. De plus, cet environnement module la biodisponibilité d’une molécule thérapeutique au sein de la tumeur. Aussi, positionner les cellules tumorales cérébrales chez l’animal, dans un microenvironnement tissulaire et moléculaire complexe (cérébral) constitue un modèle d’étude pertinent. Ce dernier se rapproche au maximum des conditions observées chez les patients souffrant de tumeur cérébrale et chez qui les cellules cancéreuses prolifèrent dans du tissu nerveux central complexe.
Réduction
4215 animaux seront utilisés dans ce projet. Les efforts fournis afin de réduire le nombre d'animaux utilisés sont: i) Seuls les composés efficaces in vitro par rapport aux traitements standards, seront testés in vivo. ii) Les cellules tumorales cérébrales greffées chez l’animal sont visibles par fluorescence ce qui permet de suivre le développement tumoral, cela évite l'euthanasie à différents temps et réduit donc le nombre d’animaux utilisé (iii) La fluorescence des tumeurs permet également de suivre l’efficacité des traitements testés en temps réel ce qui apporte une information supplémentaire à la survie. (iv) Une étude statistique détermine le nombre d’animaux nécessaire minimum pour atteindre un niveau de significativité acceptable. Cela permet de limiter le nombre d’animaux et d’éviter les études ne permettant pas de répondre à une question posée par manque de puissance statistique.
Raffinement
Durant toute la durée de leur vie, les animaux sont logés en groupe afin de favoriser leur bien-être social, l’isolement étant évité autant que possible. Cette approche groupée est cruciale, car les souris, comme de nombreux rongeurs, sont des animaux sociaux et leur isolement peut entrainer un stress psychologique et des comportements anormaux. Elles sont hébergées sur des portoirs ventilés, qui permettent une circulation d'air optimale et un environnement propre. Chaque cage est équipée d’un système d'abreuvement automatique garantissant un accès constant à l’eau et d’un approvisionnement ad libitum en nourriture, ce qui répond à leurs besoins nutritionnels et hydriques tout en permettant une gestion optimale des ressources. Le milieu de vie est enrichi avec au moins deux éléments, tels que des objets manipulables ou des matériaux permettant d'explorer et de satisfaire les comportements naturels des souris, comme le grattage, le fouissage ou la nidification. Cet enrichissement environnemental est essentiel pour prévenir l’apparition de comportements stéréotypés liés à l'ennui ou au stress et pour assurer une qualité de vie optimale tout au long de l’étude. Les animaux sont suivis quotidiennement par des vétérinaires et du personnel qualifié. Lors de procédures susceptibles de provoquer des douleurs modérées à sévères, comme des interventions chirurgicales, les animaux reçoivent une anesthésie générale appropriée et en complément, un analgésique leur est administré en préopératoire et postopératoire pour prévenir toute douleur et minimiser l'inflammation. Pour prévenir les risques d'infections des souris immunodéprimées, les animaux sont hébergés dans des cages propres avec litière, aliment et enrichissement irradiés ainsi que de l'eau osmosée pour boisson. Les injections seront toujours réduite au minimum suivant le composé testé (fréquence et volume), l'alternance des sites sera privilégiée quand cela est possible et les animaux seront anesthésiés si nécessaire pour leur bien être. Un système de points limites est mis en place pour évaluer leur bien-être et détecter rapidement tout signe de souffrance ou d’inconfort, tant à court qu'à long terme. Ces points limites prennent en compte des critères variés : l’observation du comportement, l'aspect général de l’animal, son niveau d'activité, ainsi que son poids corporel. Si un animal présente des signes de détresse, des mesures immédiates sont prises pour garantir son confort et sa santé.
Choix des espèces
Les souris sont choisies dans nos études thérapeutiques en raison de leur petite taille et de leur poids faible. Cette caractéristique permet l’utilisation de quantités réduites de composés cytotoxiques. De plus, ces modèles permettent l’utilisation de volumes expérimentaux limités, facilitant ainsi les études tout en respectant les principes de réduction des animaux dans la recherche. Les souches de rongeurs telles que les souris immunodéficientes sont particulièrement utiles pour leur incapacité à rejeter les cellules tumorales humaines. En parallèle, les souches immunocompétentes sont indispensables pour étudier la croissance tumorale dans un contexte immunologique complet. Les modèles animaux immunodéprimés sont utiles pour explorer l’impact d’un système immunitaire humanisé dans les réponses thérapeutiques contre les cancers. Enfin, les rats, sont choisis ici pour des scénarios nécessitant une plus grande précision chirurgicale. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 mois car le glioblastome est une tumeur de l’adulte chez l’Homme.
Implication de la voie de signalisation Hippo dans la radiorésistance de métastases cérébrales d’origine bronchique.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Pour comprendre pourquoi les métastases cérébrales d'origine bronchique résistent à la radiothérapie, 180 souris immunodéprimées de souche Nude vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever le cerveau et la tumeur. Des cellules tumorales humaines leur sont implantées dans le cerveau au cours d'une chirurgie de trente minutes, suivie de deux séances d'IRM par semaine sous anesthésie et, pour quatre-vingt-dix d'entre elles, de trois séances d'irradiation en trois jours. L'irradiation cérébrale entraîne une fatigue et une dégradation de l'état général jusqu'à une semaine après, avec porphyrine autour des yeux et de la bouche et pelades sur la tête. Perte de poids, de motricité et de sensibilité constituent les points limites, et le porteur indique avoir adapté la surveillance pour "anticiper et éviter l'exclusion des animaux par atteinte de points limites".
Objectifs
Ce projet a pour but de caractériser l’effet d’une inhibition de la voie Hippo sur l’irradiation des tumeurs cérébrales d’origine bronchique, décrites dans la littérature comme résistantes à la radiothérapie (RT) actuelle. En effet une inhibition de cette voie de signalisation permettrait d’élucider son implication dans l’inefficacité des traitements actuels tels que la RT. Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer les connaissances des phénomènes de radiorésistance de ces tumeurs et l’implication de la voie de signalisation. L’étude de tumeurs humaines implantées dans des souris immunodéprimées permettront un modèle plus similaire aux cas cliniques. Cibler la voie Hippo en parallèle de la RT pourrait améliorer la prise en charge des patients et leur taux de survie.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques d’irradiation des métastases cérébrales d’origine bronchiques actuelles en ciblant la voie de signalisation hippo.
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, tous les animaux sont concernés. -Imagerie (IRM pour suivi de la taille tumoral, sous anesthésie générale) : 2 séances par semaine à partir d’une semaine post chirurgie : 3 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances sur 3 jours consécutifs : 12 minutes maximum par animal, 90 animaux sont concernés. - Injection sous-cutanée d'analgésique (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 2 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de tumeur. Toutefois, ces critères représentent les points limites de l’étude et ainsi si l’un de ces éléments apparait, les animaux concernés seront mis à mort. Nous nous attendons également à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation. Nous avons adapté en conséquence le suivi des animaux, le raffinement des conditions expérimentales et le scoring afin d’anticiper et d’éviter l’exclusion des animaux par atteinte de points limites. A chaque sortie des animaux de la zone protégée, lors des séquences d’imagerie par IRM, un risque d’infection ou de contamination par les autres animaux n’ayant pas un phénotype dommageable existe.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de prélever le cerveau et la tumeur pour analyses post-mortem (totale de 180 animaux).
Remplacement
Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses à la RT. Ce projet intervient après plusieurs études in vitro ayant permis de montrer les effets de l’irradiation sur la voie de signalisation Hippo mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.
Réduction
L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive (IRM) se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est, dans ce cas, son propre contrôle et permet de réduire drastiquement le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 15 animaux par groupe sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques puissants et ainsi comparer les effets des différentes expressions de la voie Hippo, en fonction du temps. Ces 15 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux basés sur nos travaux antérieurs. Il est important de noter ici que le nombre d’animaux calculés est un nombre maximal. Grâce notamment aux études en imageries qui sont quantitatives, nous réaliserons des analyses séquentielles. Ainsi, les expériences seront réalisées par plusieurs lots et si les seuils statistiques sont atteints alors le protocole sera stoppé.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux immunodéprimés seront placés en groupe sociaux dans des cages ventilées individuellement par des portoirs spécifiques (portoirs Innovive) répondant aux normes européennes, ces derniers étant eux-mêmes dans une zone spécifique et dédiés à la manipulation des animaux immunodéprimés pour la recherche en cancérologie. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation (minimum 7j) et bénéficierons également d’enrichissement (roue d’activité, tunnel en carton, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Toutefois, dans tous les protocoles d’imagerie, d’irradiation, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, ce qui entraine une hypothermie et une déshydratation des membranes qui sont contrés par l’application de vitamine A sur les membranes et l’utilisation de couvertures chauffantes thermorégulées .
Choix des espèces
Les souris immunodéprimées sont l’espèce de choix pour évaluer l’évolution du volume tumoral dans le temps dès lors que les cellules tumorales utilisées sont d’origine humaine. Les souris immunodéprimées retenues pour réaliser ce travail sont la souche Nude. Cela permet l’implantation de xénogreffes humaines sans prendre le risque du rejet. Cependant, le système immunitaire est encore capable de produire des cellules permettant de se rapprocher d’un micro-environnement plus représentatif de la situation clinique. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.
Test de stratégies expérimentales permettant de prévenir les troubles moteurs et cognitifs dans un modèle murin de paraplégie spastique héréditaire MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Les souris porteuses de deux copies du gène muté développent des difficultés locomotrices, une prostration et une perte de poids à partir de seize mois, un phénotype que le porteur réserve aux lots expérimentaux. 3 086 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la quasi-totalité et modéré pour quarante d'entre elles. Le génotypage passe par le prélèvement de l'extrémité de la queue, puis viennent un traitement de sept mois incorporé aux croquettes ou un gavage unique de la mère gestante. Suivent trois séries de deux tests comportementaux, un test de mémoire répété cinq jours et un test de coordination motrice répété trois jours, et pour un groupe jusqu'à quatorze prélèvements de sang sous anesthésie toutes les deux semaines. Les couples reproducteurs sont tués dès que leur reproduction baisse, les autres à la fin de chaque procédure pour récupérer des tissus ou prélever des embryons.
Objectifs
Les paraplégies spastiques héréditaires sont des maladies neurodégénératives d’origine génétique caractérisées par une mort neuronale, mais aussi parfois des troubles de développement du cerveau. Ces maladies sont très hétérogènes et sont causées par des mutations dans environ 80 gènes différents. Elles touchent environ 3 personnes sur 100.000 en Europe, avec un début généralement à l’âge adulte mais qui peut apparaitre dans l’enfance. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pour la prise en charge de ces pathologies. Nous travaillons sur une des formes les plus fréquentes de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles de développement du système nerveux. Nous utiliserons un modèle animal (souris) pour cette forme de paraplégie spastique héréditaire. Nous avons déjà montré que ce modèle présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau et il récapitule les principaux signes observés chez les patients. L’objectif du projet est de mieux caractériser les différentes étapes d’évolution de la maladie, de son développement à la mort neuronale, et d’évaluer dans un modèle animal des stratégies thérapeutiques qui pourraient permettre de prévenir l’apparition des symptômes et la mort neuronale. MODIFICATION : l’allongement du temps de maintien des animaux de 8 à 12 mois implique l’ajout de tests comportementaux et d’un prélèvement sanguin ce qui nécessite une modification du projet initial sans ajout d'animaux.
Bénéfices attendus
Nous travaillons sur une des formes les plus fréquente de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles du neurodéveloppement et actuellement aucun traitement ne peut être proposé aux patients. Un premier aspect du projet permettra de tester l’efficacité de deux médicaments sur la mort neuronale dans le modèle animal de la maladie. Si nous pouvons démontrer qu’au moins un de ces deux médicaments retarde la mort neuronale, notre projet pourrait permettre d’avancer vers une stratégie thérapeutique pour les patients atteints de cette paraplégie spastique héréditaire. Par ailleurs, nous savons que la maladie que nous étudions est associée à de légers défauts de développement du cerveau, mais nous ne savons pas si, et dans quelle mesure, ces défauts participent à l’apparition des symptômes de la maladie. Notre projet pourrait permettre de répondre à cette question. Comme le diagnostic des patients a généralement lieu à l’adolescence, après la phase de développement, la compréhension du rôle du développement permettra de mieux expliquer la maladie aux patients et d’améliorer leur prise en charge.
Procédures
La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids. Pour déterminer la présence de la mutation (génotypage), un petit prélèvement de l’extrémité terminale de la queue sera effectué sur les jeunes animaux. Cet acte sera réalisé rapidement (moins d’une minute par animal) et une seule fois sur chaque animal. Nous réaliserons des traitements pour évaluer leur impact sur l’évolution de la maladie. Une approche sera un traitement chronique pendant 7 mois qui sera administré par incorporation dans les croquettes pour éviter des gestes invasifs. Une autre approche sera une administration unique par gavage de la mère gestante à un moment précis du développement embryonnaire (une fois, inférieur à une minute). Une partie des animaux sera soumise à trois séries de 2 tests comportementaux sur des animaux vigiles (à l’âge de 6 semaines, 4 mois et 8 mois, ou 4 mois, 8 mois et 12 mois). Le premier test est répété pendant 5 jours et vise à étudier les troubles de la mémoire (3minutes maximum par session, 2 fois 5 jours) ; le second test est répété pendant 3 jours et vise à tester la coordination motrice (5 minutes maximum par session, 5 fois 3 jours). A l’issue de chaque série de tests comportementaux, les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin sous anesthésie générale (3 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement). Un groupe d’animaux sera soumis à des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie générale toutes les 2 semaines (14 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement) L’ensemble des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire en fin de procédure expérimentale.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour le génotypage peut générer une légère douleur chez l’animal et un risque rare de saignement. Pour l’étude de l’effet thérapeutique de médicaments, des effets secondaires (diarrhées, perte de poids) pourraient être associés au traitement. Pour l’étude sur la contribution du développement à la maladie, nous administrerons un médicament par gavage, ce qui peut générer une gêne et un inconfort et des effets indésirables liés à la molécule administrée. Les tests comportementaux peuvent générer du stress chez les animaux liés à leur manipulation et aux changements de pièces. Les prélèvements de sang peuvent générer un stress, une douleur et un inconfort lié à la piqûre, et leur répétition peut engendrer une déshydratation. Il existe un risque d’hématome après le prélèvement. L’anesthésie générale mise en place pour les prélèvements sanguins sera associée à une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque rare de dépression cardiorespiratoire. La mutation génétique portée par les souris porteuses de 2 copies du gène muté peut générer des souffrances après de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids.
Devenir
Les couples ayant permis les générations des animaux seront euthanasiés lorsqu'une diminution significative de la reproduction est observée. A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de récupérer les tissus post-mortem ou prélever des embryons.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons dans la mesure du possible des modèles in vitro qui évitent l’utilisation d’animaux. En effet, nous utilisons des modèles in vitro qui miment le développement du cerveau et qui permettent de répondre à certaines questions sur la contribution de ce développement sur la maladie que nous étudions. Cependant ce modèle in vitro ne permet pas de répondre à toutes les questions car : (i) le comportement des neurones diffère selon leur environnement in vitro et in vivo ; et (ii) la mise en place de l'organisation du cerveau ne peut pas être reproduite in vitro. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de mener des expériences comportementales. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable pour notre projet, mais nous utiliserons le modèle in vitro dès que possible afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans le cadre de la maladie que nous étudions, il existe un modèle de souris permettant d’évaluer les différents aspects que nous souhaitons étudier dans ce projet et ainsi obtenir des données transposables chez l’homme. L’étude de l’effet thérapeutique de médicaments sur les symptômes de la maladie ne peut se faire que sur un modèle animal et ne peut pas être remplacé par un modèle in vitro. De même, l’étude de l’influence d’un développement anormal sur l’organisation du cerveau adulte et ses conséquences comportementales ne peut se faire qu’avec des modèles animaux. Il n’existe pas de méthodes expérimentales n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettent d'étudier le développement du cerveau et ses effets sur des troubles moteurs et cognitifs. Ces éléments rendent l’utilisation de l’animal indispensable pour notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé en prenant en compte la lignée de souris génétiquement modifiée nécessaire à l'étude et en réduisant au plus le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables et valides. Nous affinerons les analyses statistiques en fonction de données à analyser. De plus, afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. En nous basant sur nos études précédentes, nous estimons qu’il nous faudra de 8 à 20 animaux par groupe en fonction des analyses à réaliser. Ainsi, au total, nous estimons qu’il faudra 3086 animaux pour obtenir des résultats significatifs dans ce projet. Toutefois, si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux, tous ne seront pas utilisés, ni produits. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires pour nos lots expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce et seront observés quotidiennement. Les animaux que nous utilisons sont génétiquement modifiés. Comme seules les souris porteuses de 2 copies du gène muté présentent un phénotype dommageable, nous privilégierons un schéma de croisement permettant de limiter le risque d’expression du phénotype dommageable seulement aux animaux nécessaires pour les lots expérimentaux. Le maintien de la lignée privilégiera les animaux avec une seule copie du gène muté. Les animaux porteurs de 2 copies du gène muté seront particulièrement surveillés pour détecter tout signe précoce d’expression du phénotype dommageable, notamment des difficultés locomotrices et une prostration qui sont 2 signes caractéristiques liés à la mutation. La biopsie pour génotypage sera la plus petite possible et réalisée sur un animal jeune (cicatrisation rapide). Il s’agit d’un geste rapide, réalisé au calme et parfaitement maitrisé. Pour le maintien de notre lignée, afin d’éviter toute dérive génétique, toutes les 10 générations, nous croiserons notre lignée de souris avec des souris sauvages provenant d’un élevage extérieur. Les souris qui recevront des traitements à visée thérapeutique seront traitées à des doses déjà utilisées dans des publications et n’entrainant pas d’effets délétères. Ces souris seront néanmoins surveillées dans les jours qui suivent l’intervention pour vérifier qu’elles continuent à s’alimenter. De plus, les traitements chroniques seront administrés par incorporation à la nourriture afin de diminuer la manipulation des animaux. Pour réduire le stress en lien avec les prélèvements de sang ils seront réalisés sous anesthésie générale. Pour les animaux soumis à des prélèvements répétés, après chaque prélèvement une injection de sérum physiologique sera réalisée pour prévenir toute déshydratation. Des points limites spécifiques à chaque procédure sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Un protocole d’analgésie sera utilisé lors de l’euthanasie des souris afin qu’elle se fasse sans douleur et sur un animal pré-sédaté.
Choix des espèces
Dans le projet, nous utiliserons un modèle de souris déjà caractérisé et qui récapitule les principaux symptômes observés chez les patients atteints de la forme de maladie que nous étudions. L’étude de ce modèle nous permettra donc d’obtenir des données transposables chez l’homme. Le modèle de souris utilisé présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau. Ce modèle est donc parfaitement adapté pour répondre à notre question scientifique, et il est impossible de répondre à cette question sans l’utilisation d’un modèle animal. Afin d’étudier les différentes composantes de la maladie et l’impact d’un traitement à différents âges sur son évolution, nous étudierons des animaux à partir du stade embryonnaire jusqu’à l’âge de 12 mois. La mutation génétique des animaux sera vérifiée à l’âge de 7 à 10 jours.
Développement d’un antigène universel comme cible pour l’immunothérapie dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Incision d'un centimètre à l'abdomen ou au crâne sous guidage stéréotaxique, injection de cellules tumorales, suture par clips retirés sept à quatorze jours plus tard sous une nouvelle anesthésie : 696 souris passent par cette chirurgie. 796 souris en tout vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une centaine d'entre elles développant spontanément des tumeurs mammaires vers vingt-quatre semaines. Il s'agit de faire exprimer aux cellules cancéreuses un antigène synthétique, un drapeau artificiel que des anticorps ou des macrophages génétiquement modifiés viendraient reconnaître, sur des protocoles pouvant durer huit mois. Le porteur écrit que l'isolement des animaux sera évité, puis qu'un isolement temporaire pourrait être envisagé si les clips de suture provoquent des comportements agressifs entre souris.
Objectifs
Ce projet vise à développer une nouvelle approche d’immunothérapie contre le cancer, capable de s’attaquer à un grand nombre de tumeurs solides, en contournant l’une des principales limites actuelles : la variabilité des antigènes tumoraux d’un patient à l’autre, voire au sein d’une même tumeur. Notre idée repose sur l’introduction dans les cellules cancéreuses d’un antigène synthétique, une sorte de « drapeau » artificiel qui signale la cellule cancéreuse au système immunitaire. Ce marquage pourrait ensuite être reconnu par des traitements immunothérapeutiques spécialement conçus pour cibler cet antigène. Le projet se structure autour de trois axes complémentaires : 1. Création de modèles de tumeurs exprimant l’antigène synthétique Nous développerons des lignées de cellules tumorales murines, notamment de cancer du sein et de tumeurs cérébrales (gliomes), modifiées pour exprimer cet antigène à leur surface. Ces lignées seront ensuite utilisées dans des souris avec un système immunitaire fonctionnel, afin d’étudier si le système immunitaire est capable de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses ainsi marquées. 2. Utilisation de vecteurs viraux pour délivrer l’antigène dans les tumeurs Nous utiliserons des petits virus à ADN non pathogènes, déjà bien connus pour leur sécurité, pour introduire le gène de l’antigène synthétique directement dans les cellules tumorales. Ces virus seront conçus pour cibler uniquement les cellules cancéreuses, grâce à des systèmes de régulation activés spécifiquement dans l’environnement tumoral. L’objectif est de garantir une expression du marqueur uniquement dans la tumeur, sans affecter les tissus sains. 3. Développement de traitements ciblés contre cet antigène Enfin, nous concevrons deux types d’immunothérapies ciblant spécifiquement cet antigène : des anticorps thérapeutiques, et des macrophages génétiquement modifiés (CAR-M). Ces cellules modifiées seront capables de reconnaître, attaquer et éliminer les cellules cancéreuses marquées, tout en stimulant une réponse immunitaire plus large contre la tumeur.
Bénéfices attendus
Ce projet représente une avancée majeure dans le développement d’une nouvelle immunothérapie capable de cibler spécifiquement les tumeurs solides du sein et du cerveau, en combinant l’utilisation d’un antigène synthétique, de vecteurs viraux adaptés et de traitements innovants tels que les anticorps thérapeutiques et les macrophages génétiquement modifiés (CAR-M). À court terme, il permettra de surmonter les limites des thérapies actuelles en offrant une méthode plus efficace et sécurisée pour éliminer les cellules tumorales, tout en limitant les effets sur les tissus sains. À plus long terme, cette approche pourrait être étendue à d’autres types de cancers solides, élargissant ainsi son impact thérapeutique. Par ailleurs, le projet vise à établir un protocole robuste pour l’intégration de cette stratégie dans les traitements cellulaires de nouvelle génération, améliorant la précision et la sécurité des immunothérapies. Enfin, si les résultats précliniques sont prometteurs, ce travail ouvrira la voie à une première application clinique, offrant une nouvelle option aux patients souffrant de tumeurs résistantes et contribuant ainsi à améliorer significativement leur prise en charge.
Procédures
Le projet se déroulera en 5 parties dont plusieurs étapes sont communes. Une partie des animaux (696 souris) sera pesée (1 min) puis recevra une injection d'anti-douleur (30 sec) avant d'être anesthésiée par voie gazeuse (durée anesthésie : 20 min). Sous anesthésie, une incision de 1 cm maximum sera réalisée au niveau de l'abdomen (348 animaux) ou du crâne à l'aide d'un appareil de guidage spécifique (348 animaux) (durée : 1 min). Des cellules tumorales seront alors injectées au niveau du site (1min) et une suture sera réalisée au moyen de clips (1 min). Les clips seront retirés après cicatrisation (7 à 14 jours) sous anesthésie gazeuse (durée : 5 min). Pour les modèles cérébraux (348 animaux), un système de canule de traitement sera mis en place afin de limiter de multiples interventions chirurgicales pour le traitement des tumeurs. Le poids des souris sera évalué 2 fois par semaine (1 min) et la croissance des tumeurs sera mesurée 2 fois par semaine au moyen d'un pied à coulisse (348 animaux ; 2 min) ou par imagerie sous anesthésie (348 animaux ; durée anesthésie : 20 min). Pour l'imagerie, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse et maintenus sous anesthésie à l’aide d’un masque. Ils recevront ensuite l’injection d’une molécule permettant la réalisation de l’imagerie (durée : 30 sec). Dans les parties 1 et 2, 32 animaux recevront un traitement dans leur eau de boisson. Dans les parties 3, 4 et 5, une semaine après l'injection des cellules tumorales, 536 animaux recevront 1 à 2 injections de petits virus à ADN non pathogènes ou d’immunothérapies espacées de 4/5 jours (durée : 1 à 6 min) au niveau de la tumeur ou par voie générale. Pour 250 souris, cette injection se fera sous anesthésie gazeuse (durée 20 min). En parallèle, nous utiliserons dans la partie 5, des animaux (100 souris) développant spontanément des tumeurs au niveau mammaire à 24 sem. d'âge environ. Le poids des souris sera évalué 2 fois /semaine (1 min) et la croissance des tumeurs sera mesurée 2 fois par semaine avec un pied à coulisse (2 min). Ces animaux recevront 1 à 2 injections de petits virus à ADN non pathogènes ou d’immunothérapies espacées de 5 jours (durée : 1 à 6 minutes) au niveau de la tumeur. Les animaux seront surveillés quotidiennement selon des critères précis. Au moindre signe de souffrance, les animaux seront mis à mort selon la méthode réglementaire définie (durée max des procédures : 8mois).
Impact sur les animaux
Les procédures que nous prévoyons de réaliser pourraient être à l’origine d’un stress lié à la manipulation. De plus, le développement de tumeurs sur l’abdomen de l’animal ou au niveau de la zone subventriculaire du cerveau des animaux pourrait être à l’origine d’une faible gêne de la mobilité ou encore une potentielle perte de poids de l’animal. L’étape initiale d’injection des cellules nécessitant une anesthésie gazeuse, les animaux pourraient souffrir de stress au cours de cette manipulation qui serait de quelques minutes (2 ou 3 minutes jusqu’à l’anesthésie complète). Les pesées et mesures de masse tumorale pourront également conduire à un stress léger de courte durée (1 minute) répété deux fois par semaine. Malgré les précautions prises, l’utilisation de clips pour la suture des animaux après injection des cellules cancéreuses pourrait provoquer un inconfort ou des comportements agressifs inter-individuels jusqu’à la cicatrisation complète (5 à 7 jours). Dans ce cas, un isolement temporaire pourrait être envisagé après avis de la structure de Bien-être des Animaux et en accord avec les recommandations ministérielles. Les cellules injectées conduisant à la croissance tumorale et potentiellement à la dissémination de métastases, cette dernière pourrait avoir un effet sur le comportement des animaux qui sera étroitement surveillé.
Devenir
À l’issue des procédures expérimentales prévues dans ce projet, tous les animaux seront mis à mort selon les normes éthiques en vigueur, afin de limiter toute souffrance inutile et de permettre la récupération des tissus pour analyses scientifiques. La mise à mort interviendra soit à la fin du protocole expérimental planifié, soit de manière anticipée si des signes cliniques de souffrance, de détresse ou de dégradation de l’état général sont observés.
Remplacement
Dans un modèle cellulaire, nous avons développé l’antigène synthétique et confirmé son adressage à la membrane plasmique des cellules cancéreuses mammaires et de gliome par différentes techniques. Nous avons également établi des lignées cellulaires stables exprimant l’antigène synthétique, ainsi que des lignées à expression qui peut être induite. Ces cellules ont été cultivées dans des conditions avec très peu d’oxygène et l’expression de l’antigène a été vérifiée à l’aide des mêmes techniques. Par ailleurs, des co-cultures ont été réalisées entre les cellules cancéreuses exprimant l’antigène synthétique et les macrophages CAR évaluant ainsi leur capacité à reconnaître et éliminer les cellules cancéreuses. Ces résultats confirment la pertinence de poursuivre par des études dans un modèle animal, essentielles pour valider nos hypothèses dans un environnement biologique plus complexe et pour développer de nouvelles stratégies d’immunothérapie.
Réduction
Nous avons mis en œuvre plusieurs stratégies pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant des résultats robustes et statistiquement significatifs. Tout d’abord, des expérimentations préliminaires dans des cellules ont permis de sélectionner l’antigène synthétique optimal et les conditions optimales pour l’efficacité des immunothérapies (macrophages CAR et anticorps thérapeutiques). Ces études incluent le développement et l’analyse de lignées cellulaires stables ou pouvant être induites ainsi que des co-cultures pour valider les interactions immunitaires. Ensuite, les calculs de puissance statistique ont été réalisés pour minimiser le nombre de souris nécessaires par groupe tout en assurant une détection fiable des différences biologiques. Enfin, des techniques avancées comme la cytométrie en flux et l’imagerie par bioluminescence seront utilisées pour maximiser les données obtenues à partir de chaque animal, réduisant ainsi le besoin d’augmenter les cohortes. Ces approches permettent de réduire au strict minimum le nombre d’animaux respectant ainsi le principe des 3R, sans altérer la robustesse de nos résultats.
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage dans un environnement enrichi (maison, carré de coton, copeaux de cartons...) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). L’isolement d’animaux sera évité. Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Afin de prévenir le stress des animaux lié à la manipulation par l’expérimentateur, les souris seront préalablement habituées à la présence de l’expérimentateur et à leur manipulation par l’humain. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin réduire leurs stress et angoisse. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant toute procédure pouvant provoquer un stress, une angoisse ou une souffrance. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. En cas de souffrance lié au score observé sur la grille d’évaluation de la douleur, un traitement analgésique sera envisagé jusqu’à disparition des signes de souffrance. Des points limites à ne pas dépasser ont été définis préalablement au projet et l’atteinte de l’un d’entre eux ou l’inefficacité du traitement analgésique conduirait à la mise à mort immédiate des animaux selon la méthode définie. Ces points limites comportent notamment toute blessure de la tumeur mais aussi toute atteinte aux libertés fondamentales de l’animal (telles que la gêne au déplacement, à la posture, à l’expression d’un comportement normal ou la présence de souffrance et/ou de détresse chez l’animal) Le poids des souris sera évalué deux fois par semaine. Une perte de poids de plus de 15% constatée et maintenue sur plus de 72h conduira à la mise à mort de l’animal. La mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines, car à cet âge leur système immunitaire est pleinement développé. Cela est essentiel pour notre projet, qui étudie des traitements agissant via le système immunitaire pour éliminer les cellules cancéreuses. Le choix de la souris comme espèce repose sur plusieurs raisons : ● Tout d’abord, les cellules cancéreuses utilisées dans notre étude proviennent de souris. Il est donc logique et scientifiquement cohérent d’utiliser un modèle murin pour garantir une compatibilité biologique. ● Par ailleurs, la souris est l’un des modèles les plus utilisés en recherche sur le cancer, car elle présente de nombreuses similitudes avec l’humain en ce qui concerne le développement des tumeurs et la réponse immunitaire.
Mise au point d’élevage de puces
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
1 214 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des souriceaux âgés de deux à sept jours sont placés sans contention pendant une heure au contact de colonies de puces, et lorsque plus de mille puces se nourrissent en même temps l'exsanguination entraîne une perte de conscience puis la mort en cinq minutes environ. Aucun anesthésique n'est administré, le porteur indiquant qu'il perturberait la prise de repas des puces, et des souris adultes rasées puis maintenues en contention stricte pendant une heure sont prévues en dernier recours. L'objectif est d'établir en laboratoire des colonies de puces de rongeurs pour étudier la transmission de la peste, et les molécules analgésiques que les puces injectent en piquant sont présentées comme "une forme de raffinement biologique supplémentaire".
Objectifs
La peste est une maladie transmise par les puces, qui touche principalement les rongeurs et parfois de nombreux mammifères, y compris les humains. Les raisons ayant conduit à la disparition de la peste en Europe, ainsi que les conditions d’une éventuelle réémergence ou propagation sur le territoire français et européen, restent mal comprises. Cette incertitude tient en grande partie à notre méconnaissance des espèces de puces présentes localement et de leur capacité à transmettre Yersinia pestis, que ce soit dans des contextes passés, actuels ou futurs. Or, cette connaissance est essentielle pour mieux comprendre les épidémies anciennes et évaluer les risques contemporains de résurgence. Dans ce contexte, la mise en place de colonies stables de puces constitue une étape préalable indispensable à toute étude expérimentale visant à caractériser leur biologie, leur comportement alimentaire et leur compétence vectorielle. Notre projet a ainsi pour objectif d’établir en laboratoire des colonies viables de puces de rongeurs, issues de sept espèces différentes au maximum, à partir d’individus adultes collectés sur le terrain. Pour cela, nous développerons des protocoles d’élevage spécifiques à chaque espèce, selon une approche progressive et itérative combinant observation, ajustements environnementaux et documentation rigoureuse. Ce travail vise à poser les bases d’un modèle expérimental aujourd’hui inexistant pour des espèces d’intérêt majeur en santé publique et animale.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est l’établissement de colonies stables de puces de rongeurs collectées sur le territoire français, dans des conditions expérimentales reproductibles. A ce jour, aucun protocole validé ne permet l’élevage en laboratoire de la plupart des espèces ciblées, pourtant cruciales pour comprendre leur écologie et leur rôle potentiel dans la transmission de pathogènes. L’obtention de telles colonies représentera une avancée méthodologique majeure, en fournissant pour la première fois un matériel biologique vivant, contrôlé et standardisé. Elle ouvrira la voie à des recherches expérimentales sur la biologie de ces puces, leur comportement alimentaire, leur physiologie et leur compétence vectorielle. Ce projet posera ainsi les bases d’une capacité expérimentale inédite, au service de la santé publique, de la santé animale et de l’écologie vectorielle.
Procédures
Les animaux seront exposés une seule fois au contract de puces pendant une durée d'heure.
Impact sur les animaux
L’exposition aux puces peut entraîner deux types de nuisance. D’une part, les piqûres elles-mêmes, atténuées par les propriétés analgésiques et anti-inflammatoires de leur salive. D’autre part, la perte sanguine liée à l’alimentation des insectes. Lors d’expositions avec un nombre limité de puces, la quantité de sang prélevée demeure faible et n’entraîne pas d’effet physiologique observable dans nos conditions. A l’inverse, lors du nourrissage de colonies établies sur souriceaux, l’alimentation simultanée d’un très grand nombre de puces provoque une perte de sang importante, conduisant rapidement à une perte de conscience puis au décès très rapide. Dans ce contexte, la phase consciente est brève et la perception nociceptive potentielle reste transitoire. Chez l’adulte, la contention est douce et de courte durée, constituant une source de stress supplémentaire, sans douleur manifeste observée.
Devenir
Quel que soit la procédure, les animaux ne seront pas maintenus en vie après leur utilisation. Leur prise en charge en fin de protocole est strictement encadrée et conforme aux exigences sanitaires et réglementaires en vigueur, afin d’éviter tout risque de contamination croisée et de garantir la sécurité des installations expérimentales.
Remplacement
A ce jour, il n’existe aucun modèle in vitro capable de reproduire le cycle biologique complet des puces ni leurs interactions physiologiques avec un hôte. Les puces sont des insectes hématophages stricts, et la prise de repas sanguin constitue un déclencheur physiologique essentiel à leur développement, leur reproduction et leur ponte. Ce processus dépend non seulement de la disponibilité du sang, mais aussi de signaux sensoriels et hormonaux issus du contact avec un hôte vivant. L’utilisation de systèmes artificiels de nourrissage, comme des membranes synthétiques, reste inadaptée à notre contexte expérimental. Ces dispositifs ne permettent ni une alimentation efficace ni une reproduction stable chez les espèces ciblées ici. Ils exposent également les puces à des anticoagulants et à des contaminations bactériennes ou fongiques, nécessitant l’ajout d’antimicrobiens qui altèrent leur physiologie et compromettent la validité des données. Enfin, il n’existe actuellement ni lignée cellulaire, ni modèle substitutif permettant de reconstituer ex vivo les interactions complexes entre la puce et son hôte. L’objectif de ce projet, en développant un modèle expérimental fiable, est aussi de jeter les bases de futures alternatives, plus éthiques, reproductibles et standardisées.
Réduction
L’utilisation de souriceaux permet de nourrir un grand nombre de puces tout en mobilisant un nombre réduit d’animaux. Un seul souriceau remplace le volume sanguin obtenu par 4 à 5 souris adultes dans un système artificiel équivalent. Cette approche contribue significativement à la réduction du nombre total d’individus utilisés. Par ailleurs, notre stratégie expérimentale a été conçue pour limiter autant que possible le recours aux animaux, tout en garantissant la validité scientifique du modèle. Lors de la phase initiale de mise au point, un nourrissage tous les deux jours est prévu pour identifier les conditions optimales de développement et de reproduction pour chaque espèce. Dès qu’une reproduction est confirmée, la fréquence est réduite progressivement à trois, puis à deux nourrissages hebdomadaires, en fonction de la dynamique de la colonie. Un suivi de la viabilité des colonies sera mis en place afin d’ajuster en continu le nombre d’animaux requis pour le maintien de chaque lignée.
Raffinement
Plusieurs mesures ont été intégrées pour minimiser la contrainte associée aux nourrissages. Les souriceaux seront exposés sans contention, pendant une durée limitée à une heure. Ce choix participe activement au raffinement, en limitant le stress et la douleur. Le stade utilisé (2 à 7 jours) correspond à une période de développement où le système nerveux central est encore immature, ce qui réduit la perception de la douleur. Si aucune reproduction n’est observée avec les souriceaux de 2 à 5 jours, un test sera réalisé avec des individus légèrement plus âgés (6 à 7 jours). En cas d’échec persistant, des souris adultes pourront être utilisées en dernier recours. Elles seront rasées sur le flanc et placées en contention stricte pendant une heure, avec surveillance renforcée du bien-être. Aucun anesthésique ne sera administré, car il perturberait la prise de repas des puces et compromettrait la reproductibilité du modèle. Des observations systématiques seront réalisées pendant et après l’exposition afin de détecter tout signe de souffrance (vocalisation, évitement, apathie). Le raffinement repose ainsi sur plusieurs axes : réduction de la durée d’exposition, sélection de stades faiblement sensibles à la douleur, recours limité aux adultes en cas d’échec des protocoles sur souriceaux, contention encadrée, et ajustement progressif du rythme de nourrissage au strict nécessaire. Enfin, les puces injectant naturellement des molécules aux propriétés analgésiques et anti-inflammatoires lors de la prise de sang, cet effet propre à leur mode de nutrition constitue une forme de raffinement biologique supplémentaire. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure afin de permettre l’identification précoce de signes de souffrance justifiant l’interruption de l’expérimentation et l’euthanasie immédiate de l’animal.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris (Mus musculus), qui constitue un hôte naturel ou compatible pour de nombreuses espèces de puces ciblées par le projet. Elle est couramment utilisée pour le nourrissage de puces en contexte expérimental, notamment dans les protocoles publiés pour les espèces du genre Xenopsylla. Son statut d’espèce modèle, sa physiologie bien connue, et sa compatibilité avec les besoins alimentaires des puces en font un choix scientifiquement pertinent et largement validé pour ce type de protocole. Trois stades de développement pourront être utilisés dans ce projet, chacun sélectionné pour des raisons scientifiques et éthiques spécifiques. Souriceaux âgés de 2 à 5 jours. Il s’agit du stade privilégié pour les nourrissages expérimentaux. A ce stade, les souriceaux sont glabres, leur peau est fine, et leur système nerveux est encore en développement. Bien que la perception nociceptive soit présente dès la naissance, son intégration centrale est partielle, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Lorsqu’ils sont exposés à un grand nombre de puces (>1000), l’exsanguination entraîne une perte rapide de conscience suivi du décès (~5 minutes après exposition). La perception nociceptive potentielle est intense mais très transitoire, et ne s’accompagne d’aucun signe comportemental prolongé. Par ailleurs, l’utilisation de souriceaux permet de réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés : un seul individu alimente les puces alors qu’il faudrait 4 à 5 souris adultes nécessaires pour obtenir un volume sanguin équivalent lors d’un nourrissage artificiel. La faible pilosité des souriceaux permet également de limiter les risques de fuite des insectes, ce qui sécurise la procédure. Souriceaux âgés de 6 à 7 jours. Ce stade sera utilisé uniquement en cas d’échec avec les souriceaux plus jeunes. Les yeux sont encore fermés, mais une pilosité débute. Cette évolution pourrait influencer la prise alimentaire ou la reproduction des puces via des facteurs physiologiques ou comportementaux. Comme pour les stades plus jeunes, l’absence de contention et la durée d’exposition limitée permettent de maintenir un bon niveau de raffinement. Souris adultes. L’utilisation de souris adultes est envisagée en dernier recours, uniquement si les tentatives de nourrissage sur souriceaux s’avèrent inefficaces.
Étude d’un nouveau traitement contre le cancer : influence des bactéries intestinales et efficacité ciblée dans l’intestin dans différents modèles de cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Quatre-vingt-huit souris seront réutilisées dans d'autres procédures, les 504 autres tuées après une greffe de cellules cancéreuses pour analyse de leurs organes. 592 souris au total vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit sept gavages en quatorze jours puis huit autres en vingt et un jours, six récoltes de selles, des prélèvements de sang répétés et jusqu'à cinq administrations de chimiothérapie, d'inhibiteurs de tyrosine kinase, d'immunothérapie anti-PD-1 ou du candidat médicament bactérien de la société. Parmi les trois objectifs annoncés figure un objectif économique, rendre le traitement plus accessible et "attirer les industriels" en simplifiant les critères de sélection des patients.
Objectifs
Le microbiote intestinal, c’est-à-dire l’ensemble des micro-organismes vivant dans nos intestins, joue un rôle important dans la façon dont notre corps réagit au cancer et aux traitements, notamment en influençant la réponse immunitaire. La modulation de la réponse immunitaire antitumorale par le microbiote intestinal repose sur des interactions spécifiques entre certaines souches bactériennes et les cellules immunitaires au niveau de l’intestin. Des données précliniques ont mis en évidence le rôle immunomodulateur d’une souche bactérienne sélectionnée pour ses propriétés de restauration de la sensibilité à certaines thérapie anti-cancéreuse. Cette souche est utilisée actuellement en phase I d’un essai clinique (NCT05865730), administré à des patients atteints de cancer du rein avancé et traités exclusivement par immunothérapie. Avant de pouvoir proposer notre médicament à un plus grand nombre de patients, la recherche doit vérifier si la bactérie qu’il contient peut bien s’installer dans l’intestin, même chez les personnes qui ont déjà naturellement des bactéries similaires. Cette étape est importante pour s’assurer que le traitement fonctionne sans avoir besoin de vérifier à l’avance la composition du microbiote de chaque patient. Actuellement, notre médicament est testé uniquement chez des patients atteints d’un cancer du rein. Pour pouvoir en faire bénéficier d’autres personnes, nous envisageons de l’essayer aussi dans d’autres types de cancers. Le but secondaire de ces études est également de s’assurer que ce traitement fonctionne bien lorsqu’il est utilisé en même temps que les nouvelles combinaisons de médicaments déjà prescrites contre le cancer chez les patients. Il est donc nécessaire de faire ces études pour permettre d’élargir l’essai cliniques auprès de nouvelles personnes atteintes de cancers. Ces études doivent être menées sur un modèle pertinent et proche de l’humain ; bien que le microbiote de la souris diffère de celui de l’homme, ils partagent des fonctions biologiques essentielles et des réponses immunitaires similaires, ce qui en fait un modèle adapté pour étudier les effets thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Comme ce nouveau « candidat médicament » développé par notre société ne peut pas encore être testé directement chez les humains, nous devons d’abord le tester dans des conditions sûres. Pour cela, nous utilisons des souris de laboratoire, car elles sont très couramment utilisées dans la recherche contre le cancer. Elles partagent beaucoup de points communs avec l’être humain, notamment au niveau génétique. De plus, il existe déjà de nombreux modèles de cancer bien connus chez la souris, ce qui permet de reproduire des situations proches de celles observées chez les patients. Cela nous aide à vérifier si le médicament fonctionne bien, et à comparer les résultats avec les traitements standards déjà utilisés. Utiliser un autre animal rendrait les résultats moins fiables et plus difficiles à interpréter. Elles partagent beaucoup de points communs avec nous sur le plan génétique, et permettent de tester les traitements dans des conditions fiables. Le projet comporte deux grandes étapes : La première vise à vérifier si le candidat médicament, une bactérie thérapeutique, peut s’installer dans l’intestin même si une autre bactérie appelée Akkermansia n’est pas déjà présente. Si c’est le cas, cela permettrait de simplifier l’accès au traitement pour les patients, sans avoir besoin de tests préalables. La deuxième étape cherche à montrer que le candidat médicament peut renforcer l’efficacité des traitements classiques contre différents types de cancers solides (foie, rein, poumon,peau,…). Cela pourrait en faire une option complémentaire pour les patients chez qui les traitements actuels ne fonctionnent pas bien. Ce projet a trois objectifs : Pharmacologique : s’assurer que le candidat médicament fonctionne bien et peut être utilisé chez tous les patients. Thérapeutique : tester le candidat médicament avec différents traitements (comme la chimiothérapie ou la radiothérapie) pour élargir ses usages. Économique : rendre le traitement plus accessible, réduire les coûts et attirer les industriels en simplifiant les critères de sélection des patients. En résumé, ce projet pourrait changer la façon dont on personnalise les traitements contre le cancer, en utilisant le microbiote (les bactéries intestinales) pour améliorer la réponse aux thérapies.
Procédures
Chaque souris recevra 7 gavages pendant 14 jours puis 8 pendant 21 jours (durée 1 minute, vigile). Des récoltes de selles auront lieu à selles à 6 temps (J0, J6, J14, J21, J28, J34). Pour la procédure avec implantation de tumeur, les souris recevront une implantation tumorale sous anesthésie locale (durée 1 minute) suivie de traitements combinés : chimiothérapie, inhibiteurs de tyrosine kinase, immunothérapie anti-PD-1, et/ou d’Oncobax® (5 administrations par souris, durée 1 minute, anesthésie locale)). Des prélèvements de sang seront réalisés sur animaux vigiles à différents temps (J0,J7,J14, J21). Les animaux seront suivis cliniquement et euthanasiés si des critères éthiques sont atteints. Aucun autre geste invasif n’est prévu en dehors des prélèvements de selles/plasma et des injections nécessaires au protocole.
Impact sur les animaux
La contention peut induire un stress léger et transitoire, tandis que les injections sous-cutanées ou intrapéritonéales peuvent provoquer, en plus du stress, des douleurs passagères ainsi que des risques de lésions locales ou de péritonite en cas d’erreur. Le gavage oral peut induire une douleur tranistoire et légère. Les prélèvements de fèces, bien que brefs, peuvent générer un stress léger, avec des effets cumulatifs en cas de répétition, avec un impact poivant devenir modéré. La croissance tumorale peut altérer l’état général des souris : douleur modérée, réduction de la mobilité, perte d’appétit, hypothermie, complications locales (ulcérations, nécroses), et cachexie (amaigrissement sévère, fonte musculaire) dans les cas avancés.
Devenir
Certaines des souris ayant eu une procédure légère, pourront être réutilisées. D’autres souris recevront des greffes de cellules cancéreuses, et seront euthanasiées pour analyses post-mortem sur tissus et organes.
Remplacement
Avant d’envisager l’utilisation de souris, plusieurs approches alternatives ont été explorées pour tenter de répondre aux objectifs scientifiques: des outils de modélisation informatique ont été utilisés pour prédire certaines interactions moléculaires. Bien qu’utiles, ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme vivant, en particulier les réactions du système immunitaire et la dynamique des bactéries de l'intestin. Des modèles cellulaires (in vitro) ont également été employés en amont. Ces systèmes permettent d’étudier certains mécanismes localisés, mais ils ne disposent ni d’un microbiote fonctionnel, ni d’un système immunitaire complet, ce qui limite leur capacité à simuler les effets globaux du traitement. Des approches basées sur l’étude de tissus ou d’organes isolés (ex vivo), ont aussi été envisagées. Elles permettent des analyses ponctuelles, mais ne reflètent pas les processus dynamiques comme la colonisation bactérienne ou la progression d’un cancer dans un organisme entier. Enfin, les bases de données et modèles statistiques ont été utiles pour concevoir les protocoles, mais ne peuvent pas prédire la réponse globale d’un organisme vivant à un traitement complexe. Ainsi, malgré l’utilisation maximale de méthodes alternatives, l’expérimentation animale reste indispensable pour valider les hypothèses du projet. Le modèle murin (la souris) a été choisi car il est bien connu, maîtrisé par les équipes, et déjà utilisé dans les phases précédentes du développement.
Réduction
Dans ce projet, il est utilisé des modèles expérimentaux bien connus et déjà validés, ce qui permet de limiter les ajustements techniques et donc d’éviter des pertes animales inutiles. Le nombre de souris utilisées est calculé avec précision à l’aide d’outils statistiques, afin d’obtenir des résultats fiables sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. Par exemple, pour mesurer l’effet du traitement sur la croissance tumorale ou la survie, les chercheurs ont défini à l’avance le nombre minimum d’animaux requis pour détecter une différence significative entre les groupes. Ces calculs sont basés sur des données issues d’études précédentes et sur des hypothèses réalistes. Les analyses statistiques prévues permettent d’exploiter au mieux les données recueillies, sans multiplier les expériences. De plus, les expérimentations sont regroupées autant que possible, notamment pour limiter le nombre de groupes témoins, souvent nécessaires pour comparer les effets d’un traitement. Chaque procédure ne sera répétée qu’une seule fois, uniquement si les résultats sont concluants, afin d’éviter toute répétition inutile. Si une expérience ne donne pas de résultats exploitables, elle sera interrompue pour ne pas utiliser d’animaux sans raison valable. Enfin, le personnel impliqué est hautement qualifié, ce qui garantit une bonne maîtrise des gestes techniques et limite les erreurs ou les pertes d’animaux liées à des manipulations inappropriées.
Raffinement
Toutes les manipulations (comme le gavage, les injections ou les prélèvements sanguins) seront réalisées en limitant leur fréquence et leur durée au strict nécessaire. Lorsque cela est possible, ces gestes seront effectués sous anesthésie locale, afin de garantir un confort optimal. Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales : alimentation adaptée, eau stérile à volonté, enrichissement de l’environnement (abris, matériaux de nidification, etc.), et une période de quarantaine d’au moins une semaine avant le début des procédures pour favoriser leur acclimatation et réduire le stress. Dès le début de l’étude, les animaux feront l’objet d’un suivi clinique quotidien, basé sur des critères précis : poids, état du pelage, comportement, état des dents, taille et aspect des tumeurs. Ce suivi permet de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de dégradation de l’état de santé. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Dans ce projet, des souris adultes âgées de 7 à 8 semaines seront utilisées, un stade correspondant à leur maturité sexuelle, garantissant un système immunitaire pleinement développé et une stabilité hormonale. Le choix de la souris repose sur des critères scientifiques, pratiques et éthiques : c’est un modèle largement utilisé en recherche biomédicale, notamment pour étudier les interactions entre le microbiote, le système immunitaire et les traitements anticancéreux. Sa génétique est bien connue et présente de nombreuses similarités avec celle de l’humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour ce type d’étude. L’utilisation de ce modèle permet également de s’appuyer sur des protocoles déjà maîtrisés par les équipes, assurant des conditions expérimentales fiables et reproductibles, tout en limitant le nombre d’animaux nécessaires.
Sauvetage phénotypique en période périnatale pour une lignée de souris mutante.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les souriceaux porteurs de la mutation, dont 40 à 50 % meurent avant le sevrage et 60 % de ceux-là dans les 48 heures suivant la naissance, subissent une pesée quotidienne et des injections répétées pendant huit à quatorze jours. Les retombées biomédicales annoncées restent au conditionnel, ces souris pouvant selon le porteur devenir de nouveaux modèles précliniques d'une maladie rare, tandis que l'absence de groupe témoin est présentée comme un gain sur le nombre d'animaux. Aucun modèle alternatif crédible n'existerait pour le stade de la naissance, et la souris est décrite comme la référence "incontournable" du domaine.
Objectifs
Notre projet vise à étudier des modèles murins "perte de fonction" pour une portion spécifique du génome de la souris qui abrite deux gènes. Chez l'humain, ce locus est positionné dans une zone chromosomique où des anomalies génétiques entraînent une maladie rare. Cette maladie se caractérise par un tableau clinique complexe, notamment à la naissance avec un retard de croissance et de nombreux dysfonctionnements métaboliques et hormonaux. Nos résultats préliminaires révèlent que nos modèles murins récapitulent certains aspects de la pathologie humaine. C’est dans ce contexte que s’inscrit cette demande qui vise à atténuer, totalement ou partiellement, les anomalies périnatales des souriceaux génétiquement modifiés par des interventions pharmacologiques ou environnementales.
Bénéfices attendus
Notre programme de recherche vise à associer génétique et exploration phénotypique afin d’approfondir notre compréhension du rôle régulateur de deux gènes dans la survie, la croissance et l’adaptation hormonale et métabolique en période périnatale. L’étude de leur fonction à ce stade critique représente un enjeu majeur, tant sur le plan conceptuel que logistique. Par ailleurs, les expériences proposées pourraient avoir des retombées significatives dans le domaine biomédical, nos souris mutées pouvant constituer de nouveaux modèles précliniques de la maladie. Elles offriraient ainsi une opportunité unique de caractériser les étapes précoces de la pathologie, qui se manifestent dès la naissance.
Procédures
Lorsque les souriceaux sont injectés et pesés en même temps la durée est de 1 à 2 minutes soit entre 8 et 14 jours selon le traitement. Les simples pesées quotidiennes durent moins d’1 minute.
Impact sur les animaux
Le phénotype de cette lignée est que les souriceaux KO sont de plus petite taille et présentent une mortalité périnatale avec une pénétrance incomplète, avec 40-50% des souriceaux mutant qui décèdent avant le sevrage, dont environ 60% dans les 48 heures suivant la mise-bas. Les pesées quotidiennes des souriceaux peuvent induire un léger stress et une douleur légère. Les injections quotidiennes de traitement sur plusieurs jours peuvent entrainer un stress et une douleur modérés.
Devenir
Tous les animaux des procédures sont mis à mort pour réaliser des prélèvements pour des analyses.
Remplacement
Nos gènes d’intérêts sont exclusivement retrouvés chez les mammifères placentaires et sont exprimés uniquement dans le cerveau. Ce mode d’expression strictement neuronal, associé à leur apparition tardive au cours de l’évolution des mammifères, restreint considérablement le choix de modèles d’étude biologiquement pertinents. Ainsi, toutes les études publiées à ce jour ont été menées chez la souris, d’autant que ce modèle reproduit certains traits pathologiques caractéristiques de la maladie. Enfin, notre demande porte sur un stade de développement crucial : la naissance. À ce jour, il n’existe aucun modèle alternatif crédible et biologiquement pertinent pour cette étude.
Réduction
Notre stratégie de croisement permet de limiter le nombre d’animaux à produire. En effet, nous attendons à ce que 50 % des souriceaux présentent la délétion pour nos gènes d’intérêts contre seulement 25 % avec des croisements classiques. De plus, notre choix initial de traiter tous les individus sans inclure de contrôle contribue également à cette réduction puisque nous comparons uniquement deux groupes au lieu de quatre. Cet aspect est particulièrement important dans le contexte d’une expérimentation en aveugle et d’une mortalité à pénétrance incomplète. Le fond génétique, particulièrement adapté aux analyses métaboliques, contribue également à limiter la taille des groupes étudiés. Sur la base de notre expérience avec un autre modèle de souris mutées et des données disponibles dans la littérature, 15 portées par condition étudiée devraient assurer une puissance statistique suffisante. Enfin, à l’issue des expérimentations, nous prélèverons et archiverons un maximum de tissus issus d’un même individu afin d’anticiper d’éventuelles analyses anatomiques et moléculaires ultérieures.
Raffinement
Ce projet a pour objectif de suivre la survie et la prise de poids des souriceaux mutants grâce à un traitement pharmacologique ou environnemental. Les pesées et les injections de traitements seront effectuées au même moment pour ne réaliser qu’une seule préhension et contention. Nous réaliserons une surveillance deux fois par jour pour les traitements pharmacologiques et une fois par jour pour les interventions environnementales. Ce qui nous semble être un bon compromis pour le déroulement de nos expériences. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront pris en compte à chaque observation. Des points limites précoces seront mis en place pour les traitements pharmacologiques. Si les animaux présentent des signes de souffrance alors ils seront mis à mort. En revanche il n’y a pas de points limites spécifiques pour les interventions environnementales.
Choix des espèces
Tous les modèles animaux de la pathologie décrits à ce jour ont été réalisés chez la souris. Ce modèle murin est donc devenu la référence incontournable dans notre domaine de recherche, car il permet non seulement d’établir des comparaisons avec les données existantes dans la littérature, mais aussi de réduire le nombre de souris en évitant la répétition d’expériences déjà publiées et donc pouvant être considérées comme inutiles sur le plan éthique. Notre demande porte sur un stade de développement crucial, la naissance, jusqu'au sevrage des souriceaux.